微生物工业发酵连续转接新工艺的制作方法

专利名称：微生物工业发酵连续转接新工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵特别是生物农药、生物饲料添加剂微生物工业固态发酵工艺流程。
现行微生物工业固态发酵工艺流程分为两个部分，第一部分是液态菌种放大工艺过程；第二部分是开放式固态发酵培养工艺过程。
第一部分，液态菌种放大工艺遵循无菌操作原则，取经纯化培养的(苏云金杆菌或饲料酵母)沙土管菌种，转接在茄形瓶斜面上，在30℃温度下，培养72小时，将培养菌种制成芽孢悬液，接种到800ml摇瓶中，上摇床培养7～9小时，将培养物转接到一级种子培养罐中，进行放大培养7～9小时之后，将一级种子培养罐中的培养物用压差法转接入二级种子培养罐中，再进行放大培养7～9小时，将二级种子培养罐中的培养物转接固态培养基中，第一部分完成。
第二部分，开放式固态发酵培养工艺过程继第一部分，将培养基中的物料分装到长45～90cm、宽30～45cm、高2～5cm、底部有孔(或无孔)的器皿中，用灭菌的报纸或棉布覆盖，置在架子上在26～32℃的温度下培养发酵后48～72小时，发酵培养过程完毕。
现行微生物工业固态发酵培养工艺流程要进行菌种五次转接，从开始操作到发酵培养过程结束，需要141～171个小时。
现行微生物固态发酵培养工艺流程环节多，特别是在第一部分液态菌种放大工艺流程中，易受噬菌体的污染，这是由于溶源性噬菌体的特性引起的，往往造成菌种放大失败。第二部分发酵培养工艺过程，由于是开放式发酵培养，容易被杂菌污染，造成发酵质量不容易保证，发酵时间长，成本高。
本发明为克服现有技术存在的问题，提供一种流程筒单、可减少噬菌体和杂菌污染、节约时间、降低生产成本、提高产品质量的工艺。
本发明的发酵工艺流程是按照本发明的发酵工艺流程，遵循无菌操作原则，准备好三台固态反应器，做好1、2、3号固态反应器的标记。
第一部分工艺流程取经纯化培养的沙土管菌种，转接在茄形瓶斜面上，在30℃温度下，培养72小时，将培养菌种制成芽孢悬液，接种到800ml摇瓶中，上摇床培养7～9小时，将培养物转接到一级种子培养罐中，进行放大培养7～9小时之后，将一级种子培养罐中的培养物用压差法转接入二级种子培养罐中，再进行放大培养7～9小时，将二级种子培养罐中的培养物转接入蒸料罐中，再从蒸料罐转接到1号固态反应器中，完成上述工艺流程需要五次转接，历时93～99小时。
第二部分工艺流程，这是本发明的核心所在。
待1号固态反应器发酵培养12～20小时，取出1％～30％发酵物转接到2号固态反应器，剩余部分在1号固态反应器中继续发酵培养到终止后取出初级产品后再重新填料灭菌。待2号固态反应器培养罐发酵培养12～20小时，取出1％～30％发酵物转接到3号固态反应器，剩余部分在2号固态反应器中继续发酵培养到终止后取出初级产品后再重新填料灭菌。待3号固态反应器发酵培养12～20小时，取出1％～30％发酵物转接到已经填好新料并灭过菌的1号固态反应器，剩余部分在3号固态反应器中继续发酵培养到终止后取出初级产品，依此第二部分进行循环既可生产出初级产品，第二部分工艺流程仅需要一次转接，从转接到出产初级产品为36小时。
进入第二部分工艺流程达到正常循环后，不再需要进行第一部分工艺流程，减少了四次转接环节，节省了93～99小时的时间。
第三部分工艺流程如果在第二部分循环一段时间后发现有杂菌污染的情况，将固态反应器等彻底消毒灭菌，重复第一部分工艺流程进入第二部分工艺流程循环。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果1、节约了时间。进入第二部分工艺流程循环后，不再需要反复操作第一部分工艺流程，可节省93～99小时的时间。
2、工艺流程简化。进入第二部分工艺流程循环后，不再需要反复操作第一部分工艺流程，工艺流程明显减少。
3、容易控制杂菌污染特别是噬菌体污染。
第一、由于减少了原种的使用次数，有效地防止原种的污染和退化；第二、由于最大限度的减少了液态菌种放大工艺过程，减少了菌种接转次数，有效地防止噬菌体的污染；第三、由于工艺流程中的第二部分是在封闭反应器中完成发酵的，能很好地控制污染。
4、减少人力、能量消耗。进入第二部分工艺流程循环后，不再需要反复操作第一部分工艺流程，培养发酵时间明显缩短，便于操作用人、用电等可减少。
5、综合成本下降。本发明简化了工艺流程，能较好地控制污染，减少培养发酵失败次数，节约人力，减少能量消耗，工作效率提高，使综合成本下降。
按照本发明的固体发酵工艺流程，在广东梅县金云生物工程有限公司生产了苏云金杆菌(BT)生物农药。
实施例一首先准备好三台固态反应器，做好1、2、3号固态反应器的标记。
先从第一部分工艺流程开始操作取经纯化培养的苏云金杆菌沙土管菌种，转接在茄形瓶斜面上，在30℃温度下，培养72小时，将培养菌种制成芽孢悬液，接种到800ml摇瓶中，上摇床培养8小时，将培养物转接到一级种子培养罐中，进行放大培养8小时之后，将一级种子培养罐中的培养物用压差法转接入二级种子培养罐中，再进行放大培养8小时，将二级种子培养罐中的培养物转接入蒸料罐中，再从蒸料罐转接到1号固态反应器中。
上述流程完毕后进入第二部分工艺流程待1号固态反应器发酵培养12小时，取出1％发酵物转接到2号固态反应器，剩余部分在1号固态反应器中继续发酵培养到终止后取出初级产品后再重新填料灭菌。待2号固态反应器培养罐发酵培养12小时，取出1％发酵物转接到3号固态反应器，剩余部分在2号固态反应器中继续发酵培养到终止后取出初级产品后再重新填料灭菌。待3号固态反应器发酵培养12小时，取出1％发酵物转接到已经填好新料并灭过菌的1号固态反应器，剩余部分在3号固态反应器中继续发酵培养到终止。
本实施例的产品经农药送到农业部农药检定所检验，毒力效价为11300IU/mg，超过农业部规定的苏云金杆菌生物农药毒力效价为8000IU/mg的行业标准。
实施例二首先准备好三台固态反应器，做好1、2、3号固态反应器的标记。
先从第一部分工艺流程开始操作取经纯化培养的苏云金杆菌沙土管菌种，转接在茄形瓶斜面上，在30℃温度下，培养72小时，将培养菌种制成芽孢悬液，接种到800ml摇瓶中，上摇床培养8小时，将培养物转接到一级种子培养罐中，进行放大培养8小时之后，将一级种子培养罐中的培养物用压差法转接入二级种子培养罐中，再进行放大培养8小时，将二级种子培养罐中的培养物转接入蒸料罐中，再从蒸料罐转接到1号固态反应器中。
上述流程完毕后进入第二部分工艺流程待1号固态反应器发酵培养16小时，取出15％发酵物转接到2号固态反应器，剩余部分在1号固态反应器中继续发酵培养到终止后取出初级产品后再重新填料灭菌。待2号固态反应器培养罐发酵培养16小时，取出15％发酵物转接到3号固态反应器，剩余部分在2号固态反应器中继续发酵培养到终止后取出初级产品后再重新填料灭菌。待3号固态反应器发酵培养16小时，取出15％发酵物转接到已经填好新料并灭过菌的1号固态反应器，剩余部分在3号固态反应器中继续发酵培养到终止。
本实施例的产品经农药送到农业部农药检定所检验，毒力效价为11234IU/mg，超过农业部规定的苏云金杆菌生物农药毒力效价为8000IU/mg的行业标准。
实施例三继续实施例二进行，待1号固态反应器发酵培养20小时，取出30％发酵物转接到2号固态反应器，剩余部分在1号固态反应器中继续发酵培养到终止后取出初级产品后再重新填料灭菌。待2号固态反应器培养罐发酵培养20小时，取出30％发酵物转接到3号固态反应器，剩余部分在2号固态反应器中继续发酵培养到终止后取出初级产品后再重新填料灭菌。待3号固态反应器发酵培养20小时，取出30％发酵物转接到已经填好新料并灭过菌的1号固态反应器，剩余部分在3号固态反应器中继续发酵培养到终止。
本实施例的产品经农药送到农业部农药检定所检验，毒力效价分别为17590IU/m9，超过农业部规定的苏云金杆菌生物农药毒力效价为8000IU/m9的行业标准。
实施例四
首先准备好三台固态反应器，做好1、2、3号固态反应器的标记。
先从第一部分工艺流程开始操作取经纯化培养的微生物饲料沙土管菌种，转接在茄形瓶斜面上，在30℃温度下，培养72小时，将培养菌种制成芽孢悬液，接种到800ml摇瓶中，上摇床培养8小时，将培养物转接到一级种子培养罐中，进行放大培养8小时之后，将一级种子培养罐中的培养物用压差法转接入二级种子培养罐中，再进行放大培养8小时，将二级种子培养罐中的培养物转接入蒸料罐中，再从蒸料罐转接到1号固态反应器中。
上述流程完毕后进入第二部分工艺流程待1号固态反应器发酵培养12小时，取出5％发酵物转接到2号固态反应器，剩余部分在1号固态反应器中继续发酵培养到终止后取出初级产品后再重新填料灭菌。待2号固态反应器培养罐发酵培养12小时，取出5％发酵物转接到3号固态反应器，剩余部分在2号固态反应器中继续发酵培养到终止后取出初级产品后再重新填料灭菌。待3号固态反应器发酵培养12小时，取出5％发酵物转接到已经填好新料并灭过菌的1号固态反应器，剩余部分在3号固态反应器中继续发酵培养到终止。按上述工艺进行发酵生产出的饲料添加剂的结果为每克含菌量在200亿以上。
权利要求
1.一种微生物工业发酵连续转接新工艺，取纯化培养的苏云金杆菌或饲料酵母沙土管菌种，转接茄形瓶培养，制成悬液，接种到摇瓶上摇床培养，将培养物转接到一级种子罐，放大培养后，用压差法转接入二级种子培养罐，再放大培养将培养物转接固态培养基，将培养基的物料分装到底部有孔(或无孔)的器皿中，置在架子上培养发酵，其特征是将放大后菌种接种到1号固态反应器发酵培养12～20小时，取出1％～30％发酵物转接到2号固态反应器，剩余部分在1号固态反应器继续发酵成初级产品；待2号固态反应器培养罐发酵培养12～20小时，取出1％～30％发酵物转接到3号固态反应器，剩余部分在2号固态反应器继续发酵成初级产品；待3号固态反应器发酵培养12～20小时，取出1％～30％发酵物转接到已经填好新料并灭过菌的4号固态反应器，剩余部分在3号固态反应器中继续发酵成初级产品，依此循环。
全文摘要
本发明涉及微生物发酵特别是微生物工业发酵工艺流程。针对现行微生物发酵工艺流程长、环节多、易污染杂菌、发酵质量难保,本发明提供一种流程简单、减少杂菌污染、省时、成本低、提高产品质量的工艺。本发明将培养罐中的发酵物作为菌种直接转接到另一培养罐,依此循环,工艺流程简单、较好控制污染、节约人力、物力、财力、工作效率、产品质量提高,成本下降。
文档编号C12M1/16GK1221031SQ9811763
公开日1999年6月30日 申请日期1998年8月26日 优先权日1998年8月26日
发明者刘放 申请人:刘放