粒子轰击转化芸苔属植物的制作方法

专利名称：粒子轰击转化芸苔属植物的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过粒子轰击转化芸苔属植物的方法和材料。
背景信息
芸苔属植物包括许多农业上重要的作物，它们被人类用作蔬菜、食用油和调味品。实际上，芸苔属植物的油产量占全世界食用油的12％以上。为了改善农业上重要作物地质量，传统上栽培者是依靠常规的育种方法。然而，随着当代植物分子生物学和遗传学的进展，现在栽培者能通过导入外源DNA来改善植物质量。
已有人用几种不同的方法来转化植物。一种常用方法涉及用感兴趣的DNA包覆着的微粒以轰击植物细胞。实际上，粒子轰击方法已经广泛地用来转化玉米、大豆、小麦和稻谷。然而，用粒子轰击转化芸苔属植物的尝试还没有成功。实际上，唯一成功的芸苔属植物转化需要对芸苔属植物胚胎进行大量操作。因此，目前的研究者依靠其它方法(例如土壤杆菌介导的方法)来转化芸苔属植物。
概述
本发明涉及用粒子轰击方法转化芸苔属植物种类。具体地说，本发明根据的是发现了一种迅速而方便的组织制备技术，该技术使芸苔属植物细胞能被培养，能通过粒子轰击转化并再生成植物。另外，本发明提供了转化的细胞，以及生长至成熟并结籽的再生植物。这些再生的植物及其后代稳定地表达转移入的核酸分子。本文所述的发明方法的简单性使芸苔属植物中的粒子轰击转化方法不仅可以实现，而且在经济上可行。
本发明一方面提供一种产生转化的芸苔属植物细胞的方法，该方法涉及用核酸包覆的微粒轰击从非胚胎芸苔属植物组织制得的细胞，以及鉴定经该核酸转化的细胞。经核酸转化的细胞可以这样来鉴定将经轰击的细胞置于浮选装置上，使其与液体选择性培养基接触，然后选择存活细胞。该方法还可涉及从转化细胞再生出芸苔属植物。例如，可将经鉴定的细胞置于与液体再生培养基接触的浮选装置上。从非胚胎芸苔属植物组织制得的细胞可以是二倍体。另外，非胚胎芸苔属植物组织可以来自幼苗，例如4-6日龄的不育性幼苗。通过将组织切成片，并使该片与诱导培养基接触，就可从非胚胎芸苔属植物组织制得细胞。例如，可用以下方法从非胚胎芸苔属植物组织制得细胞，即将幼苗下胚轴切成多片，再将这些片纵向切开，使纵向切片的表皮侧接触诱导培养基。细胞也可通过将组织浸软成细胞浆的方法从非胚胎芸苔属植物组织制得。例如，可以这样从非胚胎芸苔属植物组织制得细胞，即除去幼苗下胚轴的下部，将其余的含有芽尖、子叶和10-50％下胚轴的上部与诱导培养基合并，然后将该组合物浸软成细胞浆。另外，还可富集细胞浆中其大小为46-230微米的细胞物质。用来转化芸苔属植物细胞的核酸能调节某多肽的表达或编码某多肽。例如，核酸能编码反义分子，如核酶或反义寡核苷酸。另外，芸苔属植物组织可以来自芸苔属植物种类，如蔓菁(Brassica napus)，黄芥子(Brassica juncea)，Brassicacarinata，黑芥(Brassica nigra)，甘蓝(Brassica oleracea)和油菜(Brassica campestris)(也称为“rapa”)。
本发明另一方面提供了通过以下方法产生的芸苔属植物细胞及其后代，该方法是用核酸包覆的微粒轰击从非胚胎芸苔属植物组织制得的细胞，并鉴定转化了该核酸的细胞。
本发明另一方面提供了一种培养芸苔属植物组织的方法，该方法包括将芸苔属植物组织置于与液体培养基接触的浮选装置上。该液体培养基可以是选择培养基。将芸苔属植物组织培养在选择培养基上，就能鉴定出已用该核酸转化的芸苔属植物组织。另外，该液体培养基可以是再生培养基。将芸苔属植物组织培养在再生培养基上，就能使芸苔属植物组织再生出芸苔属植物。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域普通技术人员通常了解的相同意义。虽然在实施或测试本发明时可以采用与本文所述的相似或等价的方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均全部纳入本文作参考。在有矛盾时，将以本文的说明书(包括定义)为主。另外，本文中的材料、方法和实施例只是描述性的，并不意味着有局限性。
从下列详细描述以及权利要求能明显得出本发明的其它特征和优点。
附图描述


图1是用于本文描绘的实验的pIMC38构建物的示意图。
详细描述
本发明提供了用粒子轰击转化芸苔属植物所涉及的方法和材料。具体地说，本发明提供了制备非胚胎芸苔属植物组织的方法，从而使芸苔属植物细胞能被培养、能被粒子轰击转化，并能再生成植物。本发明还提供了稳定转化的芸苔属植物细胞及其后代。转化的植物在本文中也称为转基因植物。
组织制备物
细胞或组织制备物定义为以适合粒子轰击的方式排列的一组细胞或组织。为了确保转化成功，细胞或组织制备物提供了相当大数目的暴露在表面上的细胞(较佳的是正迅速分裂的细胞)，因而它们能接受核酸包覆的粒子。另外，受体细胞必须能继续生长并再生出植物。许多非胚胎芸苔属植物细胞或组织来源可用来制备满足这些标准的细胞或组织制备物。例如，从芸苔属植物衍生获得的叶原生质体、分离的小孢子培养物、茎组织、以及下胚轴组织可用作芸苔属植物细胞来源。用非胚胎组织来源能极大程度地简化转化程序。典型地，采用的是从不育条件下生长的幼苗制得的下胚轴组织。在这种情况下，可将下胚轴切成纵向的切片。或者，可将幼苗的上部研磨成细胞浆。这样的上部可包括两个子叶、芽尖、以及下胚轴的顶部。
细胞浆是含有能活细胞的不溶性细胞物质的液体悬浮液。可用捣碎机将芸苔属植物组织研磨成细胞浆。另外，可以根据不溶性细胞物质的大小对细胞浆分组。例如，可将细胞浆分选通过一系列筛网，从而使特定大小的不溶性细胞物质富集。任何大小的细胞浆均可用于粒子轰击，只要该细胞浆含有能活细胞即可。例如，可对细胞浆中大小约35微米至约500微米、或大小约46微米至约230微米的细胞物质富集，并用于粒子轰击。
芸苔属植物组织制备物可含有二倍体或单倍体细胞。当采用二倍体细胞时，知道在每个整合部位的所得转化细胞最有可能是杂合的。换句话说，一个拷贝的导入的核酸整合到两个染色体相同位置上的可能性很小。然而，在采用单倍体细胞时，可用秋水仙碱处理所得的转化的单倍体细胞，以诱导染色体复制。这样，得到的细胞在每个整合部位极有可能是纯合的。另外，单倍体植物可以从所得转化的单倍体细胞再生。然后，可将这些单倍体植物与其它植物杂交，以产生特定整合部位为杂合或纯合的植物。进而，基因组中整合入导入核酸序列的细胞称为稳定转化的细胞。稳定转化的细胞通常随每次细胞分裂而保留导入的核酸序列。含有未整合入基因组的导入核酸序列的细胞称为瞬时转化的细胞。瞬时转化细胞通常随每次细胞分裂而丧失一部分导入的核酸序列。这样，转化细胞可以是瞬时转化的和／或稳定转化的。
在轰击前，非胚胎芸苔属植物组织制备物可以培养在诱导培养基，如固体诱导培养基中。该固体培养基通常通过在液体培养基中加入琼脂来制得。诱导培养基通常含有Murashige和Skoog(MS)培养基，以及相对较高浓度的植物生长素(如2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D))，以及相对较低浓度的细胞分裂素(例如激动素)。例如，可在MS培养基中加入1毫克／升2，4-D和0．3毫克／升激动素，并使用。另外，在轰击前1-3天，组织制备物通常培养在诱导培养基中。
出于本发明的目的，可以采用固体和／或液体组织培养技术。例如，诱导、选择和再生培养基可以呈固体或液体形式。在采用固体培养基时，可以将芸苔属植物组织直接置于培养基上，或可将其置于一滤膜上，然后放置该滤膜与培养基接触。在采用液体培养基时，可将芸苔属植物组织置于和液体培养基接触的浮选装置上。浮选装置通常是如其它文献(美国专利No．5，324，657)所述的多孔膜。从生产商如LifeTechnologies(Rockville，MD)和Osmotek Ltd．(Kiryat Weizmann Rehovot 76210，Israel)很容易获得浮选装置的实例、浮选装置的使用方法以及有助于液体培养技术的辅助设备。通常，将生长较快的组织培养在液体培养基中。例如，可用液体选择培养基和液体再生培养基来培养黄芥子组织。
核酸分子
可用环形或线形核酸分子来包覆颗粒，进而用该颗粒转化芸苔属植物。另外，这些核酸分子可以是RNA或DNA，包括cDNA、基因组DNA以及合成的(例如化学合成的)DNA，它可以是双链或单链的。当其为单链时，该核酸可以是有义链或反义链的。这些分子的片段也在本发明的范围内，它们可用聚合酶链反应(PCR)来制得，或通过用一种或多种限制性内切核酸酶处理来产生。RNA分子可通过例如体外转录来产生。
本发明的核酸分子通常编码某多肽，或调节某多肽的表达。例如，可以采用编码一种酶的cDNA或防止该酶合成的反义分子。术语“反义分子”包括任何核酸分子，其含有的序列与天然存在的多肽的编码链互补。反义分子还可包括侧接的序列，例如调控序列或内含子。利用互补的反义序列来特异性靶向和切割RNA的酶促性核酸分子(如核酶以及反义寡核苷酸)，被认为是本发明范围内的反义分子。这些核酶可具有任何通常的结构(包括但不局限于发夹、锤头或斧头状结构)，只要该分子能切割RNA。
通常，本发明的核酸分子是质粒形式，其含有的序列编码某多肽并促进该多肽在芸苔属植物细胞中的表达。促进多肽表达的序列通常是接在多肽编码序列两侧的调控序列。多肽可以是任何用合成方法工程改造的或用生物学方法衍生获得的多肽。此外，该多肽可以天然存在于芸苔属植物中或与芸苔属植物异源。这样，芸苔属植物多肽、植物多肽、非植物多肽、修饰过的多肽、合成的多肽、以及多肽的一部分均在本发明的范围内。
用来成功转化植物的核酸分子的组成及其构建方法均是本领域技术人员所熟知的。例如，其它地方(Weising，等人，Ann．Rev．Genetics 22421-478(1988))描述了合适的核酸组件(如启动子、聚腺苷酸化序列、可选择的标记序列、报道物序列、增强子、内含子等)的应用以及提供那些组件具体组成的文献。另外，其它文献(Sambrook J．等人，《分子克隆实验手册》第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))中描述了合适的构建方法。重要的是应注意，这里可以采用相同或相似的组成和方法来产生能用来转化芸苔属植物的核酸分子，因为用来转化芸苔属植物的核酸分子的具体组成对于本发明并不重要，本发明并不取决于具体采用的转化核酸分子的组成。
特别适用于转化芸苔属植物的核酸分子包括为所得转化芸苔属植物的有益特征而提供的或增强该特征的DNA分子。例如DNA能编码促使食物营养价值增加、产量提高、抗害虫、抗疾病等的多肽或反义分子。具体的例子包括，但不局限于，改变脂肪酸组成的异源脂肪酸去饱和酶或脂肪酸延伸酶(elongase)、赋予抗昆虫性的Bt内毒素基因或蛋白酶抑制剂；赋予耐受草甘磷除草剂的细菌ESPS合成酶基因；以及赋予杀真菌性能的壳多糖酶或葡聚糖内切-1,3-B-糖苷酶基因。另外，可将核酸分子导入芸苔属植物中作为遗传工具，以产生突变株和／或有助于芸苔属植物DNA片段的鉴定、基因标记或分离。能提供有益特征或用作遗传工具的其它核酸分子是本领域技术人员通常所知的，这些均在本发明的范围内。
导入芸苔属植物的核酸分子还可含有编码可选择标记、报道物或两者的核酸序列。这些序列在芸苔属植物中的表达能帮助鉴定和选择稳定转化的细胞、瞬时转化的细胞或两者。另外，可选择标记能载于用共转化程序导入的各别的核酸分子上。编码这些可选择标记和报道物的序列能侧接有助于芸苔属植物中表达的合适的调控序列。有用的可选择标记是本领域技术人员所熟知的，它们例如包括抗生素以及除草剂的抗性基因。这些基因的具体例子公开在其它处(Weising，等人，Ann．Rev．Genetics 22421-478(1988))。一种典型的可选择标记基因是转座子Tn5(AphII)的氨基糖苷磷酸转移酶基因，它编码的多肽赋予了对抗生素卡那霉素、新霉素和G418(遗传霉素)的抗性。本领域已知的其它可选择标记包括能从大肠杆菌衍生获得的潮霉素B磷酸转移酶(HPT)编码序列以及编码赋予对草甘磷、氨甲喋呤、膦丝菌素、咪唑啉酮、磺酰脲、溴苯腈、茅草枯等抗性或耐受性的多肽的那些基因。赋予转化芸苔属植物除草剂抗性或耐受性的可选择标记基因的表达在商业上是有用的。
编码能容易测得的标记多肽的报道基因是本领域所熟知的。通常，报道基因是不存在于受体生物或组织中或被受体生物或组织表达的基因，其编码多肽的表达可通过一些能容易检测的性质(如表型变化或酶促活性)来表现。其它文献(Weising等人，Ann．Rev．Genetics 22421-478(1988))提供了这些报道物的例子。典型的报道物包括来自生物发光的水母Aequorea victoria的绿色荧光蛋白(GFP)基因、GFP的变体、来自大肠杆菌Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因、大肠杆菌uidA基因座的β-葡糖醛酸酶基因、以及来自萤火虫Photinus pyralis的萤光素酶基因。含有GFP以及GFP变体的核酸序列的载体可购自Clontech Laboratories，Inc．(Palo Alto，CA)。GFP ApplicationNotes(应用注意)(Living ColorsTM；PT2040-l；Clontech Laboratories，Inc．)描述了GFP以及GFP变体。
可用于本文的调控序列包括任何组成型的、可诱导的、组织或器官特异性的、或发育阶段特异性的、在植物细胞中起作用的启动子。其它文献公开了这些合适的启动子(Weising等人，Ann．Rev．Genetics 22421-478(1988))。下面是适用于本文的启动子的部分代表清单来自根癌农杆菌的T-DNA的调控序列，包括甘露氨酸合成酶、胭脂氨酸合成酶和章鱼氨酸合成酶；来自玉米的醇脱氢酶启动子；来自各植物种类的光可诱导启动子，如二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基因；主要的叶绿素a／b结合蛋白基因启动子；花椰菜花叶病毒的35S和19S启动子；发育性调节的启动子，如油质蛋白、十字花科蛋白(cruciferin)、芜菁蛋白(napin)和菜豆蛋白的启动子；以及可诱导的或组成型的合成启动子或其它天然启动子，包括表现出器官特异性表达或在植物的特定发育阶段表达的那些启动子。
特别值得推荐的启动子是允许种子特异性表达的那些启动子。这些启动子有用是因为种子是植物油的主要来源，而且还因为种子特异性表达会避免非种子组织中任何潜在的有害作用。种子特异性启动子的例子包括，但不局限于，种子贮藏蛋白的启动子，该蛋白在许多植物中可占种子总蛋白直到90％。种子贮藏蛋白受到严格的调控，它以高度组织特异性和阶段特异性的方式在种子中几乎专有地表达(Higgins等人，Ann．Rev．Plant Physiol．35191-221(1984)；Goldberg等人，Cell 56149-160(1989))。另外，在种子发育的不同阶段可能表达不同的种子贮藏蛋白。
人们已经详细研究了种子特异性的基因表达(综述见Goldberg等人，Cell Sb149-160(1989)和Higgins等人，Ann．Rev．Plant Physiol．35191-221(1984))。目前有许多关于种子贮藏蛋白基因在转基因双子叶植物中种子特异性表达的例子。
种子特异性启动子的其它例子来自在早期胚胎发育和油的生物合成期间表达的基因。例如，脂肪酸去饱和酶基因的天然调控序列(包括天然的启动子)可由本领域技术人员分离后采用。可采用参与种子油生物合成的其它基因的异源启动子，这些基因例如蔓菁异柠檬酸裂合酶和苹果酸合成酶的基因(Comai等人，Plant Cell 1293-300(1989))；红花(Thompson等人，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 882578-2582(1991))和蓖麻(Shanklin等人，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 882510-2514(1991))的δ-9去饱和酶的基因；拟南芥菜属(Post-Beittenmiller等人，Nucl．Acids Res．(1989)171777)、蔓菁(Safford等人，Eur．J．Biochem．174287-295(1988))和油菜(Rose等人，Nucl．Acids Res．157197(1987))的酰基载体蛋白(ACP)的基因；大麦的β-酮脂酰基-ACP合成酶(Siggaard-Andersen等人，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 884114-4118(1991))；以及Zeamays(Lee等人，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 886181-6185(1991))、大豆(Genbank登录号X60773)和蔓菁(Lee等人，Plant Physiol．961395-1397(1991))的油质蛋白的基因。
核酸分子还可含有其它元件，如内含子、增强子、聚腺苷酸化序列等。这些元件可能是核酸分子起作用所必需的或非必需的，尽管它们能通过影响转录、mRNA的稳定性等使核酸分子更好地表达或发挥功能。这些元件可包括在所需的核酸分子中，以使核酸转化入植物的性能最优。然而，没有内含子通常也能获得足够的表达，使可选择标记满意地表现。
为了确定特定的核酸组件组合是否如所需的那样发挥功能，可通过用含有该特定组合以及一种报道物的核酸分子构建物以粒子轰击来稳定或瞬时转化芸苔属植物受体细胞。在转化后的适当时间，可进行测定该报道物表达的试验。例如，有一个试验需要鉴定大肠杆菌β-葡糖醛酸酶(GUS)基因的瞬时表达(Jefferson等人，EMBO J．63901-3907(1987))。在该情况下，进行该试验的合适时间为轰击后大约1-3天。当所用核酸分子含有的组件以前未被证实或确认与所希望的芸苔属植物受体细胞相容时，采用瞬时试验是特别重要的。
粒子轰击
用粒子轰击方法将本文描述的核酸分子导入非胚胎芸苔属植物组织制备物中。其它文献中提供了关于合适的粒子轰击仪器以及粒子轰击方法的一般性描述(Sanford等人，J．Part．Sci．Technol．527-37(1987)；Heiser W．，″用氦驱动的PDS-1000／He系统优化Biolistic_转化″，US／EG Bulletin 1688，BIO-RAD；和Dunder等人，″不同Biolistic_装置的工作性能比较″US／EG Bulletin 1689，BIO-RAD)。简言之，粒子轰击方法(也称为biolistic方法)利用非常小的粒子将所需核酸分子输送到细胞内，该粒子由生物学惰性材料制成，其上已经包覆了核酸分子。当该惰性粒子被核酸分子包覆并被加速至适当速度时，一个或多个粒子将进入一个或多个细胞，核酸分子从粒子上释放下来并在细胞中表达。尽管一些细胞可能被轰击方法致死性破坏，但其它细胞却是存活的。存活的一些受体细胞稳定地保留了导入的核酸分子并表达该核酸分子。
粒子(称为微粒)通常是高密度的材料，如钨或金。它们被感兴趣的核酸分子包覆。包覆程序在其它文献中已有详细描述(Stanford等人，Methods Enzymol．217483-509(1993)和Heiser W．，″用氦驱动的PDS-1000／He系统优化Biolistic_转化″，US／EGBulletin 1688，BIO-RAD)。然后将微粒置于大轰击粒子的表面上，该大轰击粒子的作用是将来自合适能量来源的动力转移给微粒。在大轰击粒子和微粒被加速至适当速度后，它们接触一个阻挡装置，该装置阻止大粒子继续沿向前的路径移动，但却允许包覆了核酸分子的微粒继续运动并冲击芸苔属植物受体细胞。合适的仪器能利用各种动力，如高压氦罐、火药和来自电弧放电的冲击波(Sanford，等人，J．Part．Sci．Technol．527-37(1987)和Sanford等人，Technique 33-16(1988))。
Klein T等人提供了一种利用火药装置的方法(Proc．Natl．Acad．Sci．USA 854305-4309(1988)和Bio／Technology 6599-563(1988))，该方法包括两个主要步骤。首先，使钨微粒在水溶液中以指定次序与核酸分子、氯化钙和不含亚精胺的碱(base)混合，对其进行包覆。各组分的浓度可以变化。例如，可以采用任何浓度的核酸分子，只要芸苔属植物受体细胞表达该转移的核酸分子。其次，在实际轰击时，设定受体细胞距炮管末端的距离以及样品室内的真空度。这些设定在其它文献中也有描述(Klein等人，Bio／Technology 6599-563(1988))并可改变。
用高压氦罐装置(Biolistic_PDS-1000／He粒子输送系统)的方法由生产商(BIO-RAD，Hercules CA)提供。具体条件(如用来包覆微粒的核酸分子的浓度、用来加速微粒的氦气压以及阻挡筛网距样品的距离)均可改变。典型地，受体组织通常置于阻挡板托盘下方6-9厘米处。
本文描述的具体的芸苔属植物组织制备物可置于培养皿或其它表面上，以基本上任何方式排列，考虑到(Ⅰ)平皿中央区域可能接受浓度最高的核酸分子包覆粒子，因此位于该区域的组织可能在轰击期间遭受破坏，(Ⅱ)到达细胞的粒子数可能随细胞距冲击波区域中心距离的增加而减少，从而使远离平皿中央的细胞可能未受到轰击和转化。Biolistic_PDS-1000／He粒子输送系统(BIO-RAD，Hercules CA)能向受体细胞输送更均匀分布的微粒。筛网(较佳的是金属筛网)可以任选地置于平皿上，以防组织飞溅或喷出。组织可用核酸分子包覆的粒子轰击一次或多次。另外，可用包覆了一种核酸分子或多种不同核酸分子的粒子轰击细胞。同样，可用一批粒子轰击组织制备物，其中该批粒子含有不同的套，每一套用不同的核酸分子包覆。
鉴定转化的芸苔属植物
在用包覆粒子轰击芸苔属植物组织制备物且核酸分子已经进入一些细胞之后，就需要鉴定含有核酸分子并保留有足够再生性能的细胞。许多方法均可用来鉴定转化的植物细胞，这些方法是本领域技术人员所知道的。简言之，这里描述两种有用的通用方法。第一种方法是，可以通过各种标准方法筛选转化的芸苔属植物细胞或从该细胞再生的植物中是否存在该核酸分子，这些标准方法包括，但不局限于，测定核酸分子内所含报道物的表达，以及评价该核酸分子的表达引起的对表型的影响(如果有的话)。第二种方法是，可将一种可选择标记序列与核酸分子一起、或作为核酸分子的一部分来传送。在这种情况下，可利用选择性试剂检测可选择标记的表达，鉴定转化细胞。
选择条件的选择必须允许转化细胞生长并积累，同时还要抑制未转化细胞的生长。由于群体中个别细胞的活力通常高度依赖于其邻近细胞的活力，因此这种情况会变得复杂。另外，选择条件还必须不能严格得使转化细胞没有植物再生性能以及所得植物没有生育力。因此，应评价选择试剂对于细胞生活力以及形态的影响。该评价可预先进行，通过实验产生针对给定选择试剂和组织的生长抑制曲线，从而制定不抑制生长的浓度范围。
在采用可选择标记时，可使受轰击的芸苔属植物组织在非选择性培养基上从轰击恢复，或直接转移到含有选择试剂的培养基中。
选择程序通常涉及使受轰击的组织接触一种毒性试剂。组织可以经历试剂浓度的依次变化以及多轮选择。特定浓度和周期长度通常根据所用的特定试剂而异。另外，选择程序可包括在初始选择回合采用浓度较低的毒性剂，然后是在以后的回合中采用较高的浓度。这能使选择试剂在较长时间内缓慢发挥其毒性作用。开始时，试剂的浓度可以是使大约5-40％的生长受抑制(从生长抑制曲线确定)。目标是使转化细胞优先生长并分裂，同时抑制未转化的细胞，但是并不达到抑制转化细胞生长的程度。一旦有一些个别的转化细胞充足生长，就将组织转移到含有较高浓度毒性剂的培养基中，以杀死基本上所有的未转化细胞。向较高浓度的转移还减少了未转化细胞适应该试剂的可能性。较高的浓度可以是抑制约30-100％生长的浓度。第一个选择周期的长度可以是大约1至4周，通常约为2周。以后的选择周期可以为大约1至约12周，通常为大约2至10周。通常可将在不增殖细胞背景中的增殖的组织部分或细胞确定为推定的芸苔属植物转化子。经过轰击的芸苔属植物组织还可在整个选择过程期间的不同时间培养在非选择性培养基上。
一旦确定了为推定转化子的部分，就可通过表型和／或基因型分析确认转化。如果采用一种选择试剂，则表型分析的一个例子可以包括测定推定转化子新重与选择性试剂的各种水平对比上的增加。可采用的其它分析将取决于转移的核酸分子的功能。例如，如果核酸分子编码的是酶或其它多肽，则可采用对该特定酶或多肽有特异性的酶促试验或免疫学试验。适合检测转移核酸分子表达的特异性生物鉴定和化学试验技术是本领域技术人员熟知的，在这里不作重复。还可通过常规方法如Southern印渍、Northern印渍或PCR分析等来确认核酸本身的存在。
芸苔属植物的再生
转化的芸苔属植物细胞可以再生成植物，并可测定所得植物的生育力。简言之，将经测试呈转化阳性的细胞置于促进组织分化和植物再生的培养基上。再生培养基的一个例子包括，但不局限于，含有较低浓度的植物生长素(如吲哚-3-乙酸(IAA))和较高浓度的细胞分裂素(如玉米素)的MS培养基。具体的再生方法可根据本领域熟知的标准程序来进行。通常，这些方法需要减低植物生长素的水平。再生培养基还可含有用于选择培养基中的相同选择试剂。再生的植物可以在生长室或温室中生长至成熟，并能发生适当的有性杂交和自交。
重要的是应注意到，植物的再生尽管对于本发明很重要，却可用任何常规方法来进行。例如，如果已经将可选择标记导入细胞内，那么可将选择试剂掺入再生培养基，以进一步确认再生的小植株是转化的。由于再生技术是众所周知的，对于本发明并不关键，因此可以采用任何技术来实现再生并产生能育的植物。
后代的分析
从转化的芸苔属植物再生获得的植物称为R0代或R0植物。R0代植物发生各种有性杂交产生的种子称为R1子代或R1代。当R1种子发芽后，所得的植物也称为R1代。
应分析R1代，以确认转移的核酸分子的成功传送和遗传。该分析可用本文描述的鉴定转化子的任何方法来进行，并可考虑采用植物的任何部分。另外，还可分析任何R1或以后(例如R2、R3、R4等)的植物以及F1或以后(例如F2、F3、F4等)的植物。
从上可以明显看出，术语“后代(子代)”包括特定细胞、细胞系、植物或植物系的后代，例如在植物上发育的种子以及从这些种子衍生获得的植物。植物的后代包括在R0、R1、R2以及随后代植物上的形成的种子，在F1、F2、F3以及随后代植物上形成的种子、或在BC1、BC2、BC3以及随后代植物上形成的种子。因此，自交的后代不仅包括最初自花传粉的R1后代，还包括R2、R3以及随后代。
培育转基因芸苔属植物
通常，如果能将核酸分子插入许多不同种类中，则本文产生的转化的芸苔属植物的商用价值最高。农场主通常根据成熟性、耐受性和其它农艺学性状的不同来种植数种植物。另外，农场主必须根据地理位置来选择品种，因为适应特定生长环境的品种通常不适应另一环境，因为它们在诸如成熟性、抗病性和抗虫害性等性状方面有差异。因此，可以有利地将核酸分子插入大量亲本芸苔属植物株系中，从而能产生许多含有所需核酸分子的品种。这可通过育种程序来方便地实现，其中进行一个变换过程(回交)，将最初能育的转基因植物与正常的原种纯系杂交，然后使子代与正常亲本回交。该杂交的后代将发生分离，一些植物将携带核酸分子，而另一些则不携带核酸分子。然后使确实携带核酸分子的植物再次与正常植物杂交，导致后代再次分离。重复该杂交，直至最初的正常亲本变换成含有该核酸分子并且具有最初亲本中所有其它重要品质的基因工程改造系。对于有待转变成基因工程改造的原种系的每个原种系均可采用分离的回交程序。这可能是两个亲本使该核酸分子纯合所必需的。芸苔属植物育种以及将基因从一个系或品种转移至另一系或品种内所需的技术对于本领域技术人员来说是众所周知的。
转基因芸苔属植物的应用
如本文所述那样产生的转基因植物可用于各种商业和研究目的。可创造转基因植物用于传统农业，以具有有利于种植者的性状(例如农艺学性状如抗害虫性或提高产量)、有利于植物收获产物的消费者的性状(例如人食物或动物饲料中的营养物含量提高)、或有利于食品加工者的性状(例如改善的加工性状)。芸苔属植物的化学组成部分如油和淀粉可被抽提出用于食品或工业用途，而且可创造转基因植物以增加或改善这些组分的水平。植物还可用于为了各种目的的种子生产。
转基因植物还可用于商业生产其中所含核酸分子编码的多肽或其它分子，其中将感兴趣的表达的分子从植物部分、种子等中抽提或纯化出来。另外，来自转基因植物的细胞或组织可体外培养、生长，或发酵生产所需的分子或用于其它目的(如研究)。
转基因植物还可用于商业育种程序，或可杂交或培育成相关作物种类的植物。核酸分子编码的改进可以通过例如原生质体融合从一个芸苔属植物种类转移到另一个芸苔属植物种类中。
转基因植物在研究或育种中有许多用途，包括通过插入诱变产生新的突变型植物，以便确定以后可通过传统突变和选择创造的有益的突变株。本发明的方法还可用来产生具有独特的“特征序列”或其它标记序列的植物，这些序列可用来鉴定独有的系和品种。
在以下实施例中发明将进一步被描述。这些实例不局限于本发明中权利要求的范围。
实施例
用特定的组织制备程序通过粒子轰击产生转化的芸苔属植物。
实施例1-采用剪切组织制备方法的芸苔属植物转化
使蔓菁Westar品种的不育化种子在含有琼脂和30毫摩尔氯化钙的MS培养基上于暗处发芽5-6天。此阶段具有芽尖的幼苗的高度为3-6厘米。用不育性幼苗作为组织来源的优点是维持供体材料所需的设备、时间和精力最少。收获这些幼苗的下胚轴，并切成长度为2-3厘米的片。将每片下胚轴片纵向切成两半，然后置于诱导培养基中，使表皮侧与培养基接触，那就是使新切开的表面大致朝上。诱导培养基是含有0．5-1．0毫克／升2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和0．2-0．3毫克／升激动素的MS培养基。使纵向切片紧密排列，每个平皿约20片。在诱导培养基上培养1-2天后，用核酸包覆的金颗粒轰击纵向切片。
用来包覆轰击粒子并转化非胚胎芸苔属植物细胞的核酸分子是pIMC38(图1)。该构建物含有两个基因新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因和β-葡糖醛酸酶(GUS)基因。两个基因均由CaMV 35S启动子推动，终止于胭脂氨酸合成酶(NOS)基因终止子。35S-NPTII-NOS和35S-GUS-NOS单元以相反方向排列。NPTII基因作为一个选择标记，如果它合适地表达，它将赋予培养物中转移细胞以卡那霉素抗性，并使转化的种子发芽期间有遗传霉素抗性。
用来轰击非胚胎芸苔属植物细胞或组织制备物的装置是Biolistic_PDS-1000／He系统(Dupont)。粒子轰击的步骤按照BioRadUS／EG Bulletin 1688和1689中的方法进行。具体采用的金属粒子是0．6μ或1．0μ的金粒子。
轰击后，使纵向切片在诱导培养基中培养3天。然后将培养物转移到选择培养基中。选择培养基与诱导培养基相同，只是加入选择试剂卡那霉素至最终浓度为25毫克／升。2-3周后，将培养物转移到再生培养基中，该培养基含有2毫克／升玉米素、0．1毫克／升IAA以及25毫克／升卡那霉素。此后每隔大约两周，将这些细胞传代培养到再生培养基上，直至出现绿芽。
选出一株再生植物(命名为“Peter”)，分析NPTII核酸的存在。具体地说，收集″Peter″的叶组织，从那些细胞中抽提出DNA，用NPTII特异性引物进行PCR分析。该分析揭示来自＂Peter＂的细胞含有NPTII核酸(表Ⅰ)。
使再生植物在温室中生长至性成熟。在“Peter”和无转基因的商用蔓菁Quantum品种之间进行人工授粉。另使“Peter”自花传粉。
收获“Peter”的R1种子，收获Quantum与“Peter”杂交的F1种子，测试遗传霉素抗性。将不育化的种子置于含有1．2克／升Bacto-agar和50毫克／升或100毫克／升遗传霉素(Gibco-LifeSciences，II811-023)的测试培养基中。将种子推入培养基中约0．1-0．4厘米深，随后每周测定发芽状态，三周后记录最后的评分。用下列描述来对种子的发芽状态评分。通常，当在50毫克／升遗传霉素测试培养基中生长时，非转基因的种子生长直至高度为1．5厘米，具有的子叶呈绿色，有黄色至棕色的边缘，但是根的长度不会超过0．5厘米。另外，非转基因的种子在50毫克／升遗传霉素测试培养基中放两周后不会长成活的幼苗。因此，将在50毫克／升遗传霉素测试培养基中的这样的种子确定为NPTII阳性该种子发芽长出幼苗，幼苗绿色子叶的高度超过2厘米，根的长度超过1厘米。另外，将在50毫克／升遗传霉素培养基中象无遗传霉素培养基中生长的非转基因种子一样迅速正常发芽的种子标记为“++”。
表Ⅰ．再生植物“Peter”、自交后代(R1和R2)以及杂交后代(F1和F2)的分析
++=正常活力、正常的小植物形态；+=中等活力、正常的小植物形态；N／A=不适用；F1=Quantum×Peter；Quantum是非转基因的商用蔓菁品种。
来自再生植物＂Peter＂(R0)的一些R1种子在含有遗传霉素培养基上生长时正常发芽，这表明芸苔属植物发生转化(表Ⅰ)。将在遗传霉素选择中存活的一些R1幼苗转移到土壤中，自花传粉，然后收获R2种子。这些R2种子有大多数发芽，并在含有遗传霉素的培养基中正常地强壮地生长。F1(Quantum×Peter)种子在含有遗传霉素的培养基中正常发芽，但是不象有遗传霉素抗性的R1或R2那样强壮生长。因此，NPTII核酸拷贝数以及整合的NPTII核酸的纯合特征看来影响NPTII表达水平。将在遗传霉素选择中存活的一些F1幼苗转移到土壤中自花传粉，收获并测试Quantum×Peter的F2种子。这些F2种子中约有一半能在含有遗传霉素的培养基中正常地、强壮地发芽。对R2植物的NPTII特异性PCR分析揭示了一个阳性信号，从而确认NPTII核酸被整合到“Peter”中。然而，“Peter”的所有代中的GUS染色均为阴性。
实施例2-采用研磨组织制备方法的芸苔属植物转化
收获芸苔属植物Westar品种的4-6天龄不育幼苗，弃去下胚轴下部、种皮和根。幼苗的剩余上部含有10-50％的下胚轴、两个子叶以及一个芽尖。用捣碎机将该上部和液体诱导培养基一起研磨成细胞浆。具体地说，使大约200株幼苗的上部与30毫升诱导培养基混合。使该混合物在捣碎机(33BL79型捣碎机，Warning Products Division，Dynamics Corporation of America)中室温下浸软。使所得浆料通过一系列筛网，分成组织大小范围不同的组。收集组织大小为46-230微米的组，在置于固体诱导培养基上的12个滤膜(直径为4厘米)上高密度培养。培养3天后，如实施例1所述的那样，用核酸分子包覆的金粒子轰击含有研磨组织的滤膜，在诱导培养基上再培育3天。然后将培养物转移到选择培养基中培养2-3周，然后在再生培养基上培养直至再生出芽苗。
如实施例1所述的那样分析再生植物中NPTII核酸的存在。另外，分析这些植物部分的GUS表达。简言之，表达GUS的细胞在GUS染色试验后呈蓝色。采用的GUS染色试验由Anne-Marie Stopm在Sean R．Gallagher编辑的《GUS方法用GUS基因作为基因表达的报道物》，103-113页，Academic Press，San Diego，California，1992中有详细描述。一些再生的芽苗和叶在GUS染色后显示出强烈的蓝色，这表明转移的外源GUS核酸序列有表达。
将再生的植物转移到土壤中并长至成熟。用实施例1所述的种子发芽试验测试10个R1种子的遗传霉素抗性。6个种子不能发芽。其余4个种子中的两个有遗传霉素抗性，获得的小植物在这些条件下显示出中等活力(表Ⅱ)。另外，如上所述，使17个R1种子在遗传霉素不存在的情况下发芽，对每个幼苗的叶片进行GUS染色。其中11个表现出强烈的蓝色(表Ⅱ)。R2植物的GUS染色和NPTII特异性PCR分析揭示了阳性信号。这些结果综合起来表明，NPTII基因和GUS基因均整合到基因组中，并成功地传递给后代。
表Ⅱ．对用研磨方法产生的再生植物的分析
+=中等的活力、正常的小植物形态；N／A=不适用
实施例3-黄芥子的转化
黄芥子DZJ-01系是一专有的系，它具有的组织培养和再生特征与黄芥子其它系的那些特征相当。用实施例2所述的研磨组织制备方法成功地转化了DZJ-01系。由于DZJ-01组织在培养物中的生长比蔓菁组织迅速，因此改变一些培养条件。具体地说，如实施例2所述那样制备DZJ-01组织并进行轰击。轰击后，使组织在固体诱导培养基上生长6天。然后将培养物转移到浮筏(floating raft)系统中，在液体选择培养基中培养8天，此时将培养基换成液体再生培养基。这两种液体培养基与实施例2中的对应培养基有相同的组成，只是省略了琼脂。该浮筏系统包括LifeRaft膜筏(LifeTechnologies，目录号10518-017)、LifeRaft浮动单元(Life Technologies，目录号No．10521-011)、具有LifeGuard膜排气盖的Magenta容器(Life Technologies，目录号10678-019)，并如生产商所述的那样使用。
每周更新再生培养基，直至发育长出绿色芽尖。在形成芽后，将它们转移到固体再生培养基中，然后转移到固体无激素MS培养基中。
一株再生的植物(命名为“J．J．”)在上述GUS染色试验中显示出强烈的蓝色。另外，用GUS特异性引物的PCR分析揭示了强的阳性信号，表明存在GUS特异性序列(表Ⅲ)。这些结果综合起来提示导入的DNA被整合到R0植物的基因组中。在性成熟时，使“J．J．”自花传粉，收获R1种子。为了验证整合，使R1种子发芽，测试得到的小植物的GUS表达。一些R1幼苗在GUS染色后表现出强烈的蓝色，这表明GUS基因整合到黄芥子基因组中。另外，R2植物的GUS染色和NPTII特异性PCR分析揭示了阳性信号，这进一步确认GUS和NPTII基因整合到黄芥子基因组中。
表Ⅲ．再生的黄芥子植物的分析
其它实施例
应理解，尽管本发明已经结合详细说明对本发明作了描述，但是前述内容的目的是为了描述，并不限制由所附权利要求范围确定的本发明范围。其它方面、优点和改进均在下列权利要求的范围内。
权利要求
1．一种产生转化的芸苔属植物细胞的方法，所述方法包括下列步骤
(a)用核酸包覆的微粒轰击从非胚胎芸苔属植物组织制得的细胞，形成经轰击的细胞制备物；和
(b)鉴定出已用所述核酸转化了所述经轰击制备物的细胞。
2．根据权利要求1所述的方法，其中从非胚胎芸苔属植物组织制得的所述细胞是二倍体。
3．根据权利要求1所述的方法，其中所述非胚胎芸苔属植物组织来自芸苔属植物的幼苗。
4．根据权利要求3所述的方法，其中所述幼苗是4至6天龄的不育的幼苗。
5．根据权利要求1所述的方法，其中通过将所述组织切成至少一片并使所述至少一片与诱导培养基接触的方法从非胚胎芸苔属植物组织制得所述受轰击细胞。
6．根据权利要求1所述的方法，其中通过以下方法从非胚胎芸苔属植物组织制得所述受轰击细胞，该方法是在大致横向上切开幼苗的下胚轴，形成至少一片下胚轴片，纵向切开所述至少一片下胚轴片，使所述纵向切片中的至少一片与诱导培养基接触。
7．根据权利要求1所述的方法，其中通过将所述组织浸软成细胞浆的方法从非胚胎芸苔属植物组织制得所述受轰击细胞。
8．根据权利要求1所述的方法，其中通过在诱导培养基中将幼苗上部浸软形成细胞浆的方法从非胚胎芸苔属植物组织制得所述受轰击的细胞，所述上部包括芽尖、子叶和10-50％的下胚轴。
9．根据权利要求7所述的方法，其中富集所述细胞浆中大小为46微米至230微米的细胞物质。
10．根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸编码多肽或调节多肽的表达。
11．根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸包括反义分子。
12．根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸包括核酶。
13．根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸包括反义寡核苷酸。
14．根据权利要求1所述的方法，其中所述芸苔属植物组织来自选自蔓菁、黄芥子、Brassica carinata、黑芥、甘蓝和油菜的芸苔属植物种类。
15．根据权利要求1所述的方法，其中所述鉴定包括将所述受轰击的细胞培养在浮选装置上与液体选择培养基接触，选出在所述选择培养基存在下存活的那些细胞。
16．根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括从所述经鉴定的细胞再生出芸苔属植物的步骤。
17．根据权利要求16所述的方法，其中所述再生步骤包括将所述经鉴定的细胞培养在浮选装置上与液体再生培养基接触。
18．用权利要求1所述的方法产生的芸苔属植物细胞及其后代。
19．一种培养芸苔属植物组织的方法，所述方法包括在液体选择培养基或液体再生培养基存在下在浮选装置上培养所述组织。
全文摘要
本发明涉及用粒子轰击方法转化芸苔属植物的方法和材料。具体地说,本发明提供了制备非胚胎芸苔属植物组织的方法,从而使芸苔属植物细胞能被培养,通过粒子轰击转化并再生成植物。另外,本发明提供了稳定转化的芸苔属植物细胞及其后代。本发明还提供了用液体培养基培育芸苔属植物组织的方法,从而使转化的芸苔属植物细胞被鉴定出并再生成转化的芸苔属植物。
文档编号C12N15/82GK1291860SQ9980340
公开日2001年4月18日 申请日期1999年2月25日 优先权日1998年2月26日
发明者陈之征, J·塞利奥 申请人:嘉吉有限公司