专利名称：不孕症的治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种体外受精(以下称IVF)的改良方法。
人卵母细胞的IVF已经常规地应用于女性和男性低生育力的治疗。标准的IVF治疗包括给女性患者长期的激素刺激，如30天，该治疗开始时用促性腺激素释放激素(以下称GnRH)来抑制患者自己的促卵泡激素(以下称FSH)和促黄体激素(以下称LH)，随后注射外源促性腺激素，如FSH和/或LH，以保证多个排卵前卵泡的发育和排卵之前多个体内成熟的卵母细胞的吸出。吸出的卵母细胞随后在体外受精并培养，一般培养3天后，在4-8细胞期转移回子宫。优化和简化该程序的努力一直不断。但是应用当前的治疗模式，总体怀孕率不能明显地提高约20％左右。在一次欧洲IVF患者的大调查中发现，从每个患者吸出的11.5个卵母细胞中有7.2个卵母细胞在受精前即刻经历了减数分裂的恢复，仅4.3个卵母细胞受精，受精后体外培养时只有2.2个卵母细胞达到8细胞胚期(ESHRE，Edinburgh，1997)。
由于当今人工胚胎质量极不可预测，必须转移多于一个胚以获得合理的成功机会。因此，转移2-3个胚(在某些国家高达5个胚)很常见，这样带来很大的多孕副作用，如极大不适和给患者及孩子带来风险。而且，据估算，因多生(如双胎和三胎等)增加的卫生保健费用超过整个IVF费用。
因此，目前的治疗存在几个缺点，4个最明显的是1.注射促性腺激素具有卵巢刺激过度的危险，这是一种潜在的需要住院治疗的致命状况，2.多孕(分别是双胎和三胎正常频率的50-1,000倍)，3.存在大量的患者群体由于例如多囊卵巢综合症和许多糖尿病而不能承受目前的方法，以及4.潜在的长期癌症风险。
另外，还有体重增加、肿胀、恶心、呕吐、情绪易变和其它不适，以及患者不愿给自己注射等缺点。
据WO 96/00235，某些甾醇类衍生物能用来调节减数分裂。其中之一的例子是4，4-二甲基-5α-胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇(此后称FF-MAS)。
本文中，术语MAS化合物指介导卵母细胞减数分裂的化合物。更具体地，MAS化合物是在下面实施例1试验中所述的这样一些化合物，具有一定比例的比对照组明显高的生发泡破裂(此后称GVB)。优选的MAS化合物应具有一定比例的GVB，至少是50％，优选地至少80％。
MAS化合物的实施例在WO 96/00235、96/27658、97/00884、98/28323、98/54965和98/55498中已提到，更具体地为其中专利权利要求1中所述的那些。
在WO 95/000265中，一些潜在的减数分裂调节剂在未成年雌性小鼠上已作试验。在受试动物断颈处死前48小时，它们单次注射包含FSH(20IU)和LH(20IU)的人绝经促性腺激素。移出卵巢，置于次黄嘌呤培养基且使之不含(freed)外源组织。然后，从卵泡中穿刺取出卵母细胞，从丘细胞游离，培养于包含减数分裂调节性衍生物的培养基中。
当前，尽管有巨大兴趣和临床努力，体外成熟在人类中已证明很不成功。
本发明的一个目标是治疗人类不孕症。
本发明的另一个目标是改善人卵母细胞的成熟。
本发明的另一个目标是改善核、胞浆和/或膜卵母细胞成熟的同步。
本发明的另一个目标是改善卵母细胞的受精。
本发明的另一个目标是通过人体外成熟及受精来提高卵母细胞的植入率。
本发明的另一个目标是减少人前成胚(preembryo)染色体异常(非整倍体)的发生率。
本发明的另一个目标是提高人前成胚的分裂速率。
本发明的另一个目标是提高人前成胚的质量。
简言之，本发明涉及一种人类体外受精的方法。其中，妇女在连续的30天期间内用下丘脑激素和/或垂体激素或其激动剂或拮抗剂或其活性衍生物进行治疗，其后取出卵母细胞并活化最终成熟，或接触MAS化合物以体外同步化卵母细胞成熟。本发明的优选实施方案见下文权利要求中所述。发明详述参照女性月经周期，实施本发明治疗的一个方法如下在一个周期的约第21天至下一个周期的约第15天通过用GnRH(如Synarel)(400-600μg/日刺激卵细胞)在第二个周期中第6-15天左右用FSH(例如，Gonal-F，Puregon或Humegon(150-400IU/日)治疗女性，刺激卵细胞。
在第二个周期中第15-16天用hCG(例如Pregnyl或Profasi(2000-5000IU/日))治疗女性刺激卵细胞。
第18天前后从女性中取出卵细胞。
第二个周期中的第18-19天前后为刺激减数分裂用MAS化合物使卵细胞成熟。在此额外的成熟步骤中，MAS化合物的浓度可在约0.1-100μmol/L的范围内，如10-20μmol/L。
此成熟步骤的时间可在约1-60小时范围。如果用黄体生成素或其拮抗剂或激动剂或其活性衍生物和/或人绒毛膜促性腺激素或其激动剂或拮抗剂或其活性衍生物诱导前排卵卵泡至黄体化，用MAS化合物使卵母细胞成熟的持续时间约1-15小时，优选约6小时。如果，未用黄体生成素或其拮抗剂或激动剂或其活性衍生物和/或人绒毛膜促性腺激素或其激动剂或拮抗剂或其活性衍生物诱导前排卵卵细胞，与MAS化合物的卵母细胞成熟持续约15-60小时。
在第二个周期中约第19-21天前后卵细胞在体外进行受精。
从吸出前一天起，妇女应接受雌激素，例如戊酸雌激素(每天2×10mg)。两天后，她还要每天接受孕激素，例如Progestane vagetoria，它将使子宫内膜更容易接受未来的胚胎。治疗的持续时间将根据每个患者进行个体化设计。医生能在各种雌激素和孕激素之中挑选。
在第二个周期中约第21天前后转移一个或多个胚至妇女子宫。
上述方法将MAS加入到现有的IVF方案中，通过介导最终或完全成熟或者卵母细胞同步分裂以改善功效。或者，MAS可用于拯救周期中的卵母细胞，否则其可由于表观FSH过度应答而取消。在这种情况下，负责医生基于超声(PCO样响应)和雌二醇曲线会考虑取消。由此避免hCG治疗。在替代hCG治疗约15-16天时吸取卵母细胞。
除了用MAS化合物的额外成熟步骤外，按通常方法进行IVF。因为人们预期通过传统IVF方法可足以使卵细胞成熟，人们不会想到加入此额外的成熟步骤会产生任何额外的作用。
以上治疗和程序的多数步骤均按已知方法实施，余下的步骤以本身已知的方式实施。有关从卵巢的卵泡中取出卵母细胞、分离的卵母细胞的培养、需要用的培养基、用精子受精及转移胚至输卵管的更多细节可在文献中找到，例如美国专利说明书第5,693,534号，此处列入作为参考。
依据本发明，所用培养基中要加入MAS化合物。该培养基中MAS化合物的量在约0.01-100μmol的范围，优选在大约0.1-100μmol的范围。
在连续30天的连续期间内用下丘脑激素和/或垂体激素或其拮抗剂或活性衍生物治疗妇女的优选的理由是获得多个前排卵卵泡。
下丘脑激素是存在于人下丘脑中的一类激素。垂体激素是存在于人垂体中的一类激素。促性腺激素是脊椎动物垂体前叶和哺乳动物胎盘所分泌的控制性腺活动的一类激素。化学本质上它们都是糖蛋白。促性腺激素的例子有FSH、LH和绒毛膜促性腺激素，例如人绒毛膜促性腺激素(此后称hCG)。FSH刺激卵巢卵泡及其中卵母细胞的生长以及睾丸中精子的形成。例如，FSH可以是绝经的FSH或者重组FSH。在女性体内，LH激活卵巢的雌激素产生组织产生孕激素，很可能促进卵巢卵泡的终末期发育、启动卵母细胞的最后成熟(包括排卵)以及在哺乳动物中启动黄体发育。这些激素是已知的。本领域技术人员显然知晓可以替代性使用这些激素的激动剂或拮抗剂。本领域技术人员也显然知晓可以替代性使用这些激素的活性类似物。某些这类激动剂、拮抗剂和类似物是已知的，而其它的可通过本身已知的方法制备。有关这些已知方法的实例是化学合成与遗传工程。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种方法或用途，其中在连续30天的期间内使用下丘脑激素和/或垂体激素或其激动剂或拮抗剂或其活性衍生物治疗妇女至少约7天，优选地至少约10天，更优选地至少约14天。
在又一个优选的实施方案中，本发明涉及一种方法或用途，其中用以治疗妇女不孕症、和/或改善其卵母细胞的成熟、和/或改善核、胞浆和/或膜卵母细胞成熟的同步性、和/或改善卵母细胞的受精、和/或通过人体外成熟和受精来提高卵母细胞的植入率。
在又一个优选的实施方案中，本发明涉及一种方法或用途，其中连续的期间为一个月经周期。
在又一个优选的实施方案中，本发明涉及一种方法或用途，其中卵母细胞与MAS化合物的成熟持续约15-约60小时。
在又一个优选的实施方案中，本发明涉及一种方法或用途，其中用黄体生成激素(LH)或其激动剂或拮抗剂或活性衍生物和/或人绒毛膜促性腺激素(HCG)或其激动剂或拮抗剂或其活性衍生物诱导前排卵卵泡至黄体化。
在又一个优选的实施方案中，本发明涉及一种方法或用途，其中用MAS化合物对卵母细胞的成熟持续约1-15小时，优选约6小时。
在又一个优选的实施方案中，本发明涉及一种方法或用途，其中MAS化合物的剂量在约0.01-100μM/L的范围内，优选地在大约0.1-100μM/L的范围内。
在又一个优选的实施方案中，本发明涉及一种方法或用途，其中MAS化合物是WO 96/00235、96/27658、97/00884、98/28323、98/54965和98/55498中提到的化合物之一，更具体地是所述专利申请的权利要求1中所述化合物。
在又一个优选的实施方案中，本发明涉及一种方法或用途，其中MAS化合物是FF-MAS。
另外，本发明涉及下丘脑激素和/或垂体激素或其激动剂或拮抗剂或其活性衍生物在生产待使用于妇女的激素产品中的用途，其中在连续30天期间内，用下丘脑激素和/或垂体激素或其激动剂或拮抗剂或其活性衍生物治疗妇女，所述期间后立即从该妇女吸出一个或多个卵母细胞，卵母细胞在含有本处所述的MAS化合物的适当培养基中培养之后，该卵母细胞用人精子受精然后所得胚转移至妇女。
另外，本发明涉及下丘脑激素和/或垂体激素或其激动剂或拮抗剂或其活性衍生物以及MAS化合物在生产用于人体外受精处理的药物中的用途，其中在连续30天的期间内，下丘脑激素和/或垂体激素或其激动剂或拮抗剂或其活性衍生物用于治疗妇女，其后MAS化合物用于从该妇女取出的一个或多个卵细胞的体外卵母细胞成熟。
另外，本发明涉及一种呈单位剂量形式用于体外受精的药物试剂盒，其包含单独的单位剂量，所述试剂盒包含单独剂量单位用于连续每日施用的下丘脑激素和/或垂体激素或其激动剂或拮抗剂或其活性衍生物，用于连续每天施用以及1个剂量单位的MAS化合物。该试剂盒可以具有以上所述的优选特征。
本发明进一步用下面的实施例详细说明，不过，它们不限于这些说明。前面说明中所公开的特征在以下的实施例和权利要求中可以其单独或组合形式用作以不同形式等现本发明的材料。
卵母细胞在Hx培养基中冲洗3次，均一大小的卵母细胞分成CEO和NO两组。CEO和NO培养于4孔碟(Nunclon，丹麦)，每孔含Hx培养基0.4ml及10μM受试化合物。一个对照孔(即35-45个卵母细胞培养于不加受试化合物的相同培养基中)始终与3个测试孔(即每孔35-45个卵母细胞加受试化合物)同时培养。
卵母细胞于含5％CO2的加湿空气中，37℃培养24小时。培养结束后，用立体显微镜(Wildt，Leica MZ 12)分别计算带GV、GVB和极体(此后称PB)卵母细胞的数目。GVB百分率定义为每孔中经历GVB的卵母细胞占孔中卵母细胞总数的百分率，计算公式为％GVB＝((GVB数目+PB数目)/卵母细胞总数)×100
吸出的液体将用来寻找丘卵母细胞复合物(COC)，一旦在立体显微镜下(可用可不用胚过滤器)鉴别出来，就培养COC。
与FF-MAS的接触可从1-60小时变化，优选从4-30小时，且可在受精前，受精后24小时内或最多24小时。可以使用对于熟练技术人员而言已知的多种卵母细胞培养基或培养基成分。人血清白蛋白(HSA)可加或可不加入该培养基中，如果加，浓度可在0.1-100mg/ml之间，优选地5-15mg/ml或0.5-1.5％(体积/体积)。FF-MAS的制剂可以是乙醇贮存溶液、DMSO或其它有机溶剂的溶液，也可以是FF-MAS/HSA包被过的干孔，加入合适的培养基即可使用。FF-MAS的浓度可在0.1-100μM变动，优选地10-30μM。
在与FF-MAS体外培养之后或期间，卵母细胞可通过常规的IVF、或通过胞浆内精子注射(此后称ICSI)或通过将来合适的可产生受精卵的受精方法来受精，发育中的胚可在受精后第1-6天、优选地2-3天时以单卵或多卵方式转移。
患者在卵细胞转移之前和之后可以接受个体化设计的孕酮和/或雌激素治疗，以引发和维持适当的可接受性子宫内膜。
与现有方法相比，上面的方法可以获得更好的结果。实施例3FF-MAS作为标准的基于FSH的IVF治疗辅助物的用途在当前周期中的第1天或第2天开始患者经历用重组FSH以平均每日剂量225IU下调，且在当前周期中使用GnRH拮抗剂即Cetrorelix(1mg/日，皮下，一次)。在施用hCG即Profasi(10.000IU，一次)时至少存在17mm或以上的3个卵泡。吸出卵泡在含有标准体外受精(IVF)培养液(IVF20(其可得自斯堪的纳维亚IVF ScieneeAB，Gothenburg瑞典))、补加人血清血蛋白(0.8％)及FF-MAS(5μM)之卵母细胞培养液中培养分裂中期II的卵母细胞。所有卵母细胞在37℃下于培养箱中正常条件下培养。每一卵母细胞在作为培养液体系的4小室培养碟中的一个孔培养。在胞质内精子注射(此后称为ICSI)之前用处理接触培养液的时间为4小时(±30分钟)，且在上述IVF20培养液中ICSI之后为20小时(±1小时)。在ICSI之后第1、2和3天评价前成胚的分裂期和破裂/形态。培养3天后，选取最好的前成胚(一般为两个前成胚)放回女性患者。女性患者接受雌激素即Estrofem(6mg/日)和孕酮即Utrogestan(600mg/日，微粉化的，阴道栓剂)以使患者子宫的内膜衬里产生反应且适于转移的卵细胞植入。支持性类固醇激素的持续因病人而易，且依超声扫描及血液检查在3-10周后seponate。
与现有方法相比，用上述步骤获得更好的结果。实施例4 FF-MAS作为标准的基于FSH之IVF治疗辅助物的用途。
患者经历用GnRH类似物即Synarel(鼻喷剂，每日喷两次)下调至少14天(自前一月经周期的黄体期或月经周期的增生期第1或第2日起)，且用重组FSH以平均每日225IU的剂量进行卵巢刺激。在施用hCG即Profase(1000IU，一次)时至少存在17mm或以上的3个卵泡。吸出卵泡在含有标准体外受精(IVF)培养液(IVF20(其可得自斯堪的纳维亚IVF Scienee AB，Gothenburg瑞典))、补加人血清血蛋白(0.8％)及FF-MAS(5μM)之卵母细胞培养液中培养分裂中期II的卵母细胞。所有卵母细胞在37℃下于培养箱中正常条件下培养。每一卵母细胞在作为培养液体系的4小室培养碟中的一个孔培养。在胞质内精子注射(ICSI)之前用处理接触培养液的时间为4小时(±30分钟)，且在上述IVF20培养液中ICSI之后为20小时(±1小时)。在ICSI之后第1、2和3天评价前成胚的分裂期和破裂/形态。培养3天后，选取最好的前成胚(一般为两个前成胚)放回女性患者。女性患者接受雌激素即Estrofem(6mg/日)和孕酮即Utrogestan(600mg/日，微粉化的，阴道栓剂)以使患者子宫的内膜衬里产生反应且适于转移的卵细胞植入。支持性类固醇激素的持续因病人而易，且依超声扫描及血液检查在3-10周后seponate。
与现有方法相比，用上述步骤获得更好的结果。
权利要求
1.一种人体外受精方法，其中，妇女在连续30天的期间内用下丘脑激素和/或垂体激素或其激动剂或拮抗剂或其活性衍生物治疗，其后吸出卵母细胞并活化成熟或与MAS化合物接触使之体外同步化。
2.下丘脑激素和/或垂体激素或其激动剂或拮抗剂或其活性衍生物在制备待施用于妇女的激素产品中的用途，所述妇女在连续30天的期间内用下丘脑激素和/或垂体激素或其激动剂或拮抗剂或其活性衍生物治疗，在所述期间后立即从该妇女中吸出一个或多个卵母细胞，所取卵母细胞在含有此处所述MAS化合物的适宜培养基中培养后，所述卵母细胞用人精子受精，其后所得胚转移至妇女。
3.下丘脑激素和/或垂体激素或其激动剂或拮抗剂或其活性衍生物以及MAS化合物在制备人体外受精的治疗药物中的用途，其中下丘脑激素和/或垂体激素或其激动剂或拮抗剂或其活性衍生物在连续30天的期间内用于治疗妇女，其后，MAS化合物用于对取自该妇女的一个或多个卵细胞的体外卵母细胞成熟。
4.根据前述任何一项权利要求的方法或用途，其中治疗所述妇女的不孕症，和/或改善其卵母细胞成熟，和/或改善核、胞浆和/或膜卵母细胞成熟的同步性，和/或改善其卵母细胞的受精，和/或通过人体外成熟和受精来提高植入率。
5.根据前述任何一项权利要求的方法或用途，其中在连续30天的期间内妇女用下丘脑激素和/或垂体激素或其激动剂或拮抗剂或其活性衍生物治疗的时间至少约7天，优选地至少约10天，更优选地至少约14天。
6.根据前述任何一项权利要求的方法或用途，其中连续的期间为一个月经周期。
7.根据前述任何一项权利要求的方法或用途，其中用MAS化合物对卵母细胞的成熟持续约15-60小时。
8.根据前述任何一项权利要求的方法或用途，其中前排卵卵泡用黄体生成素(LH)或其激动剂或拮抗剂或其活性衍生物和/或人绒毛膜促性腺激素(HCG)或其激动剂或拮抗剂或其活性衍生物诱导至黄体化。
9.根据前述任何一项权利要求的方法或用途，其中用MAS化合物对卵母细胞的成熟持续约1-约15小时，优选约6小时。
10.根据前述任何一项权利要求的方法或用途，其中MAS化合物的剂量范围为约0.01-约100μmol/L，优选地在约0.1-约100μmol/L的范围内。
11.根据前述任何一项权利要求的方法或用途，其中MAS化合物是WO 96/00235、96/27658、97/00884、98/28323、98/54965和98/55498中提到的化合物之一，更具体地是所述专利申请的权利要求1中所提及的化合物。
12.根据前述任何一项权利要求的方法或用途，其中MAS化合物是FF-MAS。
13.一种呈单位剂量形式用于体外受精的药物试剂盒，其包含分开的单位剂量，所述试剂盒包含用于连续每天施用的下丘脑激素和/或垂体激素或其激动剂或拮抗剂或其活性衍生物的分开的剂量单位，用于连续每天施用，和1个剂量单位的MAS化合物。
14.根据前述权利要求的试剂盒，其具有任一上述从属 中所述优选的特征。
15.在此所述的任何新颖特征或这些特征的组合。
全文摘要
通过加入一种减数分裂激活化合物可改善的体外受精方法。
文档编号A61K38/24GK1353617SQ00804135
公开日2002年6月12日 申请日期2000年2月23日 优先权日1999年2月24日
发明者C·格罗达尔, T·H·汉森, A·卢比格, C·赫格勒－哈顿 申请人:诺沃挪第克公司