阿卡维基转移酶及其制备与应用的制作方法

专利名称：阿卡维基转移酶及其制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及来自放线菌、主要来自游动放线菌属菌株SE 50/13或SE 50/110及其突变体的阿卡维基转移酶(AT)，涉及酶的分离、纯化和表征的方法，涉及编码阿卡维基(acarviosyl)转移酶的acbD基因的分离和表征，涉及阿卡维基转移酶在异源宿主生物中的表达，涉及将阿卡波糖微量组分转化为阿卡波糖中或者用于阿卡波糖制备的阿卡维基转移酶的用途，涉及阿卡维基转移酶在阿卡波糖纯化中的用途，也涉及通过使阿卡维基转移酶失活以降低微量组分生成的生产突变体的制备。
一系列的放线菌、特别是幅动菌科生成糖苷水解酶、主要是消化道糖切割酶的类寡糖抑制剂，这一发现是先有专利申请的要点(例如DE 20 64 092和DE 22 09 834)。抑制剂含有阿卡维基单元，以α-1，4-糖苷键连接到麦芽寡糖或其它糖上。阿卡维基核心可以在其两边连接不同数目的葡萄糖单元。核心上的葡萄糖残基决定抑制剂的比活性。相对短的分子(含有1-5个葡萄糖单元的成分)主要作用于双糖，反之吡喃葡萄糖数目增加时，可更有效地作用于α-淀粉酶。阿卡波糖(即化合物O-4，6-二脱氧-4-[[1S-(1S，4R，5S，6S)-4，5，6-三羟基-3-(羟甲基)-2-环己-1-烯基]-氨基]-D-吡喃葡糖基-(14)-O-D-比喃葡糖基-(14)-D-吡喃葡萄糖)被描述为该组中最具潜力的α-糖苷酶抑制剂[DE 23 47 782]。
在人类医学中阿卡波糖用于糖尿病的控制。游动放线菌属菌株SE 50(CBS No.961.70)及其自然变异体SE 50/110(CBS 674.73)、要不就是SE 50/13(CBS 614.71)[DE 22 09 83]以及它们的选择体和突变体生成次级代谢物阿卡波糖。在所提的例如所述德国专利申请P 20 09834的实施例1-4的专利申请中描述了具有该性质的蔗糖酶抑制剂的分离。除主要产物阿卡波糖外，与该分离相关的、具有不同数目麦芽寡糖和双糖残基的含阿卡维基化合物作为微量组分出现。
阿卡波糖含有阿卡维基残基，按照现有的知识，后者首先在生物合成期间生成，以便连接到麦芽糖基残基上。1986年，在设计以阐明阿卡波糖生物合成的研究过程期间，Goeke(Goeke，K.，EnzymaitscheUntersuchungen zum Zuckerstoffwechsel und zur Biosynthese des α-Glucosidase-Inhibitors Acarbose bei Axtinoplanes spec.[Enzymicinvestigations on sugar metabolism and on the biosynthesis of theα-glucosidase inhibitor acarbose in Actinoplanes spec.]；Dissertation，MunsterUniversity)描述了将阿卡波糖的麦芽残基(阿卡维基-麦芽糖)酶促交换为放射性标记的麦芽糖使用[U-14C]-麦芽糖时，生成具有放射性标记的麦芽糖残基的阿卡波糖。涉及的酶即阿卡维基转移酶(AT)的原始术语为假二糖基(PDS)转移酶。在细胞分裂和差速离心后，碎片部分的活性高于上清液阿卡波糖/麦芽糖交换反应的3.25倍，因此总结出PDS转移酶是膜连接的。1991年，Schaper(Schaper，B.，Biochemische undPhysiologische studien zur Biosynthese des α-Glucosidase-InhibitorsAcarbose[Biochemical and physiological studies on the biosynthesis of theα-glucosidase inhibitor acarbose]；Dissertation，Munster University)证实了这一发现，并详细说明了膜结合酶的处理步骤，提到部分纯化的酶的最适pH为4.5，最适温度为30℃，以及用Mn2+作为辅因子。
现已惊讶地发现，能够交换阿卡波糖麦芽糖基的阿卡维基转移酶不以膜结合形式出现，相反地，AT主要在培养滤液中出现，酶活性的增加与细胞生长平行。可以从细胞上清液中分离高纯度的酶。为此，用硫酸铵从培养物上清液中沉淀酶。离心后，将沉淀溶于缓冲液(含有甘油和CaCl2)中，将该缓冲液再次离心后，将产生的上清液通过阴离子交换柱。流出物含有阿卡维基转移酶。从该溶液中通过透析获得部分富含制品AT，要么通过DEAE-Fractogel色谱分离法纯化AT，用可沉淀淀粉沉淀两次，并用阿卡波糖或麦芽糖解附。
纯化的阿卡维基转移酶的分子量为76kDa(SDS-PAGE)，最适温度为20-40℃。酶的稳定温度高达大约40℃。最适pH测定为6.2-6.9，并且依赖于Ca2+离子。
对纯化的酶进行测序。令人惊讶的是，产生的基本序列与产生菌游动放线菌属菌株SE 50/110的阿卡波糖基因簇中acbD基因相应的DNA序列很好地吻合。
更惊奇的是，阿卡维基转移酶可以用其它糖残基取代阿卡波糖的麦芽糖残基，生成阿卡波糖同系物，或能够通过用麦芽糖残基取代发酵期间生成的类阿卡波糖微量组分的糖残基，生成阿卡波糖。因此，阿卡维基转移酶催化一般反应阿卡维基-X+Y→阿卡维基-Y+X(X＝葡萄糖、麦芽糖、麦芽寡糖和其它糖，Y＝葡萄糖、麦芽糖、麦芽寡糖和其它糖)。
因此本发明公开从游动放线菌属菌株SE 50/110或其突变体培养物中分离、纯化阿卡维基转移酶的全过程。
纯化的阿卡维基转移酶的表征。
用胰蛋白酶酶切后测定的酶的氨基酸序列超过100个氨基酸。从该氨基酸序列得到的基本序列与acbD基因的基本序列很好地吻合。
用麦芽糖取代相对的糖残基，由阿卡波糖微量组分制备阿卡波糖的方法。
通过用其它适宜的糖残基取代阿卡波糖的麦芽糖残基，制备药理学性质改变的阿卡波糖同系物。
使用阿卡维基转移酶或固定的AT，从培养肉汤中分离阿卡波糖(亲和色谱)，同时将阿卡波糖同系物转化为阿卡波糖。
编码阿卡维基转移酶的acbD基因的分离和表征。
在异源宿主生物中阿卡维基转移酶的重组制备。
改进的生产突变体的制备，即通过使acbD基因失活，切断不需要的微量组分的生成，使游动放线菌属产物范围限制在阿卡波糖-生物合成的所需主要产物。
下面详细描述本发明。此外通过权利要求的内容确定本发明。
下面详细描述本发明。
I.酶的纯化来自游动放线菌属菌株SE 50/110或其突变体的培养滤液种子培养脱脂大豆粉2％甘油2％CaCO30.2％自来水pH 7.2 用NaOH调pH1000ml锥瓶，装至125ml接种物5ml原培养物(72h的种子培养物，在20℃保存)培养30℃，260rpm，72h主要培养脱脂大豆粉1％淀粉3％CaCO30.2％自来水1000ml锥瓶，装至125ml接种物5ml种子培养物培养30℃，260rpm，96-144h培养120小时后，培养滤液的AT活性达到最高值2.6nkat/ml。培养滤液中AT成为主要蛋白。
表1描述了纯化方案。
表1阿卡维基转移酶的纯化方案使用以下缓冲液缓冲液125mM Tris/HCl pH 8.5+10％甘油+1mMCaCl2缓冲液225mM Tris/HCl pH 7.5+1mMCaCl2缓冲液310mM Tris/HCl pH 7.5+1mMCaCl2缓冲液40.1mM Tris/HCl pH 7.2+0.01mMCaCl2淀粉*煮沸的可溶性淀粉，在4℃12h(“冷沉淀”)，40,000xg离心60分钟；使用沉淀物。
大豆粉/淀粉培养物↓3,000xg；10分钟培养滤液｜分段(NH4)2SO4沉淀(20-40％饱和度)↓25,000xg；3分钟(2x)沉淀物｜溶于缓冲液1中↓25,000xg；30分钟上清液↓DEAE-阴离子交换柱；0-1M NaCl流出物↓透析(12h)，缓冲液1滞留物↓DEAE-阴离子交换柱；0-1M NaCl0.15-0.35M NaCl部分↓用淀粉*保温(12h)，40,000xg；60分钟沉淀物(在缓冲液2中)｜用阿卡波糖保温(25mM；室温2h)↓40,000xg；60分钟上清液｜用缓冲液3透析(3×6h)↓用淀粉*保温(12h),40,000xg；60分钟沉淀物(在缓冲液3中)｜用麦芽糖保温(250mM；2h)↓40,000xg；60分钟上清液↓用缓冲液4透析(3×6h)纯化的AT
表2总结了纯化过程表2阿卡维基转移酶的纯化，摘要(对于样品设计，见表1的纯化流程)<tables id="table1" num="001"><table width="772">纯化步骤总蛋白(mg)总活性(nkat)比活(nkat/mg)收率(％)富集培养滤液40017404.35100120-40％(NH4)2SO413911477.75661.8柱1的流出物89107812.1622.8柱2的活性部分2078938.8(43.1)*458.9淀粉沉淀+阿卡波糖解附9.753855.53112.8淀粉沉淀+麦芽糖解附5.542577.32417.8</table></tables>*最高活性部分AT的纯化使AT富集17.8倍，收率为24％。
II.阿卡维基转移酶活性的测定1.放射活性试验a)将阿卡波糖或阿卡波糖同系物在30℃、在tris-马来酸盐缓冲液(pH 6.3)中，在含阿卡维基转移酶制品的存在下，与[14C]-麦芽糖一同保温。然后用阳离子交换树脂将阿卡波糖从麦芽糖中分离出来。在阿卡波糖部分中的[14C]-放射活性水平和总放射活性给出取代比率，而后者与AT活性有关。
阿卡维基-(α-1，4)-(糖)+[14C]-麦芽糖→阿卡维基-(α-1，4)-[14C]-麦芽糖+糖b)如a)中将[14C]-阿卡波糖(标记于麦芽糖单元)在AT的存在下，与麦芽寡糖或其它糖一起保温。混合物如a)中进行处理和评价。
阿卡维基-(α-1，4)-[14C]-麦芽糖+糖→阿卡维基-糖+[14C]-麦芽糖2.薄层色谱如a)中将[14C]-阿卡波糖或阿卡波糖同系物与麦芽糖、麦芽寡糖或其它糖一起保温。反应混合物含有10μl AT制品(AT在0.1mM Tris/HCl pH 7.2+0.01mM CaCl2中；4.5nkat/ml)10μl阿卡波糖(70mM储液)或阿卡波糖同系物(大约30mM)10μl底物(70mM储液)或麦芽糖(600mM)样品的制备30μl反应混合物↓ 18小时；30℃加入70μl乙醇↓ 7000g离心5分钟取出80μl上清液→5μl用于TLC↓75μl↓在真空浓缩器中干燥用于HPLC的样品TLC硅胶60 TLC铝箔(Merck)；流动相∶丁醇∶乙醇∶水(50∶30∶20)；Cer喷显剂；在110℃研制。
3.HPLC试验将阿卡波糖或阿卡波糖同系物如2中所述与麦芽糖、麦芽寡糖或其它糖一起保温。沉淀蛋白后，用ECD HPLC或UV HPLC分析剩余溶液的化学组分。
III.阿卡维基转移酶的性质摩尔质量 76kDa(SDS-PAGE)最适pH 6.2-6.9最适温度 30℃(20-40℃)温度稳定性 高达大约40℃微量元素依赖性 Ca2+根据下面列出的受体特性可以得出以下受体分子的通式。
R1是H、CH2OH或CH3R2是H、(CH2)mCH3，m＝0-10吡喃糖[α(1-＞2)，(1-＞3)，(1-＞4)，(1-＞6)，β(1-＞2)，(1-＞3)，(1-＞4)]呋喃糖[α(1-＞6)]葡糖醇、苯基-、氮苯基-等R3是O、S或CHOH具体受体纤维二糖二脱氧-D-葡萄糖D-葡萄糖酸内酯异麦芽糖异麦芽三糖昆布二糖(3-O-β-D-吡喃葡糖基-D-葡萄糖)麦芽糖麦芽三糖麦芽四糖麦芽五糖麦芽六糖麦芽七糖甲基-D-吡喃葡糖苷宫殿糖(palatinose)潘糖(6-α-葡糖基麦芽糖)槐糖(2-O-β-D-吡喃葡糖基-α-D-葡萄糖)木二糖L-木糖D-木糖nigeroseL(-)-葡萄糖5-硫-D-葡萄糖肌醇麦芽糖醇(maltitol)扁桃苷支链淀粉糊精α-D(+)-麦芽糖-1-磷酸4-氮苯基-α-D-吡喃葡糖苷4-氮苯基-β-D-吡喃木糖苷D(-)-水杨苷苯基-α-D-吡喃葡糖苷辛基-D-吡喃葡糖苷壬基-β-D-吡喃葡糖苷辛基-β-D-吡喃葡糖苷癸基-β-D-吡喃葡糖苷具体供体阿卡波糖阿卡波糖微量组分2阿卡波糖微量组分4A阿卡波糖微量组分4B阿卡波糖微量组分4C阿卡波糖微量组分B假阿卡波糖IV.蛋白测序阿卡维基转移酶片断的N-末端序列用Applied Biosystems 473A气-液固相蛋白测序仪(Foster City，CA.，U.S.A.)分析。使用该仪器的标准测序程序。用户手册中详细地描述了用具即使用的程序以及PTH分离体系(用户手册蛋白测序体系模式437A(1989)，Applied Biosystems，Foster City，CA 94404，U.S.A.)。
使用Applied Biosystems PR-18柱(220mm×2mm，5μ材料)。借助于所有PTH氨基酸的50pM标准进行PTH氨基酸的鉴定和定量测定。使用Applied Biosystems测序仪数据系统610A评价数据。从AppliedBiosystems获得蛋白测序使用的化学药品。
Pharmacia(Freiburg，Germany)Smart System用来分离胰蛋白酶酶切多肽。
分离胰蛋白酶酶切多肽的HPLC柱(2.1mm×100mm；5μ材料)得自Pharmacia(Freiburg，Germany)，而胰蛋白酶(测序级)得自Merck(Darmstadt，Germany)或Sigma(Deisenhofen，Germany)。
V.acbD基因的分离和测序(AcbD蛋白＝AT)除非另外指出，所有的遗传操作方法都按Sambrook等人描述的(Molecular Cloning；A Laboratory Manual；2nd edition，1989；Clod SpringHarbour Laboratory Press，N.Y.，U.S.A.)进行。
从质粒pAS2(DE 195 07 214)分离用于筛选的基因探针。由E.coliDH5α，通过煮沸法或碱裂解以及用限制性内切酶BamHI水解，制备质粒pAS2。分离产生的2.2kb BamHI片断，借助缺口平移用32P-标记的脱氧核苷酸进行放射性标记。该标记的片断用作分离阿卡波糖生物合成基因(DE 195 07 214)的基因探针，称为下述的acbD探针II。
如下分离阿卡波糖生物合成基因。来自游动放线菌属菌株SE50/110的染色体DNA用限制性内切酶SstI水解，通过凝胶色谱分离，用acbD探针II通过Southern杂交检查同源DNA序列的存在。基因探针杂交的SstI片断大小为11kb。从胶上洗脱出11kb的SstI片断，将其连接到载体pUC18中；将该重组载体克隆到E.coli DH5α中。产生的质粒命名为pAS5。质粒pAS5用限制性内切酶PstI和HindIII水解。产生的片断大小为1.4kb PstI片断5.4kb PstI片断0.05kb PstI/HindIII片断2.6kb HindIII/PstI片断3.8kb PstI片断(连接到pUC18载体的1.1kb PstI/SstI片断)从胶上洗脱出2.6kb的HindIII/PstI片断，连接到pUC18载体中；将该重组载体克隆到E.coli DH5α中。产生的质粒(pAS5/15.1)用多种限制性内切酶水解，将产生的pUC18中的DNA片断在E.coli DH5α中进行亚克隆并进行测序。为了检查来自pAS5/15.1的片断的DNA序列，也用PCR法从游动放线菌的染色体DNA上扩增DNA片断，将其连接到pUC18中，克隆到E.coli DH5α中，然后进行测序。由来自pAS5/15.1的亚克隆片断的DNA序列得出PCR引物的DNA序列(参见下面)。
为了测定游动放线菌2.6kb的HindIII/PstI片断的DNA序列，构建以下质粒，分别测定插入的DNA序列pAS5/15.1＝pAS5的2.6kb HindIII/PstI片断pAS5/15.2＝pAS5/15.1的0.75kb SalI片断pAS5/15.3＝pAS5/15.1的0.5kb SalI片断pAS5/15.4＝pAS5/15.1的0.4kb SalI片断pAS5/15.5＝pAS5/15.1的0.35kb SalI片断pAS5/15.6＝pAS5/15.1的1.25 PvuII片断pAS5/15.7＝pAS5/15.1的0.7kb PvuII/HindIII片断pAS5/15.9＝pAS5/15.1的0.1kb PvuII片断pAS5/15.12＝pAS5/15.1的0.9kb KpnI/NcoI片断pAS5/18＝0.3kb PCR片断(引物见表3)pAS5/19＝0.3kb PCR片断(引物见表3)Sanger等人的方法(1977)或由此衍生的方法用于DNA测序。用自读测序盒(Pharmacia，Freiburg，Germany)与自动激光荧光(A.L.F.)DNA测序程序(Pharmacia，Freiburg，Germany)进行研究。购置适宜的荧光标记的pUC反测序引物和测序引物(Pharmacia，Freiburg，Germany)。表3 PCR引物的序列和测序反应引物的序列PCR引物质粒pAS5/18引物名称序列acbD3 5’ACCAGGCCGAGGACGGCGCCC3’acbD4 5’AGCGGCATGTGCTTGACGGCG3’质粒pAS5/19引物名称序列acbD5 5’ACCGGCTCGAACGGGCTGGCACC3’
acbD6 5’CCCTCGACGGTGACGGTGGCG3’测序反应引物引物名称序列通用引物5’GTAAAACGACGGCCAGT3’反向引物5’GAAACAGCTATGACCATG3’实施例1.阿卡维基转移酶的制备、纯化和表征野生型菌株游动放线菌属菌株SE 50/110或来自该菌株的突变体在大豆粉/甘油培养基进行种子培养后，于30℃、在大豆粉/淀粉培养基的生产培养物中发酵，转式摇床的转动频率为260rpm。保温大约120小时后，分离出菌块。从培养物的上清液中，用硫酸铵(20-40％饱和度)沉淀酶。离心后，将沉淀物溶于缓冲液(25mM tris/HCl，pH 8.5，含有甘油和CaCl2)中，将该溶液再离心。将产生的上清液通过DEAE-阴离子交换柱。流出液含有阿卡维基转移酶。由该溶液通过透析得到部分富集制品的AT，或通过DEAE-Fractogel色谱纯化AT。用淀粉沉淀两次，用阿卡波糖或麦芽糖解附(见表1)。富集17.8倍，收率为24％。
将阿卡波糖(供体)的阿卡维基残基转移到麦芽糖(受体)上测定阿卡维基转移酶的活性。用SDS-PAGE测定的酶的大小为76,000Da，最适pH为6.2-6.9，最适温度为20-40℃。
2.阿卡维基转移酶的测序阿卡维基转移酶用胰蛋白酶降解，以测定内部氨基酸序列。胰蛋白酶在赖氨酸和精氨酸之后切割蛋白。
AT的胰蛋白酶酶切将大约1mg AT溶于1000μl 6M氯化鈲/0.5M三-(羟甲基)-氨基甲烷，pH 8.6中。加入30μl 1M二硫苏糖醇(DDT)后，样品在54℃过夜还原。加入60μl 2M碘乙酸钠后，样品在黑暗中保温30分钟。此后，对0.5M尿素/0.1M碳酸氢铵进行透析(在3小时以及过夜后进行完全更换缓冲液；透析袋排阻为25kD)。将这样预处理的样品在37℃，在20μg胰蛋白酶(测序级)的存在下降解18小时。通过在离心机中干燥，将样品浓缩至大约100μl。
胰蛋白酶酶切多肽的HPLC分离将三分之一的样品装载到RP-18柱上(2.1mm×100mm；5μ材料)，用Smart System(溶液A0.1％TFA，溶液B0.1％TFA/60％ACN；检测215mm，流速0.15ml/min，室温；梯度7分钟0％B，52分钟70％，54分钟100％B)进行分离。由于AT的分子量高，在胰蛋白酶降解期间生成非常复杂的混合物。因此需要将各个部分再进行色谱分离以获得用于随后测序的纯净多肽。
分离部分的再色谱分离合并含有多肽的部分，在离心机中进行干燥浓缩。将浓缩液再在RP-18柱上(2.1mm×100mm；5μ材料)(溶液A0.025M NH4Ac，溶液B0.025M NH4Ac/60％ACN；检测215mm，流速0.15ml/min，室温；梯度0分钟0％B，33分钟60％，38分钟100％B)进行色谱分离。用不同色谱分离条件将第一次分离的部分28+29(Smar 4003)和部分30(Smar 4002)再色谱分离后，产生多肽的纯度适用于N-末端序列的测序。
N-末端序列的测序例如将再色谱分离(Smar 4002)的部分32在离心机中干燥以彻底蒸发。将多肽溶于TFA中，装载到预先用BioBrene处理的玻璃纤维滤器上以进行测序。多肽用快速正规测序仪周期进行测序。鉴定PTH氨基酸，用50pmol PTH标准进行定量测定。表4记录了N-末端测序的结果。从来自AT的8种胰蛋白酶酶切多肽分析了总共133种氨基酸。
表4来阿卡维基转移酶的胰蛋白酶酶切多肽的N-末端序列1.1.部分28+29的再色谱分离(Smar 4003)1.2.再色谱分离的部分351Asn-Leu-Gly-Val-Gly-Ala-Ile-Trp-Ile-Ser-Pro-His-Val-Asp-Asn-Ile-
22 23Asn-Val-Pro-Ala-Ala-Gly-(Gly)...
2.1.部分30的再色谱分离(Smar 4002)2.2.再色谱分离的部分321Thr-Gly-Lys-Pro-Val-Pro-Val-Gln-Phe-Thr-Val-Gln-Asn-Pro-Pro-21Ala-Thr-Ala-Pro-Gly-Glu...
2.3.部分25的再色谱分离(Smar 4004)2.3.1.再色谱分离的部分311Ser-Thr-Val-Ala-Pro-Val-Leu-Gly-Ala-Gly-Gln-Val-Ala-Val-Trp-Ser-Tyr-Arg-182.3.2.再色谱分离的部分25+261Tyr-Gln-Asp-Gln-Tyr-Tyr-Ser-Leu-Ala-Asp-Ile-Ala-Asp-Leu-Asp-20Gln-Gln-Asn-Pro-(Arg)2.4.部分21的再色谱分离(Smar 4005)2.4.1.再色谱分离的部分23112Trp-Ile-Asn-Asp-Asp-Val-Tyr-Val-Tyr-Glu-Arg-Leu...
2.5.部分31+32的再色谱分离(Smar 4001)2.5.1.再色谱分离的部分301Asp-Tyr-Leu-Tyr-Glu-Gln-Asp-Leu-Ile-Thr-Phe-Leu-Asp-Asn-Gln-18Asp-Thr-Arg2.6.部分16+17的再色谱分离(Smar 4007)2.6.1.再色谱分离的部分1719Asp-Asp-Ala-Asn-Tyr-Trp-Met-Asp-Arg2.7.部分20的再色谱分离(Smar 4007)2.7.1.再色谱分离的部分11112Ala-Val-Leu-Thr-Gly-Asn-Thr-Val-Tyr-Asp-Trp-Lys3.将阿卡波糖同系物转化为阿卡波糖在AT供体特性的研究中，将诸如阿卡波糖微量组分2、4A、4B和成分B以及假阿卡波糖之类的阿卡波糖同系物
在试验混合物中，在阿卡维基转移酶的存在下，用麦芽糖处理。在30℃反应24小时后，试验混合物通过HPLC用UV探测分析氨基相。评价(表5)证明，微量组分的含量降低，然而阿卡波糖的含量却增加，即阿卡维基单元从阿卡波糖微量组分2、4A、4B和4C转移至麦芽糖上。表5使用AT将阿卡波糖微量组分2、4A、4B和4C转化为阿卡波糖
用成分B和假阿卡波糖发现转化的痕迹。
4.高级阿卡波糖同系物从阿卡波糖中的分离在AT受体特性的研究中，将阿卡波糖在实施混合物中，在足够高浓度的麦芽寡糖和其它糖的存在下，用阿卡维基转移酶进行反应。在30℃反应18小时后，试验混合物通过HPLC用UV探测分析氨基相。评价(表6)证明，探测到新合成的糖，而麦芽糖伴随着减少。
表6阿卡波糖的阿卡维基残基向作为受体的不同糖的转移(PA＝面积百分数；RT＝保留时间)<tables id="table3" num="003"><table width="766">受体阿卡波糖(RT)受体(RT)麦芽糖(PA％)新组分(PA％)(RT)去离子双蒸水纤维二糖脱氧-D-葡萄糖葡萄糖酸内酯D-葡萄糖异麦芽糖异麦芽三糖昆布二糖麦芽糖麦芽三糖麦芽四糖麦芽五糖麦芽六糖麦芽七糖甲基-D-吡喃葡糖苷宫殿糖(Palatinose)潘糖槐糖木二糖D-木糖L-木糖31.431.330.430.630.231.830.928.530.231.831.132.631.230.329.231.131.130.528.530.729.113.54.517.15.710.113.915.615.826.838.140.641.742.61.813.521.216.510.85.95.82.917.22.63.77.69.75.416.338.119.819.917.917.218.911.59.31416.320.85.7110291411167272120201520139203422/561525.06.637.418.019.623.530.138.840.642.14343.63.824.837.533.216.7/17.314.816.0</table></tables>
在放射活性试验中测定AT活性时，用糊精也观察到交换寡糖 相对活性(％)麦芽糖 100麦芽三糖 27麦芽四糖 40麦芽七糖 49纤维二糖 15糊精 455.用AT处理阿卡波糖的修改方法原则上，AT催化的反应也可以用来按照以下原则从培养溶液中富集阿卡波糖，而同时将阿卡波糖同系物转化为阿卡波糖1)在阿卡维基转移酶的存在下，将阿卡波糖或阿卡波糖同系物[阿卡维基-(G)n]与高分子量糊精或淀粉[(G)m]反应，阿卡维基-(G)n+(G)m→阿卡维基-(G)m+(G)n通过透析或沉淀多糖，除去低分子量杂质，然后2)与麦芽糖反应，释放阿卡波糖，阿卡维基-(G)m+(G)n→阿卡维基-(G)n+(G)m通过使用淀粉和固定化AT的反应器(例如柱)也可以得到同样的效果-通过淀粉/AT柱过滤粗阿卡波糖溶液-洗涤除去杂质-用麦芽糖洗脱阿卡波糖在上述反应流程中，G表示葡萄糖，m和n分别表示1-20的整数，而m与n不同。
6.E.coli菌株的培养，质粒DNA的制备和DNA片断的分离在37℃、LB培养基中培养E.coli DH50α。在选择压力下(氨苄青霉素，100μg/ml)保持含质粒细菌。培养在260rpm的转式摇床上进行。保温至少16小时的混合物称为过夜培养物(OC)。
来自在选择压力下保温的1.5ml OC的细胞用来制备质粒DNA。用碱SDS裂解法分离质粒(Bimboim and Doly，1979)。
完全按生产商的说明将限制性内切酶用于载体DNA的专一水解(Gibco BRL，Eggenstein，Germany)。使用5U恰当的限制性内切酶来限制10μg质粒DNA，在37℃保温2小时。再加入等量的限制性内切酶，将混合物再保温至少1小时以确保完全水解。
根据DNA片断的大小，在0.5-1.2％垂直琼脂糖凝胶板上电泳分离酶切的DNA。用无菌解剖刀切下含DNA片断的凝胶块并称重，以洗脱DNA。然后用JETsorb盒按照生产商的说明，将DNA片断从琼脂糖中洗脱出来(Genomed，Bad Oeynhausen，Germany)。
7.游动放线菌属菌株SE 50/110的生长，染色体DNA的制备、切割以及凝胶电泳分离将游动放线菌属菌株SE 50/110在30℃、TSB培养基中在转式摇床上培养3天。在小培养管中以240rpm进行种子培养(5ml)，主要培养(50ml)以100rpm在500ml固定的烧瓶中进行。培养后，通过离心沉淀细胞，在TE缓冲液中洗涤两次。
通过酚/氯仿抽提法(Hopwood et al.，1985)，用1.5-5mg细胞(鲜重)制备总DNA。将20μg染色体DNA在37℃用10U恰当的限制性内切酶(Gibco BRL，Eggenstein，Germany)，在适宜的缓冲液中水解2小时。再加入等量的限制性内切酶，将混合物再保温至少1小时以确保完全水解。
在0.6％垂直琼脂糖凝胶板上电泳分离酶切的DNA。
再用JETsorb盒，将DNA片断洗脱出来(见实施例6)。
8.acbD基因探针的制备将按实施例6制备的pAS2的片断用Gibco BRL，Eggenstein，Germany提供的切口平移系统，按照后者的说明进行放射活性标记。为此使用0.5-1.0μgDNA片断，以及[α32P]dCTP(3000Ci/mM；Amersham.Braunschweig，Germany)。将混合物煮沸10分钟(变性)，立即加入杂交液(见实施例9)中。
9.将DNA转移至膜上，DNA的杂交(Southern杂交)以及放射自显影将DNA片断从琼脂糖凝胶通过Southern转移法转移至膜上(Southern，1975)。将按实施例7描述得到的琼脂糖凝胶在0.25M HCl中冲洗20分钟。将胶置于三层3MM Whatman纸(Whatman，Maidstone，England)上，将HybondTM-N+膜(Amersham，Braunschweig，Germany)置于胶上，使得不产生气泡。然后将几层吸水纸置于膜上。将大约1kg重物置于一叠滤纸上。通过吸过0.4M NaOH转移DNA。转移至少12小时后，用2×SSC冲洗尼龙膜5分钟，然后晾干。
尼龙膜在50-100ml预杂交液中68℃水浴振荡至少2小时。在此期间至少更换两次溶液。在杂交加热箱中杂交至少12小时。使用15ml含acbD探针II(见实施例8)的杂交溶液。
随后用6×Potwash和1×Potwash各洗涤15分钟，将尼龙膜进行充分地洗涤。然后用密闭膜包好仍湿润的尼龙膜。用Hyperfilm-MP(Amersham，Braunschweig，Germany)于-80℃，在暗盒中使用增感屏进行放射自显影，至少进行16小时。
10.SstI片断从游动放线菌属菌株SE 50/110总DNA中的分离和克隆用SstI完全水解游动放线菌的染色体DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离，将长度为9.0-12kb的DNA片断从琼脂糖中洗脱出来(见实施例6)。从E.coli DH5α制备载体质粒pUC18，用SstI水解，用碱性磷酸酶(Boehringer，Mannheim，Germany)按生产商的说明进行处理。在体积为20μl、片断与载体的比率为3∶1、含有0.01-0.1μg DNA混合物中进行连接。使用1U T4 DNA连接酶与适宜的缓冲液(Gibco BRL，Eggenstein，Germany)。
用完全连接混合物转化E.coli DH5α转化感受态细胞(按照Hanahan，1983)。将抗氨苄青霉素转化子转移至LB-Amp选择平板上(氨苄青霉素，100μg/ml)。
11.从阿卡波糖生物合成组中鉴定含有11kb SstI片断的质粒检查抗氨苄青霉素转化子与acbD探针II杂交的11kb SstI片断的存在。在所有情况下，这些克隆的10个在选择平板上显出，保温过夜，然后用3ml LB培养基将其从平板上洗下来。从20个这样的10克隆库中分离质粒DNA(用Birnboin和Doly，1979的方法)。用限制性内切酶EcoRI和HindIII水解20个不同的质粒制品，以从多重接头上取出克隆的SstI片断。限制性混合物在0.6％琼脂糖凝胶上分次电泳，将DNA从琼脂糖凝胶上通过Southern转移，转移至尼龙膜上(见实施例9)。其中一个库与acbD探针II反应阳性，将其分为10个独立的克隆。同样分离这些克隆的质粒并经过上述方法。杂交的质粒命名为pAS5。它含有10.65kb SstI片断。
12.2.6kb HindIII/PstI片断的克隆为了能够鉴定其它阅读框架，由质粒pAS5制备几个HndIII/PstI亚克隆。为此质粒pAS5用限制性内切酶HindIII和PstI水解。得到以下片断1.4kb PstI片断5.4kb PstI片断0.05kb PstI/HindIII片断
2.6kb HindIII/PstI片断3.8kb PstI片断(连接到pUC18载体的1.1kb PstI/SstI片断)产生的DNA片断通过琼脂糖凝胶电泳分离，从胶上洗脱(见实施例6)。由E.coli DH5α制备pUC18载体质粒，用HindIII和PstI水解，用碱性磷酸酶(Boehringer，Mannheim，Germany)按照生产商的说明进行处理。克隆2.6kb HindIII/PstI片断。如实施例10进行连接和转化。带有2.6kb HindIII/PstI的质粒片断命名为pAS5/15.1。
13.从游动放线菌的染色体DNA扩增以及克隆两个0.3kb DNA片断为了对质粒pAS5/15.5和质粒pAS5/15.6中克隆的DNA片断之间重叠的DNA区进行测序，由这些质粒(见实施例14)的已知DNA序列合成两个引物(acbD3和acbD4)。用这些引物，从游动放线菌的染色体DNA上扩增0.3kb DNA片断。变性温度为95℃(1分钟)，退火温度为68℃(20秒)，引物在72℃延伸(20秒)。进行25个扩增周期。按照生产商的说明使用Taq聚合酶(Gibco BRL，Eggenstein，Germany)。PCR混合物含有5％甲酰胺。将BIOMETRA Personal Cycler(Gottingen，Germany)用于PCR反应。PCR混合物用乙醇沉淀，随后将DNA连接到pUC18(用HindIII水解)中，将该重组质粒克隆到E.coli DH5α中。为了对质粒pAS5/15.5和质粒pAS5/15.6重叠的DNA区进行测序，用两个引物acbD5和引物acbD6用同样的试验混合物扩增另一0.3kbDNA片断，并克隆。
pAS5/15.18和pAS5/15.19.克隆后，用引物acbD3和acbD4扩增的PCR片断产生亚克隆pAS5/15.18，而用引物acbD5和acbD6扩增的PCR片断产生亚克隆pAS5/15.19。
14.来自pAS5的亚克隆片断由pAS5亚克隆几个片断，以阐述双链DNA的序列(

图1)。
pAS5/15.1.质粒pAS5用限制性内切酶HindIII和PstI水解。产生，克隆其中的2.6kb HindIII/PstI片断。为此，在0.7％琼脂糖凝胶上分离限制性混合物，从胶上洗脱出2.6kb HindIII/PstI片断(见实施例6)，将其连接到pUC18(用HindIII/PstI水解)中，然后将该重组质粒克隆到E.coli DH5α中。
pAS5/15.2；pAS5/15.3；pAS5/15.4；pAS5/15.5.质粒pAS5/15.1用限制性内切酶SalI水解。产生的6个片断在1％琼脂糖凝胶上分离。片断的大小为0.75kb、0.5kb、0.4kb、0.35kb、0.05kb和3.2kb(连接到pUC18的0.5kb片断)。将亚克隆标记的片断从胶上洗脱出(见实施例6)。用限制性内切酶SalI如实施例6制备用于克隆的pUC18载体。如实施例10进行连接。将0.75kb片断连接到制备的pUC18中，产生质粒pAS5/15.2。将0.5kb片断连接到制备的pUC18后，得到质粒pAS5/15.3。质粒pAS5/15.4含有0.4kb片断，而0.35kb片断是质粒pAS5/15.5的成分。
pAS5/15.6；pAS5/15.7；pAS5/15.9.质粒pAS5/15.1用限制性内切酶PvuII水解。产生的5个片断在1.2％琼脂糖凝胶上分离。片断的大小为1.25kb PvuII片断0.15kb PvuII片断0.8kb PvuII片断(连接到来自pUC18的0.1kb HindIII/PvuII片断的0.7kb PvyII/HindIII片断)0.66kb PvuII片断(连接到来自pUC18的0.16kb PstI/PvuII片断的0.5kb PvyII/PstI片断)2.4kb PvuII片断(pUC18的残余部分)将1.25kb片断连接到pUC18(用HincII水解)中，将该重组质粒克隆到E.coli DH5α中，产生质粒pAS5/15.6。将0.8kb片断克隆到HincII水解的pUC18载体后，得到质粒pAS5/15.7。质粒pAS5/15.9含有0.15kb片断。
pAS5/15.12.质粒pAS5/15.1用限制性内切酶NcoI和KpnI水解。将产生的0.9kb NcoI/KpnI片断从1.2％琼脂糖凝胶上洗脱出(见实施例6)，连接到载体pUCBM21(用NcoI/KpnI水解)中，将该重组载体克隆到E.coli DH5α中，产生质粒pAS5/15.12。
15.游动放线菌2.6kb HindIII/PstI片断的DNA测序将实施例13和实施例14描述的质粒进行测序。来自一个制品(见实施例6)的6-8μg质粒DNA用于测序反应。用自读测序盒(Pharmacia，Freiburg，Germany)进行测序反应。使用dsDNA测序的标准方案。将荧光标记的通用测序引物和反测序引物用作测序反应的起始分子(见表3)，以使能够用A.L.F.评价核苷酸序列。将8ml Hydro Link Ranger(serva，Heidelberg，Germany)、33.6g尿素、8ml 10×TBE缓冲液和水混合至80ml，将混合物过滤灭菌并脱气1分钟以制备凝胶。加入350μl 10％(w/v)过硫酸铵和40μl N，N，N’，N’-四甲基乙二胺起始聚合反应。将溶液注入胶模(50×50×0.05cm)中。在38W、45℃恒温下进行电泳。1×TBE缓冲液用作电泳缓冲液，使用也用来控制电泳仪(A.L.F.Manager2.5 program；Pharmacia)的连接的计算机(Compaq 386/20e)将测定的荧光处理为DNA序列。
16.阿卡维基转移酶在浅青紫链霉菌中的过量表达由穿梭载体pUWL201在浅青紫链霉菌TK21中表达游动放线菌的阿卡维基转移酶基因(acbD)(U.Wehmeier，未发表，Fig.2)。质粒(6.4kb)由载体pUWL199(Wehmeier，1995)组成，其中用含有ermE*p启动子(Bipp et al.，1994)的KpnI/XbaI片断和pBLUESCRIPT多重接头(Stragenea)的HincII/ClaI部分取代2.0kb KpnI/XbaI片断。将质粒pAS5/15.1(见实施例12)用限制性内切酶HindIII和PstI水解，以将acbD基因克隆到E.coli DH5α和S.TK21中。将产生的2.6kb HindIII/PstI片断连接到载体pUWL201(用HindIII和PstI水解)中，将产生的重组质粒克隆到E.coli DH5α中。产生的质粒命名为pAS9。从E.coli DH5α用碱裂解法制备质粒pAS9，用原生质体转化法(Hopwood et al.，1985)将其克隆到浅青紫链霉菌TK21中。在该克隆中，acbD基因在组成型ermE*p启动子(M.Bibb，Norwich，England；个人通讯)的控制下。浅青紫链霉菌TK21/pAS9在TSB培养基(25μg/ml硫链丝菌肽)中培养后，在SDS聚丙烯酰胺凝胶(Lugtenberg et al.，1975)上可以探测到75kDa明显带的上清液中的额外蛋白。
17.由于基因断裂的阿卡维基转移酶的失活游动放线菌阿卡维基转移酶基因(acbD)用基因断裂法失活。为此，将游动放线菌的染色体acbD基因用抗生素抗性基因部分取代。通过同源重组插入抗生素抗性基因。初步试验证明，游动放线菌对抗生素红霉素、链霉素、安普霉素、新霉素和卡那霉素敏感。因此将抗生素抗性基因ermE、aphD1、aaC4和aph用于诱变。在第一个实施例中，来自载体pUGT1(Ingham et al.，1995)的抗红霉素抗性基因(ermE)用来失活acbD。为此，用KpnI水解pUGT1后，在琼脂糖凝胶上分离出1.5kb大小的KpnI片断上的抗性基因，然后从胶中分离出抗性基因。用限制性内切酶NcoI将质粒pAS5/15.1(见实施例12)线性化。NcoI识别序列在2.6kb克隆的染色体片断的1050bp处。用DNA聚合酶I的Klenow片断按照生产商的说明(Gibco BRL，Eggenstein，Germany)，将质粒pAS5/15.1和制备的1.5kb KpnI片断的水解末端转化为光滑的DNA双链末端。随后通过连接，将存在于1.5kb KpnI片断的红霉素抗性基因克隆到E.coli DH5α中的质粒pAS5/15.1的acbD基因中。将该质粒线性化。用常规方法(原生质体转化)导入。也可以通过与E.coliS17-1和游动放线菌接合转移重组质粒。电击法成为质粒转移的另一选择方法。用由红霉素抗性基因破坏的、构建的质粒的acbD基因取代染色体acbD基因，产生同源重组。由于发生双链交叉，产生游动放线菌属SE 50/110抗红霉素的acbD突变体。以下方法也可以用来将其它抗性基因重组到游动放线菌中(1)电击法，(2)原生质体转化(Hopwood etal.，1985)，(3)菌丝转化(Madon and Hutter，1991)和(4)接合(Mazodier etal.，1989)。
缓冲液和溶液细菌生长培养基LB培养基胰蛋白胨10gNaCl10g酵母浸出物5g水至1000mlpH用4M NaOH调至7.5TSB培养基胰蛋白胨-大豆肉汤(氧化型) 30g水至1000mlTE缓冲液(pH 8.0)Tris-HCl10mMNa2-EDTA 1mM质粒DNA的标准制备(由Bimboin和Doly，1979的方法修改)混合物I 50mM葡萄糖50mM Tris-HCl(pH 8.0)10mM EDTA(pH 8.0)5mg裂解酶/ml混合物II200ml NaOH1％(w/v)SDS(十二烷基磺酸钠)
混合物III 3M乙酸钠1.8M甲酸DNA/DNA杂交20×SSC 3M NaCl0.3M柠檬酸钠预杂交液6×SSC0.01M磷酸钠缓冲液，pH 6.81mM EDTA0.5％SDS0.1％脱脂奶粉杂交液在标记反应后，将acb探针加入15ml预杂交液中。
6×Postwah6×SSC0.5％SDSDNA测序TBE缓冲液(pH 8.0)1M Tris碱0.83M硼酸10mM EDTA文献1) Bibb，M.J.et al.(1994)The mRNA for the 23S rRNA methylase encoded by the ermE gene ofSaccharopolyspora erythraea is translated in the absence of a conventionalribosome-binding siteMol.Microbiol.14，33-545.2) Birnboim，H.C.，J.Doly(1979)A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNANucleic Acids Res.7，1513-15233) Hanahan，D.(1983)Studies on transformation of Escherichia coli with plasmidsJ.Mol.Biol.166，557-5804) Hopwood，D.A.et al.(1985)Genetic manipulation of Streptomyces；A laboratory manual；The John Innes Foundation，Norwich，England5) Ingham，C.J.，et al.(1995)Rho-independent terminators without 3′poly-U tails from the early region ofactinophage phi C31Nucleic Acids Res. 23，370-373.6) Lugtenberg，B.et al.(1975)Electrophoretic resolution of the major outer membrane protein of Escherichiacoli into four bandsFEBS Lett.58，254-258.7)Madon，J.，R.Hütter(1991)Transformation System for Amycolatopsis (Nocardia) mediterranei；direct8)Mazodier，P.et al.(1989)Intergenic conjugation between Escherichia coli and Sureptomyces speciesJ.Bacteriol.171，3583-35859)Sanger，F.et al.(1977)DNA sequencing with chain terminating inhibitorsProc.Natl.Acad.Sci.USA 74，5463-546710) Southern，E.M.(1975)Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gelelectrophoresisJ.Mol.Biol.98，503-52111) Wehmeier，U.F.(1995)New functional Escherichia coli-Streptomyces shuttle vectors allowing blue-white screening on Xgal platesGene 165，49-150
权利要求
1.阿卡维基转移酶。
2.来源于游动放线菌属菌株SE 50或SE 50/13或SE 50/110及其变异株的阿卡维基转移酶。
3.基本上纯的阿卡维基转移酶。
4.具有图3氨基酸序列的阿卡维基转移酶及其功能衍生物。
5.图4中编码阿卡维基转移酶的DNA序列及其功能衍生物。
6.将阿卡波糖微量组分转化为阿卡波糖的方法，阿卡维基-Gn+麦芽糖→阿卡波糖+Gn，其中Gn表示葡萄糖、双糖和麦芽寡糖，其特征在于，反应由阿卡维基转移酶催化。
7.阿卡维基转移酶在诸如α-淀粉酶抑制素(trestatin)或抑淀粉酶素之类的其它假寡糖转化为阿卡波糖中或其它糖苷酶抑制剂的转化中的用途。
8.阿卡维基转移酶的用途，即从培养的上清液中富集阿卡波糖，而同时通过与高分子量糊精或淀粉在阿卡维基转移酶的存在下，将阿卡波糖同系物转化为阿卡波糖，阿卡维基-(G)n+(G)m→阿卡维基-(G)m+(G)n其中，G表示葡萄糖，m和n分别表示1-20的整数，而且m与n不同；借助于透析或反渗透或通过沉淀多糖，除去低分子量杂质，然后在足够高浓度的麦芽糖存在下，用阿卡维基转移酶与麦芽糖反应，释放阿卡波糖，阿卡维基-(G)m+(G)n→阿卡维基-(G)n+(G)m
9.阿卡维基转移酶在异源宿主生物中的重组制备。
10.含有按照权利要求5的DNA的载体。
全文摘要
本发明涉及来自放线菌、主要来自游动放线菌属菌株SE50/110及其变异体的阿卡维基转移酶,涉及酶的分离、纯化和定性的方法,涉及编码阿卡维基转移酶的acbD基因的分离和定性,涉及阿卡维基转移酶在异源宿主生物中的表达,涉及用来将阿卡波糖微量组分转化为阿卡波糖以及用于阿卡波糖制备的阿卡维基转移酶的用途,涉及阿卡维基转称酶在阿卡波糖纯化中的用途,也涉及通过使阿卡维基转移酶失活以降低微量组分生成的生产变异株的制备。
文档编号C12R1/19GK1172161SQ9710490
公开日1998年2月4日 申请日期1997年3月21日 优先权日1996年3月22日
发明者A·克鲁格, H·G·德尔维, J·G·伦兹, W·施罗德, H·佩普, K·格尔克, B·沙珀, M·汉克, W·派珀斯伯格, J·迪斯特勒, A·斯拉特拉斯曼 申请人:拜尔公司