专利名称：由酶促反应制备的二聚il-2以及用于制备该il-2的源于神经的转谷氨酰胺酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种源于神经的新的转谷氨酰胺酶(下文中命名为TGN)以及由哺乳动物酶促产生的二聚白细胞介素-2(IL-2)，该二聚IL-2对少突神经胶质细胞有细胞毒性。本发明进一步涉及所述酶TGn以及所述具有少突神经胶质细胞细胞毒素活性的二聚IL-2的制备，以及两者用于诱导和促进哺乳动物神经再生的用途。
哺乳动物中枢神经系统(CNS)的已成熟神经在轴突损伤后极少显示有再生能力。受损的轴突可以自动生长，但在生长几百微米还没有横越受伤位点以及延伸至远侧的残余部分即已停止。这种再生障碍归因于神经周围环境的不接受特性，包括星型细胞(瘢痕形成细胞)没有能力支持生长，巨噬细胞和/或其产物的缺乏，以及抑制轴突生长的成熟少突神经胶质细胞的形成。
近来，我们证明在自发再生系统如成熟鱼视神经中，对损失的应答以及再生过程都与一种因子或几种因子的存在相关联，我们将它称为少突神经胶质细胞胞毒因子(OCF)，该因子选择性地对鱼和大鼠的少突神经胶质细胞有毒(公开的欧洲申请EP No.415321;Cohen等人，1990;Sivron等人，1991)。后来我们对该源于鱼的因子进行鉴别，其为一种类似于IL-2的分子，其分子量为28KDa，而人免疫IL-2的分子量为15KDa，源于鱼淋巴细胞的IL-2分子量为14KDa(公开的欧洲申请EP No.501445;Eitan等人，1992)。OCF和IL-2之间分子量的差异产生了有关该因子来源的问题，即，或者它是由存在于神经中的细胞或从炎症细胞产生的原位修饰的IL-2，或者是与编码免疫IL-2的基因不同但与其具有高度同源性的基因的产物。
根据本发明现已发现，鉴别为转谷氨酰胺酶族的一个成员并且发现其在鱼而不是哺乳动物的受损伤后视神经中含量增高的一种酶在可能是通过将两个分子交联而修饰IL-2的方法中起作用，在该修饰方法中产生了在受损伤鱼视神经中观察到的类似于IL-2的高分子量物质。本文中称之为TGN的该源于神经的新的转谷氨酰胺酶。引起IL-2的二聚化作用。从而使之对少突神经胶质细胞有胞毒性。
本发明涉及显示出少突神经胶质细胞胞毒活性的可由酶促产生的二聚IL-2。本发明进一步提供了从哺乳动物IL-2直接酶促制备具有少突神经胶质细胞胞毒活性的二聚IL-2的手段和方法。
由于在由受损伤鱼视神经限制的培养基中早期可检测少突视神经胶质细胞毒性因子和IL-2类似物，而在完整鱼视神经限制的培养基中没有检测到(EP415321和EP501445)，因而在受损伤鱼视神经中探究IL-2原位加工以及修饰为具有少突神经胶质细胞胞毒活性的二聚体形式的原理。
本发明发现了可从受损伤鱼视神经中获得转谷氨酰胺酶族的一种酶。该源于神经的转谷氨酰胺酶(TGN)将哺乳动物IL-2转化为具有少突神经胶质细胞胞毒活性的二聚IL-2。
因此本发明进一步涉及TGN酶，该酶是水溶性的，由十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和银染色分析测定该酶分子量为约55KDa，并且在受损伤的鱼视神经中检测到该酶的含量比在完整鱼视神经中酶含量增高。用抗一种多肽的抗体将受损伤的鱼视神经的条件培养基亲和层析可以纯化TGN。其中所说的一种多肽与转谷氨酰胺酶的保存完好的活性抗原决定基位点相对应。
本发明进一步涉及由哺乳动物包括人，酶促制备具有少突神经胶质细胞胞毒活性的二聚IL-2的方法，该方法包括将哺乳动物，包括人的IL-2与本发明的TGN酶一起保温。
在本发明中用作为TGN酶底物的单体IL-2包括任何种类的天然和重组IL-2，优选的是哺乳动物IL-2，最优选的是人IL-2，并且可采用常规技术，如采用Robb等人的方法(1983)制备。该单体物质优选用重组DNA技术，例如由Taniguchi et al.，1983，或Devos，R.，1983方法制备。根据本发明优选使用重组人和鼠IL-2。
如前面所述，最先由EP No.415321公开的从鱼视神经中得到的少突神经胶质细胞胞毒因子，后来也从再生鱼视神经的条件培养基(本文中的再生性鱼限制性培养基)中纯化到，并且由下列步骤证实它是一种IL-2类似分子(EP No.501445)(ⅰ)抗IL-2的抗体中和了再生性鱼限制性培养基中的少突神经胶质细胞胞毒活性;(ⅱ)Western印变分析显示在再生性鱼限制性培养基中存在一条28KDa的IL-2免疫反应谱带;(ⅲ)利用抗IL-2抗体进行亲和层析从再生性鱼限制性培养基中纯化该因子;以及(ⅳ)重组鼠IL-2体外对少突神经胶质细胞有选择性细胞毒性作用，但对星形细胞无毒。少突神经胶质细胞胞毒因子可能相当于本发明的二聚IL-2。
可由本发明酶促生产的哺乳动物二聚IL-2有下列特性(ⅰ)它是水溶性的;
(ⅱ)它是IL-2的共价二聚体;
(ⅲ)它对少突神经胶质细胞系有选择性毒性，面对其他细胞如Ⅰ-型星形细胞和成纤维细胞无毒。
(ⅳ)其对少突神经胶质细胞的细胞毒性可由抗IL-2的抗体进行中和;
(ⅴ)通过用源于神经的转谷氨酰胺酶一起保温可从哺乳动物IL-2中获得该物质;
(ⅵ)其分子量约为Vestern印迹分析测得的底物哺乳动物IL-2的分子量的两倍。
在优选的实施例中，本发明酶促制备的哺乳动物二聚IL-2是具有分子量约30KDa的人二聚IL-2。
本发明的源于神经的转谷氨酰胺TGN具有下列特性(ⅰ)它是水溶性的;
(ⅱ)它可从再生性鱼视神经中获得;
(ⅲ)它将免疫IL-2转化为具有少突神经胶质细胞毒性的二聚IL-2;
(ⅳ)由SDS-PAGE和银染色法测得其分子量约为55KDa;
(ⅴ)在受伤鱼视神经中检测到该酶含量比在完整鱼视神经中含量更高;
(ⅵ)在转谷氨酰胺酶族的检定特征中表明它将腐胺结合到载体蛋白上;
(ⅶ)其在pH9和56℃结合腐胺时具有最大活性;
(ⅷ)在结合腐胺时，以其与底物的函数计算得到它的Km值为5.5×10-7;
(ⅸ)对于IL-2二聚化过程该酶是Ca2+依赖性酶;以及(ⅹ)在用抗相应于转谷氨酰胺酶两个位点的肽的抗体进行的Western印迹分析中该酶显示一个免疫反应谱带，所说肽选自于相应于转谷氨酰胺酶的活性位点的14聚体序列Lys-Lys-Val-Lys-Tyr-Gly-Gln-Gys-Trp-Val-Phe-Ala-Gly-Val以及一个10聚体序列:
Asn-Ser-Lys-Leu-Thr-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys。
酶促生产的二聚IL-2以及本发明的源于神经的转谷氨酰胺酶TGN，单独一种或两者结合使用，可用作为药物组合物，以诱导和促进哺乳动物，包括人的中枢神经系统(CNS)的受损伤的神经的再生。在EP No.415321和EP No.501445中描述了这些组合物的制备。含有二聚IL-2或TGN酶或两者的组合物，通过选择性地除去通常成为哺乳动物CNS再生的障碍的少突神经胶质细胞，而在体内治疗受伤神经，从而促进轴突在其自身周围环境中生长。
图1显示再生性鱼视神经的条件培养基(CM)使人IL-2(hIL-2)二聚体化的能力。将CM试样与hIL-2保温过夜，将该混和物进行SDS-PAGE(12%丙烯酰胺)，然后用IL-2抗体进行Western吸印试验。用ECL(Amersham)观察免疫反应谱带。泳道1，在Ca2+存在下用hIL-2与CM一起保温;2，在没有Ca2+时将CM与hIL-2一起保温;3，在Ca2+存在时仅有CM;4，仅hIL-2。在同一凝胶上电泳分子量标记物，并标明其位置。
图2显示Western吸印分析结果，结果表明在再生性鱼视神经中存在55KDa的转谷氨酰胺酶免疫蛋白。在SDS-PAGE(10%丙烯酰胺)上电泳正常非损伤神经的高速离心上清液(HSS-N)，和再生视神经的高速离心上清液(HSS-C)以及CM。将印迹与抗转谷氨酰胺酶族保守14-氨基酸序列的抗体一起保温。用ECL(Amersham)观察。泳道1，CM;2，HSS-C;3，HSS-N。
图3描绘表示鱼视神经转谷氨酰胺(TGN)的逐步纯化过程的SDS-PAGE结果。泳道1，HSS;2，Elu-PLL(从PLL琼脂糖柱得到的洗脱液);3，Elu-TG Ab(从抗-转谷氨酰胺酶亲和柱得到的洗脱液)。
图4A-C说明TGN酶的生化特征。组A显示由TGN介导将腐胺结合至酪蛋白与pH的函数;组B显示由TGN介导的腐胺向酪蛋白上的结合与温度的函数;以及组C表示由Scatchard图表分析测定TGN的Km值。
图5显示纯化的TGN二聚化hIL-2。泳道1，纯化TGN与hIL-2一起保温;2，单独hIL-2;3，单独TGN。按图1描述进行该实验，所不同的是用纯化的TGN替代CM。所有保温过程都在5mM Ca2+存在下进行。
图6A-D显示在由TGN介导的二聚化后IL-2活性转为对少突神经胶质细胞有毒性。用仅含有TGN，用TGN预保温的hIL-2，或仅hIL-2的各种制剂处理富集少突神经胶质细胞的培养物。通过MTT[3-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物]比色分析估测胞毒活性(以存活细胞数表示)。组A表示在存在或不存在TGN时用10或100U/ml的hIL-2处理各种培养物在MTT染色后的定量分析(与630nm处的吸收值相对照的540nm处的吸收值)结果。组B仅用hIL-2(100U/ml)处理的培养物的显微照片;组C仅用TGN处理的培养物的显微照片;组D用hIL-2(100U/ml)和TGN(含有酶促生产的二聚hIL-2)的混和物处理的培养物的显微照片。
图7A-C描绘在TGN处理的受伤神经中功能活性的线状记录图。该图表示从用TGN处理的一种典型动物中获得的结果。按照本说明书描述在损伤前以及损伤后1和6周时记录视觉激发的潜在(VEP)应答(分别为组A，B和C)。注意损伤6周后(组C)，恢复情况由几个小峰表示，而所有小峰相对地向未受伤神经方向飘移。该值是从在每一时间点四次记录获得的平均值(实心线)±SE(灰线)。
图8A-C描绘了对照(缓冲液处理)受损神经的VEP应答线性图。如本说明书描述用缓冲液处理代表性动物(大鼠)并且在受伤前以及受伤后1和6周记录VEP应答(分别为组A，B和C)。数值为平均值(实心线)±SE(灰线)。
图9描绘了用PCR设计和构建人IL-2 cDNA产物。(A)用于构建人IL-2 cDNA产物的两组引物，包括增加的限制性位点(虚线框内)(Bp-pos是指在人淋巴细胞产生的IL-2 cDNA序列上引物的位置)。(B)用于制备两个不同单体IL-2 cDNA的复制产物的两组PCR反应。复制产物用于构建线性二聚IL-2。
图10描绘了缺陷型病毒载体扩增子(amplicon)质粒pCB。扩增粒子包括一个来自于pRB3119含有HSV1切割/包装信号(HSVa)的片段，一个含有DNA复制的HSV原点(HSV ori)的片段，以及一个来自于pcDNAlac含有CMV启动子，Lac Z基因，以及猿猴肾病毒40聚腺苷化信号[多聚(A)+信号]的片段。将这些序列插入到含有一个β-内酰胺酶基因(AmpR)以及一个细菌DNA复制原点(Col E1 ori)的氨苄青霉素抗性质粒pT7-3。该扩增粒子可作为用于放大反应的缺陷型病毒载体基因组的主要成分使用。
图11显示用鼠抗人IL-2单克隆抗体进行的线性IL-2二聚体的Western印迹分析。左面一组显示从感染非洲绿猴肾异倍体细胞(泳道1.3)收集的基质的两个稀释液(1∶3，泳道1，3，5，和1∶9，泳道2，4，6)。通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS/PAGE)分析感染的非洲绿猴肾异倍体细胞提取物(泳道2，4)以及从仅由缺陷型病毒感染的细胞中获得的基质及细胞提取物(分别为泳道5和6)。箭头指示每一轨道上的免疫反应谱带。右边组表示商品单体IL-2(泳道2)以及由源于神经的转谷氨酰胺酶合成的并用作为大小对照物的二聚IL-2(泳道1)。分子量标记物在同一凝胶上电泳，并标明其位置。
图12显示线性化二聚IL-2对少突神经胶质细胞没有毒性。利用从图11描述的等份样品的不同稀释液(右边组)检测由MTT比色法估测的针对少突神经胶质细胞的胞毒活性。将结果与平行实验(右边组)比较，平行实验中用来源于再生性视神经(CM)的可溶性物质处理少突神经胶质细胞，该再生性视神经中已鉴别出有胞毒IL-2类似因子，平行实验也可用酶促合成的人二聚IL-2处理。这两种处理都能引起成熟少突神经胶质细胞数量的显著降低(由ANOVA根据Fisher比较，分别为二聚IL-2，F＝7.833;CM，F＝104.976;P＝0.02以及P＝0.0001)。该试验设置三个重复，并重复进行三次。其结果以未处理的培养物值的平均值±SD表示，代表百分存活率。
图13显示线性化二聚IL-2引起CTLL-2细胞的增殖。采用胸腺嘧啶掺入法测定的对CTLL-2细胞的生物学活性可采用从图1中描述的样品(左边组)得到的试样进行检测。将其结果与平行试验(右边组)结果比较，该平行试验中用商品单体人IL-2处理CTLL-2细胞作为对照。该试验设置三个重复。结果用cpm表示。
根据本发明，已发现鉴定为转谷氨酰胺酶族一个成员的源于神经的55KDa酶在再生性鱼视神经中含量增大，并且与IL-2二聚化有关。二聚化形式在轴突受损伤后起着重要作用，其作用机理是改变一些因子的活性以便满足再生所需要的损伤诱导条件。例如，受伤后对少突神经胶质细胞的毒性对消除已知抑制轴突生长和延长的成熟少突神经胶质细胞有重要作用。因此，受伤后诱导的能够改变IL-2活性，从而增加其对少突神经胶质细胞的毒性的一种酶含量增加可能是解释本文观察到的结果的因素之一。
据报道转谷氨酰胺酶，是分布于许多组织的一个蛋白质族，与蛋白质的稳定化有关，从而增加了这些蛋白质对化学的，酶学的以及物理性降解的抗性。在血浆以及胞外体液中发现该族酶，并且在血凝块的纤维蛋白网络中，在细胞膜中以及胞外基质，角质化特征物(Greenberg et al.，1991)中都检测到由这些酶修饰的蛋白质。本发明的转谷氨酰胺酶TGN在神经受损伤的状态况下才可发现，并且首先是从神经系统中纯化的。利用抗保存完好的抗原决定基，即来自于其他组织和品种的已知转谷氨酰胺的活性位点的抗体进行亲和层析可以完成纯化过程。因而似乎源于鱼神经的转谷氨酰胺酶也具有这些保守序列，或至少一个接近同源的序列，由此可解释其作用于源于人的蛋白质即hIL-2的活性。在该阶段不能排除除活性位点以外的序列发生变异，并且这种变异可能为特定地发生于神经系统。但其他来源和种类的转谷氨酰胺酶也可以是有活性的，并且也包括在本发明范围之内。
到目前为止，用于防止少突神经胶质细胞抑制作用的最有效的方法包括使用特异于这些抑制剂的抗体(Schnell and Schwab，1990)。TGN的可获得性为通过将任何种类的重组IL-2与TGN酶一起保温而制备对所有物种的少突神经胶质细胞有毒性的因子开辟了一条途径。
哺乳动物可能并不缺乏IL-2本身，而是缺乏翻译后加工所需的酶。相当于少突神经胶质细胞毒性因子的酶促产生的二聚IL-2似乎是为了在受伤后从成熟神经中消除少突神经胶质细胞，从而使神经对轴突生长更有传导性而需要的活性形式。
因而，根据本发明，提供了证实下述原理的证据，即一种活性因子(IL-2)被转化为具有不同活性类型的形式(酶促产生的IL-2二聚体)。为了检验是二聚化蛋白质的结构在向活性因子的转变中起作用，还是二聚体的任何构型变化(例如线性化)起作用，我们构建了单纯性疱疹病毒(HSV1)的缺陷型病毒载体，该病毒可表达高水平的线性二聚化IL-2蛋白质。与酶促合成的二聚IL-2(其中通过转译后修饰将单体蛋白转化为二聚形式)相对而言，由此构建的线性二聚IL-2蛋白仅从转录水平上，因而是转译产物。使用该方法，即使缺陷型病毒本身遗留在细胞中并继续表达插入蛋白，我们也能获得在其合成后释放至培养基中的高含量线性二聚IL-2蛋白质。
线性IL-2二聚体的结构不同于酶促方法制备的IL-2二聚体的结构，因而可用于证明该蛋白质的胞毒特性是由于其结构变构引起的。由遗传工程技术制备的线性二聚IL-2保留了单体IL-2的生物学活性但没有显示由酶促二聚化IL-2产生的少突神经胶质细胞胞毒活性，从而说明IL-2转变为具有特定活性类型的二聚体形式的过程是结构依赖性的。
另外，在哺乳动物CNS的神经模切片中TGN～本身可在神经的自身环境中再生性生长从而使其功能恢复。尽管本文给出的例子是源于鱼视神经的转谷氨酰胺酶，但本发明也包括所有转谷氨酰胺酶，特别是源于神经的转谷氨酰胺酶。
现在通过下面的非限制性实施例描述本发明。
实施例1受伤鱼视神经的条件培养基能从分子量特性上改变IL-2由于少突神经胶质细胞毒性因子存在于由受伤鱼视神经限制的培养基中，因而发现少突神经胶质细胞毒性因子是一种分子量约28kd的IL-2类似分子，其细胞毒性可由抗IL-2抗体中和，然后检查受伤鱼神经是否携带可能是一种酶的物质，该物质能将低分子量的哺乳动物IL-2转变为IL-2的高分子量形式。检查再生性鱼视神经的限制性培养基中是否存在将外源添加的IL-2进行转译后修饰的作用机理。因此，在5mM Ca2+存在或不存在情况下，将人重组IL-2(hIL-2)与该限制性培养基(CM)一起保温，在抗IL-2的抗体的帮助下将得到的产品进行Western印迹分析。
为了上述目的，按照前面描述的Eitan等人，1992方法制备再生性鱼视神经的CM。简单地说，用0.05%3-氨基苯甲酸乙基酯(Sigma)将鲤鱼麻醉，用镊子压破右眼视神经(30秒)，6-7天后切下，并在无血清培养基中保温(在25℃1.5小时，300μl培养基中放置4个神经片段)。收集得到的培养基(CM)并采用Bradford方法测定其蛋白质浓度。
将6μg CM样液与hIL-2保温过夜，同时加5mM CaCl2缓慢振荡。将该混合物进行SDS-PAGE(12%丙烯酰胺)电泳。在200mA电流时将凝胶吸印至硝基纤维膜上，吸印过程2小时，用含有5%(重量/体积)牛奶的磷酸缓冲盐水(PBS)在4℃与该硝基纤维素膜保温过夜，然后在PBS中洗涤。将该印迹在37℃下与IL-2抗体一起保温2小时，然后在含有0.05%吐温-20的PBS中洗3次5分钟，最后在室温下用辣根过氧化酶(HRP)结合的山羊抗-兔IgG保温2小时。用ECL(Amersham)观察免疫反应带。
结果显示于图1中，其中泳道1，在Ca2+存在下用hIL-2和CM一起保温;泳道2，在不存在Ca2+时用hIL-2与CM一起保温;泳道3，只在Ca2+存在时的CM;泳道4，在没有Ca2+时仅有hIL-2。分子量标准的在同一凝胶上电泳，并标明其位置。在仅含有hIL-2的轨道上，存在一条15KDa的免疫反应带。在用CM保温后，检测到具有分子量为原始IL-2化合物分子量两倍的另一条IL-2免疫反应谱带。这些结果增加了再生性神经具有使IL-2二聚化的机理的可能性。当从保温混合物中删除Ca2+时没有观察到高分子量的IL-2免疫反应带(图1，泳道2)。表明二聚化过程是由Ca2+依赖性的酶介导的。
实施例2 受伤后鱼视神经中转谷氨酰胺酶免疫活性增高基于上述结果，我们认为存在下列可能性具有修饰IL-2作用的因子是一种在损伤后选择性增加的酶，并且该酶的作用是使IL-2分子实现二聚化。据认为转谷氨酰胺酶是一种可能的候选物，因为已知该酶是与蛋白质多联有关(Greenberg et al.，1991);而且有人提出在再生性鱼视神经中有迹象表明转谷氨酰胺酶活性增高(Chakrabarty et al.，1987)。
在兔中诱导出抗每一种结合至牛血清白蛋白上的10和14氨基酸合成肽的抗转谷氨酰胺酶抗体。肽序列Asn-Ser-Lys-Leu-Thr-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys,或Lys-Lys-Val-Lys-Tyr-Gly-Gln-Gys-Trp-Val-Phe-Ala-Gly-Val相应于其他物种或组织的转谷氨酰胺酶已知序列。14聚体肽代表转谷氨酰胺酶的活性位点。
Western吸印试验分析证实在再生性鱼视神经中存在一条55KDa转谷氨酰胺酶免疫反应带。按实施例1所述吸印凝胶。在SDS-PAGE(10%丙烯酰胺)电泳CM(20μg)以及再生性视神经的高速离心上清液(HSS-C;16μg)和正常未受伤神经的高速离心上清液(HSS-N;20μg)。用抗上述保守性14聚体肽的抗体在室温下与该印迹一起培养2小时，然后在含0.05%吐温20的PBS中洗三次5分钟。最后，用HRP-结合的山羊抗兔抗体与印迹一起在37℃培养2小时。用ECL(Amersham)观察印迹。
结果显示于图2中，其中泳道1，CM;2，HSS-C;3，HSS-N。在CM和HSS中观察到55KDa免疫反应带。光密度分析结果显示55KDa免疫反应带在HSS-C中强度比在HSS-N中高3倍。
实施例3 鱼视神经转谷氨酰胺酶的纯化为了验证上述观察到的IL-2的修饰作用是由于该转谷氨酰胺酶免疫反应蛋白的作用，按下列所述纯化该酶在压破损伤6-7天后切下鲤鱼(Cyprinus carpio)视神经(n＝60)并在含1.5mMCaCl2，1mM亚精胺，25μg/ml抑肽酶，25μg/ml亮肽素和5μg/ml胃酶抑素的10mM Tris-HCl，pH7.4的缓冲液中匀浆化。将蔗糖加至匀浆上使其终浓度在0.25M。在4℃以150，000g离心1小时后收集高速离心上清液(HSS)，并且由Bradford方法测定该蛋白质的含量。然后通过一个结合了多聚-L-赖氨酸(PLL)的琼脂糖亲和柱洗脱HSS，将得到的洗脱液(洗脱液PLL)加到另一个亲和纯化的兔抗体的亲和柱上，该抗体是按上面描述抗转谷氨酰胺酶的保守性14聚体肽制备的。用0.2M甘氨酸，pH2.7从柱上洗脱结合的物质，用1M Tris，pH8.0中和，并测定其蛋白质含量(洗脱物TG Ab)。纯化步骤概括于表1中。
表1鱼视神经转谷氨酰胺酶的纯化纯化步骤 产量/mg 纯化程度粗匀浆 14 1洗脱液PLL 1.8 7.8洗脱液TGAb 0.004 3500将从转谷氨酰胺酶亲和柱上洗脱的蛋白质加到10%SDS-PAGE上电泳以验证其纯度。图3是显示鱼视神经转谷氨酰胺酶(TGN)逐级纯化的SDS-PAGE结果。在每一步骤后，将得到的制剂进行SDS-PAGE电泳，并通过银染色法染色凝胶以观察所分析的蛋白质。泳道1，HSS;2，Elu-PLL;3，Elu-TG Ab。如图所示，在最后一个步骤纯化后获得一条55KDa单谱带。
也可以通过将再生性鱼视神经的限制性培养基加到结合了PLL的琼脂糖亲和柱上，然后将洗脱液加到另一个抗体亲和柱上并洗脱，如在上文中描述的用于匀浆纯化的方法，而纯化TG酶。
实施例4 由TG介导的腐胺与酪蛋白的结合将放射性腐胺结合到载体蛋白上是转谷氨酰胺酶族的一个检定特征。任何具有赖氨酸残基的载体蛋白都可用于该分析中，如酪蛋白，牛血清白蛋白等。
在该实施例中，通过将[14C]腐胺结合到N，N-二甲基酪蛋白(Chakrabarty et al.，1987)可检测源于神经的转谷氨酰胺酶的活性特征。在加到反应混和物中前，将在实施例3中用甘氨酸从TG-Ab亲和柱上洗脱的纯化TG酶在N，N-二甲基酪蛋白(1mg/ml)存在下透析2小时。通过加入粗制TGN(07-10ng)起始反应，然后在37℃保温20分钟，通过加入冰冷三氯乙酸(TCA;终浓度5%)终止反应。TGN比活性值是502000±115000([14C]腐胺/μg蛋白质;cpm)(n＝3，两种纯化，三次试验)。
滴定酶活性与温度，pH和底物浓度的关系分别显示于图4A和4B中，发现在pH为9左右并且在50℃时TGN有最大活性。根据滴定的活性与底物浓度函数计算Km值，并且发现其值为5.5×10-7M。通过检测TGN存在时[14C]腐胺与酪蛋白的结合完成滴定过程。
实施例5 纯化的鱼视神经转谷氨酰胺酶使人IL-2二聚化检测实施例3中纯化的酶使IL-2二聚化的能力。按实施例1中描述将人重组IL-2(hIL-2)保温，不同的是在该试验中使用纯化的TGN而不是粗制CM。分别将hIL-2或纯化TGN酶在相同缓冲液中单独保温以作为对照。所有保温过程都是在5mM Ca2+和0.3%加热失活的胎牛血清(FCS)存在下进行的。
在保温后，将混合物进行Western吸印分析。在SDS-PAGE(12%丙烯酰胺)上电泳分离后，吸印至硝化纤维素膜上，吸印是在200mA进行2小时。然后在PBS中洗涤硝化纤维素膜，首先在含有5%牛奶的PBS中4℃保温过夜，并且然后37℃下用抗人IL-2的兔抗体进一步培养2小时，接着在含有0.05%吐温-20的PBS中洗涤3次。在最后一次洗涤后，在室温下进一步用结合至辣根过氧化物酶的山羊抗-兔抗体(HRP-GaRb)培养1.5小时，接着用含有吐温-20的PBS洗3次，并在Western印迹检测试剂(ECL，Amersham)中保温1分钟，风干，曝光于胶片。结果显于图5中，其中泳道1，纯化TGN加hIL-2;2，单独hIL-2;3，单独TGN。
如图5所示，除原始的IL-2外，获得了一条30KD的高分子量IL-2免疫反应带。光密度检测分析结果显示在这些条件下有约25%的IL-2发生二聚化。
实施例6 酶促生产的二聚IL-2对少突神经胶质细胞的毒性为了确定二聚化作用的生物学意义，我们检测得到的二聚IL-2是否具有针对少突神经胶质细胞的毒性。用纯化的TGN酶与hIL-2(100U/ml或10U/ml浓度)一起保温。然后将混合物加到大鼠脑少突神经胶质细胞的富集培养物中。对照培养物由未处理的少突神经胶质细胞以及分别与100U/ml或10U/ml的hIL-2接触的少突神经胶质细胞以及与纯化酶接触的少突神经胶质细胞组成。
按照Bottenstein和Sato，1979描述的方法制备源于新生大鼠脑的富集少突神经胶质细胞培养物，并且接种于用PLL(20μg/μl)(Sigma)覆盖的滴定盘井眼中。72小时后，用含有单独TGN，用TGN预保温的hIL-2或单独hIL-2的各种制剂处理接种的细胞。用固定量的TGN与两种不同浓度，10U/ml和100U/ml的hIL-2一起保温。利用MTT比色法(Sigma)(T.Mosmann，1983，J.Immunol.Meth.6555-63)估测胞毒活性(以存活细胞数表示)。用各种制剂保温48小时后，将MTT(10μl，5mg/ml)加入保持3小时;然后除去培养基，并加入溶于异丙醇中的100μl的0.04M HCl。缓慢振荡细胞直至所有晶体溶解。记录相对于作为参照的630nm处吸收的540nm处的吸收值。
其结果显示于图6A-D中。显微照片表示在MTT染色后各种不同处理的培养物的情况。B，仅用hIL-2(100U/ml)处理培养物;C，仅用TGN处理的培养物;D，用hIL-2(100U/ml)和含酶促制备的二聚hIL-2的TGN的混和物处理培养物。如在图6所看到，只有用含有酶促产生的二聚IL-2的反应混和物处理的哪些少突神经胶质细胞培养物显示出细胞毒性。图5所示结果表明在含有二聚IL-2的反应混和物中，25%的IL-2是二聚化的，而其余都是单体形式。因此在100U/ml的单聚IL-2无毒性的条件下，似乎25U/ml二聚体形式的IL-2足以产生细胞毒性。
为了制备富集少突神经胶质细胞培养物，切下新生大鼠脑(2天龄)[在2ml Leibowitz培养基(L-15)中放2个脑;Gibco]并用溶于含1mM乙二胺四乙酸(EDTA)的DMEM(不含Ca2+和Mg2+)中的3×104U/ml胰蛋白酶(Sigma)化学离解。在用胰蛋白酶溶液在37℃培养10分钟之前进行机械离解。然后将细胞转移至15ml圆锥形试管中，该试管中含有1ml溶液的74U/mlDNA酶(Sigma)，5200U/ml黄豆胰蛋白酶(Sigma)以及3mg BSA，在室温下保温1分钟，加至10ml培养基，随后在DMEM中洗3次。在最后一次洗涤后，将细胞悬浮于含5-10%胎牛血清(FBS;Sigma，在56℃加热失活30分钟)的10ml DMEM中，流过网筛筛分后，接种于预先用20μg/ml多聚L-赖氨酸(PLL，MW 100000;Sigma)在37℃覆盖过夜的85mm2容量瓶(Nunc)中。在细胞接种后开始的二十四小时后更换一次培养基，然后每2-3天更换一次。在接种后第8天，振荡培养细胞4-6小时，移去上清液，剩下的细胞继续在10ml培养基(DMEM加5-10%PBS)中培养几小时，然后振荡培养过夜。收集通过振荡除去的细胞，并离心，将沉淀的细胞重新悬浮于1-2ml的无血清培养基中。将由此获得的用富集少突神经胶质细胞复原的细胞播种于预先用PLL(20μg/ml)覆盖的96-井平板上。细胞接种于100μl的限制培养基(Raff's修改为Bottenstein's和Sato's限制培养基)中。48-72小时后按上面所述处理种子细胞。
实施例7 TGN处理后能使横切的成熟大鼠视神经功能恢复将电极植入30头成离熟(12-14周龄)Sprague-Dawley(SPD)大鼠的视觉外皮层，以在受伤前和受伤后联机监测视觉通路的变化。将已麻醉的大鼠(Rumpon，Vetalar)置于小动物趋实体仪中，在暴露的颅骨上钻二个洞，使硬脑膜保持完整性以使外皮层损伤减至最小。钻在鼻骨上面的一个洞用作为参照点。第二个洞位于0C1区，即在坐标前囟点-8mm以及横坐标3mm处。电极是将金触点针(WirePro，Inc.)连接至螺杆上，将其旋在洞中并用丙烯酸粘结剂粘合至颅骨上。用频闪观察器刺激(氙闪烁管4W/秒，1-2毫秒持续时间，0.3Hz)激发，增强1000倍(AM系统，微电极Ac扩增器，1800型)并转换为数字(12位制，500个样本/秒)(National Instruments，Board MIO16-9 and Labview 2.2.1 Data Acquisition and Management System)先记录完整神经中的电势场，然后记录损伤后的电势场。在记录视觉激发的电势(VEP)应答期间，一直将另一侧眼睛挡住。在植入电极一周后，切开神经鞘而暴露出左眼视神经。在不损伤神经血管的情况下，借助于带有一个200um尖端以及一个光滑平齐边缘的特别设计的玻璃探针从眼球上解剖下2mm神经纤维。将神经全部横切下，借助于一个玻璃吸管将加或未加TGN(分别为TGN处理和对照)的2μl缓冲液注射到受伤位点。为了进行外科手续，处理以及记录，接着设计一套双盲方案。从实施例3的CM制备的TGN，经纯化后，用于该试验。
受伤一周后，在30只动物中有8只显示残留VEP活性，反映出可能模切不完整，从该试验收回这些动物，并将10只TGN处理的以及12只对照动物留下进行其余试验。受伤六周后，再记录留下的22只动物的VEP应答。用两个参数表示VEP应答特征第一个负峰值应答的等待期和幅度。在该联机试验中，由于1周时没有应答而留下接着试验的10只TGN处理的受伤神经动物中有7只显示其功能恢复(表2)。在1周后留下的12只对照动物中，在5周后未检测到功能恢复(表2)。
在大多数情况下用TG处理的受伤神经的活性峰值相对于未受伤神经而言似乎发生迁移，两种神经其活性峰在幅度和等待时间有显著差异(表3)。在TGN处理的受伤神经中峰值幅度比预期的更高，但总是比完整神经更小，这可能是由于分枝到原始靶(侧生漆状核)的空白位点或者是由于与激活应答有关的神经传递素的性质和数量的变化造成的。
图7A-C显示TGN处理的SPD大鼠受伤神经功能活性的联机记录的典型结果。在受伤前(组A)和受伤后1和6周(分别组B和C)记录VEP应答。受伤后一周，未检测到VEP应答。但是六周后，记录到阳性VEP活性。其峰值相对受伤前状态有转移，因此有更长的等待期和更小的幅度。图8A-C显示从对照动物(缓冲液处理)记录到的典型结果。该图显示在受伤前(组A)和受伤后1和6周(分别为组B和C)时在代表性动物中记录到的VEP应答活性。受伤6周后没有检测到VEP应答。
表2单个TGN处理的受伤动物和对照动物的VEP应答。在受伤6周后记录每一动物的VEP应答。该表表示第一个阴性峰值的等待期和幅度。所有这些动物显示在受伤1周后完全没有VEP活性。
处理 等待时间(毫秒) 幅度(μV)TGN0 0TGN56 28TGN0 0TGN78 44TGN57 46TGN0 0TGN51 24TGN53 38TGN57 42TGN79 27对照(n=12) 0 0
表3在TGN处理的受伤和完整神经中VEP应答的特征。该表显示第一次阴性活性峰的平均等待时间及幅度。ANOVA，仅提供一种因子分析结果。＊DF＝1，F＝34.018，P＝0.0001。＊＊DF＝1，F＝93.101，P＝0.0001。根据Fisher比较结果显示显著性为95%。
组等待时间(毫秒)*幅度**(μV) 动物数(平均值±SE) (平均值±SE)TGN处理的 61.6±4.5 35.6±3.4 7受伤神经完整神经 39.7±1.4 131.8±8.7 13该试验证明在进行假定能促使其在自身变性环境中生长的处理(Lavie et al.，1990)后被横切的成年哺乳动物CNS神经恢复功能。在其他研究中虽然CNS轴也在其自身环境中获得生长，但直到目前为止没有生理学功能恢复。因此，例如已报道的利用能产生抗哺乳动物髓鞘质相关抑制因子抗体的杂交瘤细胞能促进脊髓内的再生(Schnell and Schwab，1990)。同样，用胚胎星形胶质细胞包裹的微孔移植块能促进被压破的脊背神经根轴突生长至成年哺乳动物脊髓内的灰色物质(Rudge et al.，1990)。已经证明新生长出的哺乳动物轴突的生理学活性不是由于在神经自身环境内生长引起的，而是在由移植的外周神经桥替代神经的自身生长不适环境后产生的，这导致轴突沿移植块的长度生长，一直至脑。在靶CNS组织中已发现上丘苦杏仁酶但轴突仅穿过有限的距离(Kirstead et al.，1990;Aguayo et al.，1990a和1990b)。
在该试验中，在局部使用TGN酶后功能恢复，在自然再生神经系统受伤后该酶含量增高。从再生鱼视神经中分离到的该酶能在体外使IL-2二聚化，从而以这种方式改变其特性，使其对少突神经胶质细胞有毒性。在本试验中，以下面设想为依据体内能形成活性IL-2二聚体，以及通过在受伤后立即，至少在受伤位点的中间附近，酶促产生二聚IL-2而消除成熟少突神经胶质细胞从而能促进生长，但TGN酶的其他活性机制不应消除。基于这些设想，在体内使用TGN。
VEP应答是一种代表从视网膜至外皮层的视觉系统完整性的客观生理学参数。基于我们的发现，即在受伤1周后没有检测到VEP活性，但在5周后记录到显著活性，因而假定VEP应答是轴突生长并重接的结果是合理的。而且，在大多数TGN处理的神经中相对于完整神经其等待时间延长，进一步支持应答是新生长的(未髓鞘质化的)重新刺激靶组织的轴突引起的结论。
实施例8 制备线性二聚化IL-2通过使用一种病毒表达载体构建线性化二聚IL-2蛋白质，从而使其能在感染细胞的培养基中表达大量的线性IL-2二聚体。
在该实施例中，使用下列实验步骤。
8.1淋巴细胞和RNA制剂分离人淋巴细胞并刺激其产生最大量的IL-2mRNA。用60ml的肝素化的注射器收集外周静脉血，并用等体积的磷酸缓冲盐水(PBS)稀释。然后将该混和物铺在1.077g/ml Percoll溶液(49.2% Percoll，150mM NaCl)的上面，并在4℃以400xg离心25分钟。用一个巴斯德玻璃吸管收集富含淋巴细胞的棕黄色层，并用PBS洗二次。在1μg/ml花生植物血凝集素(PHASigma)存在下，将淋巴细胞以2×106个细胞/ml的浓度平铺于由RPMI-1640(Gibco)，2%热失活的胎牛血清(IFCS)，100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素(Sigma)，以及5×10-3M β-巯基乙醇组成的完全培养基上并培养3天。然后洗涤细胞并以2×106个细胞/ml的浓度平铺于新容量瓶中的完全培养基上，用1μg/ml PHA和10ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸盐13-乙酸盐(PMA)刺激3小时。借助于Biotec Laboratories药盒利用RNAzol B方法(Chomczynski and Sacchi，1987)分离总细胞RNA，并通过测定260/280nm吸收值而对其定量。
8.2 聚合酶链反应(PCR)和序列分析借助于Gene Amp药盒(Cetus，USA)完成PCR反应。将人淋巴细胞总RNA(1μg)与总反应体积为20μl～的PCR缓冲液(1×，终浓度)，5mM MgCl2，1U/μl RNA酶抑制剂，50pmol特定的下游引物以及各1mM的dNTP在42℃下进行逆转录酶反应15分钟。在加热失活逆转录酶后，通过加入50pmol下游引物，100pmol上游引物，PCR缓冲液(1×，终浓度)，2mM MgCl2溶液和2.5U taq DNA聚合酶将反应混和物调至100μl。第一轮PCR反应在45℃进行1分钟，在72℃进行1分钟，在94℃进行1分钟完成的。接着进行30轮反应，每轮在55℃进行30秒，72℃进行1分钟以及94℃进行1分钟。在30轮结束时增加了在72℃额外反应5分钟，以确保cDNA末端完全填满，由此促使用限制性酶正确地消化(如果反应起始于一个经扩增的DNA，30轮反应中每一轮持续地在94℃进行1分钟，72℃进行1.5分钟，从而消除了非特异性的扩增带)。将PCR产物连接到一个合适的经消化的模板KS-载体上。在65℃将连接的每一种DNA(10ng)加热5分钟，然后于室温下在10μl的总反应体积中将它与连接缓冲液(1X，终浓度;Stratagene)和5U的T4DNA连接酶(Stratagene)培养15分钟。连接反应是在15℃培养过夜完成的。克隆重组体(至Epicurian coli，稳定的感受态细胞;Stratagene)并在含氨苄青霉素的平板培养基上生长过夜。根据用于小批量DNA制剂的碱性方法定义阳性克隆(Sambrook et al.，1989)，接着进行限制酶分析，凝胶电泳。借助于测序酶盒(USB)利用Sanger双脱氧链终止技术对阳性克隆进行序列分析。
8.3 转染细胞，病毒载体的繁殖以及蛋白质提取在补充了10%IFCS，1%谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的Dulbecco's修改的伊格尔氏培养基(DMEM)中繁殖兔皮(RS)细胞和非洲绿猴肾(Vero)细胞。采用磷酸钙法(Graham and van der Eb，1973)，随后甘油休克(Parker and Stark，1979)方法用20μg的pCB-IL-2二聚体(下文中描述)转染RS细胞。通过对用10μg的pCB-IL-2二聚体和10μg的X-gal质粒DNA共转染的细胞中的细菌β-半乳糖苷酶的组织化学检测(Sanes et al.，1986)而得出的每个平板中的蓝细胞数/总细胞数值决定转染效率大约为10和20%范围。在37℃和5%CO2中培养过夜后，除去培养基，以0.1噬菌斑形成单位(pfu)/细胞的感染复数(moi)用温度敏感性HSV1(Graham and van der Eb，1973)tsk菌株(Davison et al.，1984)过量感染上述细胞。在31.5℃培养1.5小时后，用补充了1%IFCS的PBS洗涤细胞两次，在相同温度下在DMEM/1%IFCS/1%青霉素-链霉素/1%谷氨酰胺中培养。
当所有细胞显示出细胞病变效应，通常在超量感染2天后收集病毒原株。以1000g离心5分钟沉淀培养基中的完整细胞，将沉淀重新悬浮于1ml的病毒缓冲液(150mM NaCl/20mM Tris，pH7.5)。将悬浮液于-70℃快速冷冻并在37℃解冻(重复此过程三次)，然后用不同稀释度的缺陷型病毒感染非洲绿猴肾异倍体细胞。在37℃(tsk的非容许温度)培养过夜后，收集含有释放出的合成蛋白质的培养基并在10mM Tris，pH7.5，150 mM NaCl，1%Triton，1mM EDTA，1mM亚精胺以及蛋白质抑制剂(25μg/ml亮肽素和5μg/ml抑肽素)中4℃培养2小时而提取细胞，然后收集上清液。将得到的产物进行Western印迹分析(Eitan at al.，1992)以证实在培养基/感染细胞提取物中有IL-2二聚蛋白质表达。
8.4 通过PCR构建人IL-2cDNA将来源于人淋巴细胞的IL-2cDNA序列(Taniguchi et al.，1983)用一个引物设计者程序快速处理，该程序可以帮助选择用于PCR的最适引物。在平行试验中，将该序列用一个克隆管理者程序处理，该程序可以产生一个能使我们检测出不存在于IL-2基因中的限制性位点的限制性图谱。将这些位点加入到引物的末端。然后我们完成二个PCRs反应反应A产生一个含有所有被转译密码但在最后一个被转译密码子前立即终止的IL-2 cDNA复制本，因而该复制本DNA不含有终止密码子;反应B的产物起始于第一个被转译的密码子但在终止位点的外面结束，因此含有终止密码子。两组引物和PCR显示于图9中。在反应A的下游引物及反应B的上游引物上设计的限制性位点是相同的，因此通过将A和B的反应产品在阅读框架中并以正确方向融合可以构建二聚化的cDNA。由于加上了限制性位点，因而在产物A的最后密码子以及产物B的起始密码子之间有六个碱基，这导致在接点处增加了二个氨基酸。我们期望两个额外的氨基酸对二聚体中每一个IL-2单体分子的作用都是最小的。
8.5 PCR产物的序列分析由于在表达试验中使用了PCR产品，因而证明在PCR操作中没有有引入突变是重要的。选择每一种PCR类型的三个适当消化的阳性克隆(如在上述8.2中描述)进行序列分析，其中发现每一组克隆中有一个表达正确序列，没有产生突变。选择这两个未突变克隆用于构建线性IL-2二聚体。
8.6 在缺陷型病毒载体中构建线性IL-2二聚体在本文使用的缺陷型病毒载体的原型(pCB，图10)包括一个来自于pRB3119含有HSV1切割/包装信号(HSVa)的片段，一个含有DNA复制的HSV源点(HSV ori)的片段，以及来自于含有巨细胞病毒(CMV)启动子，lac Z基因，以及猿猴肾病毒40聚腺苷化信号(多聚(A)+信号)的pcDNAlac的片段。将这些序列插入到含有一个β-内酰胺酶基因(AmpR)以及一个细菌DNA复制源点(Col El ori)的氨苄青霉素抗性质粒pT7-3中。在第一步中，从该载体中切掉1acZ基因。这一过程通过用HindⅢ线性化该载体，接着用PstI将其部分消化，并在GenecleanⅡ药盒(BIO101)帮助下从琼脂糖凝胶上提取正确的载体带而完成的。以三个一组的连接反应，将两个PCR产物连接至得到的载体(可由前面设计的两种产物的互补限制性位点，如在上面8.4中讨论，测定它们的正确方向，由B紧接A)上。通过限制性酶分析双重检验得到的构建体pCB-IL-2二聚体，随后制备大批量DNA(CsCl)(Sambrook et al.，1989)，并转染至兔皮(RS)细胞。按上面8.3中讨论，将收获的病毒原株转染非洲绿猴肾(Vero)细胞。
实施例9 线性化二聚IL-2蛋白质产物的分析由于已知IL-2蛋白质被释放至繁殖细胞的培养基中，收集在上述实施例8.6中获得的感染Vero细胞的培养基，并用作为线性二聚化IL-2蛋白质源。在平行试验中，在同样条件下制备细胞提取物并检测，以便测定在感染细胞中是否保留合成的蛋白质。通过使用抗IL-2的单克隆抗体(图11，左边组)将两种悬浮液进行Western印迹分析。分析细胞上清液(泳道1，3)和提取物(泳道2，4)以及从仅用缺陷型病毒感染的细胞获得的上清液(泳道5)和细胞提取物(泳道6)的两组稀释液(1∶3，泳道1，3，5和1∶9，泳道2，4，6)。与仅用缺陷型病毒感染的细胞(5，6)相反，没有检测到免疫反应带，所有四种含有上清液(1，3)或细胞提取物(2，4)的泳道(1-4)显示有约37kd的谱带，该带与特定的IL-2单克隆抗体发生免疫反应。人单体IL-2蛋白质商品的分子量为14kd，并且采用前面描述的源于神经的转谷氨酰胺酶从该商品单体IL-2合成的二聚蛋白质的分子量为28kd(图11，右边组分别为泳道2和1)。相对于由转谷氨酰胺酶和单体IL-2体内合成的二聚体而言，在感染细胞中线性化二聚体蛋白质的转译后修饰作用可用于解释由两种不同方法产生的二聚体IL-2之间大小的不同。该上清液(泳道1，3)还含有另外一条约44kd的谱带。该额外的谱带也可以根据转译后修饰如糖基化或磷酸化作用来解释，这些修饰在蛋白质释放到培养基中时已经发生了。
实施例10 线性化二聚体IL-2对少突神经胶质细胞无毒然后我们试图发现该线性化人IL-2二聚体是否能模拟本发明的由转谷氨酰胺酶二聚体的人IL-2的体外胞毒活性。为了查清这种可能性，将来自于和如实施例9中用于Western印迹分析的相同样品及相同稀释上清液的样品加到大鼠少突神经胶质细胞的培养物中。
按Bottenstein and Sato，1979的描述从新生大鼠脑中制备富集少突神经胶质细胞培养物，并接种于预先用多聚-L-赖氨酸(PLL)覆盖的载玻片上(Eitan et al.1992)。在48小时后，用线性二聚IL-2蛋白质的试样处理接种的细胞，并通过比色法估测存活细胞的数目(Eitan et al.，1992)而测定细胞毒性含量。在任何稀释的线性二聚体或用作为对照的tsk(图12，左边组)中相对于用作为对照的未处理细胞(100%)而言，通过比色法测定的成熟少突神经胶质细胞数目并未减少。甚至在高蛋白浓度时也未检测到减少(图12左边组)。在另一方面，来源于已鉴定出含有IL-2样胞毒因子的再生性鱼视神经的可溶性物质(Eitan et al.，1992)，以及体外酶促合成的人二聚IL-2都能引起成熟少突神经胶质细胞数量的显著减少(图12，右边组)。
实施例11 利用一种IL-2依赖性T细胞系检测线性二聚IL-2中IL-2的生物学活性为了排除因HSV1载体表达而致使IL-2蛋白质活性损失不会导致线性二聚体对少突神经胶质细胞的毒性的损失的可能性，我们分析线性二聚体活性，并估测其模拟单体IL-2作为T细胞系促有丝分裂剂(CTLL-2)的能力。因而将CT LL-2细胞接种于多井培养平板(含10%FCS，2mM谷氨酰胺以及0.05mMβ-巯基乙醇的100μl RPMI接种2×103个细胞)。在2-3小时后，将与用于进行Western印迹分析及细胞毒性分析的相同样品及相同稀释(1∶9)上清液的试样加到细胞中37℃培养过夜。每个井中加入1μCi的[3H]胸腺嘧啶，再培养4小时。在培养结束时，收集细胞，通过cpm检测掺入的胸腺嘧啶。胸腺嘧啶掺入检测(cpm)结果证明，与用作为对照的tsk相反，加入不同浓度的线性二聚体可以剂理依赖性方式引起细胞增殖(图13，左边组)。甚至观察到的增殖作用高于由用作为对照的商品单体IL-2引起的增殖(图13，右边组)。
该试验证明，在对少突神经胶质细胞毒性方面，得到的转译产物线性二聚体IL-2不同于转译后修饰IL-2得到的酶促产生的二聚体。当保留了单体IL-2在T细胞促有丝分裂方面的已知IL-2活性时，线性二聚体对少突神经胶质细胞无毒，暗示线性二聚体IL-2的少突神经胶质细胞毒性的损失不是由于在其制备期间生物学活性的损失引起的，但涉及其构象结构，已证明少突神经胶质细胞毒性不需要构象结构。
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权利要求
1.一种可从受损伤的鱼视神经获得的源于神经的转谷氨酰胺酶，它能将IL-2转变为具有少突神经胶质细胞胞毒活性的二聚IL-2。
2.根据权利要求1所说的源于神经的转谷氨酰胺酶，由SDS-PAGE和银染色法测得该酶的分子量为约55KDa。
3.根据权利要求1或2所述的源于神经的转谷氨酰胺酶，与完整的鱼视神经相比，在受损伤后的鱼视神经中检测到该酶有更大的含量。
4.根据权利要求1-3的任何一项所述的源于神经的转谷氨酰胺酶，该酶能将IL-2转变为有少突神经胶质细胞胞毒活性的二聚IL-2。
5.根据权利要求4所述的源于神经的转谷氨酰胺酶，该酶能将哺乳动物的IL-2转变为具有少突神经胶质细胞胞毒活性的二聚IL-2。
6.根据权利要求5所述的源于神经的转谷氨酰胺酶，该酶能将鼠重组IL-2转变为有少突神经胶质细胞胞毒活性的二聚IL-2。
7.一种根据权利要求5的来源于神经的转谷氨酰胺酶，它能将人重组IL-2转变为具有少突神经胶质细胞胞毒活性的二聚IL-2。
8.一种具有下列特征的源于神经的转谷氨酰胺酶TGN(ⅰ)该酶是水溶性的;(ⅱ)该酶是可从再生的鱼视神经获得;(ⅲ)该酶能将免疫IL-2转变为有少突神经胶质细胞胞毒活性的二聚IL-2;(ⅳ)该酶具有由SDS-PAGE和银染色法测定的分子量约55KDa;(ⅴ)与完整的鱼视神经相比在受损伤的鱼视神经中测得该酶有更大的含量;(ⅵ)该酶可将腐胺结合到载体蛋白中，表现出转谷氨酰胺酶族的检定特征。(ⅶ)在pH＝9以及56℃结合腐胺时该酶有最大活性。(ⅷ)在结合腐胺时，以其与底物的函数计算得到其Km值为5.5×10-7;(ⅸ)该酶在IL-2二聚化过程中是Ca2+依赖性酶;和(ⅹ)在用抗相应于转谷氨酰胺酶的二个位点的肽的抗体进行的Western吸印分析试验中该酶显示出一条免疫反应谱带，所说肽选自于相应于转谷氨酰胺酶的活性位点的14-聚肽序列Lys-Lys-Val-Lys-Tyr-Gly-Gln-Cys-Trp-Val-Phe-Ala-Gly-Val,以及一种10聚体肽序列:Asn-Ser-Lys-Leu-Thr-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-，
9.一种根据权利要求8所述的源于神经的转谷氨酰胺酶，该酶将哺乳动物IL-2转变为具有少突神经胶质细胞包毒活性的二聚IL-2。
10.根据权利要求8所述的源于神经的转谷氨酰胺酶，该酶将鼠重组IL-2转变为具有少突神经胶质细胞胞毒活性的二聚IL-2。
11.根据权利要求8所述的源于神经的转谷氨酰胺酶，该酶将人重组IL-2转变为具有少突神经胶质细胞胞毒活性的二聚IL-2。
12.一种生产具有少突神经胶质细胞胞毒活性的二聚IL-2的酶学方法，该方法包括将IL-2与一种转谷氨酰胺酶一起保温。
13.一种生产具有少突神经胶质细胞胞毒活性的二聚体IL-2的酶学方法，包括将IL-2与权利要求1至12的任何一项所述的转谷氨酰胺酶一起保温。
14.根据权利要求13所说的方法，其中IL-2是哺乳动物IL-2。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中IL-2是重组鼠IL-2。
16.根据权利要求13或14所述的方法，其中IL-2是重组入IL-2。
17.由权利要求12至16任何一项所述方法获得的具有少突神经胶质细胞胞毒活性的二聚IL-2。
18.由权利要求12至16任何一项所述方法获得的具有少突神经胶质细胞胞毒活性的哺乳动物二聚IL-2。
19.由权利要求12至16任何一项所述方法获得的具有少突神经胶质细胞胞毒活性的人二聚IL-2。
20.具有少突神经胶质细胞胞毒活性的人二聚IL-2，它是通过将重组人IL-2与一种转谷氨酰胺酶一起保温制备的。
21.具有少突神经胶质细胞胞毒活性的人二聚IL-2，它是通过将重组人IL-2与权利要求8所述的源于神经的转谷氨酰胺酶一起保温制备的。
22.具有下列特征的且具有少突神经胶质细胞胞毒活性的哺乳动物二聚IL-2(ⅰ)它是水溶性的;(ⅱ)它是IL-2的共价二聚体;(ⅲ)它选择性地对少突神经胶质细胞系有毒，但对其他细胞，如Ⅰ-型星型胶质细胞和成纤维细胞无毒;(ⅳ)其对少突神经胶质细胞的胞毒活性可由抗IL-2的抗体中和;(ⅴ)通过与转谷氨酰胺酶一起保温可从哺乳动物IL-2中获得;以及(ⅵ)根据Western印迹分析测定，其分子量约为底物哺乳动物IL-2分子量的两倍。
23.具有下列特征的且具有少突神经胶质细胞胞毒活性的哺乳动物二聚IL-2;(ⅰ)它是水溶性;(ⅱ)它是IL-2的共价二聚体(ⅲ)它选择性地对少突神经胶质细胞系有毒，但对其他细胞，如Ⅰ-型星型胶质细胞和成纤维细胞无毒。(ⅳ)其对少突神经胶质细胞的胞毒活性可由抗IL-2的抗体中和(ⅴ)通过与一种源于神经的转谷氨酰胺酶一起保温可以从哺动物IL-2中获得(ⅵ)根据Western印迹分析测定，其分子量约为底物哺乳动物IL-2分子量的两倍。
24.根据权利要求22或23所说的哺乳动物二聚IL-2，它是通过将哺乳动物的IL-2与一种转谷氨酰胺酶或与如权利要求1至8中任一项所说的源于神经的转谷氨酰胺酶一起保温获得的。
25.具有下列特性的且具有少突神经胶质细胞胞毒活性的人二聚IL-2(ⅰ)它是水溶性的;(ⅱ)它是IL-2的共价二聚体;(ⅲ)它选择性地对少突神经胶质细胞系有毒，但对其他细胞，如Ⅰ-型星型胶质细胞和成纤维细胞无毒;(ⅳ)其对少突神经胶质细胞的胞毒活性可由抗IL-2的抗体中和;(ⅴ)通过与转谷氨酰胺酶一起保温可从人IL-2中获得;以及(ⅵ)根据Western印迹分析测定，其分子量约为30KDa。
26.具有下列特性的且具有少突神经胶质细胞胞毒活性的人二聚IL-2(ⅰ)它是水溶性的;(ⅱ)它是IL-2的共价二聚体;(ⅲ)它选择性地对少突神经胶质细胞系有毒，但对其他细胞，如Ⅰ-型星型胶质细胞和成纤维细胞无毒;(ⅳ)其对少突神经胶质细胞的胞毒活性可由抗IL-2的抗体中和，(ⅴ)通过与一种源于神经的转谷氨酰胺酶一起保温可从人IL-2中获得;以及(ⅵ)根据Western印迹分析测定，其分子量约为30KDa。
27.根据权利要求25或26所说的人二聚IL-2，它可通过将重组人IL-2与一种转谷氨酰胺酶或与如权利要求1至8中任何一项所要求的源于神经的转谷氨酰胺酶一起保温获得的。
28.权利要求17至27中任一项所说的二聚IL-2的用途，用于诱导和促进哺乳动物中枢神经中受损伤神经的再生。
29.一种转谷氨酰胺酶的用途，用于诱导和刺激哺乳动物中枢神经系统受伤神经的再生。
30.权利要求1至11中任一项所说的源于神经的转谷氨酰胺酶的用途，用于诱导和促进哺乳动物中枢神经系统中受损伤神经的再生。
31.一种诱导和促进哺乳动物中枢神经系统中受损伤神经的再生的药物组合物，其含有一种作为活性成分的具有少突神经胶质细胞胞毒活性的可酶促产生的二聚IL-2。
32.根据权利要求31所说的药物组合物，其包含有权利要求23或24所述的人二聚IL-2。
33.根据权利要求31所述的药物组合物，其含有权利要求25或26所述的人二聚IL-2。
34.权利要求17至27中任一项所述的二聚IL-2的用途，用于制备药物组合物，以诱导和促进哺乳动物中枢神经系统中受损伤神经的再生。
35.权利要求23或24所述的哺乳动物二聚IL-2的用途，用于制备诱导和促进哺乳动物中枢神经系统中受损伤神经的再生的药物组合物。
36.权利要求25或26所述的人二聚IL-2的用途，用于制备诱导和促进哺乳动物中枢神经系统中受损伤神经的再生的药物组合物。
37.一种用于诱导和促进哺乳动物中枢神经系统受伤神经再生的药物组合物，它含有一种转谷氨酰胺酶作为活性成份。
38.一种用于诱导和促进哺乳动物中枢神经系统受伤神经再生的药物组合物，它含有一种源于神经的转谷氨酰胺酶作为活性成份。
39.根据权利要求37或38所述的药物组合物，它含有权利要求1至11中任何一项所要求的源于神经的转谷氨酰胺酶。
全文摘要
本发明提供了一种来源于神经的新的转谷氨酰胺酶，该酶能将免疫产生的IL-2转变为有少突神经胶质细胞胞毒活性的二聚体IL-2。源于神经的转谷氨酰胺酶和哺乳动物如人的二聚体IL-2都可用作为药物组合物中的活性成分，以诱导和促进哺乳动物中枢神经系统的受损伤神经的再生。
文档编号C12P21/00GK1084888SQ9311738
公开日1994年4月6日 申请日期1993年7月30日 优先权日1992年7月30日
发明者M·许瓦兹, S·艾坦 申请人:耶达研究及发展有限公司