专利名称：不同性状海带配子体的鉴定方法及可采用的部分dna序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及经济海藻海带配子体的鉴定方法，即不同性状海带配子体的鉴定方法及可采用的部分或全部DNA序列。
背景技术：
海带是海岸植物中个体较大，质柔味美，营养价值和经济价值较高的一种重要经济海藻，应用历史悠久。海带营养价值极高，历来被人们视为海昧珍品，含碘量高达0.2-0.4％，另外还含有丰富的蛋白质、脂肪、氨基酸、维生素和无机盐等，许多国家把它誉为“保健食品”。海带是重要的工业原料，综合利用可提取褐藻胶、碘、甘露醇、马尾藻精和氯化钾等多种工业产品。紫菜还具有重要的药用价值。我国古代的《本草经疏》和《本草纲目》中记载海带主治“十二种水肿瘿瘤聚结气、痔疮”、“利小便”等。由于海带含有丰富的碘元素，可有效的防治甲状腺肿大(俗称大脖子或大头颈)等碘缺乏病。经常食用海带还有降低血压的功效。《中国海藻志》记载海带有狭叶海带(Laminaria angustata Kjellm.)、掌状海带(L.digitata Lamx.)、海带(L.japonica Aresch)、长海带(L.longissima Mijabe)、皱海带(L.religiosa)和糖海带(L.saccharina(L.)Lam.)等。
自从海带雌雄配子体分离方法建立以来，随着养殖和杂交育种技术的发展，许多具有优良性状的海带新品种在生产中得到了广泛应用。但是不同种海带或具有不同优良性状的同种海带的配子体从肉眼是很难区分开来的，目前主要是借助显微镜观察。随着分子生物学的迅猛发展，一些分子标记技术诸如随机引物扩增多态性(RAPD)、限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)和简单序列重复间区(ISSR)等已被广泛的应用于重要经济海藻的鉴定。由于这几种标记方法稳定性和重复性不高、耗时耗力，极大的限制了她们在实际中的应用。
核糖体DNA是编码核糖体RNA的基因，在植物细胞核中以头尾相连的方式在染色体上重复排列，每个细胞中的拷贝数目在1000到10000之间。核糖体DNA中包含了进化速率不等的编码区、非编码区和非转录区，ITS(Internal transcribed spacer)是核糖体DNA中介于18S和5.8S之间(ITS1)以及5.8S和26S之间(ITS2)的非编码转录间隔区，目前研究显示，18S、5.8S和26S等rDNA基因的碱基对序列非常保守，不同植物间的差别很小；而位于植物rDNA基因间的ITS1和ITS2的碱基对序列则差异较大。由于ITS存在于高重复的核糖体DNA中，进化速率快且片段长度不大(在红藻中ITS1在100-400bp之间，ITS2在400-1400bp之间)，加上协调进化(concerted evolution)使该片段在基因组不同重复单元间十分一致，因而十分适合于植物系统发育与进化和种质鉴定的研究。尤其是近些年来，建立在PCR基础上直接测序方法的建立和广泛应用，ITS序列分析已成为在序列水平上对科内属间及属下种间的植物进行命名、分类、亲缘关系确定和系统进化研究的重要手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种不同性状海带配子体的鉴定方法及可采用的部分或全部DNA序列，从分子水平上对不同性状海带配子体进行鉴别分析，使结果更准确、更可靠。
为实现上述目的，本发明首先建立了一套海带配子体高质量DNA的制备方法，接着对海带不同配子体rDNA ITS区序列进行了测序，获得了rDNA ITS(包括ITS1，5.8S和ITS2)的全序列。
本发明利用rDNA ITS区DNA序列鉴别不同性状海带配子体的方法包括如下步骤进行藻体材料收集、鉴定和保存工作；(1)总DNA提取取新鲜健康的藻体材料，用无菌水处理后，在液氮种研磨成粉末，提取总DNA；(2)PCR扩增以步骤(1)获得的DNA为模板，以寡核苷酸作为聚合酶链式反应(PCR)的引物，扩增ITS区段，所用的引物分别采自藻体5.8S和28S的保守区段，采用正向引物P15’AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG3’，反向引物P45’AATCCTGGTTAGTTTCTTTTCCTC3’，利用该引物对总DNA进行PCR扩增反应；(3)PCR产物纯化；(4)DNA序列测定纯化后的DNA进行序列测定(应用直接测序技术)，确立rDNA ITS区，包括ITS1、5.8S和ITS2区的全序列；(5)DNA序列数据分析待分析的rDNA ITS区的序列一经测定，用对位排列软件进行对位排列，并辅以人工校对，用系统进化分析软件分析各样品DNA序列与数据库中各个序列间的差异。
每一个样品从DNA提取到测序至少重复3次。
所述总DNA提取可以采用CTAB抽提和Glassmilk纯化的方法；或将新鲜的藻体加液氮研磨成粉末后，转移到提取缓冲液中，63-65℃水浴30-60min后用氯仿∶异戊醇抽提一次；上清液中加10％SDS和1/3体积的4M的KAC，冰浴10-20min后用氯仿∶异戊醇再抽提一次，取上清液加2/3体积异丙醇沉淀DNA；DNA溶解在TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH 7.5)中，加入Rnase除去RNA后用氯仿∶异戊醇抽提一次，加1/3体积异丙醇沉淀DNA，干燥后的DNA重新溶解在TE中；纯化部分DNA；提取缓冲液组成为10mmol L-1Tris.HCl，pH 8.0，20mmol L-1EDTA，1.4M NaCl，2％CTAB，1.5％SDS；PCR扩增的20μL反应液含10mmol/LTris-HCl，pH 8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，Taq polymerase1U，4种dNTP各2mmol/L，两个引物各4-6mmol/L，DNA模板20-60ng；PCR扩增的反应循环参数为96℃预变性3分钟；94℃1分钟，53-57℃10秒钟，72℃1分钟；2个循环；94℃10秒钟，53-57℃10秒钟，72℃1分钟，30-38个循环；72℃延伸5分钟；ITS区扩增后测序所采用的引物为，正向引物P15’AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG3’，反向引物P45’AATCCTGGTTAGTTTCTTTTCCTC3’。
申请人从中国科学院海洋研究所获得了3种具有不同性状的海带(Laminaria japonica，L.saccharina(L.)Lamouroux f.，L.angustata Kjellman)的17个配子体和一种巨藻(Macrocystis pyrifera(L.)Ag.)的2个配子体，共19个样品，所有样品都经过藻类专家鉴定；本发明提供了它们不同配子体世代ITS1、5.8S和ITS2扩增的特异DNA序列，即中国经济海藻海带配子体ITS区DNA序列，具有序列表SEQ ID NO1～19中任意一组碱基序列，其可以应用于不同海带配子体鉴定方法中。
分析结果显示，几种不同性状海带配子体的ITS序列长度在660bp左右，与Genebank中已经注册的海带配子体(ITS1，5.8S rDNA和ITS2)的序列相似度在90％以上，说明海带配子体ITS序列的保守性比较强。如果不考虑空位，中国经济海藻海带(Laminaria japonica)配子体整个ITS区长度为658bp，狭叶海带(Laminaria angustata kjellman)为660bp，糖海带(Laminaria saccharina Lamouroux f.)为664bp；如果考虑空位则都为673bp。而所测得海带配子体ITS区核苷酸变异率，如果考虑点突变和点缺失，在种内为0.61-0.91％；在种间，不考虑点缺失，为0.59-3.41％，如果考虑点缺失则为2.23-6.24％。
本发明具有如下优点1.本发明首先建立了一套海带配子体高质量DNA的制备方法。
2.本发明提供了利用经济海藻海带配子体的DNA序列及利用该序列对不同性状海带配子体进行鉴定的方法，也即利用经济海藻海带配子体的ITS1及5.8S rDNA和ITS2的全部DNA序列及利用该序列鉴定其不同性状配子体的方法。
3.本发明对中国经济海藻海带不同配子体的rDNA ITS区序列进行了测序，获得了rDNA ITS(包括ITS1，5.8S和ITS2)的全序列。
图1为运用同源性引物P1和P4对模板DNA进行扩增电泳结果示意图。
具体实施例方式
下面详细描述所述方法实施例1(1)总DNA提取新鲜的藻体加液氮研磨成粉末，转移到提取缓冲液[10mmol L-1Tris.HCl，pH 8.0，20mmol L-1ethylenediaminetetra-acetic acid(EDTA)，1.4MNaCl，2％cetyltrimethyl ammonium bromide(CTAB)，1.5％sodium dodecylsulfate(SDS)]中，65℃水浴1h后用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次。上清液中加10％SDS和1/3体积的4M的KAC，冰浴10min后用氯仿∶异戊醇(24∶1)再抽提一次，取上清液加2/3体积异丙醇沉淀DNA。DNA溶解在TE中，加入Rnase除去RNA后用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次，加1/3体积异丙醇沉淀DNA，干燥后的DNA重新溶解在TE中。部分DNA用北京生物发展科学与技术有限公司提供的试剂盒(商品号MK 001-3)进行纯化。琼脂糖凝胶电泳后染色显示提取的基因组DNA大小在23Kb以上。
(2)PCR扩增海带配子体ITS区扩增的特异引物为P1和P4，序列如下P1(正向)为5’AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG3’，位于18S上，P4(反向)为5’AATCCTGGTTAGTTTCTTTTCCTC 3’，位于26S上。
PCR反应扩增反应在20μL的体系中完成，反应液含10mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，Taq polymerase 1U，4种dNTP各2mmol/L，两个引物各5mmol/L，DNA模板约50ng。反应循环参数为96℃预变性3分钟；94℃1分钟，55℃10秒钟，72℃1分钟，2个循环；94℃10秒钟，55℃10秒钟，72℃1分钟，35个循环；72℃延伸5分钟。以ddH2O代替模板DNA做空白对照。
(3)PCR产物纯化PCR产物用Watson试剂盒纯化，具体操作按试剂盒使用指南进行。
(4)DNA序列测定用BigDyeTM测序试剂盒进行测序反应，测序反应参数为Mix 1μL，纯化后的DNA约30-50ng，Primer 1.5pmol，buffer 1.2μL，ddH2O适量。测序反应条件为95℃1min，95℃30s，50℃30s，60℃4min，总共35各循环。用ABI PRISM 377-96全自动测序仪上进行序列测定。
(5)DNA序列数据分析ITS1和ITS2的起止范围参照Genbank中已经注册的部分海带配子体ITS1、5.8S rDNA和ITS2序列，所得序列输入计算机后用Clustal W软件进行比对排列，并辅以人工校对。用MEGA 2.1和PHYLIP 3.6分析软件包分别分析各样品DNA序列之间的差异，并构建亲缘关系。
实施例2在本实施例中以P15’AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG3’和P45’AATCCTGGTTAGTTTCTTTTCCTC 3’为引物及反应组分为体系，采用两套PCR扩增程序进行扩增。
程序a95℃5分钟；90℃1分钟，50℃2分钟，5个循环；72℃1分钟；90℃1分钟，60℃1分钟，72℃1分钟，30个循环；72℃10分钟。
程序b96℃3分钟；94℃1分钟，55℃10秒钟，72℃1分钟，2个循环；94℃10秒钟，55℃10秒钟，72℃1分钟，35个循环；72℃5分钟。电泳结果显示程序a和程序b都能扩增出一条大小为700bp左右的条带。但是程序a扩增的带型不稳定，量也较大，用其测序显示出讯号较弱，部分样品需要重测。而程序b扩增的产物用于测序能直接得出好的结果。说明设计的引物P1和P4的同源性较好，可靠性较高，对反应程序有依赖性。
实施例3利用同源性较好的引物P1和P4扩增海带“901”配子体不同世代(1)待检测植物总DNA提取将待检样品用无菌水冲洗干净，在液氮中研成粉末。根据本专利提供的CTAB抽提和Glassmilk纯化的方法提取基因组总DNA。
(2)模板DNA的质量检测运用引物P1和P4(P1、P4序列见实施例1)对待检样品总DNA进行扩增，检测是否能扩增出约700bp左右的片段和扩增片段的亮度，以验证模板DNA的质量、调整模板DNA的浓度。
PCR扩增反应在20μL的体系中完成，反应液含10mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，Taq polymerase 1U，4种dNTP各2mmol/L，两个引物各5mmol/L，DNA模板约50ng。反应循环参数为96℃预变性3分钟；94℃1分钟，53-57℃10秒钟，72℃1分钟；2个循环；94℃10秒钟，53-57℃10秒钟，72℃1分钟，30-38个循环；72℃延伸5分钟。以ddH2O代替模板DNA做空白对照。
(3)运用同源性引物P1和P4对模板DNA进行扩增。
电泳结果显示扩增产物非常理想(如下图1所示，图中M100bp Ladder3、4、5依次为海带“901”配子体6、7、8代ITS区扩增图谱)，所以同源性引物P1和P4或许能用于海带目其他海藻配子体的世代鉴定。
序列附表(中国经济海藻海带配子体rDNAITS区(包括ITS1、5.8S和ITS2)的全序列)1.叶片较长，源于中科院海洋所的海带(Laminaria.japonica Aresh)雄配子体的ITS区全序列CCGAAAGCGGGTTCGTTCAATCCCCCCCGCTCTATAAATTGTCTGTGAGGCCGCTTCGTGCGGCCTCTTTACCCCGAGAAAGAATTCGTTATGCGAAGTTGGGCGAGGGGCGCCTCGCCGAGAGCCTGTGAAAAGGCCCTCGAATCAAAGCGCACCCCACATTTCAACCCATTAAACTCTGAATCTGAACTCAAAGGGGCGCTGCGCTAGCCGCGGCTCCCCCAACCTTTAACGTTGTCTTTCAGCGACGGATGTCTTGGCTCCCACAACGATGAAGAACGC
AGCGAAATGCGATACGTCTTGCGACTTGCAGAATCCAGTGAATCATCAAAACTTTGAACGCATCTTGCGCTTCCGGGATACTCCTGGGAGCATGCTTGTCGGAGTGTCTGTTGACACCACTCGCCCCTCTTCTCTCCTGTCTCACGACGGGGGAGTCGCGGCGGCGGACTTTGAGTGTTCCGGAGTTCCCATGCTCCGAGTGCACCTAATCTCGTGAACGAAGCCTCTCGCGCCCTGCCGCACAGAGTTGTTGACGGCGCTCGCTTCGGCGGCGACTCTCGACTCACCAAACGTGCGCAGGATGCCTGCCTCATTCCGGCGCTCCGACGCCGACCCTTCTGGGTCAGCGTTGGAAACCGTACCACTTTCGTT2.叶片较长，源于中科院海洋所的海带(Laminaria japonica Aresh)雌配子体的ITS区全序列CCGAAAGCGGGTTCGTTCAATCCCCCCCGCTCTATAAATTGTCTGTGAGGCCGCTTCGTGCGGCCTCTTTACCCCGAGAAAGAATTCGTTATGCGAAGTTGGGCGAGGGGCGCCTCGCCGAGAGCCTGTGAAAAGGCCCTCGAATCAAAGCGCACCCCACATTTCAACCCATTAAACTCTGAATCTGAACTCAAAGGGGCGCTGCGCTAGCCGCGGCTCCCCCAACCTTTAACGTTGTAAAACTTTCAGCGACGGATGTCTTGGCTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTCTTGCGACTTGCAGAATCCAGTGAATCATCAAAACTTTGAACGCATCTTGCGCTTCCGGGATACTCCTGGGAGCATGCTTGTCGGAGTGTCTGTTGACACCACTCGCCCCTCTTCTCTCCTGTCTCACGACGGGGGAGTCGCGGCGGCGGACTTTGAGTGTTCCGGAGTTCCCATGCTCCGAGTGCACCTAATCTCGTGAACGAAGCCTCTCGCGCCCTGCCGCACAGAGTTGTTGACGGCGCTCGCTTCGGCGGCGACTCTCGACTCACCAAACGTGCGCAGGATGCCTGCCTCATTCCGGCGCTCCGACGCCGACCCTTCTGGGTCAGCGTTGGAAACCGTACCACTTTCGTT3.碘含量高，源于中科院海洋所的海带(Laminaria japonica Aresh)雄配子体的ITS区全序列CCGAAAGCGGGTTCGTTCAATCCCCCCCGCTCTATAAATTGTCTGTGAGGCCGCTTCGTGCGGCCTCTTTACCCCGAGAAAGAATTCGTTATGCGAAGTTGGGCGAGGGGCGCCTCGCCGAGAGCCTGTGAAAAGGCCCTCGAATCAAAGCGCACCCCACATTTCAACCCATTAAACTCTGAATCTGAACTCAAAGGGGCGCTGCGCTAGCCGCGGCTCCCCCAACCTTTAACGTTGTAAAACTTTCAGCGACGGATGTCTTGGCTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTCTTGCGACTTGCAGAATCCAGTGAATCATCAAAACTTTGAACGCATCTTGCGCTTCCGGGATACTCCTGGGAGCATGCTTGTCGGAGTGTCTGTTGACACCACTCGCCCCTCTTCTCTCCTGTCTCACGACGGGGGAGTCGCGGCGGCGGACTTTGAGTGTTCCGGAGTTCCCATGCTCCGAGTGCACCTAATCTCGTGAACGAAGCCTCTCGCGCCCTGCCGCACAGAGTTGTTGACGGCGCTCGCTTCGGCGGCGACTCTCGACTCACCAAACGTGCGCAGGATGCCTGCCTCATTCCGGCGCTCCGACGCCGACCCTTCTGGGTCAGCGTTGGAAACCGTACCACTTTCGTT4.碘含量高，源于中科院海洋所的海带(Laminaria japonica Aresh)雌配子体的ITS区全序列
CCGAAAGCGGGTTCGTTCAATCCCCTCCGCTCTATAAATTGTCTGTGAGGCCGCTTCGTGCGGCCTCTTTACCCCGAGAAAGAATTCGTTATGCGAAGTTGGGCGAGGGGCGCCTCGCCGAGAGCCTGTGAAAAGGCCCTCGAATCAAAGCGCACCCCACATTTCAACCCATTAAACTCTGAATCTGAACTCAAAGGGGCGCTGCGCTAGCCGCGGCTCCCCCAACCTTTAACGTTGTAAAACTTTCAGCGACGGATGTCTTGGCTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTCTTGCGACTTGCAGAATCCAGTGAATCATCAAAACTTTGAACGCATCTTGCGCTTCCGGGATACTCCTGGGAGCATGCTTGTCGGAGTGTCTGTTGACACCACTCGCCCCTCTTCTCTCCTGTCTCACGACGGGGGAGTCGCGGCGGCGGACTTTGAGTGTTCCGGAGTTCCCATGCTCCGAGTGCACCTAATCTCGTGAACGAAGCCTCTCGCGCCCTGCCGCACAGAGTTGTTGACGGCGCTCGCTTCGGCGGCGACTCTCGACTCACCAAACGTGCGCAGGATGCCTGCCTCATTCCGGCGCTCCGACGCCGACCCTTCTGGGTCAGCGTTGGAAACCGTACCACTTTCGTT5.叶片较宽，源于中科院海洋所的海带(Laminaria japonica Aresh)雄配子体的ITS区全序列CCGAAAGCGGGTTCGTTCAATCCCCCCCGCTCTATAAATTGTCTGTGAGGCCGCTTCGTGCGGCCTCTTTACCCCGAGAAAGAATTCGTTATGCGAAGTTGGGCGAGGGGCGCCTCGCCGAGAGCCTGTGAAAAGGCCCTCGAATCAAAGCGCACCCCACATTTCAACCCATTAAACTCTGAATCTGAACTCAAAGGGGCGCTGCGCTAGCCGCGGCTCCCCCAACCTTTAACGTTGTAAAACTTTCAGCGACGGATGTCTTGGCTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTCTTGCGACTTGCAGAATCCAGTGAATCATCAAAACTTTGAACGCATCTTGCGCTTCCGGGATACTCCTGGGAGCATGCTTGTCGGAGTGTCTGTTGACACCACTCGCCCCTCTTCTCTCCTGTCTCACGACGGGGGAGTCGCGGCGGCGGACTTTGAGTGTTCCGGAGTTCCCATGCTCCGAGTGCACCTAATCTCGTGAACGAAGCCTCTCGCGCCCTGCCGCACAGAGTTGTTGACGGCGCTCGCTTCGGCGGCGACTCTCGACTCACCAAACGTGCGCAGGATGCCTGCCTCATTCCGGCGCTCCGACGCCGACCCTTCTGGGTCAGCGTCGGAAACCGTACCACTTTCGAT6.叶片较宽，源于中科院海洋所的海带(Laminaria japonica Aresh)雌配子体的ITS区全序列CCGAAAGCGGGTTCGTTCAATCCCCCCCGCTCTATAAATTGTCTGTGAGGCCGCTTCGTGCGGCCTCTTTACCCCGAGAAAGAATTCGTTATGCGAAGTTGGGCGAGGGGCGCCTCGCCGAGAGCCTGTGAAAAGGCCCTCGAATCAAAGCGCACCCCACATTTCAACCCATTAAACTCTGAATCTGAACTCAAAGGGGCGCTGCGCTAGCCGCGGCTCCCCCAACCTTTAACGTTGTAAAACTTTCAGCGACGGATGTCTTGGCTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTCTTGCGACTTGCAGAATCCAGTGAATCATCAAAACTTTGAACGCATCTTGCGCTTCCGGGATACTCCTGGGAGCATGCTTGTCGGAGTGTCTGTTGACACCACTCGCCCCTCTTCTCTCCTGTCTCACGACGGGGGAGTCGCGGCGGCGGACTTTGAGTGTTCCGGAGTTCCCATGCTCCGAGTGCACCTAATCTCGTGAACGAAGCCTCTCGCG
CCCTGCCGCACAGAGTTGTTGACGGCGCTCGCTTCGGCGGCGACTCTCGACTCACCAAACGTGCGCAGGATGCCTGCCTCATTCCGGCGCTCCGACGCCGACCCTTCTGGGTCAGCGTCGGAAACCGTACCACTTTCGTT7.叶片薄、宽、长，源于中科院海洋所的海带(Laminaria japonicaAresh)雄配子体的ITS区全序列CCGAAAGCGGGTTCGTTCAATCCCCCCCGCTCTATAAATTGTCTGTGAGGCCGCTTCGTGCGGCCTCTTTACCCCGAGAAAGAATTCGTTATGCGAAGTTGGGCGAGGGGCGCCTCGCCGAGAGCCTGTGAAAAGGCCCTCGAATCAAAGCGCACCCCACATTTCAACCCATTAAACTCTGAATCTGAACTCAAAGGGGCGCTGCGCTAGCCGCGGCTCCCCCAACCTTTAACGTTGTCTTTCAGCGACGGATGTCTTGGCTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTCTTGCGACTTGCAGAATCCAGTGAATCATCAAAACTTTGAACGCATCTTGCGCTTCCGGGATACTCCTGGGAGCATGCTTGTCGGAGTGTCTGTTGACACCACTCGCCCCTCTTCTCTCCTGTCTCACGACGGGGGAGTCGCGGCGGCGGACTTTGAGTGTTCCGGAGTTCCCATGCTCCGAGTGCACCTAATCTCGTGAACGAAGCCTCTCGCGCCCTGCCGCACAGAGTTGTTGACGGCGCTCGCTTCGGCGGCGACTCTCGACTCACCAAACGTGCGCAGGATGCCTGCCTCATTCCGGCGCTCCGACGCCGACCCTTCTGGGTCAGCGTCGGAAACCGTACCACTTTCGTT8.叶片薄、宽、长，源于中科院海洋所的海带(Laminaria japonicaAresh)雌配子体的ITS区全序列CCGAAAGCGGGTTCGTTCAATCCCCCCCGCTCTATAAATTGTCTGTGAGGCCGCTTCGTGCGGCCTCTTTACCCCGAGAAAGAATTCGTTATGCGAAGTTGGGCGAGGGGCGCCTCGCCGAGAGCCTGTGAAAAGGCCCTCGAATCAAAGCGCACCCCACATTTCAACCCATTAAACTCTGAATCTGAACTCAAAGGGGCGCTGCGCTAGCCGCGGCTCCCCCAACCTTTAACGTTGTCTTTCAGCGACGGATGTCTTGGCTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTCTTGCGACTTGCAGAATCCAGTGAATCATCAAAACTTTGAACGCATCTTGCGCTTCCGGGATACTCCTGGGAGCATGCTTGTCGGAGTGTCTGTTGACACCACTCGCCCCTCTTCTCTCCTGTCTCACGACGGGGGAGTCGCGGCGGCGGACTTTGAGTGTTCCGGAGTTCCCATGCTCCGAGTGCACCTAATCTCGTGAACGAAGCCTCTCGCGCCCTGCCGCACAGAGTTGTTGACGGCGCTCGCTTCGGCGGCGACTCTCGACTCACCAAACGTGCGCAGGATGCCTGCCTCATTCCGGCGCTCCGACGCCGACCCTTCTGGGTCAGCGTCGGAAACCGTACCACTTTCGTT9.叶片厚、宽、脆，源于中科院海洋所的海带(Laminaria japonicaAresh)雄配子体的ITS区全序列CCGAAAGCGGGTTCGTTCAATCCCCCCCGCTCTATAAATTGTCTGTGAGGCCGCTTCGTGCGGCCTCTTTACCCCGAGAAAGAATTCGTTATGCGAAGTTGGGCGAGGGGCGCCTCGCCGAGAGCCTGTGAAAAGGCCCTCGAATCAAAGCGCACCCCACATTTCAACCCATTAAACTCTGAATCTGAACTCAAAGGGGCGCTGCGCTAGCCGCGGCTCCCCCAACCTTTAACGTTGTCTTTCAGCGACGGATGTCTTGGCTCCCACAACGATGAAGAACGC
AGCGAAATGCGATACGTCTTGCGACTTGCAGAATCCAGTGAATCATCAAAACTTTGAACGCATCTTGCGCTTCCGGGATACTCCTGGGAGCATGCTTGTCGGAGTGTCTGTTGACACCACTCGCCCCTCTTCTCTCCTGTCTCACGACGGGGGAGTCGCGGCGGCGGACTTTGAGTGTTCCGGAGTTCCCATGCTCCGAGTGCACCTAATCTCGTGAACGAAGCCTCTCGCGCCCTGCCGCACAGAGTTGTTGACGGCGCTCGCTTCGGCGGCGACTCTCGACTCACCAAACGTGCGCAGGATGCCTGCCTCATTCCGGCGCTCCGACGCCGACCCTTCTGGGTCAGCGTTGGAAACCGTACCACTTTCGTT10.叶片厚、宽、脆，源于中科院海洋所的海带(Laminaria japonicaAresh)雌配子体的ITS区全序列CCGAAAGCGGGTTCGTTCAATCCCCCCCGCTCTATAAATTGTCTGTGAGGCCGCTTCGTGCGGCCTCTTTACCCCGAGAAAGAATTCGTTATGCGAAGTTGGGCGAGGGGCGCCTCGCCGAGAGCCTGTGAAAAGGCCCTCGAATCAAAGCGCACCCCACATTTCAACCCATTAAACTCTGAATCTGAACTCAAAGGGGCGCTGCGCTAGCCGCGGCTCCCCCAACCTTTAACGTTGTCTTTCAGCGACGGATGTCTTGGCTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTCTTGCGACTTGCAGAATCCAGTGAATCATCAAAACTTTGAACGCATCTTGCGCTTCCGGGATACTCCTGGGAGCATGCTTGTCGGAGTGTCTGTTGACACCACTCGCCCCTCTTCTCTCCTGTCTCACGACGGGGGAGTCGCGGCGGCGGACTTTGAGTGTTCCGGAGTTCCCATGCTCCGAGTGCACCTAATCTCGTGAACGAAGCCTCTCGCGCCCTGCCGCACAGAGTTGTTGACGGCGCTCGCTTCGGCGGCGACTCTCGACTCACCAAACGTGCGCAGGATGCCTGCCTCATTCCGGCGCTCCGACGCCGACCCTTCTGGGTCAGCGTTGGAAACCGTACCACTTTCGTT11.源于中科院海洋所的巨藻(Macrocystis pyrifera)雄配子体的ITS2区全序列CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCGAGCGAGCGAGCGAACGAGGGGCCGGCGAGAGGGGGCGCGGACTCTGAGTGTTCCGGAGTCTCCCACGCTCCGAGTGCACCTAATCGCGTGAACGAAGCCTCTCGCGCCCTGCCGCACAGAGTTGTTGACGGCGCTCGCTTCGGCGGCGACTCTCGACTCACGAAAACGTGCGCAGGACATGCGGGCTGCTTCCTTCCGGCGCTCCAGCATATCTCTGCTGGAATCCGTACACCACTTTCGTT12.源于中科院海洋所的巨藻(Macrocystis pyrifera)雌配子体的ITS1和5.8S rDNA区全序列CCGAAAGCGGGTTCGTTCAATCCCCCCCGCTCTATAAATTGTCTGAGACTCTGCGCCCGACTCACGGAGGGCGCGTTTCTACACCCCGAGAAAGGATTCGTTATGCGAAGTTGGGCGAGGGGCGCCTCGCCGAGAGCTCAATCAAGCGCTCTCGAACCAAAGCGCACCCCACATTTCAACCCCATTAAACTCTGAATCTGAACTAAAAGGGGTGCCGCGCTCGCCGCGGCTCCCCCAACCTTTTAACGTTGTCTTTCAGCGACGGATGTCTTGGCTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTCTTGCGACTTGCAGAATCCAGTGAATCATCAAAACTTTGAACGCATCTTGCGCTTCCGGGATACTCCTGGGAGCATGCTTGTCGGAGTGTCTGTT
13.源于美国的糖海带(Lamimaria saccharina(L.)Lamouroux f.)雄配子体的ITS区全序列CCGAAAGCGGGTTCGTTCAATCCCCCCCGCTCTATAAATTGTCTGTGAAGCCGCCGGTTTCGGCGGCCTCTGTACCCCGAGAAAGAACTCGTTATGCGAAGTTGGGCGAGGGGCGCCTCGCCGAGAGTTTTTGTAAGAAGAGCTCTCGAATCAAAGCGCACCCCACATTTCAACCCATTAAACTCTGAATCTGAACTCAAAGGGGCGCTGCGCTAGCCGCGGCTCCCCCAACCTTTAACGTTGTCTTTCAGCGACGGATGTCTTGGCTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTCTTGCGACTTGCAGAATCCAGTGAATCATCAAAACTTTGAACGCATCTTGCGCTTCCGGGATACTCCTGGGAGCATGCTTGTCGGAGTGTCTGTTGACACCACTCGCCCCTCTTCTCTCCTGTCTCACGACGAGGGGGTCGCGGCGGCGGACTTTGAGTGTTCCGGAGTTCCCATGCTCCGAGTGCACCTAATCTCGTGAACGAAGCCTCTCGCGCCCTGCCGCACAGAGTTGTTGACGGCGCTCGCTTCGGCGGCGACTCTCGACTCACCAAACGTGCGCAGGATGCCTGCCTCATTCCGGCGCTCCGACGCCGGCCCGGTAAAAAAGGTCGGCGTTGGAAACCGTACCACTTTCGTT14.源于美国的糖海带(Lamimaria saccharina(L.)Lamouroux f.)雌配子体的ITS区全序列CCGAAAGCGGGTTCGTTCAATCCCCCCCGCTCTATAAATTGTCTGTGAAGCCGCCGGTTTCGGCGGCCTCTGTACCCCGAGAAAGAACTCGTTATGCGAAGTTGGGCGAGGGGCGCCTCGCCGAGAGTTTTTGTAAGAAGAGCTCTCGAATCAAAGCGCACCCCACATTTCAACCCATTAAACTCTGAATCTGAACTCAAAGGGGCGCTGCGCTAGCCGCGGCTCCCCCAACCTTTAACGTTGTCTTTCAGCGACGGATGTCTTGGCTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTCTTGCGACTTGCAGAATCCAGTGAATCATCAAAACTTTGAACGCATCTTGCGCTTCCGGGATACTCCTGGGAGCATGCTTGTCGGAGTGTCTGTTGACACCACTCGCCCCTCTTCTCTCCTGTCTCACGACGAGGGGGTCGCGGCGGCGGACTTTGAGTGTTCCGGAGTTCCCATGCTCCGAGTGCACCTAATCTCGTGAACGAAGCCTCTCGCGCCCTGCCGCACAGAGTTGTTGACGGCGCTCGCTTCGGCGGCGACTCTCGACTCACCAAACGTGCGCAGGATGCCTGCCTCATTCCGGCGCTCCGACGCCGGCCCGGTAAAAAAGGTCGGCGTTGGAAACCGTACCACTTTCGTT15.源于日本的海带(Laminaria japonica Aresh)，其杂交后代雄配子体的ITS区全序列CCGAAAGCGGGTTCGTTCAATCCCCCCCGCTCTATAAATTGTCTGTGAGGCCGCTTCGTGCGGCCTCTTTACCCCGAGAAAGAATTCGTTATGCGAAGTTGGGCGAGGGGCGCCTCGCCGAGAGCCTGTGAAAAGGCCCTCGAATCAAAGCGCACCCCACATTTCAACCCATTAAACTCTGAATCTGAACTCAAAGGGGCGCTGCGCTAGCCGCGGCTCCCCCAACCTTTAACGTTGTCTTTCAGCGACGGATGTCTTGGCTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTCTTGCGACTTGCAGAATCCAGTGAATC
ATCAAAACTTTGAACGCATCTTGCGCTTCCGGGATACTCCTGGGAGCATGCTTGTCGGAGTGTCTGTTGACACCACTCGCCCCTCTTCTCTCCTGTCTCACGACGGGGGAGTCGCGGCGGCGGACTTTGAGTGTTCCGGAGTTCCCATGCTCCGAGTGCACCTAATCTCGTGAACGAAGCCTCTCGCGCCCTGCCGCACAGAGTTGTTGACGGCGCTCGCTTCGGCGGCGACTCTCGACTCACCAAACGTGCGCAGGATGCCTGCCTCATTCCGGCGCTCCGACGCCGACCCTTCTGGGTCAGCGTCGGAAACCGTACCACTTTCGTT16.源于中科院海洋所的狭叶海带(Laminaria angustata Kjellman)雄配子体的ITS区全序列CCGAAAGCGGGTTCGTTCAATCCCCCCCGCTCTATAAATTGTCTGTGAGGCCGCTTTGTGCGGCCTCTTTACCCCGAGAAAGAATTCGTTATGCGAAGTTGGGCGAGGGGCGCCTCGCCGAGAGTCTGTAAAATGGCTCTCGAATCAAAGCGCACCCCACATTTCAACCCATTAAACTCTGAATCTGAACTCAAAGGGGCGCTGCGCTAGTCGCGGCTCCCCCAACCTTTAACGTTGTAAAACTTTCAGCGACGGATGTCTTGGCTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTCTTGCGACTTGCAGAATCCAGTGAATCATCAAAACTTTGAACGCATCTTGCGCTTCCGGGATACTCCTGGGAGCATGCTTGTCGGAGTGTCTGTTGACACCACTCGCCCCTCTTCTCTCCTGTCTCACGACGAGGGAGTCGCGGCGGCGGACTTTGAGTGTTCCGGAGTTCCCATGCTCCGAGTGCACCTAATCTCGTGAACGAAGCCTCTCGCGCCCTGCCGCACAGAGTTGTTGACGGCGCTCGCTTCGGCGGCGACTCTCGACTCACCAAACGTGCGCAGGATGCCTGCCTCATTCCGGCGCTCCGACGCCGACCCTTTTGGGTCAGCGTTGGAAACCGTACCACTTTCGTT17.源于中科院海洋所的狭叶海带(Laminaria angustata Kjellman)雌配子体的ITS区全序列CCGAAAGCGGGTTCGTTCAATCCCCCCCGCTCTATAAATTGTCTGTGAGGCCGCTTTGTGCGGCCTCTTTACCCCGAGAAAGAATTCGTTATGCGAAGTTGGGCGAGGGGCGCCTCGCCGAGAGTCTGTAAAATGGCTCTCGAATCAAAGCGCACCCCACATTTCAACCCATTAAACTCTGAATCTGAACTCAAAGGGGCGCTGCGCTAGTCGCGGCTCCCCCAACCTTTAACGTTGTCTTTCAGCGACGGATGTCTTGGCTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTCTTGCGACTTGCAGAATCCAGTGAATCATCAAAACTTTGAAACGCATCTTGCGCTTTCCGGGATACTCCTGGGAACATGCTTTGTCGGGAATGGCTTGTTGACACCACTCGCCCCTCTTCTCTCCTGTCTCACGACGAGGGAGTCGCGGCGGCGGACTTTGAGTGTTCCGGAGTTCCCATGCTCCGAGTGCACCTAATCTCGTGAACGAAGCCTCTCGCGCCCTGCCGCACAGAGTTGTTGACGGCGCTCGCTTCGGCGGCGACTCTCGACTCACCAAACGTGCGCAGGATGCCTGCCTCATTCCGGCGCTCCGACGCCGACCCTTTTGGGTCAGCGTTGGAAACCGTACCACTTTCGTT18.源于中科院海洋所的孤雌生殖海带(Laminaria japonica)雄配子体的ITS区全序列CCGAAAGCGGGTTCGTTCAATCCCCCCCGCTCTATAAATTGTCTGTGAGGCCGCTTCGTGCGGCCTCTTTACCCCGAGAAAGAATTCGTTATGCG
AAGTTGGGCGAGGGGCGCCTCGCCGAGAGCCTGTGAAAAGGCCCTCGAATCAAAGCGCACCCCACATTTCAACCCATTAAACTCTGAATCTGAACTCAAAGGGGCGCTGCGCTAGCCGCGGCTCCCCCAACCTTTAACGTTGTCTTTCAGCGACGGATGTCTTGGCTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTCTTGCGACTTGCAGAATCCAGTGAATCATCAAAACTTTGAACGCATCTTGCGCTTCCGGGATACTCCTGGGAGCATGCTTGTCGGAGTGTCTGTTGACACCACTCGCCCCTCTTCTCTCCTGTCTCACGACGGGGGAGTCGCGGCGGCGGACTTTGAGTGTTCCGGAGTTCCCATGCTCCGAGTGCACCTAATCTCGTGAACGAAGCCTCTCGCGCCCTGCCGCACAGAGTTGTTGACGGCGCTCGCTTCGGCGGCGACTCTCGACTCACCAAACGTGCGCAGGATGCCTGCCTCATTCCGGCGCTCCGACGCCGACCCTTCTGGGTCAGCGTTGGAAACCGTACCACTTTCGTT19.源于中科院海洋所的孤雌生殖海带(Laminaria japonica)雌配子体的ITS区全序列CCGAAAGCGGGTTCGTTCAATCCCCCCCGCTCTATAAATTGTCTGTGAGGCCGCTTCGTGCGGCCTCTTTACCCCGAGAAAGAATTCGTTATGCGAAGTTGGGCGAGGGGCGCCTCGCCGAGAGCCTGTGAAAAGGCCCTCGAATCAAAGCGCACCCCACATTTCAACCCATTAAACTCTGAATCTGAACTCAAAGGGGCGCTGCGCTAGCCGCGGCTCCCCCAACCTTTAACGTTGTCTTTCAGCGACGGATGTCTTGGCTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTCTTGCGACTTGCAGAATCCAGTGAATCATCAAAACTTTGAACGCATCTTGCGCTTCCGGGATACTCCTGGGAGCATGCTTGTCGGAGTGTCTGTTGACACCACTCGCCCCTCTTCTCTCCTGTCTCACGACGGGGGAGTCGCGGCGGCGGACTTTGAGTGTTCCGGAGTTCCCATGCTCCGAGTGCACCTAATCTCGTGAACGAAGCCTCTCGCGCCCTGCCGCACAGAGTTGTTGACGGCGCTCGCTTCGGCGGCGACTCTCGACTCACCAAACGTGCGCAGGATGCCTGCCTCATTCCGGCGCTCCGACGCCGACCCTTCTGGGTCAGCGTTGGAAACCGTACCACTTTCGTT
权利要求
1.一种不同性状海带配子体鉴定方法，其特征在于，步骤如下(1)总DNA提取取新鲜健康的藻体材料，用无菌水处理后，在液氮种研磨成粉末，提取总DNA；(2)PCR扩增采用正向引物P15’AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG3’，反向引物P45’AATCCTGGTTAGTTTCTTTTCCTC3’，利用该引物对总DNA进行PCR扩增反应；(3)PCR产物纯化；(4)DNA序列测定纯化后的DNA进行序列测定，确立rDNA ITS区，包括ITS1、5.8S和ITS2区的全序列；(5)DNA序列数据分析待分析的rDNA ITS区的序列一经测定，用对位排列软件进行对位排列，并辅以人工校对，用系统进化分析软件分析各样品DNA序列与数据库中各个序列间的差异。
2.根据权利要求1所述的不同性状海带配子体的鉴定方法，其特征在于所述总DNA提取是采用CTAB抽提和Glassmilk纯化的方法。
3.根据权利要求1所述的不同性状海带配子体的鉴定方法，其特征在于所述总DNA提取为新鲜的藻体加液氮研磨成粉末后，转移到提取缓冲液中，63-65℃水浴30-60min后用氯仿∶异戊醇抽提一次；上清液中加10％SDS和1/3体积的4M的KAC，冰浴10-20min后用氯仿∶异戊醇再抽提一次，取上清液加2/3体积异丙醇沉淀DNA；DNA溶解在TE缓冲液中，加入Rnase除去RNA后用氯仿∶异戊醇抽提一次，加1/3体积异丙醇沉淀DNA，干燥后的DNA重新溶解在TE中；纯化部分DNA。
4.根据权利要求3所述的不同性状海带配子体的鉴定方法，其特征在于所述的提取缓冲液组成为10mmol L-1Tris.HCl，pH8.0，20mmol L-1EDTA，1.4M NaCl，2％CTAB，1.5％SDS。
5.根据权利要求1所述的不同性状海带配子体的鉴定方法，其特征在于PCR扩增的20μL反应液含10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50mmol/LKCl，1.5mmol/L MgCl2，Taq polymerase 1U，4种dNTP各2mmol/L，两个引物各4-6mmol/L，DNA模板20-60ng。
6.根据权利要求1所述的不同性状海带配子体的鉴定方法，其特征在于PCR扩增的反应循环参数为96℃预变性3分钟；94℃ 1分钟，53-57℃ 10秒钟，72℃ 1分钟；2个循环；94℃ 10秒钟，53-57℃ 10秒钟，72℃ 1分钟，30-38个循环；72℃延伸5分钟。
7.根据权利要求1所述的不同性状海带配子体的鉴定方法，其特征在于所述ITS区扩增后测序所采用的引物为，正向引物P15’AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG3’，反向引物P45’AATCCTGGTTAGTTTCTTTTCCTC3’。
8.一种权利要求1所述的不同性状海带配子体的鉴定方法中可以采用的部分DNA序列，其特征在于其为中国经济海藻不同性状海带配子体ITS区DNA序列，具有序列表SEQ ID NO1～19中任意一组碱基序列。
9.根据权利要求8所述的不同性状海带配子体鉴定方法中可以采用的部分DNA序列，其特征在于如果不考虑空位，中国经济海藻海带整个ITS区长度为658bp，狭叶海带为660bp，糖海带为664bp；如果考虑空位则都为673bp。
10.根据权利要求8所述的不同性状海带配子体鉴定方法中可以采用的部分DNA序列，其特征在于所测得海带配子体ITS区核苷酸变异率，如果考虑点突变和点缺失，在种内为0.61-0.91％；在种间，不考虑点缺失，为0.59-3.41％，如果考虑点缺失则为2.23-6.24％。
全文摘要
本发明涉及对经济海藻海带的配子体进行鉴定的方法，即不同性状海带配子体的鉴定方法及可采用的部分或全部DNA序列；步骤为1)总DNA提取；2)以上步骤提取的DNA为模板，对总DNA进行PCR扩增反应；3)PCR产物纯化；4)纯化后的DNA进行序列测定，确立rDNAITS区，包括ITS1、5.8S和ITS2区的全序列；5)用对位排列软件进行对位排列，并辅以人工校对，用系统进化分析软件分析各样品DNA序列与数据库中各个序列间的差异。本发明首先建立了一套海带配子体高质量DNA的制备方法和利用DNA序列鉴定经济海藻海带配子体的方法；并对中国经济海藻海带配子体的rDNA ITS区序列进行了测序。
文档编号C12Q1/68GK1614032SQ20031010503
公开日2005年5月11日 申请日期2003年11月7日 优先权日2003年11月7日
发明者段德麟, 胡自民, 赫英俊 申请人:中国科学院海洋研究所