均匀；
[0035] ③用移液枪分别移取不同浓度的抑菌原液6yL至各个营养琼脂培养基平板表 面，在37°C下培养24h，之后观察各浓度平板的抑菌情况，其中未长菌落平板的最低浓度即 为最低抑菌浓度（MIC)，结果见表1所示。
[0036] 表1松木层孔菌超临界萃取物最低抑菌浓度
[0037]
[0038] 注：" + "表示有菌落，表示未见菌落。
[0039] 2. 5抑菌圈法测定抑菌活性
[0040] ①称取步骤（1)松木层孔囷超临界卒取物样品l〇〇mg，用二甲基亚讽（DMSO)洛解， 配制成10.Omg/mL的样品溶液；
[0041] ②取干净的小试管，编号，将样品溶液置于其中；
[0042] ③将高压灭菌后的培养基，培养皿，滤纸片等实验所需物品，放进超净工作台，打 开紫外灭菌30min;
[0043] ④倒营养琼脂培养基平板，移液枪分别移取三种供试菌菌悬液（IO7CFU/ mL) 20yL，打入营养琼脂培养基平板内，无菌条件下用三角涂布棒将菌液涂布均匀；以 2.Omg/mL的链霉素DMSO溶液为阳性对照。
[0044] ⑤取灭菌后的两片滤纸片，置于培养基表面，分别用移液枪移取6yL样品溶液于 其中一片滤纸片上，移取相同剂量二甲基亚砜于第二片滤纸片上做阴性对照；
[0045] ⑥在37°C恒温培养箱放置24h左右，用数显游标卡尺测量抑菌圈的直径，每组实 验重复3次，结果见表2。
[0046] 表2松木层孔菌超临界萃取物抑菌圈直径
[0049] 2. 6松木层孔菌超临界萃取物抑菌率的测定
[0050] 称取步骤⑴的松木层孔菌超临界萃取物样品lOOmg，用二甲基亚砜（DMSO)溶解， 配制成5mg/mL的样品溶液；
[0051] 采用三点接种法，在涂布有三种供试菌菌悬液的营养琼脂培养基平板上放置3片 灭菌后的滤纸片，用移液枪分别移取5.Omg/mL的样品溶液6yL，2mg/mL氨苄青霉素钠水溶 液6yL和2mg/mL二甲基亚巩水溶液6yL，分别滴加在三片滤纸片上，每个实验设置3次重 复，阳性对照为：2mg/mL氨苄青霉素钠水溶液；阴性对照：2mg/mL二甲基亚砜水溶液。将以 上平板均倒置于37°C恒温培养箱中培养24h后，测量三个抑菌圈的直径，并求平均值作为 抑菌实验的结果。同样条件下，测试10.Omg/mL样品溶液在涂布三种供试菌菌悬液的平板 上的抑菌率，具体抑菌率结果见表3。
[0052] 以上细菌培养和抑菌操作时的加样和加料操作均在在超净工作台中进行。
[0053] 抑制率=(供试品抑菌圈直径-阴性对照抑菌圈直径）/阳性对照抑菌圈直 径X100%
[0054] 表3松木层孔菌超临界萃取物抑菌率
[0055]
[0056] 实施例2 :
[0057] 松木层孔菌子实体一剪碎至0.3-0. 6cm3的小块一机械粉碎过40目筛一60°C干 燥一称取190g-CO2超临界萃取（超临界萃取仪：美国Thar超临界流体超细微造粒系统 SFP，美国Thar科技公司有限公司），萃取压力为40MPa，时间3h，温度50°C，OV流速为20g/ min-收集分离釜中棕色油状萃取物一称重为I. 85g，得率0. 97% -抑菌测定一松木层孔 菌抑制剂，抑菌效果如表4和表5。
[0058] 表4松木层孔菌超临界萃取物最低抑菌浓度
[0059]
[0060] 注：" + "表示有菌落，表示未见菌落。
[0061] 由表4可见，松木层孔菌的超临界提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑 菌浓度为2. 5mg/mL，对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度均为5.Omg/mL。
[0062] 表5松木层孔菌超临界萃取物抑菌率
[0063]
[0064] 从表5可以看出，松木层孔菌超临界萃取物对3种实验细菌均有较好的抑制效果， 其中对大肠杆菌的抑菌效果最好，10.Omg/mL时的抑菌率达86. 6%。
[0065] 上述实验结果表明，松木层孔菌超临界萃取物对常见的3种食品腐败菌均有一定 的抑制作用，可将本发明成果应用于食品防腐保鲜等领域。
[0066] 对比实施例1松木层孔菌水提取
[0067] 松木层孔菌子实体一剪碎至0.3-0.6cm3的小块一机械粉碎过30目筛一50°C干燥 -称取50g-加入20倍重量的水，加热沸腾提取一索氏抽滤得过滤液一55°C旋转蒸发浓缩 -冷冻干燥一松木层孔菌水提物，称重为2. 05g，得率4. 1%-抑菌测定。
[0068] 表6松木层孔菌水提物最低抑菌浓度
[0069]
[0070] 注：" + "表示有菌落，表示未见菌落。
[0071] 由表6可见，在实验浓度范围内，松木层孔菌水提物对枯草芽孢杆菌没有抑制效 果，对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为10mg/mL，对大肠杆菌的最低抑菌浓度为20mg/ mL，相比表1的超临界萃取物抑菌效果要差很多。
[0072] 对比例2桑黄（鲍氏针层孔菌）超临界萃取物
[0073] 桑黄子实体一剪碎至0. 3-0. 6cm3的小块一机械粉碎过30目筛一50°C干燥一称取 180g-CO2超临界萃取（超临界萃取仪：美国Thar超临界流体超细微造粒系统SFP，美国 Thar科技公司有限公司），萃取压力为30MPa，时间2h，温度40°C，OV流速为15g/min-收 集分离釜中黄色油状萃取物一称重为I. 88g，得率1. 04%-抑菌测定。
[0074] 表7桑黄超临界萃取物最低抑菌浓度
[0075]
[0076] 注：" + "表示有菌落，表示未见菌落。
[0077] 由表7可见，因萃取物浓度在20mg/mL已达最大溶解浓度左右，在实验浓度范围 内，桑黄超临界萃取物对三种菌都没有抑制效果。
[0078] 对比例3桦褐孔菌超临界萃取物
[0079] 桦褐孔菌子实体一剪碎至0. 3-0. 6cm3的小块一机械粉碎过30目筛一50°C干燥一 称取180g-CO2超临界萃取（超临界萃取仪：美国Thar超临界流体超细微造粒系统SFP，美 国Thar科技公司有限公司），萃取压力为30MPa，时间2h，温度40°C，OV流速为15g/min- 收集分离釜中黄色油状萃取物一称重为I.12g，得率0. 62%-抑菌测定。
[0080] 表7桦褐孔菌超临界萃取物最低抑菌浓度
[0081]
[0082] 注：" + "表示有菌落，表示未见菌落。
[0083]由表7可见，在实验浓度范围内，桦褐孔菌超临界萃取物对枯草芽孢杆菌和金黄 色葡萄球菌均没有抑制效果，而对大肠杆菌的最低抑菌浓度为20mg/mL，相比表1的松木层 孔菌超临界萃取物抑菌效果要差很多。
【主权项】
1. 一种松木层孔菌（Phellinus pini)超临界萃取物作为抑菌剂的应用，其特征在于 所述超临界萃取物是将松木层孔菌子实体进行超临界CO2萃取获得的萃取物，所述超临界 萃取条件为：以CO 2为超临流体，萃取压力为20~40MPa，时间1~3h，温度30°C -50°C，CO 2 流速为10~20g/min。2. 如权利要求1所述松木层孔菌超临界萃取物作为抑菌剂的应用，其特征在于所述松 木层孔菌子实体在萃取前先粉碎，过20~40目筛，40~60°C干燥，获得松木层孔菌子实体 粉末；然后将粉末加入CO 2超临界萃取仪的萃取釜进行CO 2超临界萃取。3. 如权利要求2所述松木层孔菌超临界萃取物作为抑菌剂的应用，其特征在于所述萃 取压力为30~40MPa，时间2~3h，温度30°C -50°C，OV流速为15~20g/min。4. 如权利要求1所述松木层孔菌超临界萃取物作为抑菌剂的应用，其特征在于抑菌剂 为大肠杆菌抑菌剂、金黄色葡萄球菌抑菌剂或枯草芽孢杆菌抑菌剂。5. 如权利要求4所述松木层孔菌超临界萃取物作为抑菌剂的应用，其特征在于超临界 萃取物对大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为2. 5mg/mL，对枯草芽孢杆菌的最低 抑菌浓度均为5. Omg/mL。
【专利摘要】本发明公开了一种松木层孔菌超临界萃取物作为抑菌剂的应用，所述超临界萃取物是将松木层孔菌子实体进行超临界CO2萃取获得的萃取物，所述超临界萃取条件为：以CO2为超临流体，萃取压力为20～40MPa，时间1～3h，温度30℃-50℃，CO2流速为10～20g/min；本发明松木层孔菌提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌等几种食品常见细菌均有较好的抑制效果，对大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为2.5mg/mL，对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度均为5.0mg/mL；由于超临界萃取物是非极性，可用于油脂类的抑菌剂，以期应用于食品的防腐和贮藏保鲜。
【IPC分类】A23L3/3463
【公开号】CN105077510
【申请号】CN201510412505
【发明人】杨开, 张佳妍, 叶帮伟
【申请人】庆元县金源真菌多糖制品有限责任公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年7月14日