专利名称：用家蚕幼虫蛹表达外源基因的方法
技术领域：
本发明是一种用家蚕幼虫、蛹表达外源基因的方法，属基因工程领域。
大肠杆菌、酵母等微生物系统已用于表达外源基因进行生产，并形成了一些基因工程产品。但由于大肠杆菌的表达产物形成一种不溶解的包函体故需要加变性剂溶解和恢复天然结构。动物细胞作为外源基因表达系统，其特点是表达产物保持天然的三维结构，能将蛋白质侧链进行糖基化，去掉基因中的内函子，翻译后产物的修饰加工，分泌等都在细胞内完成，但是动物细胞培养价格昂贵，周期长，条件要求严格而且表达有限，大量培养需要特定技术与设备。因而近年来人们试图以昆虫细胞作为寄主细胞成为外源基因的表达系统，较为成效的有1.前田进，细胞工学vol.4，767-790，1985年所述，将家蚕核多角体病毒构成的载体质粒插入目的基因与家蚕核多角体病毒DNA共同感染家蚕离体培养的细胞中，在家蚕细胞内重组，并进而感染家蚕幼虫在体内表达。家蚕易被人工饲养，但是家蚕病毒构成的载体质粒插入的外源目的基因只能和家蚕病毒一起感染家蚕细胞或家蚕幼虫，仍有局限性。
2.D.summers，Bio/Technology，vol.6.48-55.1988年所述，采用苜蓿银纹夜蛾Autographa Californica核多角体病毒(以下简称ACNPV)已构成带有不同外源目的基因的多种ACNPV载体质粒，它与ACNPV DNA一起感染草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(以下简称sf)离体细胞，在其中重组表达，山于细胞培养产量低，速度慢而且草地贪夜蛾很难人工大量饲养，无法形成基因工程产品。
本发明目的是为了得到一种高效表达，成本低，又适合于人工饲养的一种基因工程方法，即采用已构成带有不同外源目的基因的各种ACNPV载体质粒，使它能与家蚕病毒DNA共同感染家蚕离体细胞，得到的杂交重组病毒感染到家蚕幼虫和蛹体内，在其体内能得到基因表达。
本发明是这样实现的1.病毒和细胞家蚕细胞株Bm-N细胞在BML/TC-10培养基培养。用家蚕核多角体病毒感染2-5令家蚕幼虫增殖病毒，用蔗糖密度梯度超离心法提纯。
2.病毒DNA的制备经纯化后的家蚕核多角体病毒用0.25M氯化钠和蒸馏水洗涤后用碱性碳酸钠缓冲液37℃保温2小时溶解，离心除去不溶物，上清液用苯酚抽提，离心，水相再用氯仿抽提，最后将水相对重蒸馏水透析过夜，应用此法制备的核多角体病毒DNA用于家蚕细胞株Bm-N细胞的转染重组。
3.质粒PAC360，PAC373，PAC700，PBlue Bac等系列质粒都可在大肠杆菌中增殖，用苯酚提取，用琼脂糖-4B层析柱纯化。
4.细胞内重组及重组病毒的筛选将带有外源目的基因的ACNPV质粒0.1-5微克及家蚕核多角体病毒DNA 0.2-10微克悬浮于950微升转染缓冲液(10-50mM HEPES，0.7mM Na2HPO4，20-100mM NaCl，4-10mM葡萄糖，5mM KCl，0.1-10μg/ml小牛胸腺DNA，PH6.8-8.2)中加10-100μl 2.5M CaCl2溶液，室温放置30分钟，使之形成纤细状沉淀，将其加入单层家蚕细胞，25-30℃培养5-10小时，吸弃转染液，换培养液，在25-30℃继续培养2-5天，直至病毒多角体形成。取上述转染的细胞培养液经稀释后取2ml加至培养皿培养单层家蚕细胞上，25-30℃保温2-4小时后，吸弃感染液，用培养液漂洗单层细胞，在单层细胞上复盖1-2%琼脂凝胶，琼脂凝胶复层用培养液培制含200μg/ml5-氯-4-溴-3-吲哚β-D-半乳糖苷(x-gal)，25-80℃培养4-6天至兰色空斑形成，挑取兰色空斑，再次重复做空斑测定，分离重组病毒。
5.重组病毒对家蚕幼虫、蛹的感染采用针刺、注射、口服的接种方法将病毒感染到2-5令家蚕幼虫和家蚕蛹体内。
本发明扩大了ACNPV构成的载体质粒的应用范围，使目前重组的ACNPV在草地贪夜蛾离体培养细胞表达产物可以转入家蚕幼虫或蛹体内进行培养，家蚕饲养在我国已有悠久历史，很易形成一定规模的基因工程产品的产业，因而具有重要的经济意义。本发明的表达产物可廉价地大量生产，可将家蚕细胞内杂交重组的核多角体病毒进一步感染到家蚕幼虫和蛹体内，其表达水平高于细胞内表达的100倍，这种高效表达具有重要的生产价值。例如一条家蚕在20多天生长期里食桑叶20克，体重5克每条蚕可得4毫克的表达产物。
本发明的表达产物稳定，实验结果证明能表达产物的家蚕幼虫和蛹体体液内蛋白酶活力微弱，而体液中蛋白酶抑制剂合成高，感染5天后的家蚕幼虫与令期起始相比蛋白酶抑制剂提高了200倍，而眨家蚕幼虫体液中蛋白酶抑制剂只增加20倍，这说明表达产物在幼虫体液内是稳定的。
本发明以生产β-半乳糖苷酶为实施例1.β-半乳糖苷酶作为外源目的基因插入ACNPV构成的载体质粒的培养条件采用带有β-半乳糖苷酶的ACNPV构成的载体质粒PAC360转化到大肠杆菌中增殖，在LB培养基内含每毫升50微克氯苄青霉素的条件下培养。
2.家蚕核多角体病毒DNA的制备用蔗糖密度梯度超离心法纯化病毒，在0.1M Na2CO3，0.1M NaCl，0.1%SDS，每毫升含/毫克的蛋白酶K，PH10.8 37℃保温2小时离心，转速是15000转/分，除去沉淀，上清液用重蒸馏的苯酚提取，再离心，水相用氯仿提取，水相用重蒸馏水透析过夜，得到DNA。
3.带有β-半乳糖苷酶的ACNPV构成的重组质粒与家蚕核多角体病毒DNA重组取带有β-半乳糖苷酶的质粒PAC360/微克与病毒DNA2微克悬浮于950微升转染缓冲液(20mM HEPES，0.7mM Na HPO4，37mM NaCl，6mM葡萄糖，5mM KCl，0.5μg/ml小牛胸腺DNA，PH7.05)中，加50微升2.5M CaCl2溶液，室温放置30分钟，此时出现纤细状沉淀，将其加入单层家蚕细胞，在28℃下培养7小时后弃除转染液，再换新的培养液(BML/TC-10)在28℃内继续培养3-4天，直至病毒多角体形成，取已转染的细胞培养液经稀释后取2毫升加至培养有单层家蚕细胞的培养皿上28℃下保温2小时，吸弃感染液，将培养液轻轻漂洗单层细胞，在单层细胞上覆盖1.5%琼脂糖凝胶，琼脂糖凝胶覆层用BML/TC-10培制含每毫升200微克5-氯-4-溴-3-吲哚β-D-并乳糖苷(X-gal)28℃培养5天，兰色空斑形成，挑取兰色空斑，再次重复空斑测定，分离重组病毒。
4.带有β-半乳糖苷酶基因的重组病毒感染家蚕幼虫用多点针刺法将重组病毒刺入五令家蚕幼虫体内，第6天取样，可得体液1毫升含有40毫克β-半乳糖苷酶，表达活力每毫升10×106单位。
权利要求
1.本发明用家蚕幼虫和蛹表达外源基因的方法，属基因工程，包括带有外源目的基因的昆虫病毒质粒，与同种不带外源基因的昆虫病毒核酸二者在其专一的昆虫寄主细胞和虫体中重组表达，其特征是用带有外源目的基因的昆虫为首苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒质粒与不带外源目的基因的家蚕核多角体病毒的核酸，通过共同感染家蚕离体培养细胞得到杂交重组的病毒，再用得到的杂交重组病毒感染家蚕幼虫和蛹得到基因表达具体方法是a)用家蚕核多角体病毒感染家蚕幼虫，用常规方法提纯家蚕核多角病毒及制备核多角体病毒的DNA，用于家蚕细胞的转染重组。b)将带有外源目的基因的苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒的质粒0.1-5μg及家蚕核多角体病毒DNA0.2-10μg悬浮于950μl转染缓冲液(10-50mM HEPES，0.7mM Na2HPO4，20-100mM NaCl，4-10mM葡萄糖，5mM KCl，0.1-10μg/ml小牛胸腺DNA，PH6.8-8.2)中加10-100μl2.5M CaCl2溶液，室温放置30分钟，使之形成纤细沉淀，将其加入单层家蚕细胞，25-30℃培养5-10小时，吸弃转染液，换以培养液，25-30℃继续培养2-5天直至病毒多角体形成。取上述转染的细胞培养液经稀释后取2ml加至培养皿培养单层家蚕细胞上，25-30℃保温2--4小时后，吸弃感染液，用培养液轻轻漂洗单层细胞，在单层细胞上复盖1-2%琼脂凝胶，琼脂凝胶复层用培养液培制含200μg/ml5-氯-4-溴-3-吲哚β-D-半乳糖苷，25-30℃培养4-6天至蓝色空斑形成，挑取兰色空斑，再次重复做空斑测定，分离重组病毒。c)将重组病毒用针刺，注射，口服方法接种家蚕幼虫和蛹。
2.如权利要求1所述带有目的基因的苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒的质粒为PAc 373，PBlue Bac，PAc 700当与家蚕核多角体病毒杂交重组并在家蚕幼虫及蛹中表达。
3.如权利要求1所述的转染缓冲液最佳PH为7.05，最佳培养温度为28℃。
全文摘要
本发明属于基因工程领域。是用家蚕幼虫和蛹表达外源基因的方法，采用带有外源目的基因的苜蓿银纹夜蛾Autographacalifornica核多角体病毒的质粒与家蚕Bombyxmori核多角体病毒共同感染家蚕离体培养细胞杂交重组获得表达，杂交重组的病毒再感染家蚕幼虫和蛹也得到表达。家蚕幼虫可以人工饲养，并且表达水平高于家蚕离体培养细胞的100倍以上，这种高效表达，具有重要的生产价值和经济意义，能形成基因工程产品产业。
文档编号C12N15/09GK1062170SQ90102998
公开日1992年6月24日 申请日期1990年12月7日 优先权日1990年12月7日
发明者巫爱珍, 孙玉昆 申请人:中国科学院上海生物工程实验基地筹备处