基因突变动物的制作方法

专利名称：基因突变动物的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因转导动物。更详细而言，本发明涉及早老蛋白基因转导动物，在该动物中导入了引起人阿尔茨海默病的突变早老蛋白基因。
背景技术：
阿尔茨海默病是一种表现为进行性痴呆症状的神经性疾病，其病理组织学特征为脑内出现明显的多量老年斑和神经原纤维在神经细胞内蓄积，慢慢地神经细胞因产生功能障碍而脱落。已知阿尔茨海默病在老年人中发病较多，随着年龄的增加患者的比率增大。目前阿尔茨海默病尚不能根治，为了防备将来老龄人口的急剧增加，人们殷切希望早日开发出治疗和预防阿尔茨海默病的方法以及对该病有效的预防、治疗剂。
老年斑是在神经细胞外的沉积物，它含有多种成分，其主要成分是一种由39-42个氨基酸残基构成的多肽，叫做淀粉状β蛋白(AB)。淀粉状β蛋白是从淀粉样前体蛋白质(amyloid precursorproteinAPP)由称作β促胰液肽酶(セクレタ一ゼ)和γ促胰液肽酶的蛋白酶酶切产生的。老年斑是由是具有β片层结构的坚固的淀粉状β蛋白沉积而形成的。老年斑的形成是从漫性老年斑的“斑点”状沉积开始的，这一阶段没有产生神经变性，进一步伴随着弥漫性老年斑成为坚固的沉积物时，神经变性和神经细胞开始发生脱落，由此出现痴呆等阿尔茨海默病的症状。已知淀粉样β蛋白主要存在两种，即由40个氨基酸残基构成的Aβ40和由42个氨基酸残基构成的Aβ42。细胞所产生的淀粉样β蛋白大部分为Aβ40，而Aβ42只少量存在，但Aβ42的凝集性高，与Aβ40相比，它对于老年斑的形成发挥的作用较大(玉岗内科77卷，843页，1996年)。
阿尔茨海默病是一种，常染色体显性遗传的家族性疾病。最初发现的该家族性阿尔茨海默病的致病基因是1991年，发现的APP的突变体，其第717位的氨基酸残基由缬氨酸突变为异亮氨酸，该基因位于21号染色体上(Goate A．等，Nature 349卷，704页，1991年)。
此外，成为阿尔茨海默病原因的其它APP突变体也相继被发现，与前者相同第717位氨基酸残基变为苯丙氨酸的突变体(Murrell J．等，Science 254卷，97页，1991(年)，在相同位点上的氨基酸残基突变为甘氨酸的突变体(Chartier，Harlin等，Nature 353卷，844页，1991年)，第670位和第671位的2个氨基酸残基由赖氨酸、甲硫氨酸突变为天冬酰胺、亮氨酸(Mullan M．等；Nature Genet．1卷，345页，1992年)，第692位的氨基酸残基由丙氨酸突变为甘氨酸的突变体(Hendrisk L．等，Nature Genet，1卷，218页，1992年)等等。
1993年曾报道载脂蛋白E(apo E)是家族性阿尔茨海默病的病因或危险因子。即发现基因存在于19号染色体上的apo E异构体中apo E4的第112位氨基酸残基为精氨酸、第158位的氨基酸残基为精氨酸。在阿尔茨海默病患者具有apo E4的比率显著地高于健康人群。(Corder E．H．等，Science 261卷，921页，1993年)。
其后1995年发现阿尔茨海默病的新致病基因是存在于14号染色体上“早老蛋白-1”(PS-1；当初叫做S182)基因(SherringtonR．等Nature 375卷，754页，1995年)的突变体及存在于1号染色体上“早老蛋白-2”(PS-2，当初叫做E5-1或STM-2)基因(Rogaev E．I．等Nature 376卷，755页，1995年)的突变体(本说明书中分别将它们)称作“早老蛋白-1基因”及“早老蛋白-2基因”。并且，分别将它们的基因产物叫做“早老蛋白-1”及“早老蛋白-2”或叫做“PS-1”和“PS-2”)。
早老蛋白-1和早老蛋白-2分别由467个氨基酸残基及448年氨基酸残基构成，具有7次(或8次)跨膜的1级结构，推测以膜蛋白的形式存在。二者在氨基酸水平的同源性高，全部为67％，跨膜部分为84％。关于早老蛋白-1的功能性，由于其与线虫的sel-12蛋白和SPE-4蛋白有高度的同源性，因此早老蛋白-1的功能与这些蛋白有相类似的可能性。SPE-4蛋白是参与线虫精子形成过程的蛋白质，并参与蛋白质的输送、贮藏。
因而早老蛋白-1可能参与了象APP那样膜蛋白的加工、轴向输送、膜小泡的膜融合过程等。此外，Lin-12控制着线虫的发育，Lin-12的突变会造成发育异常。人们发现Stl-12是挽救这种发育异常的基因。一般认为lin-12参与了细胞间的信号传递，并暗示早老蛋白-1也有可能参与了细胞间某处的信号传导。
最初的报道表明早老蛋白-1作为家族性阿尔茨海默的原因有5个氨基酸残基发生取代突变。之后自本发明者们报道了以OS-2(第213位的氨基酸残基由异亮氨酸突复为苏氨酸)和OS-3(第96位的氨基酸残基由缬氨酸突变为苯丙氨酸)(Kamino K．等Neurosci．lett．208卷，195页，1996页)以来，人们相继从多个家族性阿尔茨海默病的家谱中发现了各种各样的位点突变体，现在已知在30处以上的位点上有40种以上的氨基酸残基发生替换(HardyTINS 20卷，154页，1997年)。
到目前为止家族性阿尔茨海默病中早老蛋白-1的突变的占70～80％。关于PS-2有报道说有2处突变。如上所述，从遗传学分析的角度证明PS-1和PS-2的突变体与家族性阿尔茨海默病密切相关。
另一方面，最近有关早老蛋白-1及早老蛋白-2突变体怎样成为阿尔茨海默病发病原因的机制也进行了研究。有这样的报道，在具有这些突变体的阿尔茨海默病患者的血清中及皮肤的成纤维细胞的培养液(Scheuner D．等Nature Med．2卷，864页，1996年)。用早老蛋白-1和早老蛋白-2突变体转化的培养细胞株的培养液中(Xia W．等，J．Biol．Chem，272卷，7977页，1997年。BorcheltDR等Neuron 17卷，1005页，1996年。Citron M．等Nature Med．3卷，67页，1997年)、以及具有早老蛋白-1突变体的家族性阿尔茨海默病患者的脑组织中(Lemere C．A．等，Nature Med．2卷，1146页，1996年)，与正常型早老蛋白-1和早老蛋白-2相比Aβ40几乎没有变化，而Aβ42大量增加。
也就是说，引起这些结果表明引发阿尔茨海默病的可能性是由于家族性阿尔茨海默病的早老蛋白-1和早老蛋白-2的突变体，通过使在老年斑的形成中起重要作用的Aβ42增加所致。转导编码早老蛋白-1突变体基因的转基因小鼠也被制备出来。(Duff K．等Nature383卷，710页，1996年。BorcheltDR等Neuron17卷，1005页，1996年。Citron M．等Nature Med．3卷，67页1997年)。报道说在这些转基因小鼠的脑内Aβ42异常地增加。该结果有利支持了引发家族阿尔茨海默病的可能性是由于早老蛋白-1和早老蛋白-2的突变体通过使在老年斑的形成中起主要作用的Aβ42增加所致这一结论。但是这些转基因小鼠的报道中没有关于转基因小鼠脑组织学的研究。由此推测到在转基因小鼠内未观察到显著的脑组织学变化。
一般而言，转基因动物对于解析目的基因在生物体内的功能是一有利手段。但是在功能解析上仍有许多困难和问题。首先在技术上很难控制导入基因的表达量、表达组织、发育过程中的表达时期。此外，由于动物自身拥有的基因正常表达，在转基因动物的体内双方的基因产物处于共存状态，这样就有可能充分地能析导入基因功能的问题。再者，导入基因有时特别过量表达，本来在生物体内不发挥作用的功能却在转基因动物中完全表达，其结果就给制备的基因突变动物的解析带来了混乱。
除转基因动物外，作为解析目的基因功能的手段也可利用敲除动物(knock out)。敲除动物是人为破坏动物自身拥有的目的基因使之处于无功能状态。通过对基因敲除动物进行详细解析可明确目的基因在生物体内的功能。但是，由于敲除动物体内的其它基因产物可替代被破坏的基因产物的功能，这样即便是纯合也观察不到敲除动物体内独特的变化。另外还含有这样的问题，由于破坏的基因产物在动物的发生、发育上是必须的，对于纯合是致死的，而在杂合中可成长，但是在异系中进行基因的功能的详细解析事实上是不可能的。
发明的公开本发明课题是制作阿尔茨海默病的病态动物模型，提供与人的阿尔茨海默病患者的病态转接近的动物模型，而不是有上述缺点的转基因动物。更具体而言，本发明的课题是通过用同源重组法导入变异早老基因来获得使突变的早老蛋白可在脑内表达的基因突变动物，它是在阿尔茨海默病致病原因的早老基因中通过同源重组法导入了变异的基因(突变的早老基因)。另外，本发明的其它课题是提供上述基因突变动物的制作方法，以及提供该制作方法中有用的质粒以及应用该基因突变动物来评价用于预防和／或治疗阿尔茨海默病的物质的方法。
为了阐明早老蛋白-1的功能以及早老蛋白-1基因的突变如何引发阿尔茨海默病，本发明者们将小鼠自身的早老蛋白-1基因置换为具有上述OS-2型突变的早老蛋白-1基因，制作了敲入(Knock in)小鼠。结果发现该基因突变动物能够避免转基因小鼠和敲除(Knockout)小鼠的缺点，有利于阐明具有突变型早老蛋白-1基因的家族性阿尔茨海默病的病因、病情。本发明者们又继续研究，直至完成如下所述的本发明。
也就是说，本发明提供了人以外的具有突变型早老基因的基因突变动物，更优选地，本发明提供具有突变型早老蛋白-1基因的突变动物，该基因中包含编码突变型早老蛋白-1的DNA序列，而该早老蛋白-1的氨基酸序列中的一个氨基酸被其它的氨基酸所取代。
另外，本发明提供具有早老蛋白-1突变基因的人以外的基因突变动物，该基因包含编码突变型早老蛋白-1的DNA序列，而该早老蛋白-1的氨基酸序列，优选小鼠来源的早老蛋白-1的氨基酸序列中有1或2处以上选自以下序号的氨基酸被其它的氨基酸所替代，即选自第79位、第82位、第96位、第115、120、135、139、143、146、163、209、213、231、235、246、250、260、263、264、267、269、280、285、286、290、318、384、392、410、426及436位的氨基酸；并且本发明提供具有突变型早老蛋白-1基因的人以外的基因突变动物，该基因包含编码突变型早老蛋白-1的DNA序列，而该早老蛋白-1的氨基酸序列，优选小鼠来源的早老蛋白-1的氨基酸序列中有1或2处选自以下的突变，即A79V、V82L、V96F、Y115H、Y115C、E120K、E120D、N135D、M139V、M139T、M139I、I143F、I143T、M146L、M146V、H163Y、H163R、G209V、I213T、A231T、A231V、L233P、A246E、L250S、A260V、C263R、P246L、P267S、R269G、R269G、R269H、E280A、E280G、A285V、L286V、S290C、E318G、G384A、L392V、C410Y、A426P及P436S(各字母单字母表示法表示的氨基酸，数字表示从早老蛋白-1的N端开始的氨基酸序号，数字左侧的野生型氨基酸被右侧的氨基酸所取代。以下，在本说明书中用同样的方法对突变型早老蛋白-1和突变型早老蛋白-2进行表示)。
另外，本发明提供具有突变型早老蛋白-1基因的人以外的基因突变动物，该基因包含编码突变型早老蛋白-1的DNA序列，而该突变型早老蛋白-1的第213位的异亮氨酸为异亮氨酸以外的氨基酸所取代；并提供具有突变型早老蛋白-1基因的人以外的基因突变动物，该基因包含编码第213位的异亮氨基酸被苏氨酸取代的突变型早老蛋白-1的DNA序列。
按这些发明，其优选方案是具有突变型早老蛋白-1基因的上述基因突变动物，其编码早老蛋白-1氨基酸序列中第213位氨基酸相邻的DNA序列突变为以下序列5’-TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3’(N指T以外的碱基，M为T或C，有下划线的碱基是编码第213位氨基酸的碱基)；具有突变型早老蛋白-1基因的上述基因突变动物，其编码早老蛋白-1氨基酸序列中第213位氨基酸相邻的DNA序列突变为以下序列5’-TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3’(N指C，M为T或C，下划线的碱基是编码第213位氨基酸的碱基)；具有突变型早老蛋白-1基因的上述基因突变动物，其编码早老蛋白-1氨基酸序列中第213位氨基酸相邻的DNA序列突变成5’-TGTGGTCGGGATGATMGCC MYZ CACTGGAAAGGCCC-3’(XYZ指编码异亮氨酸以外的氨基酸的3个碱基的密码子，M指T或C，有下划线的碱基是编码第213位氨基酸的碱基)。
从其它观点来看，本发明提供具有突变型早老蛋白-2基因的人以外的基因突变动物，该基因中包含编码早老蛋白-2的氨基酸序列中第141位和／或第436位氨基酸被其它氨基酸取代的这样蛋白的DNA序列，其优选方案是提供具有突变型早老蛋白-2基因的人以外的基因突变动物，而该基因中包含编码具有N141I和／或M239V突变的突变型早老蛋白-2的DNA序列。
这些基因突变动物的优选方案是提供的基因突变动物；它因突变的早老蛋白-1基因及／或突变的早老蛋白-2基因引起淀粉样β蛋白的过量表达；能表达突变的早老蛋白，且该蛋白的表达能产生充分数量的淀粉样β蛋白，使得哺乳动物的大脑皮质周边部分形成进行性神经疾病。上述基因突变动物，它是哺乳动物中的啮齿类，优选小鼠；上述的基因突变动物是通过同源重组导入了突变的早老蛋白-1基因和／或突变的早老蛋白-2基因；与正常动物相比较上述基因突变动物的特征为，突变的早老蛋白-1基因引发产生的脑组织中淀粉样蛋白的表达量能充分引起在学习记忆试验中的引为障碍，且该蛋白表达量在该动物海马区的大脑皮质周边部分能诱发异常的神经病理；并且提供人以外的基因突变动物，它具有的DNA包含编码突变型早老蛋白的突变早老蛋白-1基因和编码标记蛋白的碱基序列。其中早老蛋白-1氨基酸序列中的1或2个以上的氨基酸被其它的氨基酸取代，即突变早老蛋白-1。
再其它观点来看，本发明提供编码早老蛋白-1氨基酸序列中第213位氨基酸附近的DNA序列为5’- TGTGGTCGGGATGATMGCC ANCCACTGGAAAGGCCC-3’的，含有突变型早老蛋白-1基因的质粒(需要说明的是，N指A、G或C，M为T或C，有下划线的碱基为编码第213位氨基酸的碱基)；并提供编码突变早老蛋白-1的突变早老蛋白-1基因，其突变早老蛋白-1最白的氨基酸序列中第213位氨基酸被异亮氨酸以外的氨基酸取代。提供含有编码第213位氨基酸附近的DNA序列5’-TGTGGTCGGGATGATMGCC XYZ CACTGGAAAGGCCC-3’基因的质粒。(M为T或C，XYZ指编码异亮氨酸以外的3个碱基的密码子，有下划线的碱基是编码第213位氨基酸的碱基)。也提供包含突变型早老蛋白-1基因外显子8的染色体DNA，该基因编码突变型早老蛋白-1的氨基酸序列中第213位氨基酸被异亮氨酸以外的氨基酸取代。
另外提供含DNA的质粒，该DNA是在包含编码突变型早老蛋白-1的突变型早老蛋白-1基因的cDNA或染色体DNA全长或突变部分的碱基序列中导入了Sau 3AI部位，其中早老蛋白-1的氨基酸序列中第213位氨基酸被异亮氨酸以外的氨基酸取代；氨基酸的置换是由213位的异亮氨酸换为苏氨酸的上述质粒；包含具有下述碱基碱基序列的特定DNA的质粒5’-TGTGGTCGGGATGATMGCCACCCACTGGAAAGGCCC-3’(这里M指T或C)。
除此之外，本发明提供编码小鼠早老蛋白-1氨基酸序列中第213位的异亮氨酸被异亮氨酸以外的氨基酸取代的突变型早老蛋白-1的基因；提供有关氨基酸的取代由异亮氨酸替代为苏氨酸的上述基因。另外提供(1)编码小鼠突变型早老蛋白-1的基因，该小鼠早老蛋白-1氨基酸序列中第213位的异亮氨酸被异亮氨酸以外的氨基酸取代，及(2)含有插在lox P中的新霉素表达单位的质粒；氨基酸置换是由异亮氨酸替换为苏氨酸的上述质粒(关于lox P已登记公告在特表平4-501501号公报的第4页)。
从其它观点来看，本发明提供以导入含有特定DNA质粒为特征的胚胎，该特定DNA具有以下碱基序列-5’TGTGGTCGGGATGATMGCCACCCACTGGAAAGGCCC-3’(这里M指T或C)；用上述各质粒进行同源重组而得到的胚胎；以及来源于哺乳动物的啮齿类，最理想的是提供来源于小鼠的胚。另外，提供通过分离上述基因突变动物的细胞，进行组织培养而得到的原代或传代培养细胞。以及人以外的基因突变动物的制作方法，它包括用同源重组法将突变型早老蛋白-1基因导入动物胚胎的工程，其中的突变型早老蛋白-1基因能表达突变型早老蛋白-1，且能产生足量的淀粉样β蛋白，从而使该蛋白的表达在大脑皮质的周边部位形成进行性神经疾患；以及能表达第213位异亮氨酸突变为异亮氨酸以外氨基酸的突变型早老蛋白-1的上述方法。
另外提供用于治疗和／或预防阿尔茨海默病的物质的评价方法，它包括向上述基因突变动物施用与不施用被检测化合物后的比较工序。作为该评价方法的代表例可推荐筛选法。根据本发明的理想方案，提供以下评价方法通过记忆学习试验进行比较的上述评价方法；通过病理试验进行比较的上述评价方法；基于大脑皮质周边部分的神经病理试验进行比较的上述评价方法；以神经病理为基础进行的病理试验比较是从以下的项目中选择，或2个以上的项目进行比较的上述评价方法；它包括大脑皮质周边部分肥大神经胶质增生的减少受抑制、大脑皮质周边部分2-脱氧葡萄糖的摄取减少受抑制及大脑皮质周边部分2-脱氧葡萄糖利用减少受抑制；以及从该动物的生存期、探索行动及移动行动选择1或2个以上的项目进行比较的上述评价方法。
再者可提供阿尔茨海默病治疗和／或预防剂的评价方法，这包括在被检化合物存在的条件下上述原代培养细胞或传代培养细胞的体外细胞培养工程；阿尔茨海默病或阿尔茨海默病发生可能性的诊断方法，其特征为应用编码OS-2型突变早老蛋白-1的突变型早老蛋白-1基因的部分碱基序列；用上述评价方法筛选出的用于治疗和／或预防阿尔茨海默病的物质；以及以上述物质为有效成分的阿尔茨海默病的治疗和／或预防剂。
另外提供具有突变型早老基因和编码淀粉样前体蛋白质之突变蛋白质基因的基因突变动物，该动物是通过上述基因突变动物与具有编码淀粉样前体蛋白质(APP)突变蛋白基因、且淀粉样β蛋白的产量较多的动物进行交配而获得的杂交动物及其后代。本发明理想的形式为通过交配获得或通过交配获得的杂种小鼠及其子孙。本发明的理想方案中提供的上述基因突变动物为PS 1突变小鼠，它有编码APP突变蛋白的基因，及有较高的淀粉样β蛋白的产量。
附图的简单说明

图1是从小鼠基因组DNA文库中克隆得到的含有小鼠早老蛋白-1外显子8染色体DNA片段Pα的限制性酶谱图。
图2表示具有小鼠早老蛋白-1基因外显子8一部分的质粒pmX-1的制作方法流程，该部分包含用定点突变法导入OS-2型突变的部位。
图3表示制作目标载体的流程图。
图4表示制作目标载体的流程图。
图5表示制作目标载体的流程图。
图6表示制作目标载体的流程图。
图7表示目标载体的制作流程以及目标载体pOS-2 neoloxP的结构。
图8是以具有OS-2型突变早老蛋白-1基因的#2小鼠(雄)与CAG-cre #13小鼠的F4(雌)进行交配所得仔代的部分尾巴为材料得到的染色体DNA电泳结果，该结果是将DNA按实施例10中的方法进行PCR，然后将所得产物用1％琼脂糖凝胶电泳获得的。从右侧开始第2和第4个小鼠染色体DNA显示无neo表达单位。图中最左边的泳道是分子量标记。[A]表示染色体DNA上缺失neo时的带；[B]表示染色体DNA为野生型时的带；[C]是染色体DNA上neo存在时的带。
本发明的最佳实施方案用于本发明基因突变动物制作的突变型早老基因(本说明书中谈到的突变型早老基因“是指突变型早老蛋白-1基因和突变型早老蛋白-2基因中的任一方或二者)是指编码突变型早老蛋白(本说明书中的二突变型早老蛋白”指突变型早老蛋白-1及突变型早老蛋白-2中的任一方或二者)的基因。该突变型早老基因具有使淀粉样β蛋白的产量增加的性质。本发明的基因突变动物是导入了上述突变型早老基因的哺乳类动物，例如通过同源重组法。突变早老蛋白的突变最好是因氨基酸残基被置换而产生，其突变个数虽然没有限制，但最好是1个。
来源于哺乳类动物早老蛋白-1的全长如E．Levg-Lahad，等在1995年，Science，269，pp 973-977的记载。来自于人及小鼠的早老蛋白-1全长及编码该蛋白的DNA的一例分别显示在序列表的序列号1～4。例如来源于小鼠早老蛋白-1中，优选突变部位选自第79位、第82、96、115、120、135、139、143、146、163、209、213、231、235、246、250、260、263、264、267、269、280、285、286、290、318、384、392、410、426及436位的1或2个以上。
更优选的突变是，早老蛋白-1的氨基酸序列，优选小鼠的早老蛋白-1的氨基酸序列选自A79V、V82L、V96F、Y115H、Y115C、E120K、E120D、N135D、M139V、M139T、M139I、I143F、I143T、M146L、M146V、H163Y、H163R、G209V、I213T、A231T、A231V、L235P、A246E、L250S、A260V、C263R、P264L、P267S、R269G、R269G、R269H、E280A、E280G、A285V、L286V、S290C、E318G、G384A、L392V、C410Y、A426P、及P436S的1或2个突变。这些突变中特别优选第213位氨基酸为其它氨基酸取代的突变(本说明书中有时叫做“OS-2型突变”)，例如第213位的异亮氨酸置换为异亮氨酸之外的氨基酸的突变，或者第213位的异亮氨酸置换为苏氨酸的突变特别适宜。
来源于哺乳类动物的早老蛋白-2的全长如在1995年Science，269，pp．973-977中的记载。突变部位优选在第141位和／或436位，来源于小鼠的序列中更优选N141I和／或M239V。早老蛋白-1和早老蛋白-2的任一方或二者中突变共存均可。
本发明的基因突变动物，其特征为其染色体DNA上有上述突变早老蛋白-1基因及／或突变的早老蛋白-2基因，本发明的基因突变动物可以是不限定特殊种类的哺乳类动物，但啮齿类动物较为适宜。最好是小鼠。本发明的基因突变动物可以这样制作用含有突变型早老基因大约10kbp左右序列的DNA制作质粒，将该质粒导入胚胎干细胞，以此引起细胞内同源重组，从而进行基因突变动物制作。
本发明的基因突变动物是通过同源重组而导入上述突变早老蛋白-1基因和／或早老蛋白-2基因的结果，其特征是氨基酸在大多数情况下有1处发生突变。而转基因动物是突变部分的DNA序列随机插入到染色体DNA上，大多数情况下重复序列的数十个拷贝被插入到多个部位。本发明的基因突变动物则避免了这样的问题，它能在基因水平正确地解析阿尔茨海默病的病情。当然，本发明的基因突变动物中导入含标记的DNA时，有时会含有插入该标记部分及标记的序列。例如为了插入用Sau 3AI能切断的部位可替换1个碱基，将PCR产物用Sau 3AI酶切后可用电泳进行确认。
本发明的基因突变动物与正常动物相比，具有因基因突变能产生大量β淀粉样蛋白的特征。对由本发明的基因突变动物所造成的淀粉样β蛋白的增加量没特别限定，但在进行各种障碍评价时，例如在评价记忆障碍、病理所见、各种神经障碍的程度时β蛋白的增加量与正常动物相比最好要达到有实质性差异的程度。
本发明所提供的DNA、质粒、培养细胞及哺乳类动物细胞的胚同样也以含有上述突变型早老蛋白-1基因和／或突变型早老蛋白-2基因为特征。例如突变是早老蛋白-1、最好是含有编码OS-2型突变早老蛋白-1的突变型早老蛋白-1基因cDNA或染色体DNA全长或突变部分的DNA；在含有上述cDNA或染色体DNA全长或突变部分的DNA序列中导入了Sau 3AI部位的DNA质粒，含有编码OS-2型突变早老蛋白-1的突变早老蛋白-1基因的外显子8的染色体DNA；以上内容均包括在本发明的范围内。另外，这些基因或DNA中有1或2个以上，优选1到20个，更优选1到数个碱基发生置换的基因或DNA也包括在本发明的范围内。
本发明的DNA或质粒的例子，如1)由编码早老蛋白-1的第213位的异亮氨酸置换成苏氨酸的突变型早老蛋白-1的突变型早老蛋白-1基因构成的DNA，及含有该DNA的质粒；2)由突变型早老蛋白-1基因构成的DNA或含有该DNA的质粒，其中编码突变型早老蛋白-1氨基酸序列中第213位附近的氨基酸的DNA序列如下5’-TGTGGTCGGGATGAT M GCCA N CCACTGGAAAGGCCC-3’(N指T以外的碱基，M为T或C)，3)由突变型早老蛋白-1基因构成的DNA或含有该DNA的质粒，该基因为编码OS-2型突变早老蛋白-1氨基酸序列中第213位附近氨基酸的DNA碱基序列如下5’-TGTGGTCGGGATCAT M GCC XYZCACTGGAAAGGCCC-3，(M指T或C，XYZ是编码异亮氨酸以外的3个碱基的密码子)；4)上述1)-4)任一项中导入了Sau 3AI限制性位点的DNA或包含该DNA的质粒；5)在含有突变型早老蛋白-1基因cDNA或染色体DNA全长或突变部分的序列中导入了Sau 3AI限制性位点的DNA或含有该DNA的质粒，其中突变型早老蛋白-1基因编码的突变型早老蛋白-1是早老蛋白-1氨基酸序列中第213位的异亮氨酸置换成苏氨酸的蛋白；6)含有编码OS-2型突变小鼠早老蛋白-1的突变型小鼠早老蛋白-1基因的外显子8含有和插在loxP之中的新霉素(neomycin)表达单位的DNA含有该DNA的质粒；以及7)含有突变型早老蛋白-1基因的外显子8和含有插在loxP中的新霉素表达单位的DNA或含有该DNA的质粒，其中突变型早老蛋白-1基因编码早老蛋白-1的氨基酸序列中第213位的异亮氨酸由异亮氨酸置换为苏氨酸的突变型早老蛋白-1。等等。但本发明的范围并不限定于这些具体例子中。
本发明所提供的胚胎或细胞是插入了上述质粒，例如具有PRL-104或PRL-105碱基序列的质粒胚胎或细胞。另外应用上述质粒通过同源重组而导入了的编码突变型早老蛋白-1基因的细胞是本发明所优选的细胞，而该突变蛋白中含有早老蛋白-1氨基酸序列中第213位的突变。胚胎或细胞只要是来源于哺乳类动物即可，对其种类无特殊限定，但可应用来源于啮齿动物，优选来源于小鼠的胚胎或细胞。[基因突变的动物的制作]在得到编码人突变早老蛋白的DNA后，按以下所述的流程可制作本发明的早老基因突变动物。以下，哺乳动物以小鼠，人突变型早老基因以人突变型早老蛋白-1基因为例进行说明，但本发明并不仅限于用此制作基因突变动物。另外，本方法是本发明制作基因突变动物方法中的一例，本发明的基因突变动物的制作方法并不限于以下方法。制作者可参照这里记载的一般方法及实施例中记载的具体方法，或者按需要对这些方法做适应的修饰乃至改变，由此可容易地制作出本发明的基因突变动物。
为了制备在PCR法中应用的探针，首先从小鼠基因组DNA文库中得到含有要制作突变动物早老蛋白-1基因外显子8中突变部位的DNA片段。小鼠基因组DNA文库除实施例中叙述的129系统的小鼠基因组DNA外，可应用任一系统的小鼠基因组DNA文库。当用小鼠为导入突变的动物时，可以应用小鼠早老蛋白-1基因的外显子8，而对其它种类的动物有必要选择适应的部分。
接着，用随机引物将上述流程中制作的DNA片段进行标记(32P)后，应用已标记的探针筛选基因组文库，克隆含有早老蛋白-1基因外显子8的染色体DNA片段。再将克隆的早老蛋白-1基因外显子8中的突变部分进行再克隆后导入突变。
制作含有染色体DNA的目标载体，该染色体DNA含有导入了突变的小鼠早老蛋白-1基因的外显子8。目标载体应予先导入neo表达元件选择标记，然后通过向培养基中添加将G418(抗生素)将染色体中未导入载体的细胞杀死。应用电穿孔法及其它的将基因导入细胞的方法将目标载体导入到ES细胞，然后在G418存在下培养ES细胞，收集出现的集落。将所得集落分为二份，一份培养、传代或冻存，另一份以同源重组法检测导入了小鼠早老蛋白-1基因外显子8的突变的ES细胞。将导入了目的突变的ES细胞的菌落保存部分取出用于以下操作程序。
从妊娠小鼠中取出8细胞期的胚胎，将上述保存的大约20个ES细胞涂到其上面后，导入伪妊娠的雌性小鼠的子宫内。从产生的后代中选择毛色嵌合的小鼠。让嵌合小鼠与C57B2／6系小鼠交配，从产生的子代中选择灰条纹色的小鼠(agouti)，从而可获得导入目的突变的小鼠。该小鼠是与导入突变早老蛋白-1基因相关的杂合体，一条染色体是早老蛋白-1基因未突变的野生型。
为了制作从小鼠基因组DNA文库中克隆含有小鼠早老蛋白-1基因外显子8染色体DNA的探针。制作原料除应用实施例中具体叙述的方法外，用碱基序列明确的小鼠和来源于人等哺乳动物的早老蛋白-1基因的cDNA均可。获得探针用DNA片段的方法。除实施例中叙述的PCR法扩增法外，可采用大量制备质粒的方法，其中质粒包括含有与小鼠早老蛋白-1基因外显子8相对应部分的小鼠染色体DNA，或含有来源于小鼠和人等哺乳动物的、碱基序列明确的早老蛋白-1基因cDNA。另外，用限制性酶酶切该质粒后，通过琼脂糖凝胶电泳等手段分取所需要的部分DNA片断就可获得目的DNA片段。
对DNA片段进行标记的方法，除采用实施例中叙述的随机引物法外，也可应用32P-dNTP存在下的PCR法。另外，也可利用预先标记的寡脱氧核苷酸作引物。用PCR或随机引物法进行标记。标记时除可应用实施例中所示的放射同位素外，也可利用生物素-抗生物素蛋白(Biotin-Avidin)系统或碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)的化学发光法。另外，也可应用T3或T7 RNA聚合酶标记的RNA片段作探针。此外，已知制备探针的方法多种多样，用任一种方法获得目的探针均可。
将目的突变导入DNA的方法，除实施例中具体显示的方法外，也可用M13等噬菌体来源的质粒或用ung-大肠杆菌复制的质粒，为了在想导入的目的变异部分导入突变应使合成的寡脱氧核苷酸与要导入目的突变的部分相互(一只有突变导入部位的碱基并不互补)结合，并以此为引物在DNA聚合酶的作用下形成杂合双链DNA质粒，用该质粒转化大肠杆菌(ung+)从而获得具有目的突变的质粒。另外，为了导入目的突变可变更碱基，并且能够用加热后慢冷却法使核酸形成互补的双链(即互补退火)，按设计合成在两端可产生限制性酶作用位点的双链寡脱氧核苷酸，然后用DNA聚合酶使之与导入突变的质粒结合，由此也可以获得具有目的突变的质粒。这些方法可根据目的要求进行适当修饰甚至改良，有时会更有效地达到目的。除此之外，在本领域内有各种可利用的导入突变的方法，任一种方法均可达到目的。
目标载体优选含有导入了突变的小鼠染色体DNA片段、编码选择标记的DNA片段、控制该转录的启动子及含有终止子选择标记的表达元件等必须要素。导入了突变的小鼠染色体DNA片段是在ES细胞内引起同源重组所必须的部分；导入突变位置前后的小鼠染色体DNA片段也是必要的。也就是说目标载体是具有与原来的小鼠DNA只在突变碱基上不同的DNA片段。其片段长度最好为10kbp，但一般情况下允许长度有少量的增减。当然片段长度过短会降低ES细胞内同源重组的几率。
选择标记有新霉素耐性基因、潮霉素耐性基因等阳性选择标记，单纯疱疹病毒的脱氧胸腺嘧啶核苷激酶基因、白喉毒素A片段等阳性选择标记，作为培养细胞株的选择标记使用的选择标记中的任何一种均可在ES细胞中使用。使用阴性选择标志时需要插入在目标载体小鼠染色体DNA片段外，使用阳性选择标记时需要其表达单位插入到目标载体小鼠染色体DNA片段中的内含子中。一旦将阳性选择标记插入到外显子，通常插入的基因就会丧失功能，有时会得不到用于检测突变影响为目的的小鼠。
ES细胞株多使用来源于129系统小鼠的细胞株，但该系统的ES细胞除应用实施例中叙述的R1外，也可应用D3、CCE、J1、AB1等ES细胞。另外也可使用来源于129系统以外小鼠的ES细胞，如C57BL／6系的小鼠。将目标载体导入ES细胞一般采用实施例中叙述的电穿孔法。但是如果磷酸钙共沉淀法和脂质体法等对培养细胞株的质检导入是可利用的话，那么其中的任何一种方法均可采用。在选择标记存在的条件下培养导入了目标载体后的ES细胞时，存活下来并形成集落的ES细胞有可能产生同源重组。在这些形成集落的ES细胞中检测产生同源重组细胞的方法通常应用PCR法，也可应用作为探针用的DNA片段、RNA片段、合成寡脱氧核苷酸或抗体等。
ES细胞混入到发育初期的受精卵后，使其继续发育，由精子或卵子可得到来源于ES细胞的小鼠。将产生同源重组的ES细胞混入发育初期受精卵的方法除实施例中叙述的方法外，也可采取从怀孕小鼠中取出胚胞期的受精卵，用注射用移液管注入10～20个ES细胞，然后移植到伪妊娠小鼠的子宫中的方法使其继续发育并得到后代。
混入ES细胞时所使用的发育初期受精卵可应用从任一品系小鼠中获得的，但为了易于鉴别混入的ES细胞是否进入所生仔代中，优选使用与提供ES细胞小鼠品系不同毛色小鼠品系的受精卵。例如，实施例中使用的ES细胞为淡灰色(agouti色，淡灰色)的129品系，提供受精卵的小鼠(C57BL／6)是黑色品系。从它们所生仔代中筛选出嵌合毛色的小鼠，这样就可比较容易地筛选出具有ES细胞来源细胞的仔代。此时，嵌合色的比率越多生值细胞由ES细胞而来的可能性越高。但伪妊娠小鼠无论是哪一品系均可。
为了让所得嵌合小鼠交配而得到导入目的突变的小鼠时最好是应用与ES细胞来源的小鼠系毛色不同的小鼠品系。通常用雄性嵌合小鼠与其它品系的雌性进行交配，若得到淡灰色的仔代则它是以杂合形成保持目的突变的小鼠。具有OS-2突变型早老蛋白-1基因的小鼠因有插入到loxP序列的neo表达元件可通过与导入cre基因的转基因小鼠进行交配，获得去neo表达元件的小鼠。
如本说明书的背景技术中所述，早老蛋白-1和早老蛋白-2的突变促进了因Aβ42的增加而促进了老年斑的形成，由此诱发了阿尔茨海默病的发病。另外有报道在导入了编码家族性阿尔茨海默病致病因子APP突变体的转基因子小鼠中有脑内产生淀粉样沉积的小鼠(Games D．等Nature 373卷，523页，1995年。Hsiao K．等Science274卷，99页，1996年。Sturchler-Pierrat C．等Proc．Natl．AcadSci．USA 94卷，24号，13287页，1997年)。这些转基因小鼠脑内的淀粉样沉积认为是由于Aβ42产生量的增加所致。
将导入编码APP突变体基因、脑内产生淀粉样沉积的转基因动物(有关导入的基因是纯合体或杂合体均可)与本发明的PS1基因突变动物(有关突变基因是纯合体或杂合体均可)交配，可制备杂交动物。应用的动物最好是小鼠。交配时哪方的动物为雄性均可。
剪取一段所得子代鼠的尾巴为材料，提取染色体DNA。以提取的染色体DNA为模板，以2条寡脱氧核苷酸为引物进行PCR其中寡脱氧核苷酸具有为插入编码APP突变体的基因突变部位而设计的碱基序列及为插入突变PS1基因的突变部位而设计的碱基序列。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测带的有无、带在胶上的移动度、并用具有含突变部位碱基序列的寡脱氧核苷酸进行杂交来确认是否含有突变的带，以此来检测提取的染色体DNA中是否含有编码APP突变体的基因及本发明的变异PS1基因。PCR可按实施例8中的方法进行。只要用于PCR引物的寡脱氧核苷酸的碱基序列中能检测出编码APP突变体的基因或突变PS1基因任何一个即可。根据PCR的结果，选择有编码APP突变体的基因且具有本发明突变PSI基因的动物，由此可获得具有2种基因均为杂合子的动物。
为了得到具有编码APP突变体基因和本发明的突变型早老蛋白-1基因这2种基因为纯合子的动物，可从具有这2种基因分别为杂合形式的动物中选择适当的雄性和雌性进行交配，再从得的子代中选出2基因为纯合形式的个体。为了验证具有编码APP突变体的基因为纯合子，剪取子代鼠尾巴的一部分，提取染色体DNA，用限制性酶将提取的染色体DNA酶切后进行琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后，将DNA点到滤膜上，以具有能与编码APP突变体的基因进行特异性结合的碱基序列的寡脱氧核苷酸为探针进行Southen印迹，测定所得带的浓度。
按照此方法可以确认本发明的突变型早老蛋白-1基因是纯合子的形式。Southen印迹中所用的寡脱氧核苷酸探针，可用放射性同位素、荧光素等手段在Southen印迹中进行标记。这样可制备具有编码APP突变体的基因和本发明突变型早老蛋白-1基因2种基因的小鼠。用该方法制作的杂交动物的特征是脑内淀粉样β蛋白质的生产较多，且促进了淀粉样变的沉积。
应用本发明的基因突变动物中导入了突变型早老基因的细胞、及含有突变型早老基因的质粒等，可筛选对阿尔茨海默病的预防和／或治疗有用的物质，评价其有用性。健康的哺乳动物中淀粉样β的蓄积是极其缓慢，而本发明的基因动物具有产生大量淀粉样β蛋白的特征。因此，通过给本发明的基因突变动物各种被检物质，然后与非施用动物或施用对照物质的动物进行比较，可评价对阿尔茨海默病的预防和／或治疗有用的物质。被检物质的筛选可作为评价的代表例而试验内容为症状、病理所见、药理试验等。
应用本发明的细胞时，除可将从本发明的动物中分离出的细胞作原代培养细胞外，也可将其原代培养细胞用病毒等不死化后，每隔数日取出原代培养细胞中的一部分，再用新的组织培养液进行继代培养，当该细胞稳定后就将其作为传代培养细胞。需要说明的是本发明的细胞中除包含从基因突变动物分离出的神经细胞等原代细胞外，还包括将原代细胞进行传代培养、也就是所谓成系化了的传代培养细胞。当应用神经细胞作为本发明细胞时，细胞表达突变型早老蛋白-1的结果是淀粉样β蛋白大量表达。在这样的神经细胞的离体培养系中添加被检测物质后通过比较细胞的生存期和一定时间后细胞的存存数目可筛选出预防或延迟因淀粉样β蛋白蓄积使神经细胞列亡的物质，并评价其有用性。
实施例以下通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明的范围并不限定于这些实施例。实施例中有时将早老蛋白-1基因略为PS-1。
实施例1含有小鼠早老蛋白-1(PS-1)基因外显子8染色体DNA的克隆为了制备用于取得含小鼠PS1基因外显子8的染色体DNA片段的探针，首先合成下列2条寡脱氧核苷酸。PR-8-U5’-GGAATTTTGGTGTGGTCGGGATGAT-3’(25聚体)PR-8-L5’-GGTCCATTCGGGGAGGTACTTGA-3’(23聚体)用这2条寡脱氧核苷酸为引物，用从129SVJ小鼠基因组文库(Stratagene)提取出的DNA进行PCR，得到大约130bp的扩增DNA片段。在32P-dCTP存在下，用随机引物标记法对该片段进行标记，并用作探针，筛选129SVJ小鼠基因组文库。检测得到的阳性噬菌体克隆的碱基序列，确定其是具有含小鼠PS-1目的基因外显子8染色体DNA的克隆。以该克隆的染色体DNA作为Pα，制作其限制性酶谱(图1)。
实施例2制备用于导入突变的质粒从具有Pα的克隆噬菌体中提取DNA，用SalI酶切后，进行1．0％琼脂糖凝胶电泳，回收Pα。将Pα用Pst1和XbaI酶切后，进行1％的琼脂糖凝胶电泳，回收约600bp的DNA片段，该片段含有编码小鼠PS1第213位的异亮氨酸的碱基，把它叫做X-1。用T4连接酶将X-1与预先用PstI和XbaI酶切的质粒pBluescript II KS+(Stratagene)连接，转化大肠杆菌，获得质粒pX-1。
实施例3OS-2型突变的导入用下述的2条寡脱氧核苷酸PRL-104和PRL-105，将OS-2型突变及限制性酶Sau3AI位点重新导入质粒pX-1。PRL-104和PRL-105均为36聚体，二者是互补性。PRL-1045’-TGTGGTCGGGA TGATC* GCCA C CCACTGGAAAGGCCC-3’PRL-1055’-GGGCCTTTCCAGTGG G TGGCG* ATCATCCCGACCACA-3’(划下线的碱基是因为导入了OS-2型突变而改变了的碱基PRL-104原来是T，PRL-105原来是A。此外，有*号的碱基是因为导入了San3AI位点而改变了的碱基PRL-104原来是T，RRL-105原来是A)。
导入突变时使用QUICK CHANGE SITE-DIRECTED MUTAGENESISKIT(Stragene)，按照其说明步骤进行。检测碱基序列确认出突变是否被正确导入，将具有这种突变X-1叫做mX-1，具有mX-1的质粒叫做p mX-1(图2)。
实施例4具有OS-2突变染色体DNA的制备用Nco I酶切实施例1中获得的含小鼠PS-1外显子8的Pα，在4种dNTPs存在的条件下用T4 DNA聚合酶使之平端化。接着用Asp718I酶切后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收含有外显子8的约5kbp的DNA片段。用T4 DNA连接酶将该DNA片段与预先用Sma I和Asp 718I酶切的质粒pBluescript II KS+连接，转化大肠杆菌得到质粒pSB-O。用Xba I完全酶切pSB-0后，用Pstl进行部分消化，另一方面，将pmX-1用Xba I和Pst I酶切后，进行1％琼脂糖凝胶电泳回收mX-1。用T4DNA连接酶将mX-1连接到上述Pst I片段中，转化大肠杆菌。检测转化的大肠杆菌的集落，选择具有质粒pSB-0的X-1部分与mX-1发生置换了的集落，将回收的质粒叫做pmSB-0(图3)。
另外，将Pα用Sal I和BamH I酶切后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收到大约7kbp含有外显子8的DNA片段。用T4DNA连接酶将预先用BamH I和Sal I酶切的pBluescript II KS连接到该片段上，转化大肠杆菌，得到质粒pSB-1。用NcoI酶切pmSB-0后，在4种dNTP存在下用T4DNA聚合酶使其平末端化，再用xbaI酶切后，进行1％琼脂糖凝胶电泳。将回收的含有外显子8大约2．2kbp的DNA片段XN和pSB-1用XbaI和PstI酶切后，进行1％琼脂糖凝胶电泳。用T4DNA连接酶连接回收的不含外显子8、大约2．3kbp的DNA片段PX。预先用Xbal酶切，在4种dNTPs存在下用T4DNA聚合酶使其平末端化，再用T4DNA连接酶连接，再用T4DNA连接酶与用SmaI和PstI酶切的质粒pBluescript II KS+连接，转化大肠杆菌。检测转化的大肠杆菌的段落，得到含有1个DNA片段NX和XP在XbaI位点结合的DNA片段的质粒pmSB-O’(图4)实施例5目标载体基本框架的制作为了在质粒pmSB-0’的Xbal部位导入Eag I位点，合成具有如下碱基序列的寡脱氧核苷酸。
5’-CTAGACGGCCGT-3’(12聚体)如下，该寡核苷酸与具有CGGCCG部分互补序列的碱基序列退火，插入到Xba I酶切位点。 用Xba I酶切质粒pmSB-0’后，用T4DNA连接酶连接该寡核苷酸，转化大肠杆菌，得到质粒pmSB-O的Xba I位点插入了Eag I位点的质粒pmSB-O’eag。该pmSB-O’eag用Nco I和Sal I酶切后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收到大约2kbp不含外显子8的DNA片段。用T4DNA连接酶连接SN和NB，通过BamH I和Sal I处理得到一个由两DNA片段在Nco I位点结合的DNA片段。将该DNA片段预先用Not I酶切后，通过绿豆核酸酶处理使其平端化，用T4DNA连接酶再结合以此破坏Not I位点以及与之重叠的Eag I位点，再用T4DNA连接酶与用BamHI和Sal I酶切的质粒pBluescript II KS连接，转化大肠杆菌，得到质粒pA(图5)。
实施例6目标载体的制作将质粒pPNT用Xbo I和BamH I酶切(Victor L．J．等；Cell 65卷，1153页，1991年)后，用T4DNA聚合酶使其平末端化，进行1％的琼脂糖凝胶电泳，将回收的大约1．7kbp含有neo表达元件的DNA片段预先用BamH I酶切后，用T4DNA连接酶使之与用T4DNA聚合酶平末端化的质粒pBS246(GIBCOBRL公司制)结合，转化大肠杆菌，获得质粒pBS 246 neo。用Not I将该质粒酶切后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收到大约2kbp具有插入到loxP序列的neo表达元件的DNA片段。用T4DNA连接酶将该DNA片段与预先用Eag I酶切的pA连接，转化大肠杆菌。检测转化的大肠杆菌集落，获得neo基因的方向与PS-1基向同向的质粒pB(图6)。
将质粒pB用BamH I和Sal I酶切后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收到具有OS-2型突变的loxP序列中插入了neo表达元件的DNA片段C。另外，将用Sal I和BamH I酶切Pα后得到的大约6．3kbp的DNA片段，向pBluescript II KS+进行亚克隆，得到质粒pSB-2。将该质粒用Hind III和BamH I酶切后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收到大约4kbp的DNA片段D。将DNA片段C和D用T4DNA连接酶连接后，用Hind III和Sal I酶切，得到DNA片段C和D在BamH I位点结合的DNA片段。将该DNA片段用T4DNA连接酶与预先用Hind III和Sal I酶切的pBluescript II KS连接，转化大肠杆菌，获得目标载体pOS-2 neoloxP(图7)。
实施例7将目标载体导入ES细胞以下实施例中所讲的细胞培养全部在37℃、5％CO2的培养箱中进行。用电穿孔法(electroporation)将目标载体向添加了15％PBS和103单位／ml LIF(ESGRO)的DMEM培养基(以下略作的ES用培养基)维持的ES细胞R1中导入，进行电穿孔的前一天收集已换成新鲜ES用培养基的R1细胞，用电穿孔溶液(20mM HEPES，pH 7．05，137mMNaCl，5mM KCl，0．7mM Na2HPO4，6mM右旋糖)洗涤。将107个R1细胞与25μg用Not I线化了的目标载体pOS-2 neoloxP和0．1ml电穿孔用溶液在电穿孔用比色杯中混合。1-2分钟后应用Bio-Rad GenePulser(Bio Rad公司)给与脉冲(脉冲条件240V，500μF)。离心回收ES细胞，悬浮到30ml ES用培养基中。在向每个预先已接种了饲养细胞的8ml ES用培养基中加入2ml ES细胞悬浮液，12-18小时后加入效价为150μg／ml的G418，培养1周。饲养细胞使用的是雄性HS1敲除(knock out)小鼠(I．Taniuchi等，EMBO J．14卷，3664页，1995年)与雌性野生型ICR品系交配后，从12-13日胚胎中分离出的成纤维细胞。
实施例8获得能引起同源重组的ES细胞收集实施例7中添加G418后培养1周所产生出的ES细胞集落。将各集落一分为二。一份继续培养。另一份用于筛选引起同源重组的克隆，用PBS将之洗涤，用蛋白酶K处理后，回收染色体DNA，通过PCR来筛选克隆。PCR中所应用的合成引物的碱基序列如下。
Prsnl-25’-CCCAACTCTATTTCTACCCTCGTTCATCTG-3’(构建的目标质粒外侧拥有的碱基序列)PKG-15’-TAGTGAGACGTGCTACTTCCATTTGTCACG-3’(neo表达元件中的碱基序列)。
PCR的实验条件是93℃ 30秒、60℃ 1分、68℃ 3分为1个循环，进行35个循环，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，产生在预测到的位置上的带为阳性克隆。在此判断的阳性克隆用寡脱氧核苷酸PRL-10和PRL-12对阳性克隆进行PCR，用Sau 3AI酶切PCR产物后进行2％的琼脂糖凝胶电泳，从带分成2条可以确定导入了突变，筛选出正确的引起同源重组的ES细胞。PRL-101和PRL-102的碱基序列如下PRL-1015’-TGCTGGAGGAAAATGTGTTATTTAAGAGCA-3’PRL-1025’-TACTGAAATCACAGCCAAGATGAGCCATGC-3’实施例9Knock in小鼠的取得将确定为能引起同源重组的ES细胞继续培养4天后，用胰酶处理细胞将其拆散。从与BDF1品系的雄性小鼠进行交配的同系雌性小鼠中取出8细胞期的胚胎，除去透明带后，接种上上述拆散的ES细胞(20个ES细胞／1个8细胞期胚)。将之移到进行伪孕处理的雌小鼠子宫内，使胎儿继续发育从而获得嵌合鼠。使该嵌合小鼠的雄性与雌性C57BL／6交配，选择仔代为淡(灰)色的小鼠，另剪切其尾部的一部分为试验材料，提取染色体DNA。用PRL-101和PRL-102进行PCR后，用Sau3AI酶切PCR产物，进行2％琼脂糖凝胶电泳，通过检测酶切的带存在来确认具有OS-2突变的小鼠。从确认的小鼠中选出的一只雄性小鼠为#2。
实施例10实施例9中得到的Knock in小鼠#2是以杂合态且拥有插入在来源于目标载体loxP之间的neo表达元件。将该小鼠#2(雄性，约4个月)与CAG-cre#13(K．Sakai等；Biochem．Biophys．Res．Commun．217318，1997)转基因小鼠的F4雌性(2个月；导入了cre基因的杂合体)进行交配，在例8的条件下，用寡脱氧核苷酸PRL-100，RRL-102及PGK-1进行PCR，通过筛选除掉了neo表达元件的小鼠来获得不具有neo表达元件的OS-2型突变的knock in小鼠(图8)。该小鼠是有关OS-2型突变的杂合子，并保持一个loxP。而且PCR中使用的PRL-100、PRL-102及PGK-1的碱基序列如下PRL-1005’-GGT CCA TCC CAG CTT CAC ACA GAC AAG TCT-3’PRL-1025’-TAC TGA AAT CAC AGC CAA GAT GAG CCA TGC-3’PKG-15’-TAG TGA GAC GTG CTA CTT CCA TTT GTC ACG-3’产业上利用的可能性本发明的基因突变动物因为具有早老蛋白-1基因，所以与正常动物(无该突变的动物)相比，其淀粉样β的产量多，呈现大脑海马神经细胞死亡和脱落等早期引发的阿尔茨海默病。因此，应用本发明的基因突变动物可进行对阿尔茨海默病的预防及／或治疗有效物质的筛选，评价其有用性。
序列表&#60110&#62第一制药株式会社&#60120&#62突变动物&#60130&#6298291M&#60150&#62JP P1998-002191&#60151&#621998-01-08&#60160&#6217&#60210&#621&#60211&#62467&#60212&#62蛋白质&#60213&#62人&#60400&#621Met Thr Glu Leu Pro Ala Pro Leu Ser Tyr Phe Gln Asn Ala Gln 15Met Ser Glu Asp Asn His Leu Ser Asn Thr Val Arg Ser Gln Asn 30Asp Asn Arg Glu Arg Gln Glu His Asn Asp Arg Arg Ser Leu Gly 45His Pro Glu Pro Leu Ser Asn Gly Arg Pro Gln Gly Asn Ser Arg 60Gln Val Val Glu Gln Asp Glu Glu Glu Asp Glu Glu Leu Thr Leu 75Lys Tyr Gly Ala Lys His Val Ile Met Leu Phe Val Pro Val Thr 90Leu Cys Met Val Val Val Val Ala Thr Ile Lys Ser Val Ser Phe 105Tyr Thr Arg Lys Asp Gly Gln Leu Ile Tyr Thr Pro Phe Thr Glu 120Asp Thr Glu Thr Val Gly Gln Arg Ala Leu His Ser Ile Leu Asn 135Ala Ala Ile Met Ile Ser Val Ile Val Val Met Thr Ile Leu Leu 150Val Val Leu Tyr Lys Tyr Arg Cys Tyr Lys Val Ile His Ala Trp 165Leu Ile Ile Ser Ser Leu Leu Leu Leu Phe Phe Phe Ser Phe Ile 180Tyr Leu Gly Glu Val Phe Lys Thr Tyr Asn Val Ala Val Asp Tyr 195Ile Thr Val Ala Leu Leu Ile Trp Asn Phe Gly Val Val Gly Met 210Ile Ser Ile His Trp Lys Gly Pro Leu Arg Leu Gln Gln Ala Tyr 225Leu Ile Met Ile Ser Ala Leu Met Ala Leu Val Phe Ile Lys Tyr 240Leu Pro Glu Trp Thr Ala Trp Leu Ile Leu Ala Val Ile Ser Val 255Tyr Asp Leu Val Ala Val Leu Cys Pro Lys Gly Pro Leu Arg Met 270Leu Val Glu Thr Ala Gln Glu Arg Asn Glu Thr Leu Phe Pro Ala 285Leu Ile Tyr Ser Ser Thr Met Val Trp Leu Val Asn Met Ala Glu 300Gly Asp Pro Glu Ala Gln Arg Arg Val Ser Lys Asn Ser Lys Tyr 315Asn Ala Glu Ser Thr Glu Arg Glu Ser Gln Asp Thr Val Ala Glu 330Asn Asp Asp Gly Gly Phe Ser Glu Glu Trp Glu Ala Gln Arg Asp 345Ser His Leu Gly Pro His Arg Ser Thr Pro Glu Ser Arg Ala Ala 360Val Gln Glu Leu Ser Ser Ser Ile Leu ila Gly Glu Asp Pro Glu 375Glu Arg Gly Val Lys Leu Gly Leu Gly Asp Phe Ile Phe Tyr Ser 390Val Leu Val Gly Lys Ala Ser Ala Thr Ala Ser Gly Asp Trp Asn 405Thr Thr Ile Ala Cys Phe Val Ala Ile Leu Ile Gly Leu Cys Leu 420Thr Leu Leu Leu Leu Ala Ile Phe Lys Lys Ala Leu Pro Ala Leu 435Pro Ile Ser Ile Thr Phe Gly Leu Val Phe Tyr Phe Ala Thr Asp 450Tyr Leu Val Gln Pro Phe Met Asp Gln Leu Ala Phe His Gln Phe 465Tyr Ile 467&#60210&#622&#60211&#621404&#60212&#62DNA&#60213&#62人&#60400&#622atg aca gag tta cct gca ccg ttg tcc tac ttc cag aat gca cag 45atg tct gag gac aac cac ctg agc aat act gta cgt agc cag aat 90gac aat aga gaa cgg cag gag cac aac gac aga cgg agc ctt ggc 135cac cct gag cca tta tct aat gga cga ccc cag ggt aac tcc cgg 180cag gtg gtg gag caa gat gag gaa gaa gat gag gag ctg aca ttg 225aaa tat ggc gcc aag cat gtg atc atg ctc ttt gtc cct gtg act 270ctc tgc atg gtg gtg gtc gtg gct acc att aag tca gtc agc ttt 315tat acc cgg aag gat ggg cag cta atc tat acc cca ttc aca gaa 360gat acc gag act gtg ggc cag aga gcc ctg cac tca att ctg aat 405gct gcc atc atg atc agt gtc att gtt gtc atg act atc ctc ctg 450gtg gtt ctg tat aaa tac agg tgc tat aag gtc atc cat gcc tgg 495ctt att ata tca tct cta ttg ttg ctg ttc ttt ttt tca ttc att 540tac ttg ggg gaa gtg ttt aaa acc tat aac gtt gct gtg gac tac 585att act gtt gca ctc ctg atc tgg aat ttt ggt gtg gtg gga atg 630att tcc att cac tgg aaa ggt cca ctt cga ctc cag cag gca tat 675ctc att atg att agt gcc ctc atg gcc ctg gtg ttt atc aag tac 720ctc cct gaa tgg act gcg tgg ctc atc ttg gct gtg att tca gta 765tat gat tta gtg gct gtt ttg tgt ccg aaa ggt cca ctt cgt atg 810ctg gtt gaa aca gct cag gag aga aat gaa acg ctt ttt cca gct 855ctc att tac tcc tca aca atg gtg tgg ttg gtg aat atg gca gaa 900gga gac ccg gaa gct caa agg aga gta tcc aaa aat tcc aag tat 945aat gca gaa agc aca gaa agg gag tca caa gac act gtt gca gag 990aat gat gat ggc ggg ttc agt gag gaa tgg gaa gcc cag agg gac 1035agt cat cta ggg cct cat cgc tct aca cct gag tca cga gct gct 1080gtc cag gaa ctt tcc agc agt atc ctc gct ggt gaa gac cca gag 1125gaa agg gga gta aaa ctt gga ttg gga gat ttc att ttc tac agt 1170gtt ctg gtt ggt aaa gcc tca gca aca gcc agt gga gac tgg aac 1215aca acc ata gcc tgt ttc gta gcc ata tta att ggt ttg tgc ctt 1260aca tta tta ctc ctt gcc att ttc aag aaa gca ttg cca gct ctt 1305cca atc tcc atc acc ttt ggg ctt gtt ttc tac ttt gcc aca gat 1350tat ctt gta cag cct ttt atg gac caa tta gca ttc cat caa ttt 1395tat atc tag 1404&#60210&#623&#6021l&#62467&#60212&#62蛋白质&#60213&#62小鼠&#60400&#623Met Thr Glu Ile Pro Ala Pro Leu Ser Tyr Phe Gln Asn Ala Gln 15Met Ser Glu Asp Ser His Ser Ser Ser Ala Ile Arg Ser Gln Asn 30Asp Ser Gln Glu Arg Gln Gln Gln His Asp Arg Gln Arg Leu Asp 45Asn Pro Glu Pro Ile Ser Asn Gly Arg Pro Gln Ser Asn Ser Arg 60Gln Val Val Glu Gln Asp Glu Glu Glu Asp Glu Glu Leu Thr Leu 75Lys Tyr Gly Ala Lys His Val Ile Met Leu Phe Val Pro Val Thr 90Leu Cys Met Val Val Val Val Ala Thr Ile Lys Ser Val Ser Phe 105Tyr Thr Arg Lys Asp Gly Gln Leu Ile Tyr Thr Pro Phe Thr Glu 120Asp Thr Glu Thr Val Gly Gln Arg Ala Leu His Ser Ile Leu Asn 135Ala Ala Ile Met Ile Ser Val Ile Val Ile Met Thr Ile Leu Leu 150Val Val Leu Tyr Lys Tyr Arg Cys Tyr Lys Val Ile His Ala Trp 165Leu Ile Ile Ser Ser Leu Leu Leu Leu Phe Phe Phe Ser Phe Ile 180Tyr Leu Gly Glu Val Phe Lys Thr Tyr Asn Val Ala Val Asp Tyr 195Val Thr Val Ala Leu Leu Ile Trp Ash Phe Gly Val Val Gly Met 210Ile Ala Ile His Trp Lys Gly Pro Leu Arg Leu Gln Gln Ala Tyr 225Leu Ile Met Ile Ser Ala Leu Met Ala Leu Val Phe Ile Lys Tyr 240Leu Pro Glu Trp Thr Ala Trp Leu Ile Leu Ala Val Ile Ser Val 255Tyr Asp Leu Val Ala Val Leu Cys Pro Lys Gly Pro Leu Arg Met 270Leu Val Glu Thr Ala Gln Glu Arg Ash Glu Thr Leu Phe Pro Ala 285Leu Ile Tyr Ser Ser Thr Met Val Trp Leu Val Asn Met Ala Glu 300Gly Asp Pro Glu Ala Gln Arg Arg Val Pro Lys Asn Pro Lys Tyr 315Asn Thr Gln Arg Ala Glu Arg Glu Thr Gln Asp Ser Gly Ser Gly 330Asn Asp Asp Gly Gly Phe Ser Glu Glu Trp Glu Ala Gln Arg Asp 345Ser His Leu Gly Pro His Arg Ser Thr Pro Glu Ser Arg Ala Ala 360Val Gln Glu Leu Ser Gly Ser Ile Leu Thr Ser Glu Asp Pro Glu 375Glu Arg Gly Val Lys Leu Gly Leu Gly Asp Phe Ile Phe Tyr Ser 390Val Leu Val Gly Lys Ala Ser Ala Thr Ala Ser Gly Asp Trp Asn 405Thr Thr Ile Ala Cys Phe Val Ala Ile Leu Ile Gly Leu Cys Leu 420Thr Leu Leu Leu Leu Ala Ile Phe Lys Lys Ala Leu Pro Ala Leu 435Pro Ile Ser Ile Thr Phe Gly Leu Val Phe Tyr Phe Ala Thr Asp 450Tyr Leu Val Gln Pro Phe Met Asp Gln Leu Ala Phe His Gln Phe 465Tyr Ile 467&#60210&#624&#60211&#621404&#60212&#62DNA&#60213&#62小鼠&#60400&#624atg aca gag ata cct gca cct ttg tcc tac ttc cag aat gcc cag 45atg tct gag gac agc cac tcc agc agc gcc atc cgg agc cag aat 90gac agc caa gaa cgg cag cag cag cat gac agg cag aga ctt gac 135aac cct gag cca ata tct aat ggg cgg ccc cag agt aac tca aga 180cag gtg gtg gaa caa gat gag gag gaa gac gaa gag ctg aca ttg 225aaa tat gga gcc aag cat gtc atc atg ctc ttt gtc ccc gtg acc 270ctc tgc atg gtc gtc gtc gtg gcc acc atc aaa tca gtc agc ttc 315tat acc cgg aag gac ggt cag cta atc tac acc cca ttc aca gaa 360gac act gag act gta ggc caa aga gcc ctg cac tcg atc ctg aat 405gcg gcc atc atg atc agt gtc att gtc att atg acc atc ctc ctg 450gtg gtc ctg tat aaa tac agg tgc tac aag gtc atc cac gcc tgg 495ctt att att tca tct ctg ttg ttg 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权利要求
1．具有突变早老蛋白基因的人以外的基因突变动物。
2．权利要求1的基因突变动物，它含有的早老蛋白-1基因包含编码突变型早老蛋白-1的DNA序列，而该早老蛋白-1中的1个氨基酸被其它的氨基酸所取代。
3．具有早老蛋白-1突变基因的人以外的基因突变动物，该突变基因含有编码突变型早老蛋白-1的DNA序列，而该蛋白的氨基酸序列中有1或2处以上选自以下序号的氨基酸被其它氨基酸所取代，如第79号、第82号、第96号、第115号、第120号、第135号、第139号、第143号、第146号、第163号、第209号、第213号、第231号、第235号、第246号、第250号、第260号、第263号、第264号、第267号、第269号、第280号、第285号、第286号、第290号、第318号、第384号、第392号、第410号、第426号、第436号。
4．具有早老蛋白-1突变基因人以外的基因突变动物，该突变基因含有编码突变型早老蛋白-1的DNA序列，而该早老蛋白-1的氨基酸序列中有1或2处以上选自以下氨基酸序列的变异，即A79V、V82L、V96F、Y115H、Y115C、E120K、E120D、N135D、M139V、M139T、M139I、I143F、I143T、M146L、M146V、H163Y、H163R、G209V、I213T、A231T、A231V、L235P、A246E、L250S、A260V、C263R、P264L、P267S、R269G、R269G、R269H、E280A、E280G、A285V、L286V、S290C、E318G、G384A、L392V、C410Y、A426P及P436S，其中各字母表示用单个字母表示法所表示的氨基酸，数字表示从早老蛋白-1N端开始的氨基酸序号，数字左侧表示的野生型氨基酸被其右侧的氨基酸所取代。
5．含有突变早老蛋白-1基因人以外的基因突变动物，该基因包含编码突变型早老蛋白-1的DNA序列，而该早老蛋白-1的第213位的异亮氨酸被异亮氨酸以外的氨基酸所取代。
6．含有突变早老蛋白-1基因的人以外的基因突变动物，该基因包含编码突变型早老蛋白-1的DNA序列，而该早老蛋白-1的第213位的异亮氨酸被苏氨酸所取代。
7．权利要求1～6任一权项中人以外的突变动物，它具有突变早老蛋白-1基因，该基因中编码早老蛋白-1氨基酸序列中第213位氨基酸相邻的DNA序列突变为以下序列，即5’-TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3’这里N指T以外的碱基，M指T或C，有下划线的碱基是编码第213位氨基酸的碱基。
8．权利要求1～6任一权项中人以外的突变动物，它具有突变的早老蛋白-1基因，该基因中编码早老蛋白-1氨基酸序列中第213位氨基酸左右的DNA序列突变为以下序列5’-TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3’其中N指C，M指T或C，有下划线的碱基是编码第213位氨基酸的碱基。
9．权利要求1～6任一权项中人以外的突变动物，它具有突变早老蛋白-1基因，该基因中编码早老蛋白-1氨基酸序列中第213位氨基酸相邻的DNA序列突变为以下序列5’-TGTGGTCGGGATGATMGCC XYZ CACTGGAAAGGCCC-3’XYZ指编码异亮氨酸以外氨基酸的3个碱基的密码子，M指T或C，具有下划线的碱基指编码第213位氨基酸的碱基。
10．具有突变早老蛋白-2基因的人以外的基因突变动物，该基因包含编码早老蛋白-2的DNA序列，该蛋白的氨基酸序列中第141位及1或436位的氨基酸被其它氨基酸所取代。
11．权利要求10的人以外的基因突变动物，它具有包含编码早老蛋白-2这样DNA序列的突变早老蛋白-2基因，该早老蛋白-2的氨基酸序列中有N141I及／或M239V的突变，其中各字母表示用单字母表示法表示的氨基酸，数字表示从早老蛋白-2N端开始的氨基酸序号，它表示数字左边的野生型氨基酸被其右边的氨基酸所取代。
12．权利要求1～11任一权项的基因突变动物，其中淀粉样β蛋白的过量表达是由早老蛋白-1基因和／或早老蛋白-2基因所引起的。
13．权利要求1～12任一权项的人以外的基因突变动物，它能表达突变的早老蛋白，且因该蛋白的表达能使大量的淀粉样β蛋白产生从而导致在哺乳动物大脑皮质周边部形成进行性神经疾病。
14．权利要求1～13任一权项中人以外的基因突变动物为哺乳动物中的啮齿类。
15．权利要求1～14任一权项中人以外的基因突变动物，其中基因突变动物为小鼠。
16．权利要求1～15任一权项中人以外的基因突变动物，其中突变型早老蛋白-1基因和／或突变型早老蛋白-2基因通过同源重组导入。
17．权利要求1～16任一权项中人以外的基因突变动物，其特征是与正常动物相比，因突变型早老蛋白-1基因引起的脑组织中淀粉样蛋白的表达量能充分地引起在学习记忆试验中的行动障碍，且在该动物海马区大脑皮质周边部诱发明显的异常神经病理变化。
18．含有编码突变型早老蛋白-1的突变型早老蛋白-1基因，和编码标记蛋白碱基序列DNA的人以外的基因突变动物，其中早老蛋白-1的氨基酸序列中1或2个以上的氨基酸转换成其它氨基酸而形成突变型早老蛋白-1。
19．含有突变型早老蛋白-1基因的DNA序列或其部分序列的质粒，其中编码早老蛋白-1氨基酸序列中第213位氨基酸附近的DNA序列如下5’-TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3’这里N指A、G或C，M为T或C，有下划线的碱基是编码第213位氨基酸的碱基。
20．含有突变型早老蛋白-1基因的DNA序列及其部分序列的质粒，其中突变型早老蛋白-1基因编码的突变型早老蛋白-1是早老蛋白-1的氨基酸序列中第213位氨基酸被异亮氨酸以外的氨基酸替换了的蛋白，编码第213位氨基酸附近的DNA序列如下5’-TGTGGTCGGGATGATMGCC XYZ CACTGGAAAGGCCC-3’这里M指T或C，XYZ指编码异亮氨酸以外的氨基酸的3个碱基的密码子，有下划线的碱基是编码第213位氨基酸的碱基。
21．含有突变型早老蛋白-1基因外显子8的染色体DNA，其中突变型早老蛋白-1基因编码的突变型早老蛋白-1是早老蛋白-1的氨基酸序列中第213位的氨基酸转换成异亮氨酸以外的氨基酸的蛋白。
22．含有在包含突变型早老蛋白-1基因的cDNA或染色体DNA全长或突变部分的碱基序列中导入Sau3AI位点DNA的质粒，其中突变型早老蛋白-1基因编码早老蛋白-1的氨基酸序列中第213位氨基酸置换为异亮氨酸以外氨基酸的突变型早老蛋白-1。
23．权利要求22中的质粒，其中氨基酸的置换是从213位异亮氨酸置换为苏氨酸。
24．质粒，它含有由下述碱基序列特定的DNA5’-TGTGGTCGGGATGAMCGCCACCCACTGGAAAGGCCC-3’这里M指T或C。
25．含有编码突变型早老蛋白-1的DNA序列的基因，其中突变的早老蛋白-1是小鼠早老蛋白-1的氨基酸序列第213位的异亮氨酸置换成异亮氨酸以外的氨基酸。
26．权利要求25的基因，其中氨基酸的置换是从异亮氨酸到苏氨酸。
27．质粒，它(1)含有编码小鼠突变早老蛋白-1的氨基酸序列中第213位的异亮氨酸被异亮氨酸以外的氨基酸置换了的突变早老蛋白-1的基因，以及(2)含有插入到loxP的新霉素表达元件。
28．权利要求27中的质粒，其氨基酸的置换是从异亮氨酸到苏氨酸。
29．胚胎，其特征为导入了含下述特定碱基序列DNA质粒，5’-TGTGGTCGGGATGATMGCCACCCACTGGAAAGGCCC-3’这里M为T或C。
30．胚胎，它是应用权利要求20、22、23、24、27或28中的质粒通过同源重组得到的。
31．权利要求29或30中的胚胎，其中胚胎是来源于哺乳动物中啮齿类的胚胎。
32．权利要求29～31任一权项中的胚胎，它是小鼠来源的胚胎干细胞。
33．通过分离权利要求1～18任一权项中基因突变动物的细胞，进行组织培养而获得的原代培养细胞或传代培养细胞。
34．人以外基因突变动物的制作方法，它包括通过同源重组将突变早老蛋白-1基因导入动物胚胎的工程，其中突变早老蛋白-1基因能表达突变型早老蛋白-1，且该蛋白的表达能使大量的淀粉样β蛋白产生，使大脑海马区或大脑皮质周边部形成进行性神经疾病。
35．权利要求第34中记述的基因突变动物的制作方法中，表达第213位的异亮氨酸突变为异亮氨酸以外氨基酸的突变早老蛋白-1的方法。
36．对阿尔茨海默病的治疗和／或预防有用物质的评价方法，它包括将被检测物质施用给权利要求1～18任一权项中记述的基因突变动物并与不施用或施用给对照物质进行比较的方法程序。
37．权利要求36中的评价方法，它通过学习记忆试验进行比较。
38．权利要求36中的评价方法，它通过病理试验进行比较。
39．权利要求36中的评价方法，它通过以大脑皮质周边部的神经病理为基础通过病理试验进行比较的。
40．权利要求38或39中的评价方法，其中以神经病理为基础进行的病理试验比较是从大脑皮质周边部的肥大的神经胶质增生减少的抑制、大脑皮质周边部的2-脱氧葡萄糖摄取减少的抑制，及大脑皮质2-脱氧葡萄糖利用减少的抑制中选1或2个以上项目进行比较。
41．权利要求36中的评价方法，其中从动物的生存期、探索行动、及移动行动中选出1或2个以上的项目进行比较。
42．阿尔茨海默治疗和／或预防剂的评价方法，它包括将权项33中记述的原代培养细胞或传代培养细胞置于被检化合物存在条件下的体外培养工程。
43．阿尔茨海默病或阿尔茨海默病可能发生的诊断方法，其特征在于它应用编码OS-2型突变早老蛋白-1的突变早老蛋白-1基因的部分碱基序列。
44．对阿尔茨海默病的治疗和／或预防有用的物质，它是用权利要求36～42任一权项中的评价方法筛选出的。
45．阿尔茨海默病的治疗剂和／或预防剂，它包含以权项44中记述的物质作有效成分。
46．基因突变动物，它具有突变型早老基因和编码淀粉样前体蛋白的突变蛋白的基因，它是将权项1～18中的基因突变动物与具有编码淀粉样前体蛋白的突变蛋白的基因并大量产生，淀粉样β蛋白的动物进行交配而制备的杂交动物及其后代。
47．权项46中的基因突变动物，其中动物为小鼠。
48．权项47中的基因突变动物，其中它具有编码淀粉样前体蛋白突变蛋白的基因、淀粉样β蛋白的产量多的小鼠为PSI突变小鼠。
49．基因突变小鼠，具有突变的早老基因和编码淀粉样前体蛋白突变蛋白基因的基因突变小鼠，它是将权利要求7～18任一权项中的基因突变动物与具有编码淀粉样前体蛋白突变蛋白的基因、且淀粉样β蛋白产量多的小鼠进行交配而制作的杂交小鼠及其后代。
50．基因突变小鼠，它含有突变的早老基因和编码淀粉样前体蛋白的突变蛋白基因，它是将权利要求7～18任一权项中的基因突变动物与具有编码淀粉样前体蛋白的突变蛋白的基因、且淀粉样β蛋白的产量多的小鼠进行交配所生的杂交小鼠及其后代。
全文摘要
具有突变早老蛋白－1基因的小鼠等基因突变动物,突变型早老蛋白－1基因含有编码突变型早老蛋白－1的DNA序列,而突变型早老蛋白－1的突变是早老蛋白－1的氨基酸序列中一个氨基酸被其它的氨基酸所取代(例如小鼠来源的早老蛋白－1第213位的异亮氨酸突变为异亮氨酸以外的氨基酸,如苏氨酸)。它可用作近似人阿尔茨海默病患者病情的动物模型。
文档编号C12N5/00GK1292638SQ99803799
公开日2001年4月25日 申请日期1999年1月7日 优先权日1998年1月8日
发明者武田雅俊, 竹田润二 申请人:第一制药株式会社