火木层孔菌中1,2-桉烷型倍半萜在抗禽流感h5n1病毒上的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种从火木层孔菌Phellinus?igniarius(L?ex?Fr)Quel（裂蹄木层孔菌phellinus?linteus(Berk?et?Curt)Teng、鲍氏层孔菌Phellinus?baumii、哈蒂针层孔菌Phellinus?hartigii(Allesch?et?Schnabl)Imaz）发酵液和子实体中分离的具有抗禽流感活性的1,2-桉烷型倍半萜。本发明首次公开了1,2-桉烷型倍半萜的一种新活性，证明其具有抗禽流感作用。本方法较一般化合物应用的优点在于：发现了这种特殊的1,2-桉烷型倍半萜新活性，具有抗禽流感病毒的作用。
【专利说明】火木层孔菌中1,2-桉烷型倍半萜在抗禽流感H5N1病毒上的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抗禽流感H5N1病毒的火木层孔菌中活性物质的提取制备方法，尤其涉及的火木层孔菌菌种，已于2013年8月26日保藏在北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，分类名称:火木层孔菌Phellinus igniarius,保藏编号为CGMCC N0.8108。
【背景技术】
[0002]倍半職(sesquiterpenes)是指分子中含15个碳原子的天然職类化合物。倍半職类化合物分布较广，在木兰目(magnoliales)、芸香目(rutales)、山茱萸目(cornales)及菊目(asterales)植物中最丰富。在植物体内常以醇、酮、内酯等等形式存在于挥发油中，是挥发油中高沸点部分的主要组成部分。多具有较强的香气和生物活性，是医药、食品、化妆品工业的重要原料。
倍半萜类化合物较多，无论从数目上还是从结构骨架的类型上看，都是萜类化合物中最多的一支。倍半萜化合物多按其结构的碳环数分类，例如无环型、单环型、双环型、三环型和四环型。亦有按环的大小分类，如五、六、七元环，直到十一元大环都有。如按倍半萜结构的含氧基分类，则便于认识它们的理化性质和生理活性，例如倍半萜醇、醛、内酯等。
[0003]I, 2-桉烷型倍半萜具有抗菌等多种重要的生理活性，如今，未见到有抗情流感病毒活性的报到。
【发明内容】
[0004]本发明公开了一种从药用菌中分离的具有抗禽流感活性的1，2-桉烷型倍半萜。本发明首次公开了 1，2-桉烷型倍半`萜的一种新活性，测定了其对MDCK细胞的最大无毒浓度，证明其具有抗禽流感H5N1病毒的作用。
[0005]本发明的技术方案如下:
首先制备火木层孔菌粗提物，由下述方法制得:
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是:
玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5%
蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5%
硫酸镁 0.1-0.5%磷酸二氢钾0.01-0.05%
(2)将火木层孔菌菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20~35°C温度，摇瓶转速为80~280r/min，pH 3~8条件下，震动培养7~15天；培养中当pH值降到2.5~4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20~35°C，发酵罐压力0.1~0.2公斤/平方厘米，pH 3~8，通气量0.5~1.lvvm,搅拌速度100~280转/分的条件，培养7~15天，即可利用火木层孔菌菌丝体发酵全液制备火木层孔菌粗提物。
[0006](3)取步骤(2)中所得火木层孔菌菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2~1/5 ；
(4)用体积百分比为60~95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2~8倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60~90%，乙醇优选为浓度65-95%的食用乙醇，所用体积优选为浓缩液体积的3-6倍；
(5)对步骤(4)所得提取液在50~70°C条件下，加热I~2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5~1/10 ；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得火木层孔菌粗提物。
[0007]然后从火木层孔菌粗提物中制备1，2-桉烷型倍半萜，步骤如下:火木层孔菌粗提物一正相硅胶层析一氯仿与甲醇梯度洗脱一TLC检测一正相硅胶层析一氯仿甲醇凝胶层析一TLC检测一正相硅胶层析一TLC检测一减压蒸干一无色油状物(1，2-桉烷型倍半萜)。
[0008]具体方法为:
(1)制备火木层孔菌粗提物；
(2)将步骤(1)所得的沉淀物与正相硅胶混匀搅拌，干燥后进行硅胶正相柱层析，使用洗脱剂洗脱2-5次，得到洗脱液；
(3)将步骤(2)中最后一次洗脱液蒸干，等体积硅胶拌样，进行正相硅胶层析，使用洗脱剂洗脱；` (4)收集步骤(3)中的洗脱液，减压浓缩，使用氯仿:甲醇=1:1溶解，进行甲醇凝胶柱层析，使用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥；
(5)将步骤(4)中得到的产物进行再次进行正相硅胶层析，使用洗脱剂洗脱；
(6)收集步骤(5)得到的洗脱液，使用TLC检测各洗脱液，适度合并洗脱液，减压干燥，即为1,2-桉烧型倍半職。
[0009]优选的，提取步骤(2)中所述的硅胶为100-200目正相硅胶，层析硅胶为正相200-300目，洗脱剂为氯仿和/或甲醇；
提取步骤(3)中所述的硅胶用量为1-3倍体积，洗脱剂为石油醚与丙酮；
提取步骤(4)中所述的凝胶为S^hadex LH-20，洗脱剂为氯仿:甲醇=1:1~1:3 ;
提取步骤(5)所述的层析硅胶为200-300目，洗脱剂为氯仿:甲醇=100:1-50:1 ;
提取步骤(6)中TLC检测要点是出现斑点，展开剂为石油醚:丙酮=30:1-35:1。
[0010]然后使用得到的1，2-桉烷型倍半萜进行对MDCK细胞毒性的测定，确定其半数中毒浓度(CC5tl)及最大安全浓度；
最后在最大安全浓度范围内进行样品在MDCK细胞水平上对H5N1毒株的作用，计算样品的半数毒性浓度(CC5tl)和半数有效浓度(EC5tl),得到样品的选择指数(SI)=CC5tl / EC50,计算抑制率。
[0011]本发明的显著优势:本方法采用多种层析技术相结合，可以精致到结构明确，纯度大于95%的1，2-桉烷型倍半萜。技术路线成熟明确、高效精确，并首次证明了其具有抗禽流感H5N1病毒的活性。
[0012](四)【具体实施方式】 实例1:火木层孔菌粗提物，由下述方法制得:
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是:
玉米淀粉 1%葡萄糖 1%
蛋白胨 0.1%酵母膏 0.1%
硫酸镁 0.1%磷酸二氢钾0.01%
(2)将火木层孔菌菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以25°C温度，摇瓶转速为110r/min，pH 7条件下，震动培养7天；培养中当PH值降到3时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度25°C，发酵罐压力0.1公斤/平方厘米，pH 3，通气量0.5-1.lvvm，搅拌速度100转/分的条件，培养7天，即可利用火木层孔菌菌丝体发酵全液制备火木层孔菌粗提物。
[0013](3)取步骤(2)中所得火木层孔菌菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/3 ；
(4)用体积百分比为70%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到55% ；
(5)对步骤(4)所得提取液在70°C条件下，加热I小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 ；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得火木层孔菌粗提物。
[0014]将上述得物称取300g与等体积100目正相硅胶混匀搅拌，进行硅胶正相柱层析。层析固定相为200-300目正相硅胶，柱高lm，直径15cm，洗脱剂为分别为氯仿，氯仿:甲醇=100:1-200:1，分别洗脱2，3个柱体积。并将所得洗脱液分别命名为Fr-l，Fr-2。将Fr_2等体积硅胶拌样，使用硅胶为100目正相硅胶，五倍体积硅胶层析，使用的硅胶为200— 300目正相硅胶。洗脱剂为石油醚与丙酮。减压浓缩洗脱液，使用甲醇:氯仿=1:1溶解，氯仿甲醇凝胶柱层析。使用TLC检测收集的洗脱液适当合并，减压蒸干，再次使用正相硅胶层析，洗脱剂为氯仿:甲醇=100:1-50: 1，收集洗脱液，使用TLC检测各洗脱液，合并收集出现斑点的洗脱液，展开剂为石油醚:丙酮=30:1-35:1。减压干燥，进行1D-13CNMR核磁共振分析，频率为 ΙΟΙΜΗζ，δ 80.14，75.46，69.61，54.26，51.95，39.88，39.43，30.86，30.46，30.37，30.22，29.65，25.78，23.77，22.61，14.89，14.51.分析结果为证明是为1，2_桉烷型倍半萜。
[0015](7)采用步骤(6)得到的化合物进行对MDCK细胞毒性的测定，确定其半数中毒浓度(CC5tl)及最大安全浓度。
[0016]在96孔板上，10(^1/孔加入4父1051111-1浓度的MDCK细胞悬液，培养24 h后，
在单层细胞上分别加入不同浓度的含样维持液，每种浓度重复3孔，并设正常细胞对照。置370C，5%C02培养箱中培养48 h后，弃培养液上清，100 μ I/孔加入5 mg.Hir1MTT的维持液，继续培养Ih后，弃MTT上清，每孔加溶解液(DMSO) 100 μ 1，振荡5_10 min，待结晶完全溶解，酶标仪测492nm处的OD值。计算出样品的半数中毒浓度(CC5tl)及最大安全浓度。当加样组的OD492值不显著低于细胞对照组OD492时，此浓度即为样品的最大安全浓度。
[0017]表1 1，2-桉烷型倍半萜各浓度对细胞生长的影响
【权利要求】
1.1, 2-桉烷型倍半萜在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用。
2.如权利要求1所述的1，2-桉烷型倍半萜在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于1，2-桉烷型倍半萜是从火木层孔菌中提取的，提取步骤顺序如下: (1)制备火木层孔菌粗提物； (2)将步骤(1)所得的沉淀物与正相硅胶混匀搅拌，干燥后进行硅胶正相柱层析，使用洗脱剂洗脱2-5次，得到洗脱液； (3)将步骤(2)中最后一次洗脱液蒸干，等体积硅胶拌样，进行正相硅胶层析，使用洗脱剂洗脱； (4)收集步骤(3)中的洗脱液，减压浓缩，使用氯仿:甲醇=1:1溶解，进行甲醇凝胶柱层析，使用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥； (5)将步骤(4)中得到的产物进行再次进行正相硅胶层析，使用洗脱剂洗脱； (6)收集步骤(5)得到的洗脱液，使用TLC检测各洗脱液，适度合并洗脱液，减压干燥，即为1,2-桉烧型倍半職。
3.如权利要求2所述的1，2-桉烷型倍半萜在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于所述火木层孔菌粗提物，由下述方法制得: (1)将火木层孔菌菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20~35°C温度，摇瓶转速为80~280r/min，pH 3~8条件下，震动培养7~15天；培养中当pH值降到2.5~4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20~35°C，发酵罐压力0.1~0.2公斤/平方厘米，pH 3~8，通气量0.5~1.lvvm,搅拌速度100~280转/分的条件，培养7~15天，即可得到火木层孔菌菌丝体发酵全液； (2)取步骤(1)中所得火木层孔菌菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2~1/5 ； (3)用体积百分比为60~95%的乙醇对上述步骤(2)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2~8倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60~90% ； (4)对步骤(3)所得提取液在50~70°C条件下，加热I~2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5~1/10 ； (5)将将步骤(4)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得火木层孔菌粗提物。
4.如权利要求3所述的1，2-桉烷型倍半萜在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于所述液体培养基配方以克/100毫升计是: 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸镁 0.1-0.5%磷酸二氢钾0.01-0.05%。
5.如权利要求3所述的1，2-桉烷型倍半萜在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于火木层孔菌粗提物制备步骤(3)的乙醇为浓度65%-95%食用乙醇，所用体积为3-6倍体积。
6.如权利要求2所述的1，2-桉烷 型倍半萜在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于提取步骤(2)中所述的拌样硅胶为100-200目正相硅胶，层析硅胶为正相200-300目，洗脱剂为氯仿和/或甲醇。
7.如权利要求2所述的1，2-桉烷型倍半萜在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，步骤(3)中所述的硅胶用量为等体积，洗脱剂为石油醚与丙酮。
8.如权利要求2所述的1，2-桉烷型倍半萜在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，步骤(4)中所述的凝胶为Sephadex LH-20,洗脱剂为氯仿:甲醇=1:1~1:3。
9.如权利要求2所述的1，2-桉烷型倍半萜在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，步骤(5)所述的层析硅胶为200-300目，洗脱剂为氯仿:甲醇=100:1-50:1。
10.如权利要求2所述的1，2-桉烷型倍半萜在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，步骤(6)所述的 检测要点是出现斑点，展开剂为石油醚:丙酮=30:1-35:1。
【文档编号】A01G1/04GK103800321SQ201310401647
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】赵晨, 宋爱荣, 孔超, 孙效乐, 王光远 申请人:青岛农业大学