专利名称：具有制瘤素m活性的新的蛋白质及其制备方法
技术领域：
本发明是关于制瘤素M突变体和具有制瘤素M生物活性的类似物，包括缺失、取代、嵌入和加工突变体。本发明的制瘤素M突变体可用于引出制瘤素M诱导的生物反应，其程度高于或低于天然的制瘤素M。本发明借助于若干实施例加以说明，在这些实施例中制备了多种制瘤素M突变体并描述了它们的特征。
制瘤素M最初是由于它对于人的肿瘤细胞系的抑制作用而被鉴别出来，它最早是从佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)诱发的人的组织细胞淋巴瘤细胞(Zarling et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 839739-9743)以及从活化的T淋巴细胞(Brown et al.，1987，J.Immunol.1392977-2983)中分离出来。该分子是由单一多肽链Mr＝28000组成的、对热和酸稳定的蛋白质。象其它天然存在的生长调节剂一样，制瘤素M显示出多种生物活性。对于某些(不是全部)人的肿瘤细胞系，观察到生长抑制作用。与此相反，将某些正常的成纤维细胞如人的包皮纤维细胞或WI-38细胞暴露于制瘤素M，促进了这些细胞的生长(Zarling et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 839739-9743)。
制瘤素M的基因已被克隆和序列化，一种活化形式的重组体制瘤素M最近已被表达在哺乳动物细胞中(见1988年1月15日共同申请待批的美国专利申请No.144574，在此引证这一文献供部分地是建立在阐明基本的制瘤素M官能区域结构及下述发现的基础上某些基因突变不仅保留了而且在某些情况下显著地增强了生物活性。本发明通过一些实施例来加以说明，在这些实施例中，采用重组体DNA诱变和表达方法制备各种缺失、加工、嵌入和取代突变体制瘤素M多肽并描述它们的特征。
在一个具体实施方案中，制备了制瘤素M缺失突变体，其中，天然制瘤素的部分或全部C末端42氨基酸已被除去。在制瘤素M的结构(见附
图1)中，可以删除从(包括)处于186位的残基到(包括)227位的C末端的残基的任何氨基酸以获得生物活性的制瘤素M突变体。这些制瘤素M缺失突变体不仅保持了生物活性，而且有几种的活性还显著地高于天然制瘤素M。
在另一实施方案中，制备了制瘤素M取代突变体，其中天然制瘤素M的至少一个半胱氨酸残基不是被半胱氨酸而是被氨基酸(特别是丝氨酸)取代。本申请人对取代突变体所作的研究揭示出，在天然制瘤素M二级结构中存在的二个二硫键中，只有在半胱氨酸残基49和167之间的那一个对于制瘤素M生物活性是所需要的。因此，既然消除在6位和127位残基的半胱氨酸之间的二硫键不会使之丧失官能，那么，不能形成该二硫键的制瘤素M突变体仍然是生物活性和官能的生长调节多肽。如同下文的实施例更充分地描述的那样，通过取代参与该“非必要的”二硫键的任意一个或全部二个半胱氨酸残基可以制备这种生物活性的制瘤素M取代突变体。此外，在80位的半胱氨酸残基也可以被取代而不牺牲生物活性。本发明的制瘤素M取代突变体在制备、配制成药物组合物、和/或影响所需要的生物反应的能力等方面优于天然制瘤素M。例如，这种制瘤素M取代突变体可以设参考)。成熟形式的制瘤素M是含有228种氨基酸的糖蛋白，其中有5种是半胱氨酸残基。这种蛋白质具有极端亲水的C末端区域结构。虽然从结构上说制瘤素M与其它已知的细胞素没有关系，但它的mRNA在其3′未转译端含有一个富有腺苷和尿苷的区域。在制瘤素M信息中的这一区域与许多细胞素、淋巴细胞活素以及其它生长调节分子的区域是同源的，这意味着一种共同的调节基因表达的方式。在许多种哺乳动物细胞上已发现了制瘤素M的细胞受体。主要的制瘤素M受体分子是Mr＝15000-16000的特定蛋白质(Linsley et al.，1989，J.Biol.Chem.2646528-6532)。
本发明是关于由制瘤素M的缺失、加工、嵌入和/或取代突变体构成的新的组合物及其衍生物和片断。本发明还涉及制瘤素M突变体在重组系统中的表达。此外，还提供了具有制瘤素M结合区的二级结构的组合物，所述结合区能够专门结合到制瘤素M受体上。制瘤素M突变体可按下述方法制备用包含为所要求的制瘤素M突变体多肽编码的DNA序列的表达病媒转化宿主细胞，培育上述转化的宿主细胞以表达外源DNA序列，从细胞溶解产物中或是从条件培养基中分离出所产生的制瘤素M突变体多肽。与天然的制瘤素M相比，这种制瘤素M突变体多肽可具有改变了的生物活性，特别是生长抑制活性。除其它用途外，本发明的组合物可特别用于调节瘤细胞增殖。
附图1是制瘤素M的氨基酸序列和官能区域的示意说明。氨基酸用标准的一个字母代码标示。
附图2说明C末端缺失的制瘤素M突变体的生长抑制活性。
附图3表明半胱氨酸至丝氨酸制瘤素M突变体的生长抑制活性。
本发明是关于保持制瘤素M生物活性的制瘤素M突变体。本发明计成使二硫键混乱和所产生的任何二级结构畸变的可能性减小到最低程度或将其完全消除。
本发明的上述及其它实施方案借助于下文中的实施例予以说明，这些实施例是本发明人对于本发明的制瘤素M突变体的制备和应用所作的研究和发现的典型代表。这些研究和发现的一个结果是，查明了为维持官能完整性而必须或应当保留的制瘤素M结构的各个方面，在制备本发明的制瘤素M突变体时应考虑到这些方面。在这方面，官能上重要的序列存在遍及于制瘤素M多肽中而不限于单一区域结构。例如，对缺失和嵌入诱变的扫描验明，氨基酸残基22-36和44-77是生物活性所必需的。另外，至186位的C末端残基缺失不会破坏生物活性，但缺少氨基酸185-182的突变体不具有活性。对于制瘤素M生长抑制活性和受体结合活性十分重要的其它序列包括残基118-121和178-181，这些序列对于制瘤素M和制瘤素M突变体的正确的加工和/或分泌来说可能是必不可少的，这是因为缺少这些序列的制瘤素M突变体是不能检测到的。与此类似，保留处在71位的天冬酰胺残基对于完全的生物活性和/或从哺乳动物细胞中分泌来说可能是非常必要的。将二个甘氨酸残基插入到三个预测的α螺旋区域结构中看来对生物活性没有明显的影响作用。甘氨酸残基预计以低的频率发生在α螺旋结构中，这意味着，附加的甘氨酸不破坏生物活性结构或者这种破坏处在可以容许的官能水平上。
强烈两亲的区域发生处于C167和R196处的肽分裂位置之间的制瘤素MC末端。用甘氨酸取代176位和184位的苯丙氨酸破坏活性，而用甘氨酸取代171位、174位和178位的组氨酸不影响生物官能。以甘氨酸取代苯丙氨酸所引起的活性丧失不可解释为完全是由于该区域的两亲特性的改变而引起的。假如该区域结构应具有螺旋结构，那么甘氨酸本身的取代可能破坏在这些位置的螺旋结构。
如同在某些(不是全部)C末端缺失突变体中N末端抗原决定部位的阻断所暗示的那样，C末端与N末端可能存在着紧密的物理联系。
本发明的制瘤素M突变体及其类似物可采用下述各种方法制备变换天然制瘤素M多肽本身、重组体DNA方法、或化学合成法例如固相肽合成。
根据本发明，提供了至少具有一种制瘤素M活性的新的DNA构成物和新的多肽组合物。其活性的绝对量可以高于或低于天然制瘤素M。具有制瘤素M活性的多肽包括至少基本上所有C末端区已被删除的制瘤素M的缺失突变体蛋白质，以及具有与天然制瘤素M的结合部位相同的三级结构的突变体蛋白质。包含有为所要求的具有制瘤素M活性的多肽编码的DNA序列的质粒构成物被用于转化宿主细胞，该宿主细胞被培养以表达所需要的多肽。然后，培育已转化的宿主细胞以表达插入的DNA序列。宿主细胞可以是真核细胞也可以是原核细胞。
人的制瘤素M具有下列氨基酸序列
这里使用的是氨基酸的一个字母的缩写，它们的含义如下A-丙氨酸、R-精氨酸、N-天冬酰胺、D-天冬氨酸、C-半胱氨酸、A-谷氨酰胺、E-谷氨酸、G-甘氨酸、H-组氨酸、I-异亮氨酸、L-亮氨酸、K-赖氨酸、M-甲硫氨酸、F-苯丙氨酸、P-脯氨酸、S-丝氨酸、T-苏氨酸、W-色氨酸、Y-酪氨酸、V-缬氨酸。
制瘤素M的另外的特征在于，分子量为32-36KD左右，这是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法在还原或非还原条件下测定的。分离的制瘤素M的活性制剂含有高甘露糖和复合的N连接低聚糖的组合物。但是，制瘤素M的未糖基化的制剂保持了细胞生长调节活性。
制瘤素M的特征还在于它对于某些细胞株的活性。制瘤素M促进正常的人的成纤维细胞的增殖(WI38和WI26细胞可作为例证)，抑制肿瘤细胞如A375、HBT10、A549和SK-MEL28的增殖，并且可以促进由正常骨髓生长为群体形成细胞。但是，它缺少抗下列细胞的胞毒活性WI26和WI38人体成纤维细胞、对肿瘤坏死因子敏感的小鼠L929细胞、以及γ干扰素敏感的人体肿瘤细胞系。制瘤素M不抑制正常人体T淋巴细胞的增殖，并且在最高达100GIA单位/毫升的浓度下不抑制由骨髓细胞向粒状细胞/髓细胞群体的形成。此外，在500GIA单位/毫升的浓度下，它也不抑制在混合的白细胞培养反应(MLC)中的人的增殖的或细胞毒性的T细胞反应。制瘤素M对于中等的酸和碱是稳定的，对于在56℃下热处理也是稳定的。
本发明的多肽包括许多组多肽，每组都具有一个共同的特征，其中，这些多肽的特征是至少具有制瘤素M的一种特性。这些组包括以下共同特征是制瘤素M或者具有与天然制瘤素M的结合区相同的二级结构的多肽的缺失突变体、加工突变体、或取代突变体。这些多肽还可以包含将许多取代、缺失、加工和/或嵌入突变结合起来的复合突变。本发明包括这样的制瘤素M类似物、突变体及其官能部分。本发明的多肽将至少具有一个生物活性的序列，该序列例如是免疫反应性的或者能够受体结合，这一序列就其生物特性来说堪与天然制瘤素M相匹敌。
下面是所使用的一些定义“缺失突变体”缺失全部或部分的制瘤素MC末端区;
“取代突变体”是制瘤素M突变体，其中，一种氨基酸已被另一种氨基酸所取代。特别有意义的是取代对于生物活性来说不必要的硫氢基基团。这些突变可包括半胱氨酸残基被另一种不带电的氨基酸例如丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸等所取代，这类氨基酸具有与半胱氨酸，特别是丝氨酸相似的荷电性能和空间填充特性;
“加工突变体”在这些突变体中，制瘤素M多肽中的蛋白水解的分裂位点已发生突变，从而使成熟多肽的加工被阻断。这一变化可能导致产生具有改变的生物活性的分子。这样的加工部位的例子包括氨基酸残基195和196;
“嵌入突变体”在这些突变体中，为氨基酸序列甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸编码的密码子被置入认为是为具有重要官能意义的氨基酸编码的DNA序列的区域中。具体例子包括置于5和6位氨基酸之间、76和77位的氨基酸之间、103和104位的氨基酸之间、以及139和140位的氨基酸之间的嵌入。
本发明的多肽还包括下述多肽，其中多肽的结合区的二级结构至少基本上与天然制瘤素M的结合区的二级结构相同。“结合区”指的是在天然制瘤素M的C末端的区域和在其N末端的区域，这些区通过二硫键C49-C167(见附图1)而彼此接近，分子的这部分可以特定地以高的亲和力结合到制瘤素M受体分子上。该结合区的特征是，在C末端区域中，特别是在含有氨基酸168-195的区域中具有两亲的螺旋结构。这里所说“两亲的螺旋结构”指的是在一端具有疏水的氨基酸残基而在另一端具有亲水的残基的区域。这种螺旋结构一般包含有约30%-50%、特别是约40%的疏水的氨基酸，例如缬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸等;约30%-50%、特别是约40%的亲水的氨基酸，例如酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸等;约10%-40%、特别是20%的至少基本上不具有疏水性或亲水性的氨基酸，例如丝氨酸、甘氨酸等。下述多肽也被包括在内，其中在C末端区中的多肽的一级结构可以在水溶液、特别是生理盐水溶液中保持一个二级结构，在上述溶液中，这一二级结构在相似的条件下至少基本上与天然制瘤素M的二级结构相类似。
多肽的氨基酸序列可以与天然制瘤素M的氨基酸序列相同或不同，通常情况下是相似的。在该结构是不同的情况下，可以按以下方式完成取代用一种疏水氨基酸取代另一种疏水氨基酸和/或用一种亲水氨基酸取代另一种亲水氨基酸，特别是取代具有类似的荷电性能和空间填充特性的氨基酸，从而至少基本上保持二级结构和制瘤素M受体特定的结合能力。结合到制瘤素M受体上的多肽的活性不一定与天然制瘤素M的活性相同，它可以部分地或整体地是制瘤素M的拮抗剂活性或拮抗物活性。
“生物活性”旨在包括细胞生长调节活性、与天然存在的人的制瘤素M的免疫学交叉反应性、或高亲和力制瘤素M受体结合。“细胞生长调节活性”指的是天然存在的制瘤素M的生物活性，它包括抑制瘤细胞生长，以及促进正常细胞生长，包括造血系统的细胞。这种细胞生长调节活性可以不同于天然存在的制瘤素M，通常有所降低。“生物活性序列”指构成直至全长多肽的氨基酸序列。“免疫学交叉反应性”的意思是由本发明的新的多肽诱发的抗体将特定地结合到完整的制瘤素M上，至少当制瘤素M处于天然状态时是这样;并且，结合到制瘤素M上的抗体将特别结合到新的肽上，在该肽中，制瘤素M和新的多肽有一个共同的抗原决定部位。
“制瘤素M受体”的意思是指一个以高的亲和力特定地结合制瘤素M的细胞表面上的结合部位，所述的结合是可饱和的并且不被结构上无关的多肽抑制。“类似物”指至少一种生物活性与制瘤素M相符合，并且含有基本上与制瘤素M的至少一部分氨基酸序列相等的氨基酸序列的化合物。类似物可以含有比天然制瘤素M多一些或少一些的氨基酸。
可以使用天然存在的或重组体制瘤素M作为起始材料制备各种制瘤素M突变体及类似物。制瘤素M可由天然来源、特别是由加入了适当的诱导物如巨大戟二萜醇或佛波醇的培养基中获得，并通过由人组织细胞淋巴瘤得到的细胞系(U937)(Sundstrom and Nilsson，1976，Int.J.Cancer 17565-577)或促细胞分裂剂如植物血球凝集素(PHA)进行调节，以及用正常的人外周血液淋巴细胞(PBL)进行调节。可以采用本专业中各种已知的纯化方法把制瘤素M突变体及类似物纯化，从而至少基本上不含细胞成分，上述纯化方法包括(但不限于)溶剂萃取法、凝胶渗透色谱法、反相HPLC法、电泳法等。制瘤素M的C末端的缺失型突变体可按下述方法得到全长制瘤素M的蛋白水解分裂，然后按每次至少一个氨基酸截断C末端，直至分子的所有C末端部分被从全长制瘤素M中删除掉。“C末端”指氨基酸186-227(见附图1)。
也可采用重组体DNA方法来制备制瘤素M的缺失型突变体、加工型突变体和取代型突变体。在分离制瘤素M时使用的方法在本专业领域中是已知的，它们包括合成、由基因组DNA中分离、由cDNA制备、或是它们的组合。各种DNA操作方法都是人们所熟知的，它们包括限制、消化、切除、结扎、活体外诱变、原始质修复、以及多重连接体(polylinkers)和接合体等，参见Maniatis et al.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York(1982)。一般地说，这种方法包括由合成制瘤素M的细胞例如组织细胞淋巴瘤细胞(U937)或PBL构成和筛选cDNA库。可以采用下述方法用探针检定编码mRNA的制瘤素M，或者检定制瘤素M的表达，然后用制瘤素M的抗体进行筛选以检测交叉反应的肽片段等。
一旦鉴别出含制瘤素M编码序列的cDNA，就可用几种方法来完成在结构基因中所需要的诱发变异。这些诱发变异可能包括上文中所述的缺失、嵌入、它们的组合，以及取代。这些变化，例如缺失，可能涉及C末端区、特别是编码氨基酸186至C末端的区域。
缺失可以采用多种本专业技术人员已知的方法来完成，包括酶切全长制瘤素McDNA、然后变换和结扎纯化的片断，或者通过定位突变、特别是Kramer等人所述的环出型(loop-out)突变(见Kramer et al.，Nucl.Acids Res.(1984)129441-9456)。
对于本发明的目的来说，可将各种不同的氨基酸分成许多小类脂族的中性的非极性的 GAPVLI极性的 STCMNQ酸性的 DE碱性的 KR芳族的 FHYW“保守取代”的意思是，来自同一小类(例如中性脂族的、酸性脂族的、碱性脂族的或芳族的)、特别是具有相同极性的氨基酸彼此相互取代。比较理想的情况是，2-4个碳原子或5～6个碳原子的氨基酸定义脂族小类中的单体定组。
将一个多肽片断结合到大的免疫原多肽载体上，以提供免疫原性，用该方法可以制备较高分子量的多肽。这样的蛋白质载体的例子有牛血清清蛋白、钥孔 血蓝蛋白(KLH)等。这些结合多肽可用于在适当的宿主生物中诱发抗体。该抗体可用来测定在体液中是否存在制瘤素M和/或它在体液中的浓度，它的存在可进一步用作检测肿瘤细胞存在的手段，上述抗体还可用以结合到制瘤素M上、从而调整其活性，此外，上述抗体还可用于纯化制瘤素M，例如用在亲合型交换柱(affinity column)中。这样得到的基因随后可用多种本技术领域中已知的方法进行操作以提供表达。既可以用真核宿主，也可以用原核宿主。这些宿主包括细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞，例如大肠杆菌、COS细胞、CHO细胞、猴肾细胞、以及家蚕细胞(sf9)。因此，在该基因要被表达在识别制瘤素M的野生型转录的和转译的调节区的宿主中的情况下，可将带有野生型5′-和3′-调节区的完整基因引入适当的表达病媒中。有各种各样的表达病媒，这些病媒使用来自哺乳动物病毒的复制系统，所述病毒例如有猿猴病毒40、腺病毒、牛乳头状病毒、牛痘病毒、昆虫杆状病毒等。研制出这些复制系统是为了提供供转染子的选择用的标记物以及提供可将基因植入其中的便利的限制部位。
如果要在不能识别天然存在的野生型转录的和转译的调节区的宿主中表达该基因，那么需要进一步的操作。已经知道多种3′-转录调节区，可以将它们插入终止密码子的下游。结构基因上游的非编码5′-区可采用核酸内切酶限制法、Bal31切除术等予以去除。作为替代方法，在便利的限制位点存在于结构基因的5′-末端附近的情况下，可以限制该结构基因并使用结合体将该结构基因连接到启动子区上，在该区中，结合体提供了结构基因的失去的核苷酸。
可以采用各种不同策略来提供表达暗盒，该暗盒在转录的5′-3′-方向上有一个转录调节区和一个转译起始区，该暗盒还可包含供诱发调节作用的调节序列、在起始区的转录和转译控制下的结构基因、以及转译和转录的终止区。这一表达暗盒可以附加含有来自提供表达产物稳定性的噬菌体或细菌基因的前导序列、提供表达产物的分泌物的分泌前导序列、以及标记基因。
起始区和终止区在宿主细胞中是官能的，它们可以是同种异体(由原始宿主得到的)或者是异种的(由外部来源得到的)或合成的DNA序列。因此，该表达暗盒可以全部地或部分地由天然来源得到，以及全部地或部分地由与宿主细胞同种异体的或异种的来源得到。本发明的各种DNA构成物(DNA序列、病媒、质粒、表达暗盒)经过了分离和/或纯化、或者被合成，因而不是“天然存在的”。
业已发现，对于最佳的基因表达来说，在动物细胞中转译起始密码子ATG周围的核苷酸序列是至关重要的。例如，Kozak广泛地研究这些区对多肽(例如胰岛素)在COS细胞中表达的影响(见Kozak，Microbiol.Reviews(1983)471-45)。因此，可能有必要修改起始密码子周围的核苷酸序列。这可以通过定位诱变或者通过使外源基因融合到高度表达的基因的起始区上来实现。
用于示例说明的转录调节区或启动子包括对于细菌-β-gal启动子、λ左启动子和右启动子、trp和lac启动子、trp-lac融合启动子等;对于酵母-糖解酶启动子如ADH-Ⅰ和ADH-Ⅱ启动子、GPK启动子、以及PGI启动子、TRP启动子;对于哺乳细胞-SV40早启动子和迟启动子、腺病毒主迟启动子等。
在转录调节区附带包含有一些调节序列，这些调节序列使结构基因的表达可通过在培养基中含有或不含营养素或表达产物、温度等加以调节的情况下，该调节序列可以含有噬菌体λPL启动子以及噬菌体λOL操纵基因和CI857温度敏感阻遏物，以提供该结构基因的温度敏感的表达。启动子的调节是通过在阻遏物和操纵基因之间的相互作用而实现的。
在真核细胞中，调节序列可以包括例如细胞巨化病毒强化因子序列，后者可以被融合到一个启动子序列如SV40启动子上、形成嵌合体的启动子，或者被插入到表达暗盒中的其它地方、最好是就在紧靠启动子序列的地方。结构基因的表达也可以被放大，例如，将显性可放大遗传标记物5′或3′的基因串联绑扎到结构基因上，然后在选定条件下培养该宿主细胞。可放大基因的一个例子是二氢叶酸还原酶(dhfr)的基因，在变成抗氨甲蝶呤(mtx)-一种叶酸盐拮抗物-的细胞中该基因的表达可以被增大。
特别有意义的是能表达下述制瘤素M的表达暗盒，它使用lac操纵基因-启动子、tac启动子、或λPL启动子-OL操纵基因、以及温度敏感的阻遏物，特别是与λ-Cro、lac或N基因核糖体结合部位结合在一起。结构基因被结合到该核糖体结合部位的下游，从而处于转录调节区和转译调节区的调节控制之下。这在美国专利申请No.264098(申请日1988年10月28日)中已有描述，引证这篇文献仅供参考。
通过提供含N末端氨基酸的融合蛋白质的合成可以获得表达产物的稳定性，所述N末端氨基酸来自例如噬菌体λN基因或Cro基因、或者细菌碱性磷酸酶基因。前导序列在译读密码的上游或内部带有结构基因。有意义的前导序列包括来自原核基因的从约8-约35、特别是从约15-约25N末端氨基酸，所述原核基因例如是噬菌体λN基因或Cro基因、或者细菌碱性磷酸酶(见美国专利申请No.264098，申请日1988年10月28日)。
此外，通过给为分泌前导和加工信号编码的结构基因提供一个5′-序列，可以制备融合的基因。用于示例说明的分泌前导包括下述的分泌先导青霉素酶、α-因子、免疫球蛋白、T细胞受体、外膜蛋白质、血清清蛋白、胰岛素、消化道酶、β转化生长因子等。通过在带有结构基因的分泌先导的适当的译读密码中融合，成熟制瘤素M或类似物可以被分泌到培养基中。例如，参见美国专利申请No.144574(申请日1988年1月15日)，引证该文献仅供参考。
至少一个附加的氨基酸可以被插入到结构基因和前导序列之间，插入的氨基酸为融合蛋白质分裂提供了例如供酶的或化学的分裂部位。作为一种替代方案，含前导序列和结构基因产物的融合蛋白质可以不经过成熟多肽的分裂就使用。
表达暗盒可以被包含在一个用于适当的细胞宿主中保持游离基团的复制系统中，或者不带有复制系统，在这里它可被汇集成宿主基因组。可以按照已知的方法将DNA引入到宿主中，例如转化、用磷酸钙沉淀的DNA转染、electroporation、用重组体病毒转染、向细胞中微量注射DNA等。
一旦结构基因被引入适当的宿主中，就可以培养宿主来表达结构基因。该宿主细胞在适当的培养基中可培养到高密度。在启动子是可以诱导的情况下，例如在原核系统中，那么将使用许可的条件，例如温度范围、代谢产物或营养素的耗尽或过剩等。在可放大的基因与结构基因串联使用的哺乳动物系统中，可以使用适宜的放大手段。
在提供分泌物的情况下，可用常规方法从培养基中分离出融合的或未融合的表达产物。在没有提供分泌物的情况下，可按常规方法收集宿主细胞并将其溶解。然后用已知方法如色谱法、电泳法、溶剂萃取法等分离并提纯所需要的产物。
重组体产物可以是糖基化的或未糖基化的，包括野生型或其它糖基化作用。这种糖基化作用与野生型糖基化作用的差别不超过约50%，通常是不超过约20%。糖基化的量部分地取决于具体的肽的序列以及在其中产生的它的生物。这种产物在大肠杆菌细胞中的表达将导致未糖基化的产物，与该产物在哺乳动物细胞中的表达相比，它在昆虫细胞中的表达一般将产生较少的糖基化作用。
5.1.制瘤素M突变体和类似物的用途制瘤素M突变体和类似物多肽以及它们的组合物可以用来制造抗体，这些抗体可以在活体内或在活体外使用。这些抗体可按常规方法制备，使用本发明的多肽作为免疫原，将该多肽注射到哺乳动物宿主(如小鼠、牛、山羊、绵羊、兔等)中，最好是与佐剂一起注射，例如完全弗罗因德氏佐剂、氢氧化铝凝胶等。然后吸除宿主，将血液用于分离多克隆抗体，如果宿主是小鼠，则可以用外周血淋巴细胞或脾淋巴细胞(B细胞)与适当的骨髓细胞融合，从而使专用于本发明化合物的抗体的单克隆表达的染色体不灭。可以制备单克隆抗体，也可以制备多克隆抗体。
制瘤素M突变体、类似物及它们的组合物可用作供检测制瘤素M受体存在与否的配体。用这种方法，可根据制瘤素M受体的存在及其密度来辨别细胞，从而检测各种化合物对这些受体的存在的影响以及测定给定的细胞对于特定制瘤素M突变体或类似物的影响的敏感程度。另外，据认为有类似制瘤素M生物活性的肽可按下述方法进行评定，即将它们结合到制瘤素M受体上的能力与天然存在的制瘤素M的相应能力作比较。一般地，所试验的肽可按下述方式进行评定将试验的肽与经过标记的制瘤素M或以高亲和力结合到制瘤素M受体上的另一种肽或含制瘤素M受体的制剂一起保温，观察被标记的制瘤素M的结合的抑制量，这一方法在下文中的实施例中有详尽描述。然后，按下文中实施例中所述，通过观察它们对与制瘤素M有关的生物官能(如抑制肿瘤细胞生长)的影响，可以确定结合到受体上的试验肽是制瘤素M拮抗剂还是拮抗物。
制瘤素M突变体、类似物及它们的组合物可用来治疗多种肿瘤病，例如癌、肉瘤、黑瘤、淋巴瘤、白血病，它们可影响到许多器官，如血液、肺、乳房、前列腺、肠、肝、心脏、皮肤、胰腺、大脑等。它们可以通过注射(病灶内、腹膜、或皮下注射)或通过任何其它适当的给药方法体内给药。可以采用任何生理上可以接受的载体如杀菌水、磷酸盐缓冲盐水、盐水、含水乙醇等进行给药。本发明的化合物可以在活体外使用，用于消除供自体骨髓移植用的骨髓中的恶性细胞，或者用于在重新输入之前抑制其它组织(如血液)中恶性细胞增殖乃至将其消除。此外，这些组合物还可用作制瘤素M诱发的卡波济氏肉瘤的生长促进活性的拮抗物，或者用来促进DNA在ICS细胞中的复制，使它们变得对化疗药物更敏感。
制瘤素M突变体、类似物及它们的组合物还可用于治疗造血系统的疾病，特别是在具有受抑制的骨髓官能的病人，例如患有再生障碍性贫血、先天或后天免疫缺损的病人或正在进行放疗或化疗的病人中作为促进造血的一种措施。
制瘤素M突变体、类似物及它们的组合物可用于治疗各种损伤，包括几乎全部皮肤损伤、角膜损伤以及人体的衬有皮膜的空腔器官的损伤。适于治疗的损伤包括由于外伤如烧伤、擦伤、刀伤等所致的损伤以及由于外科手术如手术刀口和皮肤移植所致的损伤。适合于用本发明的组合物治疗的其它病理状况包括慢性病，如慢性溃疡、糖尿病溃疡、以及其它非治愈(营养的)的病理状态。本发明的化合物可掺入到生理上可以允许的载体中，涂敷到损伤的表面上。载体的性质可以在宽的范围内变动，并且取决于所要涂敷的部位。对于涂敷到皮肤上来说，通常优先选用乳剂和软膏载体，适用的载体包括羊毛脂、磺胺嘧啶银(Marion)(专用于治疗烧伤)、Aguaphor(Duke实验室生产，地址South Norwalk，Connecticut)等。如果需要的话，可将制瘤素M类似物或突变体组合物加到绷带或其它的创伤包扎用品中，以使创伤部位持续地暴露于肽的作用下。此外，还可以采用气溶胶涂敷。
在治疗组合物中，多肽的浓度不是关键的。多肽的用量可为上皮细胞增殖诱导量。该组合物可局部地用于感染区，一般对眼睛为滴眼药，对皮肤为乳剂、膏剂或洗剂。就眼睛而言，希望频繁治疗，通常给药的间隔为4小时或更短。对皮肤而言，在治疗过程中，希望在感染区连续地保留有治疗组合物，治疗组合物的给药为每天二至四次或者更频繁。
可用各种方法配制所说组合物，包括在脂质体腔中配制，尤其是当脂质体连接到以特定肿瘤细胞为靶器官的导向分子(例如抗体、非降解颗粒状基质等)上时更是如此。在配方中还可加入的其它组分为缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、生物杀伤剂等。在文献中有大量有关这类组分的例子，在此不需详细叙述。
在下述实施例中获得的结果表明，某些突变制瘤素M多肽类保留有生物活性，并在某些情况下具有增强的生物活性。含有这些突变体的组合物既可在活体内又可在活体外用于细胞增殖的调节中，比如在培养、白细胞提取及在活体内的预防和治疗中的应用等等。一种特定用途涉及使用生物活性的制瘤素M突变体多肽类，通过抑制在骨髓中肿瘤细胞的生长并同时促进菌落细胞的生成来处理细胞，以达到自体骨髓的移植。另一种特定用途涉及使用制瘤素M突变体来促进上皮细胞的生长，从而促进伤口愈合。此外，可把突变体多肽类用作免疫原以诱导抗体生成。诱导的抗体可用于滴定体内流体中存在的制瘤素M的含量和/或通过与因子结合来调节因子的活性。
虽然以实例方式对本发明进行了颇为详细的描述，但是本领域的普通技术人员清楚地懂得，在不偏离所附权利要求的精神和范围的情况下，可进行某些变化和改进。所提供的下述实施例只是为了进行解释而不是为了限定。
6.实施例制瘤素M突变体的表达和鉴定6.1材料和方法6.1.1细胞培养在Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中添加10%胎儿牛血清(FBS)来培养A375黑素瘤、H2981和COS细胞。
6.1.2.生长抑制分析用染料结合分析法测定生长抑制活性(GIA)。在96个井式微量滴定盘内，在含有10%胎儿牛血清(FBS)的体积为0.1毫升的DMEM中接种A375黑素瘤细胞(3-4×103)。加入体积为0.1毫升的各种浓度的制瘤素M，并在37℃下连续培养72小时。除去培养基，用结晶紫将细胞染色，并通过在微滴定盘读数器(Genetic Systems Corp.，Seattle，WA)上用590纳米处的吸光度测定所结合的染料来对细胞的相对增殖定量。把在制瘤素M存在下的细胞增殖与未处理样品的细胞增殖进行比较，并以对最大生长的抑制百分数来表示。对样品以一式两份或一式三份进行分析。制瘤素M的GIA单位从抑制曲线上确定，并定义为在标准分析中抑制50%A375细胞的生长所需要的蛋白质的量。当以GIA单位对蛋白质浓度校正时，校正值的误差系数一般＜20%。
6.1.3.放射性受体测定在用制瘤素M处理之前16-24小时，把H2981细胞在48个井式塑料盘中按1-3×105/厘米2的密度进行接种。可用125I-制瘤素M(20纳克/毫升，0.7纳摩尔)在逐渐增加制瘤素M或突变制瘤素M含量的条件下在体积为0.1毫升的接合缓冲剂(Linsley et al.，1986，Biochemistry 252978-2986)中培养单层。接合反应在23℃下进行2-4小时。非特定接合在过量50倍至100倍的未标记制瘤素M存在下测定。从总接合中减去在过量未标记制瘤素M存在下接合的放射活性来计算特定的接合百分数，该数值一般为总接合的70%-95%。重复测定的误差一般小于10%。可从按逐渐增加未标记制瘤素M的量的条件下所获得的抑制曲线上测定放射性受体测定单位(RRA单位)。一个RRA单位可定义为在标准分析中125I-制瘤素M的接合达50%抑制所需要的制瘤素M的量。
以GIA或RRA(单位/毫克)计算的比活性值在不同实验间的误差高达两倍。在一次实验内，比活性误差范围为15%至30%，这大部分是由于对在培养基中免疫活性蛋白质进行定量时产生的误差造成的。相对比活性值表示突变体的比活性相对于重组体“野生型”制瘤素M的比活性的百分数。按均方根计算，所获的相对比活性的误差系数的范围为22%至45%。相对比活性值小于10%重组体“野生型”制瘤素M的突变体M被认为是失去了生物活性。
6.1.4.放射免疫测定把无血清培养基在DMEM中稀释，加入二硫苏糖醇使浓度达10毫摩尔，并经煮沸使蛋白质改性。这种处理增加了随后的制瘤素M的免疫活性。然后把处理的培养基的逐次稀释物经一狭缝印迹装置(Millipore)涂在硝化纤维薄膜上。然后对薄膜进行免疫印迹测定。如在(Linsley et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82356-360)中所描述的那样，其中使用抗6-19抗血清(下面第6.1.5节)和125I-蛋白质A进行检测。使用以假性转染细胞在无血清培养基中稀释的纯化制瘤素M来绘制标准曲线。使用扫描密度分析法来测量放射自显影图上的谱带强度，存在于转染细胞培养基中的制瘤素M的量可通过与标准曲线比较而定量。在大多数情况下，按标准曲线的线性部分的谱带强度来测定培养基中几种稀释物的制瘤素M的含量，然后取其平均值;这些测量的误差系数一般＜10%。
6.1.5.抗血清用固相技术合成相应于氨基酸6-19和206-218的制瘤素M(图1)的肽类。把肽类连接到牛的免疫球蛋白(肽6-19)或钥孔
血蓝蛋白(肽206-218)上，并按(Gentry et al.，1987，Mol.Cell.Biol.73418-3427;Linsley et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82356-360)描述的方法使兔子免疫。对于抗6-19，使用来自两只免疫兔子的血清的1∶1混合物。
6.1.6.COS细胞的转染如在(Malik，et al.，1989，Mol.Cell.Biol.92847-2853)中描述的那样，用制瘤素M突变体编码质粒对COS细胞进行转染。转染之后24小时，加入无血清培养基，并将细胞在37℃下再培养48小时。收集并测定经调整的培养基。
6.2.表达质粒的制作在Malik，et al.，1989 Mol.Cell.Biol.92847-2853中描述了制瘤素M cDNA表达质粒(即pSPOM)。在Linsley et al.，1989，J.Biol.Chem.2644282-89中描述了一种表达质粒，其中用制瘤素M信号序列编码的序列被用猴TGF-β1信号肽(这里指Pβ-OM)编码的序列取代。
6.2.1.缺失突变体结构通过用终止密码子和克隆位置编码的3′低聚核苷酸原始质的PCR放大作用来建立制瘤素M缺失突变体(终止密码子嵌入突变体)△182-227、△183-227、△184-227、△186-227、△187-227、△188-227、△189-227、△190-227、△195-227和△196-227。通过来自制瘤素M编码区的3′末端的有限核酸外切酶浸取(Henikoff，1984 Gene 28351-359)来建立突变体△191和△185。简单地说，把制瘤素McDNA亚克隆成质粒pSP64(Promega)，并在靠近cDNA的3′末端线性化，以及用核酸外切酶Ⅲ进行有限浸取。然后用DNA聚合酶I的Klenow片断削去浸取出的cDNA的3′末端。最后，把截头cDNA从在加固HindⅢ位置37基5′处的pSP64至转移开始位置切开，并用合成低聚核苷酸连接体TAGGTGAATGATCAC和TCGAGTGATCATTCACCTA克隆成Hind Ⅲ-Xhol解离的πH3MPY(Stamenkovic，1989，EMBO J.)，所说连接体为终止密码子在每一阅读框架中编码并具有一附加在Xho Ⅰ限制位置之上的上悬末端。用DNA序列分析来识别具有在位置183和190(△183-227和△190-227)上引入的终止密码子的各个克隆上。其它缺失突变体可用类似方法制备。
使用环出缺失方法(Kramer et al.，supra)可建立几种另外的制瘤素M缺失突变体(△44-47、△87-90、△118-121、△152-155和△178-181)。突变体结构被亚克隆到pH3MPY的HindⅢ-Xho Ⅰ位置上，用限制分析来筛选并以整个编码区排序来验证。
6.2.2.处理突变体结构使用商品幼兽(Amersham)借助控制低聚核苷酸的诱变剂来建立突变体克隆G195和G196。合成可以引起在位置195或196上的精氨酸残基向甘氨酸转化的非匹配的低聚核苷酸类，并按供应商的说明用于建立突变体克隆。用DNA序列分析证实克隆G195和G196的突变区的序列。
突变体克隆G195用改变低聚核苷酸产生突变的步骤来建立。在有缺口的M13噬菌体DNA再聚合并络合之后，使用Tac聚合酶链式反应(Perkin Elmer Cetus)并用M13普通正向和逆向原始质来放大制瘤素McDNA。然后把放大的cDNA亚克隆到HindⅢ-Xho Ⅰ解离的pH3MPY上，并用有限分析和/或DNA程序化识别突变体克隆。然后用序列分析来证实突变编码区。G195的序列分析结果表明，由于在产生突变时引入的二次突变，制瘤素M的仲氨酸(氨基丙酸)已变为缬氨酸。采用首先进行反向色谱步骤并随后按粒度分级分离这两个步骤组成的两步程序，进行两次操作来纯化G196。
6.2.3.取代突变体结构采用上面第6.2.2.节中所述的低聚核苷酸诱变剂来建立突变体克隆，S5、S49、S80、S127、S167和S6/S167。合成可诱导在6、49、80、127、167和6+167位置上的半胱氨酸转化的非匹配低聚核苷酸，并将其用于建立突变体克隆。突变体结构被亚克隆到pH3MPY的HindⅢ-Xho Ⅰ位置上。用DNA序列分析证实所获克隆的突变编码区。
6.2.4.嵌入突变体结构采用在上面第6.2.2.节中所述的低聚核苷酸活体外诱变剂来建立突变体克隆GAG6、GAG77、GAG14和GAG140。突变体结构被亚克隆到PH3PY的HindⅢ-XhoⅠ位置上。用DNA序列分析证实突变的编码区。
6.3.制瘤素M突变体的生物活性6.3.1.缺失和加工突变体用免疫印迹分析法对被处理突变体G195和G196(上面第6.2.2.节)和缺失突变体△195和△190(上面第6.2.1.节)编码的质粒所转染的COS细胞无血清培养基进行分析。
用被这些突变体编码结构感染的细胞制备能与抗6-19血清反应的蛋白质。用G195和G196制备的免疫活性蛋白质与来自pSPOM转染细胞(下面第7节)的Mr36，000蛋白质一起迁移，而用△195和△190制备的蛋白质迁移到离Mr32，000蛋白质更近的地方。当把抗208-219血清用于分析时，观察到来自G195和G196转染的细胞的Mr36，000形式，但用△195和△190制备的蛋白质没有发生反应。从而，在推定的处理位置上引入点突变防止了Mr32，000形式的积聚，同时就在该位置上游的缺失突变防止了Mr36，000形式的制瘤素M的积聚。这些结果表明，Mr36，000和Mr32，000形式的制瘤素M的差别是由于从位置193处开始的胰蛋白酶状的位置上或靠近该位置处的分解蛋白处理过程引起的。
把抗加工突变体形式的制瘤素M(G195和G196)的生物活性与一种和Mr32，000形式的制瘤素M(△190和△182)在粒度上几乎相同的突变蛋白质的生物活性进行对比。对于该实验，如第6.1.2.节和第6.1.3节所描述的那样，测定来自转染细胞的未处理无血清调整的培养基的GIA和RRA的活性。用在第6.1.4.节中所描述的放射免疫测定法来确定制瘤素M的浓度。如表Ⅰ所示，对△190和△195来说，它们的GIA活性对RRA活性之比值要比G195和G196的相应活性比值高10-20倍。来自被突变体△182转染的细胞的培养基在任一分析中均没有给出有意义的活性，这一事实表明，来自残基182-190的C-末端区对生长抑制活性和接合活性均是关键的。来自pSPOM(下面第7节)转染细胞的培养基具有中等活性比率，这与存在于该样品中具有不同活性的两种形式的制瘤素M是一致的。这些观察结果表明，突变体未加工形式的制瘤素M(G195和G196)具有比截头Mr32，000形式(△182和△190)更小的GIA活性。
表Ⅰ制瘤素M的突变体形式具有不同的相对生长抑制活性和接合活性样品 GIA活性1RRA活性1比率2pSPOM 11.7(27.2) 2.6(6.1) 4.5△195-227 61.7(74.3) 3.2(3.8) 19.5△190-227 20.0(21.7) 0.9(1.0) 22.5△182-227 0.02(0.06) ＜0.02(＜0.06) N/AG196 6.6(8.0) 11.2(13.5) 0.6G195 5.0(8.8) 5.3(9.3) 0.9如实施例1所示，测定来自以所示质粒转染的COS细胞的未处理无血清培养基所具有的生长抑制活性(GIA)和放射性受体活性(RRA)。如实施例1所示，用放射免疫测定法来确定制瘤素M的浓度，测得的浓度范围为0.4-1微克/毫升。N/A不适用。
1单位/毫升(×103);括号中的数字表示比活性。
2GIA活性与RRA活性的比率。
为了证实G196突变体的降低的GIA活性，将该蛋白质纯化到均匀程度并与来自pSPOM转染细胞(下面第7节)的Mr32，000形式的制瘤素M进行比较。纯化的Mr32，000形式的制瘤素M比G196具有更高的GIA活性(最大活性的半值分别在6和130pM处)。在三个独立的实验中，在这些纯化的蛋白质之间的生长抑制活性的差别为9倍、22倍和5倍(平均±标准偏差(12±9倍))。与此相反，这两种纯化的蛋白质的RRA活性是难以区分的(最大活性的半值大约在100pM处)。就RRA而言，三个独立的实验结果表明，G196的RRA活性约相当于Mr32，000形式的制瘤素M的RRA活性的1.1，1.1和2倍(1.3±0.3倍)。因此，纯化的G196(Mr36，000形式)与Mr32，000形式一样好地接合到制瘤素M受体上，但前者具有较小的GIA活性。
制瘤素M缺失突变体的生长抑制活性的比较示于图2。△181、△182和△183具有很小的生长抑制活性(＜1单位/纳克)。相对于原生制瘤素M而言，在△195-227、△190-227、△188-227和△187-227制瘤素M突变体中观察到升高了的生长抑制活性。相对于原生制瘤素M(～8单位/纳克)，突变体△187-227具有最高的活性(＞14单位/纳克)。因此，除去大部分C-末端区可增加制瘤素M的生长抑制活性。
表Ⅱ给出了几种制瘤素M缺失突变体的相对生长抑制比活性和受体接合比活性。这些数据证实，除去大部分C-末端区可增加制瘤素M的生长抑制活性。
表Ⅱ由C-末端的突变所产生的相对生长抑制活性和受体接合活性相对比活性(%)突变体 GIA RRA n△196-227 171 73△191-227 90±30 26±13 3△190-227 99 68△189-227 197±57 42±1 2△188-227 135 54△187-227 66±31 21±5 2△186-227 60±30 20±4 2△185-227 17 2△184-227 2 ＜1△183-227 ＜2 ＜1 2△182-227 ＜3 ＜1 2对来自被所示制瘤素M突变体转染的COS细胞的无血清培养基的生长抑制活性(GIA)和放射性受体活性(RRA)进行测定。用定量免疫印迹法确定制瘤素M的浓度，所获浓度的范围为0.2-1.0微克/毫升。这些数据示出了突变体相对于在同一试验中测试的野生型重组体制瘤素M的比活性的百分数，并用突变体的比活性/野生型制瘤素M的比活性X100来计算。实验次数用“n”表示。
6.3.2.取代突变体测试以上面6.2.3.节中所述的方法制备的突变体克隆的生长抑制活性。图3中所示的结果表明，在位置49和167处的关胱氨酸类对生物活性是关键的，这是因为所有缺少这些残基(S49、S167和S6/167)的突变体的生物活性很小或者没有。取代突变体S6、S80和S127的生物活性等于或大于原生制瘤素M的活性，这些结果表明，在位置6、80和127处的半胱氨酸类对制瘤素M的GIA不是关键的。事实上，把位置80上的半胱氨酸改变为丝氨酸会使生物活性发生数值较小但意义较大的增加。
6.3.3.包含氨基酸的缺失和嵌入的制瘤素M突变分别按节6.2.1.节和第6.2.4.节中描述的方法来制备扫描用的缺失和嵌入突变体，并测试它们的生长抑制活性和放射性受体活性(表Ⅲ)。缺失突变体△22-36和△44-47失去了所有GIA和RRA活性，而突变体△87-90却具有比野生型制瘤素M更大的相对比活性。缺失突变体△152-155具有中等的相对比活性。在氨基酸位置5和6、103和104、以及139和140之间嵌入Gly-Ala-Gly对生物活性不会产生任何有意义的损失。当在氨基酸位置76和77之间嵌入Gly-Ala-Gly序列时，GIA和RRA相对比活性大大地降低了，从氨基酸位置75开始为推断N连接糖基化的识别序列。
表Ⅲ由扫描缺失和嵌入突变产生的相对生长抑制比活性和受体接合比活性相对比活性(%)突变体 GIA RRA△22-36 ＜1 ＜5△44-47 ＜1 ＜3△87-90 320 260△152-155 39 48GAG6 58 37GAG77 8 24GAG104 125 196GAG140 79 40对来自以所说制瘤素M突变体结构(包括那些以标有“△”的数字表示的残基的缺失，以及Gly-Ala-Gly残基在所示位置上的嵌入皆以“GAG”表示)转染的COS细胞的无血清培养基的生长抑制活性(GIA)和放射性受体活性(RRA)进行测试。用定量免疫印迹法确定制瘤素M的浓度，其范围为0.14至1.8微克/毫升。数值表示突变体相对于在同一试验中测试的野生型重组体制瘤素M的比活性的百分数，并用突变体的比活性/野生型制瘤素M的比活性×100来计算。
7.实施例在COS细胞中制瘤素M的表达产生两种分子形式7.1.COS转染如(Malik，et al.，1989 Mol.Cell.Biol.92847-2853)所述，把COS细胞以pSPOM或pβOM转染。转染后24小时，加入无血清培养基并把细胞在37℃下再培养48小时。收集调节的培养基，并立即测定或加入乙酸酸化使其达到1N，接着将其浓缩以用于提纯。来自以pSPOM转染的细胞的培养基含有两种蛋白质(Mr36，000和Mr32，000)，这两种蛋白质在免疫方面与用u937细胞制备的原生制瘤素M有关但粒度不相等。当COS细胞以由制瘤素M编码的结构转染时，也观察到与上述相同的蛋白质，所说的制瘤素M具有被来自猴TGF-β1(pβOM)N-末端氨基酸的信号肽所取代的信号序列，而所说的氨基酸决定了与原生制瘤素M相同的N-末端序列的Mr36，000和Mr32，000的编序，这一事实表明这些蛋白质的差别不是N-末端序列不均匀性的结果。
7.2.Mr32，000形式的制瘤素M的提纯基本上用上面(Linsley，et al.，and Malik，et al.，)描述的方法，从以pSPOM转染的COS细胞的酸化并且浓缩的无血清培养基中来提纯Mr32，000形式的制瘤素M。从按粒度分级分离的培养基中收集生长抑制活性的峰值级分并用反相色谱法进行最终提纯。所获制剂主要含有Mr32，000形式的制瘤素M。在某些试验中，从能产生过量重组体制瘤素M(Oncogen;Seattle，WA)的CHO细胞的无血清培养基中，以相同的方法来制备在放射性免疫测定法中用作125I放射性标记的或用于标准曲线的制瘤素M。从这种提纯的原料得到的制瘤素M没有显示出对于抗206-218抗血清的免疫反应活性，并且具有与来自COS细胞的Mr32，000形式的制瘤素M相同的性质。
7.3.Mr36，000形式把来自与pSPOM转染细胞的Mr36，000形式的制瘤素M用三步骤程序进行部分地提纯。在一个于40%乙腈、0.1%三氟乙酸中操作的TSK3000SW交换柱上把无血清培养基酸化并按粒度分级分离。采用抗6-9血清的免疫印迹分析法来识别主要地含有Mr36，000形式的制瘤素M的级分，之后收集、浓缩并在同一交换柱上再处理。收集含有免疫化学纯的Mr36，000形式(即具有不能检测出Mr36，000的形式)的级分并用于后续实验中。用氨基酸分析法确定提纯的蛋白质的浓度，氨基酸分析由Dr.Gary Hathaway(Biotechnology Instrumentation Center，University of California，Riverside)完成。
7.4.电泳使用Laemmli体系(Laemmli，U.K.，Nature(1970)227680-685)进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶的电泳(SDS-PAGE)。使用带有5%丙烯酰胺积层凝胶的线性丙烯酰胺梯度凝胶。样品在还原气氛下进行试验。把凝胶用银试剂(BioRAD)或考马斯蓝染色、脱色并加以干燥后再进行照相。按照与前面Malik，et al.，所描述的标准比较的方法来计算不同形式的制瘤素M的表观分子量。
7.5.Mr36，000制瘤素M的胰蛋白酶处理把Mr36，000形式的制瘤素M按粒度分离法来部分地提纯并用反相色谱法进行一步提纯。所得制剂纯度用SDS-PAGE判断为～80%。把含有～150纳克制瘤素M(用RRA估计)的等分试样在37℃下用6纳克TPCK处理过的胰蛋白酶(Worthington)在30微升50毫摩尔Tris乙酸盐中于pH7.9下处理。样品在37℃下培养的时间不断增加，加入浓的电泳样品缓冲剂来使反应终止，并使用抗6-19血清的免疫印迹法来识别不同形式的制瘤素M。
7.6.低聚糖类的除去推断的制瘤素M先质序列含有两个可能的N-连接糖基化位置。为了确定在这些位置上不同的糖基化是否是由于Mr36，000和Mr32，000形式的制瘤素M的不同造成的，因此用酶N-聚糖酶处理存在于来自pSPOM转染的COS细胞的无血清调整的培养基中的蛋白质并且分析特定位置的抗血清与制瘤素M(抗6-19)的免疫反应活性，所说酶N-聚糖酶已除去N-连接低聚糖类。经过这种处理后，Mr36，000和Mr32，000形式的制瘤素M的迁移率均增加了，结果产生了新物种Mr～34，000和Mr30，000。两种片段的迁移率由于从每一种形式的制瘤素M中除去一个N-连接低聚糖基团(Mr～2，000)而增加。由于两种形式的迁移率同步增加，因此不同的N-连接糖基化不大可能是由于这些片段的粒度不同而造成的。
7.7.定位的抗血清表明Mr36，000和Mr32，000形式的制瘤素M具有不同的C-末端水疗法分析(Keski-Oji，J.et al.，J.Cell.Biochem.Suppl.(1987)11A60)表明制瘤素M的C-末端(氨基酸～190-227)是强亲水性的。在这一区域，碱式氨基酸类(R、K或H)含有38个残基中的24个63%)，有五对能表示可能的分解蛋白解离位置的二元残基。为了证实C-末端不均匀性是否是由于Mr36，000和Mr32，000形式之间的不同造成的，抗血清被培养成相应于成熟制瘤素M的N-末端(上述的Malik，et al.，and Zarling，J.M.et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.839739-9743)和由cDNA序列推断的C-末端之间的区域的肽类。然后把这些抗血清用于由pSPOM转染细胞和原生U937细胞所衍生的制瘤素M的无血清调整的培养基免疫印迹试验中。虽然抗6-19血清既能与来自pSPOM转染细胞的Mr36，000和Mr32，000形式反应，又能与来自U937细胞的Mr28，000原生制瘤素M反应，但是抗206-218血清只能与Mr36，000形式的制瘤素M反应。两种抗血清的特性均用同族肽类抑制其反应活性的能力来表示。这些结果表明，Mr36，000和Mr32，000形式的制瘤素M之间的不同至少部分地是由于C-末端的不均匀性造成的，而C-末端的不均匀性主要地是由于亲水性C-末端区内分解蛋白加工所引起的。
7.8.以限制蛋白水解作用来使Mr36，000形式的制瘤素M向Mr32，000形式转化为了证实Mr36，000形式的制瘤素M的蛋白水解处理会产生Mr32，000形式，使Mr36，000形式的部分提纯的制剂进行有限的蛋白水解。反应产物用抗6-19血清检测。随着受胰蛋白酶作用的时间不断增加，就会观察到Mr36，000形式的制瘤素M的量逐渐减小，而Mr32，000形式的量相应地增加。在测试的最长时间点，可观察到Mr32，000形式的量减少并观察到另外的低分子量的免疫反应活性产物。因为Mr32，000产物与N-末端特定抗血清反应，所以它就表示已在C-末端加工过的制瘤素M。这一事实表明，在靠近Mr36，000形式的制瘤素M的C-末端的蛋白水解作用会产生一种与pSPOM转染细胞制备的Mr32，000形式在粒度上相似的形式的制瘤素M。
7.9.制瘤素M(32K和36K形式)的生长抑制活性把来自pSPOM转染细胞的无血清调整的培养基在BioGel P60上用色谱法进行分级分离。然后测试各个级分在A375黑素瘤的细胞上的GIA活性和与抗6-19的免疫反应活性。GIA活性的峰值级分在级分35和级分40之间洗脱，它远远地处于A280吸附物质的主体之后。在该试验中不能确定GIA活性的精确的峰值级分，这是因为峰值级分所含的活性要高于在稀释的试验中所能精确测定的活性。
免疫印迹分析表明，Mr32，000形式的制瘤素M与含有GIA活性的主体的级分一起洗脱下来。可是，Mr36，000形式在GIA活性的主峰之前(级分33上的峰)已洗脱下来几个级分。由于含有Mr36，000形式的级分染色更强烈，但是它比Mr32，000形式具有较低的GIA活性，因此Mr36，000形式的GIA比活性看来比Mr32，000形式的要小。
为了对Mr32，000和Mr36，000形式的生物活性进行定量比较，收集主要含有一种形式或另一种形式的按粒度分级分离的级分并比较其GIA和RRA活性。对于这种测定，使用了一种不同的柱子(TSK3000SW)，它能给出与BioGel P60相类似的定性结果，但它能使Mr36，000与Mr32，000形式获得更好的分离。用免疫印迹法分析收集的级分以便证实没有与其它形式的制瘤素M发生交叉污染。按照SDS-PAGE的染色凝胶分析表明，每种形式的制瘤素M的纯度对Mr36，000形式大约为20%，对Mr32，000形式大约为80%。如表Ⅳ所示，部分地提纯的Mr36，000形式与Mr32，000形式相比，前者的GIA活性较小，但其RRA活性却较大。这一差别是明显的，Mr32，000形式的这些活性约相当于Mr36，000形式的这些活性的10倍。
表Ⅳ样品 GIA活性1RRA活性1比率236K形式 104 43.5 2.432K形式 345 17.9 19.2收集含有Mr36，000或Mr32，000形式的级分，并测试等分试样的生长抑制活性(GIA)和放射性受体活性(RRA)。
1单位/毫升(×10-3)2GIA活性与RRA活性的比率。
权利要求
1.一种基本上含有下列氨基酸序列的制瘤素M突变体，其中从位置186(包括该位置)的残基到位置227(包括该位置)的羧基未端残基的氨基酸缺失1020 30A-A-I-G-S-C-S-K-E-Y-R-V-L-L-G-Q-C-K-Q-T-D-L-M-Q-D-T-S-R-L-40 50L-D-P-Y-I-R-I-Q-G-L-D-V-P-K-E-R-E-H-C-R-E-R-P-G-A-F-P-S-E-60 70 80E-T-L-R-G-L-G-R-R-G-F-L-Q-T-L-N-A-T-L-G-C-V-L-H-R-L-A-D-L-E90 100 110-Q-R-L-P-K-A-Q-D-L-E-R-S-G-L-N-I-E-D-L-E-K-L-Q-M-A-R-P-N-I120 130 140-L-G-L-R-N-N-I-Y-C-M-A-Q-L-L-D-N-S-D-T-A-E-P-T-K-A-G-R-G-A-150 160 170-S-Q-P-P-T-P-T-P-A-S-D-A-F-Q-R-K-L-E-G-C-R-F-L-H-G-Y-H-R-F180 190 200-M-H-S-V-G-R-V-F-S-K-W-G-E-S-P-N-R-S-R-R-H-S-P-H-Q-A-L-R-K210 220 227-G-V-R-R-T-R-P-S-R-K-G-K-R-L-M-T-R-G-Q-L-P-R
2.权利要求1的制瘤素M突变体，其中氨基酸186至227缺失。
3.权利要求1的制瘤素M突变体，其中氨基酸196至227缺失。
4.权利要求1的制瘤素M突变体，其中氨基酸189至227缺失。
5.权利要求1的制瘤素M突变体，其中氨基酸188至227缺失。
6.一种基本上含有下列氨基酸序列的制瘤素M突变体，其中在位置6、80和127上的任何氨基酸被一种除了半胱氨酸之外的氨基酸所取代
7.权利要求6的制瘤素M突变体，其中被取代的氨基酸为丝氨酸。
8.一种基本上含有下列氨基酸序列的制瘤素M突变体，其中氨基酸87至90缺失
9.一种基本上含有下列氨基酸序列的制瘤素M突变体，其中氨基酸152至155缺失
10.一种基本上含有下列氨基酸序列的制瘤素M突变体，其中在位置195和196上的任何氨基酸被一种除了精氨酸之外的氨基酸所取代
11.权利要求10的制瘤素M突变体，其中被取代的氨基酸为甘氨酸。
12.一种基本上含有下列氨基酸序列的制瘤素M突变体，其中氨基酸序列GAG插入在氨基酸103和104之间
全文摘要
本发明涉及细胞生长调节因子制瘤素M的生物突变形式。本发明的制瘤素M突变体包括缺失、取氏和嵌入突变体并可用重组体DNA、活体外导致突变和不均匀的表达技术来制备。制瘤素M突变体可用于引发制瘤素M生物响应，并因此可找到多种治疗用途，包括在肿瘤治疗方面的用途，但并不限于这种用途。
文档编号C12N15/00GK1055389SQ9011012
公开日1991年10月16日 申请日期1990年12月8日 优先权日1989年12月8日
发明者彼得·S·林斯利, 杰弗里·C·卡利斯塔德 申请人:翁科根公司