专利名称：牛FcγRI、FcγRⅢ和CD14的cDNA序列的制作方法
技术领域：
本发明属于分子和细胞生物学领域，涉及牛的DNA序列，特别是涉及对牛FcγRI，FcγRIII和CD14的cDNA序列分析。众所周知，人和动物对病原体的抵抗力(免疫力)有特异性和非特异性之分，采取一些人为的措施和手段例如接种疫苗，注射免疫球蛋白，服用中草药免疫增强剂等都可以引起机体的免疫反应，从而达到提高人和动物的免疫能力的目的。免疫反应包括细胞免疫和体液免疫两种应答形式。当机体遇到病原细菌感染时，即产生以抗体为主的体液免疫；若人和动物体遇到病毒、霉形体或寄生虫等病原体感染时，产生以细胞因子为主的细胞免疫应答，但二者不是单独作用，而是相辅相成并有机地结合在一起，共同对付病原体。事实证明，免疫球蛋白G(IgG)是抗体的主要成份，当体内免疫反应启动时，IgG通过与细胞表面的Fc受体结合，激活靶细胞，使后者产生并释放细胞因子及其它活性物质，诱发机体一系列免疫反应，最终将病原体杀死或清除。由此看来，存在于白细胞表面的IgG的Fc受体在机体的免疫反应中扮演着极其重要的角色。
免疫球蛋白G的Fc受体(FcγR)包括牛FcγRI、FcγRII和FcγRIII，它们分别被称为CD64、CD32和CD16。其主要功能是参与机体对异物的识别和清除，ADCC、抗原的处理和提呈、抗体和细胞因子产生的调控及信号转导等，在机体细胞免疫和体液免疫中起桥梁作用。CD14为革兰氏阴性细菌细胞壁主要成份脂多糖(LPS)及脂多糖结合蛋白复合物(LBP)的受体，也是一种白细胞分化抗原，它在机体细胞因子产生调控方面，尤其在病原体为革兰氏阴性菌的疾病的发生、发展和转归方面起着重要作用。因此，研究这些受体和CD14的结构不但在理论上有助于理解其结构与功能关系，阐明它在体内的作用机制，还可以从实践中进一步探索提高机体免疫能力的方法。
近年来对IgG Fc受体的研究已成为分子免疫学领域中的研究热点。据我们查新检索，与本研究相关的文献国外有3篇，国内尚无此类报道。1992年英国学者Symons用分子杂交方法获得了牛FcγRI的部分编码基因(约0.7kb)，但不是全长基因，未能反映出FcγRI的全部基因结构；另外，Collins等英国学者在1997年发表了用RT-PCR方法获得来源于牛肠系膜淋巴结单核细胞的牛FcγRIII的编码基因，全长为0.75kb，我们获得的牛FcγRIII的编码基因为0.5kb，和Collins等报道的差异较大，可能属于另一类型；日本学者Ikeda等在1997年发表了牛CD14的全长基因序列，但他们是从染色体基因中获得的，在其编码序列中含有内含子，我们是从反转录后的cDNA文库中调取的编码牛CD14的全长基因，不含有内含子，更能反映牛CD14mRNA的真实结构。
本发明的目的在于以牛做为反刍动物的代表对其IgG Fc受体FcγRI、FcγRIII及CD14的编码基因进行克隆和序列分析。
本发明的技术方案是用健康牛的肺巨噬细胞构建牛的cDNA文库，采用标记磁微粒技术结合PCR方法对构建的牛肺巨噬细胞cDNA文库进行筛选，分别克隆到了牛的FcγRI，FcγRIII和CD14的编码基因。
其具体的做法是(1)首先构建牛的cDNA文库。用PBS将肺泡中的巨噬细胞洗出，用尼龙膜过滤除去沉淀后制成细胞悬液，用CsCl作垫层进行超速离心以提取牛肺巨噬细胞的总RNA，再用OLIGO(dT)柱层析方法分离出mRNA，用随机引物将提取的mRNA反转录为cDNA。加T4DNA聚合酶补平，再将含有BstXI酶切质粒pCDM8，回收大片段，然后用修饰过的cDNA与pCDM8大片段连接，转化大肠杆菌MC1061/P3，构成牛的cDNA文库。
(2)将一定数量的COS-7细胞铺到培养板中，37℃培养至50％连成片时(约24h)，每孔各加进一定量的牛肺巨噬细胞cDNA文库和转染试剂。转染24h后，倒掉培养液，用不含血清的DMEM洗一次，加EDTA消化COS-7细胞，并收集到离心管中。
(3)分别用鸡的卵清蛋白或抗牛CD14单克隆抗体按要求标记磁微粒。取适量标记磁微粒加到所收集的COS-7细胞中，混匀并在室温下孵育，将管子放在一块磁铁上片刻，待磁微粒沉淀后弃上清，重复洗3次，然后提取沉淀细胞中的质粒DNA，转化大肠杆菌。
(4)参考牛FcγRI和FcγRIII的已知基因片段序列，以及人和小鼠CD14基因中的保守序列，用引物分析软件设计一对引物，随机挑取转化子，按每10个为一组，混合培养后提取质粒DNA并进行PCR扩增，待有特异性DNA条带时，再用PCR扩增该组的单个菌落的质粒DNA，直到筛选到单个的阳性菌落为止。
(5)提取单个阳性菌落的质粒DNA，将插入片段亚克隆至克隆载体中，用自动序列测定系统，进行荧光素标记测序。
图1为牛FcγRIcDNA的核苷酸序列和所推导的氨基酸序列。从图1中可以看出，牛FcγRI的cDNA序列共1.4kb，其中含有编码基因1047bp，共编码349个氨基酸，含有16个氨基酸组成的信号肽序列和有23个氨基酸组成的穿膜区以及5个可识别的N-连接糖基化位点，另有6个半胱氨酸组成的三个环状胞外结构域。
图2为牛FcγRIII的cDNA序列和所推导的氨基酸序列。从图2中可以看出，牛FcγRIII cDNA序列共590bp，其中含有编码基因504bp，共编码168个氨基酸，它含有16个氨基酸组成的信号肽序列，22个氨基酸组成的穿膜区和3个可识别的N-连接糖基化位点，另有一个C2环状胞外结构域。
图3为牛CD14的cDNA序列和所推导的氨基酸序列。从图3中可以看出，牛CD14的cDNA序列共有1166bp，含有编码基因1119bp，共编码373个氨基酸。其中含有20个氨基酸构成的信号肽序列和3个可识别的N-连接糖基化位点。
实施例一，牛FcγRI cDNA序列的克隆方法及测序。
用上述方法构建牛cDNA文库，将一定数量的COS-7细胞(购自中国科学院上海细胞学研究所)铺到培养孔中，在37℃培养至50％连成片时，约24h，每孔各加入2μg牛肺巨噬细胞cDNA文库和20μl转染试剂(Gibco公司，美国)，转染24h，倒培养液，用不含血清的DMEM(Gibco公司，美国)洗一次，加0.02％的EDTA消化COS-7细胞，并收集到E ppendorf管中。
用鸡卵清蛋白(华美生物工程公司)按说明书要求标记磁微粒[DynabeadsM450(Tosylactivated)购自挪威Dynal A.S公司]后，再加牛抗鸡卵清蛋白的血清吸附标记的磁微粒，然后取该磁微粒100μl(1∶10稀释)加到COS-7细胞中，混匀并在室温下孵育30min，将存放有细胞的Eppendorf管放于一磁铁上片刻，等到磁微粒沉淀后弃上清液，再加适量PBS，重复洗3次，然后按Hirt法提取沉淀细胞中的质粒DNA，转化大肠杆菌MC1061/P3(购于Invitrogen公司)。
采用Symons等发表的编码牛FcγRI的部分基因片段，用引物分析软件设计一对PCR引物，F1为5′CGATGACAGTGGTGAATA，F2为5′-GGCTGCGCTTGATAAGAT。随机挑取转化子，按每10个为一组，混合培养后提取质粒DNA并进行PCR扩增，反应程序为94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸2min，共进行30个循环，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，待有特异性DNA条带时，再用PCR扩增该组的单个菌落的质粒DNA，直到筛选到单个的阳性菌落为止。提取单个阳性菌落的质粒DNA，将插入片段亚克隆至pUC19(购自华美生物工程公司)，用ABI公司的373A自动序列测定系统进行荧光素标记测序，可获得前面公布图1的核苷酸序列和所推导的氨基酸序列及分析结果。
序列分析表明，牛FcγRI由349个氨基酸构成，其氨基酸序列与人和小鼠FcRI的同源性分别为64.8％和61.9％。
实施例二，牛FcγRIII cDNA序列的克隆方法及测序。
1、牛肺巨噬细胞cDNA文库的构建同实施例一，不重述。
2、PCR引物的设计及合成参照Collins等发表的从牛肠系膜淋巴结的单核细胞中获得的FcγRIII的基因序列，用OLIGO引物分析软件(4.1版)设计一对引物上游引物为5′-CACTCTAACACACAGCATGT，下游引物是5′-TGGGTGAAGGATCCTCAGAT，后者含有BamHI酶切位点，引物由中国科学院微生物研究所合成。
3、PCR扩增条件及其产物的鉴定取牛cDNA文库4μl，加dNTP至终浓度为200μM，MgCl2为1.5mM，上下游引物各为0.2μM，Taq酶1.5U，总体积50μl，反应条件为94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸2min，共进行30个循环，然后进行琼脂糖凝胶电泳和酶切鉴定。
4、PCR产物的克隆和序列分析，先用Wizard PCR产物纯化试剂盒(Promega公司，美国)按说明书要求对PCR产物进行纯化，再将PCR产物用Klenow酶补平，用BamHI酶切后，与Puc19-SmaI-BamhI连接，构成pUR3.
5、转化大肠杆菌DH5α，筛选重组子，将酶切鉴定过的重组子用Qiagen试剂盒(GmbH公司，德国)提取并纯化后，再用373A自动序列测定系统进行荧光素标记测序，可获得前面公布图2的牛FcγRIII的cDNA核苷酸序列和所推导的氨基酸序列及分析结果。
实施例三，牛CD14 cDNA序列的克隆方法及测序。
按上述方法构建牛肺巨噬细胞cDNA文库。COS-7细胞、磁微粒、大肠杆菌MC1061/P3、穿梭质粒pCDM8和质粒pUC19，其来源同实施例一或二，不再注明。
单克隆抗体CC-G33的制备用Tritonx-100裂解分离的牛外周血白细胞，离心取上清，再用Sepharose柱进行亲和层析，取纯化物免疫SPF Balb/c小鼠制备单克隆抗体，用FACSan技术鉴定单抗的特异性。
磁微粒的抗体标记取4×107个Dyhabeads，加单克隆抗体CC-G33约5μg，按说明书要求进行标记。
阳性细胞的筛选按1×105个/孔的数量将COS-7细胞铺到6孔培养板(35mm)中，37℃培养至50％连成片时(约24h)，按Lipofectin试剂盒(GibcoBRL公司，美国)说明书要求进行转染，每孔加2μg cDNA文库和20μl转染剂。转染24h后倒去培养液，用不含血清的DMEM洗一次，加0.02％的EDTA消化COS-7细胞，并收集到Eppendorf管中，洗后加标记磁微粒100μl(1∶10稀释)，混匀并在室温下孵育30min，将管子放于一磁铁上片刻，待磁粒沉淀后弃上清，再加适量PBS，重复3次，然后按Hirt法提取沉淀细胞中的质粒DNA，转化大肠杆菌MC1063/P3。
PCR引物的设计和重组质粒的鉴定参考人和小鼠CD14基因中的保守序列，用OLIGO引物分析软件(4.1版)设计一对引物，hu2(5′-GAGCATTGCCCAAGCACACT)和Hu3(5′-GCCCAGCGAACGACAGATTG)，扩增长度为308bp。随机挑取转化子，按每10个为一组，混合培养后提取质粒DNA并进行PCR扩增，反应条件为94℃变性1min，60℃退火1min和72℃延伸1min，共进行30个循环经琼脂糖凝胶电泳鉴定，待有特异性DNA条带时，再用PCR扩增该组的单个菌落的质粒DNA，直到筛选出单个的阳性菌落为止。
牛CD14基因的克隆和序列分析用HindIII和XbaI双酶切重组质粒，回收插入片段，亚克隆至pUC19中，再用373A自动序列测定系统(ABI，美国)进行荧光素标记测序。获得前面公布图3的核苷酸序列和所推导的氨基酸序列及分析结果。
牛CD14与人及鼠的CD14同源性比较通过序列比较发现，牛CD14基因的核苷酸序列与人及小鼠的CD14的同源性分别为78％和69％，所推导的氨基酸序列与人CD14的同源性为73.5％，而与鼠CD的同源性仅为61.4％，三者之间的氨基酸序列的同源性为55％。
权利要求
1.一种牛FcγRI的cDNA序列。
2.根据权利要求1所述的cDNA序列，含有核苷酸序列和所推导的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的cDNA序列，核苷酸序列中含有编码基因1047个碱基对(bp)，共编码349个氨基酸。
4.根据权利要求1所述的cDNA序列，所推导的氨基酸序列中含有16个氨基酸组成的信号肽序列、23个氨基酸组成的穿膜区和5个可识别的N-连接糖基化位点，另有6个半胱氨酸组成的三个环状胞外结构域。
5.一种牛FcγRIII的cDNA序列。
6.根据权利要求5所述的cDNA序列，含有核苷酸序列和所推导的氨基酸序列。
7.根据权利要求5所述的cDNA序列，核苷酸序列中含有编码基因504bp，共编码168个氨基酸。
8.根据权利要求5所述的cDNA序列，所推导的氨基酸序列中含有16个氨基酸组成的信号肽序列、22个氨基酸组成的穿膜区和3个可识别的N-连接糖基化位点，另有一个C2环状胞外结构域。
9.一种牛CD14的cDNA序列。
10.根据权利要求9所述的cDNA序列，含有核苷酸序列和所推导的氨基酸序列。
11.根据权利要求9所述的cDNA序列，核苷酸序列中含有编码基因1119bp，共编码373个氨基酸。
12.根据权利要求9所述的cDNA序列，所推导的氨基酸序列中含有20个氨基酸构成的信号肽序列和3个可识别的N-连接糖基化位点。
全文摘要
本发明涉及牛的DNA序列,特别是涉及对牛FcγRI,FcγRⅢ及CD14进行分子克隆和cDNA序列分析。采用健康牛肺巨噬细胞构建牛cDNA文库,用标记磁微粒技术结合PCR方法对构建牛cDNA文库进行筛选,分别克隆到了牛FcγRI,FcγRⅢ和CD14的编码基因。牛FcγRIcDNA序列含有核苷酸1.4kb,其中含有编码基因1047bp,共编码349个氨基酸;牛FcγRⅢcDNA序列590bp,其中含有编码基因504bp,共编码168个氨基酸;牛CD14cDNA序列1166bp,含有编码基因1119bp,共编码373个氨基酸。
文档编号C12N15/12GK1266900SQ99103330
公开日2000年9月20日 申请日期1999年3月16日 优先权日1999年3月16日
发明者阎玉河, 张改平, 邓瑞广, 李培庆, 杨艳艳, 李学伍, 郭军庆, 李青梅, 王爱萍 申请人:河南省农业科学院畜牧兽医研究所