专利名称：重组木聚糖酶、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型的重组木聚糖酶及其应用，以及一种制备木聚糖酶的方法。
木聚糖，是植物细胞壁中的半纤维素的主要成份，由木糖(D-Xylose)分子以1→4β连结成主链，另外在支链上由阿拉伯呋喃糖、甲基葡萄糖或乙酰基以1→3或1→2来连结。在造纸工业中常使大量的木聚糖流失，并因无法加以有效利用而将其当成废物倾倒入小溪或河流中，造成资源浪费并影响生态环境。另外于农牧业中，牲畜所食用的大量饲料中亦含有许多木聚糖。不过，因动物体内没有可分解木聚糖的酶而无法被动物吸收代谢。所以如果能将木聚糖分解成五碳糖，不仅可以将造纸过程中的残渣作良好的利用，减少污染外；也可应用在饲料内，促进牲畜对饲料的利用率，具有节省饲料量的经济效果。
为了上述目的，研发微生物中特有的木聚糖酶以应用便成了目前公认最有效率的可行方法。例如USP 5,116,746、USP 5,179,021、USP5,407,827、USP 5,437,992、USP 5,498,534、USP 5,591,304即揭示于纸浆中加入木聚糖酶可帮助褪色漂白并分解残留的木聚糖；另外，USP5,429,828、USP 5,445,957、USP 5,612,055、USP 5,622,738等专利也曾揭示可将木聚糖酶添加在含大量半纤维素的饲料中帮助动物分解木聚糖，促进动物的吸收与生长。
木聚糖酶[内-1，4-b-木聚糖酶(endo-1，4-xylanase EC3.2.1.8)]可将木聚糖分解变成较短链的木寡糖，甚至可完全水解成单分子木糖。木聚糖酶普遍存在于许多微生物中，使它们可利用此酶与其他可分解多糖类的酶一起分解植物细胞壁中的木聚糖以获得所需代谢能量。另外，在一些以植物为食物的昆虫及甲壳类动物中也发现含有木聚糖酶。由此可知此酶除了不存在于哺乳类动物外，分布非常广泛[A.Sunna和G.Antranikian，1997，Crit.Rev.Biotech.17(1)39-67；Peter Biely，1985，Trends in Biotech.3(11)286-290]。
已知可发酵产生木聚糖酶的微生物包括黑曲霉(Aspergillus niger)、出芽短柄霉(Aureobasidium pullulans)、头孢属(Cephalosporium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)；如USP 5,591,619、USP5,534,429、5,491,087对此都有详述。不过活性未令人满意，产量低，费用高，纯化步骤繁复为这些现有技术的共同缺点，所以目前产业界所使用的木聚糖酶，不论在来源还是制备方法方面皆仍有极大的改良空间。
本发明的目的是提供一种新颖的具有木聚糖酶活性的蛋白质及其编码核酸序列。
本发明的进一步目的是提供一种制备具有木聚糖酶活性之蛋白质的方法。根据本发明的方法制得的蛋白质不但产量极高，而且亦具有极佳活性，并易纯化。
本发明因而提供本发明方法中用于插入可以表达具有木聚糖酶活性的蛋白质的基因所必须的聚合酶链反应引物。
本发明亦提供本发明方法中所构建的新颖重组质粒及转化细胞。
本发明的另一目的是提供一种分解木聚糖的管柱，其包含本发明之具有木聚糖酶活性的新型蛋白质。
附图简要说明
图1根据Millward-Sadler，S.J.等人所发表的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)之木聚糖酶的基因结构、功能区域及本发明重组该段基因编码序列的过程。
图2pET20b/xyldl表达质粒的示意图。
图3重组木聚糖酶基因xyldl的DNA序列(841bp)，其中粗体TCA表示催化性区域与纤维素结合区域的交接处。
图4重组木聚糖酶基因xyldl的氨基酸序列。
图5A和5B本发明转化菌株所表达的野生型(A)和重组(B)木聚糖酶于12％聚乙烯酰胺凝胶上的电泳分析图，图5AM分子量标记，其余各行含pET20b/xylns表达质粒的BL21总菌蛋白，箭头指出野生型木聚糖酶的分子量；图5BM分子量标记，CBL21对照组(没有表达产物)，第1至6行含pET20b/xyldl表达质粒的BL21总菌蛋白，箭头指出本发明重组木聚糖酶的分子量。
图6Xyld、Xylns与出芽短柄霉(Aureobasidium pullulans)木聚糖酶活性的比较图，-●-Xylds(123单位/微克)，-△-Xylns(5.7单位/微克)，-口-市售出芽短柄霉(Aureobasidium pullulans)木聚糖酶(Sigma)。
图7Xyld对pH值的稳定性分析图。
图8Xyld对温度的稳定性分析图。
图9面包酵母表达的木聚糖酶于12％聚乙烯酰胺凝胶上的电泳分析图，M行分子量标记，C行酵母菌培养基阴性对照组，第1行表达培养基5倍浓缩，第2行和第3行表达培养基10倍浓缩。
图10由酵母菌表达p416/xylds与大肠杆菌表达pET20b/xyldl的木聚糖酶的活性比较图，-●-酵母菌/Xylds(363.26单位/微克)，-○-大肠杆菌/Xyld(123单位/微克)，-口-对照组(非转化酵母菌细胞内蛋白质)。
图11p416/xylds表达质粒的示意图。
源自微生物的木聚糖酶基因可藉由常规方法予以扩增，例如聚合酶链反应(PCR)。此反应是从1980年代以来常用的一种扩增特定基因的技术(如USP 4,683,195、4,683,202等)，其实施步骤是先设计含目标基因两端序列的引物并合成后，在商购的自动化装置(温度循环机)内，重复进行开双链，与引物粘合，聚合酶合成新双链DNA以在活体外得所要的目标基因。
在本发明的一个具体实施方案中，天然木聚糖酶基因是根据Millward-Sadler及Davidson揭示的假单胞菌木聚糖酶基因5’端及3’端序列[Biochem.J.312，39-48(1995)]所合成的适当5’端及3’端引物，从荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中借助PCR扩增而得到。该产物被命名为xylns，随后将此DNA片段插入质粒中。
在上述具体实施方案中所使用的引物TLF+及JLF-，除了根据荧光假单胞菌(P.Fluorescens)木聚糖酶的特异性序列以外，同时也参照其他生物木聚糖酶基因的共有序列设计，其序列分别如下所示JLF+∶5’-ATTACCGTTAGCGAATCAAGCTCCGGTGGCAGCAGCJLF-5’-GCCACCGGAGCTTGATTCGCTAACGGTAATGTCGGA故该引物亦适于插入其他生物来源的木聚糖酶。
在本发明另一个具体实施方案中，以含有xylns序列的重组质粒作为PCR的模版，使用重叠延伸PCR方案(Ho等人，Gene 77，51-59，1989)得到含有编码重组木聚糖酶之DNA序列(xyldl，见图1)的重组质粒(见图2)，该重组木聚糖酶序列只保留催化性区域和纤维素结合性区域(见图3)。
在本发明另一个具体实施方案中，使用PCR将天然木聚糖酶基因中信号肽序列额外连接至xyldl而成xylds，随后将xylds插入载体中。
扩增所得的基因是以常规方式插入适当的载体中，包括可用于细菌、酵母菌、哺乳动物细胞及昆虫细胞表达系统的载体，例如pET、p4X6(GPD)、pPI9、pBR、pUC或pUB系列的质粒。本领域技术人员可依惯用或需要选用。
构建完成的载体随后以之转化适当的宿主细胞并令其表达。可用于本发明的宿主细胞包括细菌(如大肠杆菌)、酵母菌(如酿酒酵母(Saccharomyces cereversiae))、哺乳动物细胞(如小鼠纤维母细胞)、或是昆虫细胞(如Sf9细胞)等，其中优选为细菌和酵母细胞表达系统。不过大肠杆菌却常表达在包涵体内，自细菌中回收表达的蛋白必须先以尿素将此包涵体变性及溶解，再以透析膜恢复活性后才能获得具有活性的可溶性木聚糖酶。
在本发明进一步的具体实施方案中，分别将含有xylns及xyldl序列的质粒转化进入大肠杆菌中表达，并分别收集两种转化细胞的总蛋白质进行电泳分析(见图5A和5B)。依照野生型或重组木聚糖酶，表达量占总蛋白质份量的比例，显示经过删除突变的重组Xyld蛋白质产率远大于野生型Xylns。经重组后的木聚糖酶自包涵体溶出并恢复活性后，所得产率较野生株大5倍(重组蛋白约占细胞内蛋白质总量的60％)。
而在酵母菌表达方面，因在重组过程中木聚糖酶之编码信号肽的基因片段也插入表达质粒内而使酵母菌生产的木聚糖酶能够被分泌之培养液中而简化了纯化步骤。在30℃的温度下培养36-38小时，木聚糖酶的产量约可达1微克/毫升。
在本发明进一步的具体实施方案中，将经由xyldl、xylns及xylds序列表达的蛋白质酶Xyld、Xylns及Xylds与市售的出芽短柄霉(Aureobasidium pullulans)木聚糖酶液(Sigma)进行比活性比较。令人惊异地发现，本发明经过删除突变的木聚糖酶重组基因，其所表达的蛋白酶的比活性均明显优于野生型基因产物及市售产物(见图6及10)。
由本发明方法制得的木聚糖酶在与出芽短柄霉酶(买自Sigma)及原酶(未经改造者)比较活性后发现，本发明酶高出出芽短柄霉10～20倍，高出原酶达25倍，且产率较大，因而成本亦较已商业化者便宜。应用在造纸工业、食品工业或饲料添加剂甚有产业价值。
在本发明进一步的具体实施方案中，分别对本发明重组木聚糖酶进行不同温度及酸碱值条件下的活性测定(见图7及8)。
根据上述具体实施方案，本发明亦提供一种利用基因工程技术制造具有木聚糖酶活性的蛋白质的方法，其包含(a)将木聚糖酶基因利用遗传工程进行删除性突变，得到重组基因；(b)将重组木聚糖酶基因插入适当载体上以构建表达质粒；(c)将该表达质粒转化到适当的宿主细胞；(d)于适合该转化细胞表达木聚糖酶基因的条件下培养该转化细胞；及(e)纯化所表达的木聚糖酶蛋白质。
本发明制造具有木聚糖酶活性的蛋白质的方法除可生产前述的重组木聚糖酶外，亦适用于生产其他微生物来源的木聚糖酶。具体而言，本发明方法是以木聚糖酶基因的共有DNA序列为基础设计出适当的引物，以PCR扩增所要的重组基因、以其构建表达质粒、转化宿主细胞，并令其表达而制得具有木聚糖酶活性的蛋白质。
由于本发明重组酶亦具有连结纤维素的功能，除了可以用充填纤维素基质的管住进行大量纯化外，还可利用纤维素将此酶固定，充填于管柱之中，可提供快速体外分解木聚糖的用途。
在本发明说明书中所有前人文献及公开专利均以参考资料形式并入本发明。
为使本发明的内容更为明确，兹以示范说明性实施例进一步详细说明。实施例1 pET20b/xylns表达质粒的构建荧光假单胞菌染色体的抽取首先将10克的Bacto-trypton、5克的细菌—酵母抽提物及10克的NaCl溶于1公升的去离子水中，以1N NaOH溶液调整pH值至7.5，高压灭菌后冷却制得Luria-Betani(LB)培养液，再加入葡萄糖至0.25％即完成假单胞菌培养液的制备。
取5毫升的LB+葡萄糖培养液于37℃振荡培养荧光假单胞菌株(Pseudomonas fluorescens，N.C.I.N.B.10462)，24小时后离心(5千转/分)15分钟，以水清洗沉淀菌体一次，再次离心后倒掉上清液，加入0.75毫升水并加入0.75毫升酚抽提30分钟，再离心(12千转/分)15分钟，取出上清液后再加入0.75毫升酚抽提30分钟，离心(12千转/分)15分钟后取出上清液，再以0.75毫升氯仿抽提15分钟，离心(12千转/分)，取出上清液后加入2倍体积乙醇，离心(12千转/分)15分钟。倒掉上清液，将沉淀DNA以75％酒精洗一次，再用10mMTris-Cl(pH7.5)溶解得到的染色体DNA。假单胞菌木聚糖酶基因(xylns)的扩增5’端及3’端引物的合成根据Millward-Sadler及Davidson等人，Biochem.J.312，39-48(1995)所揭示的木聚糖酶基因序列的5’及3’端DNA序列，其中5’端不含信号肽DNA，合成两端引物，并分别带有NdeI及XhoI酶切除特定序列，其DNA序列如下
5’-GGAATTCCATATGAATGCCCAAACCCTGAGT此序列含NdeI酶切除序列。
5’-CCCCGGCTCGAGTCAATTACAAACGACACC此序列含XhoI酶切除序列。
聚合酶链反应(PCR)取约1微克假单胞菌染色体DNA，加入8微升2.5 mM dNTPs、10微升10倍Taq缓冲液、1微克5’端引物、1微克3’端引物及1微升的5 U/微升Takara Taq，再加入水至总体积为100微升，最后加50微升矿物油于上层。设定温度循环机(Thermal cycler，美商Perkin Elmer公司)的反应参数如下于94℃加热3分钟；以94℃×1分钟，50℃×1分钟，72℃×1分钟为一个循环，共反应30个循环；最后再于72℃放置10分钟。反应结束后，以0.8％低熔点琼脂凝胶进行电泳分析和溴化乙啶染色观察，确定DNA片段如预期大量扩增，片段长度约为1.9kb。将其切下来后以糖原于65～70℃加热15分钟使DNA溶离出来，趁热用酚抽提，离心10分钟，取上层液再分别以酚/氯仿及氯仿如上述方式各抽提一次，最后加入1/10体积的3N醋酸钠及2倍体积酒精，于-70℃冰冻，2小时后离心(12千转/分)，将沉淀物用70％酒精清洗一次后再离心(12于转/分)，移除上清液后使DNA沉淀物干燥，将DNA溶在水中即得纯化之标的DNA。pET20b/xylns表达质粒的构建以Ndel及XhoI限切酶于37℃分别切割PCR产物和pET20b载体(美商Novogen公司)20小时，再利用上述低熔点凝胶及加热溶离方式得到产物DNA和载体，并利用T4DNA粘合酶于16℃反应24小时，使二者粘合，接着将反应后的混合物转化DH5α菌株，将所得的转化菌落个别培养并少量抽取质粒DNA，经限切酶分析初步筛选含有约与xylns等大小的插入物的质粒，再利用Sanger’s方法以Sequence Version2.0DNA定序套组(购自美商United States Biochemical公司)，以T7启动子序列(ATTAATACGACTCACTATAGG)为引物，定序初步切选得到的DNA序列，确定得到的1.9kbDNA片段为xylns基因，而完成pET 20b/xylns表达质粒的构建。实施例2 pET20b/xyldl表达质粒的构建依照xylns的DNA序列于内部设计两段引物(JLF+，JLF-)JLF+5’-ATTACCGTTAGCGAATCAAGCTCCGGTGGCAGCAGCJLF-5’-GCCACCGGAGCTTGATTCGCTAACGGTAATGTCGGA接着以pET20b/xylns作模板，分别以两组引物(5’-NdeI顺向引物，JLF-反向引物；JLF+顺向引物，3’-XhoI反向引物)运用前述的聚合酶链反应得到xylns中的催化性区域基因片段(ES)及纤维素结合区域基因(CBD)片段。最后再以此二段DNA作模板，5’-NdeI及3’-XhoI当顺、反引物，大量扩增DNA(图1)。将扩增的DNA进行电泳分析并将长约0.83kb的DNA片段纯化出来(步骤同前述)，即为xyldl(图3)。以NdeI和XhoI于37℃反应20小时后，将大小约0.83kb的DNA纯化后与已用NdeI和XhoI切割过的pET20b载体以T4粘合酶于16℃反应20小时后，转化至DH5α大肠菌并用前述方法筛选及定序确认，即完成pET20b/xyldl表达质粒(见图2)的构建，该质粒已于1997年12月18保藏于食品工业发展研究所，保藏编号为CCRC940190。实施例3 p416/xylds表达质粒的构建首先以含有木聚糖酶的信号肽核苷序列的引物与JLF-引物，从假单胞菌染色体DNA大量复制含信号肽的催化性区域基因片段后，再以重新设计的BamHI+与EcoRI-两端引物以上述催化性区域DNA及前述的纤维素结合区域DNA作模板，用Taq聚合酶链反应大量复制出约0.9kb的DNA片段，并命名为xylds。此两段引物列示如下BamHI+5’-CGGGATCCATGAATGCCCAAACCCTGAGTEcoRI-5’-CGGAATTCTCAATTACAAACGACACC接着用前述方法纯化PCR产物、限切酶切除、T4粘合酶粘合至P416载体上成表达质粒、转化至DH5α、筛选含表达质粒的克隆、定序确认，由此完成p416/xylds表达质粒的构建(图11)。该质粒已于1998年1月13日保藏于食品工业发展研究所，保藏编号为CCRC940192。实施例4木聚糖酶的表达将pET20b/xylns、pET20b/xyldl等表达质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，然后以10毫升LB/Amp培养液于37℃下震荡培养至OD600＝2.0时，加入1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖(IPTG)，并在30℃下震荡培养诱导木聚糖酶表达，3小时后收集菌体。取1.5毫升菌液，离心并倒掉上清液，加入100微升100mM Tris-Cl，pH7.5缓冲液于菌体中，再加入200微升的1.5倍电泳蛋白染料(其配方为0.1M二硫苏糖醇、2％SDS、0.08mM Tris-Cl，pH6.8、15％甘油及0.06％溴酚蓝)，混合后于95℃下加热5分钟再以12千转/分离心，取上层液10微升以12％聚乙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析菌体全部蛋白质。分析结果如图5A和5B所示。由图5B结果可知，当缩短基因长度后，重组木聚糖酶(Xyld)在BL21(DE3)内的表达量将大为增加，占总蛋白质的一半左右，而野生木聚糖酶表达量在总蛋白质中所占比例约为10％，两者相差5倍，这表示重组木聚糖酶基因的表达明显优于野生木聚糖酶基因的表达。
由于被表达的木聚糖酶大量存在于大肠杆菌中的包涵体，所以先以8M尿素(Urea)溶于100mM Tris-Cl、10mM NaH2PO4缓冲液将包涵体溶解，接着利用透析方式逐步降低尿素浓度由8M→6M→4M→2M→0M(100mM Tris，10mM NaH2PO4)使酶复活化且成可溶性后再测酶活性。
在酿酒酵母菌(Saccharomyces cereversiae)方面，将p416/xylds以电穿透法(2500V，25μFD，400ohms)转化至BT3501菌株，30℃培养3天后，于SD培养液(0.67％YNB w/o氨基酸，2％葡萄糖，0.5％酪氨酸)10毫升中，30℃震荡培养至OD600＝1.2后，取1毫升培养至50毫升SD培养液中，30℃震荡培养至OD600＝2后，5千转/分离心5分钟。取上清液用膜过滤方式将体积浓缩10倍，取10微升液体真空抽干后加入10微升蛋白染料，95℃加热5分钟，跑12％聚乙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳(见图9)，发现其表达量为1微克/毫升菌液。实施例5木聚糖酶的活性测定及比较各取2毫升溶于0.05M醋酸钠缓冲液(pH5.4)的RBB-xylan(Sigma，5mg/ml)先置于试管内，再于每个试管中分别加入10微升Xyld溶液、10微升市售的出芽短柄霉(Aureobasidium pullulans)木聚糖酶液(Sigma公司)、100微升Xylns溶液及40微升浓缩10倍的含Xylds的酵母菌培养液，于37℃反应1、2、5、10、30、60分钟时分别取200微升反应液加入2倍体积的96％EtOH进行终止反应，于室温下静置10分钟后，12000转/分离心5分钟。吸取上清液在吸收光波长595微毫米下测定吸收值，画出对时间的关系曲线(见图6和10)。
依上述方法测得的每单位活性(U)定义为每微克酶每分钟作用产生1微升的RBB-木寡糖或木糖。此等木聚糖酶的比活性如下
由上表可知，本发明所制备的重组木聚糖酶的活性甚佳，除较野生型酶优异外，且较市售的木聚糖酶高6～20倍左右。实施例6木聚糖酶的热稳定性检验各取20微升Xyld酶液分别先置于16、30、37、52、70、95℃1小时后再根据实施例5的方法做酶活性测定。以4℃中取出的酶液的酶活性当基准，比较其他条件下酶的活性百分比(见图8)，结果发现在30至37℃，活性最佳，对热稳定性而言则应低于52℃。实施例7蛋白质浓度测定利用染料结合方式以不同，将已知浓度(5～40微克/毫升)的牛血清白蛋白(BSA)各取800微升加入蛋白试验用染料(Bio-Rad)200微升，在波长595微毫米测吸收值做标准曲线，再将未知的蛋白质浓度稀释后加入蛋白试验用染料测其吸收值，并使其在标准曲线范围内，即可反推求出未知蛋白质浓度及真正量。实施例8木聚糖酶对酸碱质的稳定性分别将RBB-Xylan反应缓冲液的pH值调成8、7、6、5、4、3、2、1后，加入10微升Xyld酶液，37℃反应30分钟，测Xyld在不同pH值下的酶活性(见图7)，结果在pH值5至8时活性最佳，在pH＝3时仍保有约50％活性。
权利要求
1.一种编码具有木聚糖酶活性的蛋白质的核酸分子，其选自以下组(a)具如下序列或其片段的核苷酸分子；和
(b)编码具有如下所示氨基酸序列或其活性片段的核酸分子。10203040MNAQTLSSNSTGTNNGFYYTFWKDSGDASMTLLSGGRYQS50607080SWGNSTNNWVGGKGWNPGNNSRVISYSGSYGVDSSQNSYL90 100 110 120ALYGWTRSPLIEYYVIESYGSYNPASCSGGTDYGSFQSDG130 140 150 160ATYNVRRCQRVNQPSIDGTQTFYQYFSVRNPKKGFGNISG170 180 190 200TITFANHVNFWASKGLNLGNHNYQVLATEGYQSRGSSDIT210 220 230 240VSESSSGGSSSVALSSSSRSSSSAGGNTGGNCQCNWWGTF250 260 270 280YPLCQTQTSGWGWENSRSCISTSTCNSQGTGGGGVVCN..
2.一种具有木聚糖酶活性的蛋白质，其具有如下所示氨基酸序列或其活性片段10203040MNAQTLSSNSTGTNNGFYYTFWKDSGDASMTLLSGGRYQS50607080SWGNSTNNWVGGKGWNPGNNSRVISYSGSYGVDSSQNSYL90 100 110 120ALYGWTRSPLIEYYVIESYGSYNPASCSGGTDYGSFQSDG130 140 150 160ATYNVRRCQRVNQPSIDGTQTFYQYFSVRNPKKGFGNISG170 180 190 200TITFANHVNFWASKGLNLGNHNYQVLATEGYQSRGSSDIT210 220 230 240VSESSSGGSSSVALSSSSRSSSSAGGNTGGNCQCNWWGTF250 260 270 280YPLCQTQTSGWGWENSRSCISTSTCNSQGTGGGGVVCN..
3.一种引物，其具有如下序列或其反义序列5’-ATTACCGTTAGCGAATCAAGCTCCGGTGGCAGCAGC，或5’-GCCACCGGAGCTTGATTCGCTAACGGTAATGTCGGA。
4.根据权利要求3的引物，其可用以插入xylns序列。
5.一种质粒，其包括根据权利要求1的核酸分子及与该核酸分子作动性连接的载体。
6.根据权利要求5的质粒，其中，所述载体能够在原核宿主细胞中表达所述核酸分子。
7.根据权利要求6的质粒，其为pET20b/xyldl。
8.根据权利要求5的质粒，其中，所述载体能够在直核宿主细胞中表达所述核酸分子。
9.根据权利要求8的质粒，其中，所述真核宿主细胞为酵母菌。
10.根据权利要求8的质粒，其中，所述真核宿主细胞为哺乳动物细胞。
11.根据权利要求8的质粒，其中，所述真核宿主细胞为昆虫细胞。
12.一种转化细胞，其是经根据权利要求6或8的质粒转化。
13.一种制造根据权利要求2的蛋白质的方法，其步骤包含(a)将木聚糖酶基因利用遗传工程进行删除性突变，得到重组基因；(b)以(a)得到的重组基因构建表达质粒；(c)将(b)中表达质粒送入合适的宿主细胞中；(d)于适合表达该重组基因的条件下培养(c)得到的宿主细胞；及(e)纯化被表达的重组蛋白质。
14.根据权利要求13的方法，其中，(a)中重组基因为根据权利要求1的核酸分子所编码。
15.一种用于快速分解木聚糖的纤维素管柱，其含有固定于纤维素的根据权利要求2的蛋白质。
全文摘要
本发明提供一种产量高且活性佳的重组木聚糖酶,以及生产该重组木聚糖酶的方法。本发明亦提供该重组木聚糖酶的编码序列,含该序列的载体及含有此载体的转化细胞。本发明进而提供一种含有固定化重组木聚糖酶的管柱。
文档编号C12P21/00GK1266903SQ9910331
公开日2000年9月20日 申请日期1999年3月15日 优先权日1999年3月15日
发明者庄明恒, 郑金松, 吴孝芸, 林龙参, 张立言 申请人:财团法人生物技术开发中心