表达免疫调节分子的重组呼吸道合胞病毒的制备的制作方法

专利名称：表达免疫调节分子的重组呼吸道合胞病毒的制备的制作方法
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人呼吸道合胞病毒(HRSV)是世界范围内严重儿科呼吸道疾病的首要病因(Collins等，Fields Virology 21313-1352，1996；在此引用作为参考)。RSV是超过所有其它病毒的诱发1岁以下幼儿肺炎和细支气管炎的病原。几乎所有的儿童在两岁时都被感染，再次感染以可观的频率发生于较大的儿童和青年中(Chanock等，于ViralInfection of Humans，3rded.，A.S.Evans，ed.，Plenum Press，N.Y.，1989；在此引用作为参考)。因呼吸道疾病引起的儿科入院的五分之一是由RSV引起的，并且仅在美国每年造成10万例入院和4,500例死亡(Heilman等，J.Infect.Dis.161402-6，1990；在此引用作为参考)。此外，有证据表明生命早期的严重呼吸道感染可以引发或恶化哮喘(Sigurs等，Pediatrics 95500-505，1995；在此引用作为参考)。
尽管RSV通常被认为感染儿童群体，也发现它是较老的人中严重疾病的重要诱因(Falsey等，J.Infect.Dis.172389-394，1995；在此引用作为参考)。RSV也在某些无免疫应答的个体(如骨髓移植受体)中引起威胁到生命的疾病(Fouillard等，Bone Marrow Transplant 997-100，1992；在此引用作为参考)。
现在有一种化学治疗试剂，病毒唑，可以治疗RSV。但其疗效和应用是有争议的。也有干扰RSV的已注册的产品，由一个供体IgG池(Groothuis等，N.Engl.J.Med.3291524-1530，1993；在此引用作为参考)或人源化RSV特异的单克隆抗体组成。这些是作为被动免疫预防试剂给药高危险个体。尽管这些产品有作用，其高成本和其它因素(如缺乏长期的有效性)使其不适合广泛的使用。其它不利之处包括传播由血液运载的病毒的可能性和制备和储存的难度和花费。此外，对该感染性疾病控制的历史，以及特别是病毒起源的疾病，表明疫苗的首要重要性。
尽管多年以来对发展抗RSV的有效疫苗制剂进行了研究，仍然没有安全和有效的疫苗被认可，以预防与RSV感染相关的严重疾病和显著的死亡率。难以发展成功的疫苗与这一事实部分相关，即，小的幼儿对RSV抗原的血清和分泌性抗体应答较低。因此，RSV对这些个体的感染更严重，而累积性免疫似乎保护更年长的儿童和成人，以抗该病毒更严重的冲击。
RSV感染中的免疫机制近来成为研究焦点。分泌性抗体在保护上呼吸道中似乎最重要，而高水平血清抗体被认为抗RSV在下呼吸道的感染中起主要作用。RSV特异的细胞毒T细胞，诱导免疫的另一个效应方面，对解决RSV的感染也重要。不过，尽管后一个效应物可因先前的免疫而增强，对病毒攻击有增强的抗性，但这种效应是短期的。F和G表面糖蛋白是RSV的两个主要保护性抗原，也是RSV中仅有的诱导RSV中和抗体和对抗攻击长效抗性的蛋白(Collins等，FieldsVirology，Fields等，eds.，21313-1352，Lippincott-Raven，Philadelphia，1996；Connors等，J.Virol.65(3)1634-1637，1991；在此引用作为参考)。第三个RSV表面蛋白，SH，不诱导RSV中和抗体和对RSV攻击的显著抗性。
发展活RSV疫苗的一个阻碍是难以在减毒和免疫原性之间获得一种适当的平衡。其它阻碍包括一些减毒病毒遗传不稳定、RSV在细胞培养时相对低的生长和病毒颗粒的不稳定。此外，天然感染诱发的免疫不能充分抗后来的感染。许多因素可能引起这种现象，包括免疫系统对限制呼吸道腔表面病毒感染相对的低效，局部粘膜免疫的短期性，快速和广泛的病毒复制，由于免疫不成熟而在幼儿中降低的免疫应答，经胎盘来源的母体血清抗体引起的免疫抑制，和病毒的某些特点，如G蛋白高水平的糖基化。RSV也作为两个抗原亚型A和B出现，如下所述，抗一个亚型的免疫对于另一个的有效性下降。
尽管RSV在生命中可以多次感染，由于先前感染诱导的保护性免疫的存在，再次感染的严重性降低，因此免疫预防是可行的。可以鼻内给药一种活的减毒RSV疫苗以引发轻度的免疫性感染。与肠胃外给药途径相比，这种方式的优点是简单和安全。这也直接刺激在抵抗RSV中起主要作用的局部呼吸道免疫。这也消除了RSV-特异的母体来源的血清抗体的免疫抑制(典型的发现于幼儿中)效果。RSV抗原肠胃外给药有时与免疫病理并发症相关(Murphy等，Vaccine 8(5)497-502，1990；在此引用作为参考)，而用活病毒从未发现这种情况。
二十世纪六十年代中期，一种福尔马林灭活的病毒疫苗被检测为抗RSV，但不能抗RSV感染或疾病，事实上，在之后的病毒感染时症状更加恶化(Kim等，Am.J.Epidemiol.89422-434，1969；Chin等，Am.J.Epidemiol.89449-463，1969；Kapikian等，Am.J.Epidemiol.89405-421，1969，在此引用作为参考)。
更近一些的RSV的疫苗发展聚焦于减毒的RSV突变体。Friedewald等报道了一种冷传代型RSV突变体(cpRSV)(J.Amer.Med.Assoc.204690-694，1968；在此引用作为参考)，其足够地减毒从而可以作为疫苗使用。这种突变体与其野生型(wt)亲本病毒相比，表现在26℃略微增加的生长效率，但其复制并非温度敏感或显著的冷适应的。但这种冷传代的突变体在成人中是减毒的。尽管其在先前感染了RSV的幼儿和儿童(即，血清反应阳性个体)中具有满意的减毒和免疫原性，这种cpRSV突变体在血清反应为阴性的幼儿上呼吸道中保持低水平的毒性。
同样的，Gharpure等报道分离出一种温度敏感RSV突变体(tsRSV)(J.Virol.3414-421，1969；在此引用作为参考)，其也是有前途的候选疫苗。一个突变体，ts-1，被广泛地在实验室和志愿者中检测。该突变体在成人志愿者中产生无病症的感染，也赋予对免疫45天后野生型病毒攻击的抗性。尽管血清反应阳性的幼儿和儿童经历无病症的感染，血清为阴性的幼儿却发展出鼻炎和其它轻微症状。此外，也发现了这种ts表型的不稳定性。尽管表现显示部分或完全的温度敏感性丧失的病毒代表从接种者可回收的病毒的一小部分，其除了轻微鼻炎外不引起其他疾病症状。
这些和其它研究表明某些冷传代和温度敏感RSV株减毒不足，因此可在一些受接种者，特别是血清反应阴性幼儿中引发疾病的轻微症状，而另一些过分减毒，不能足量复制以诱导保护性免疫应答(Wright等，Infect.Immun.37397-400，1982；在此引用作为参考)。此外，候选疫苗突变体的遗传不稳定性导致其温度敏感表型的丧失，进一步阻碍了发展有效的RSV疫苗。一般参见(Hodes等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.1451158-1164，1974；McIntosh等，Pediatr.Res.8689-696，1974；Belshe等，J.Med.Virol.3101-110，1978；在此引用作为参考)。
作为活减毒RSV疫苗的替代，研究者还用纯化的RSV包膜糖蛋白检测了候选亚单位疫苗。这种糖蛋白在棉鼠肺中诱导对RSV感染的抗性(Walsh等，J.Infect.Dis.1551198-1204，1987；在此引用作为参考)，但抗体中和活性很弱，而且纯化的亚单位疫苗对啮齿类动物的免疫导致疾病的潜在可能(Murphy等，Vaccine 8497-502，1990；在此引用作为参考)。
也探索表达F或G包膜糖蛋白的重组痘苗病毒疫苗。这些重组体表达与天然病毒对应物难以区分的RSV糖蛋白，皮下感染痘苗-RSVF和G重组体的啮齿类动物产生高水平的特异性抗体，可中和病毒的感染性。事实上，痘苗-F重组体感染棉鼠在下呼吸道中刺激对RSV复制的几乎完全的抗性和在上呼吸道中显著的抗性(Olmsted等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 837462-7466，1986；在此引用作为参考)。但痘苗-F和-G重组体对猩猩的免疫在上呼吸道中几乎不产生抗RSV攻击的保护(Collins等，Vaccine 8164-168，1990，在此引用作为参考)，在下呼吸道中产生间断的保护(Crowe等，Vaccine 111395-1404，1993；在此引用作为参考)。
尽管为发展有效RSV疫苗的进行了各种努力，仍然没有许可的疫苗用于RSV。因先前的方法未能达到目标，而强调了需要新方法发展RSV疫苗，需要特定的方法操作重组RSV，使其在活的减毒RSV重组体中包含产生新表型特征的遗传改变。但对于RSV基因组RNA和其它非区段化负义RNA病毒的操作被证明是困难的。这方面主要的阻碍包括这些病毒裸露基因组RNA的无感染性，以及对于RSV而言，在组织培养中较差的生长、冗长的复制周期、毒粒的不稳定性、基因组的复杂和基因产物的复杂组织结构。
重组DNA技术使从cDNA获得感染性非区段化负链RNA病毒成为可能，使遗传操作病毒克隆以构建新的候选疫苗成为可能，使快速检测其减毒水平和表型稳定性成为可能(综述参见Conzelmann，J.Gen.Virol.77381-389，1996；Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9311354-11358，1996；在此引用作为参考)。文中报道了在必需病毒蛋白存在时，从cDNA编码的反基因组RNA中获得的一些重组病毒，这些病毒包括感染性呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)、狂犬病病毒(RaV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)、麻疹病毒(MeV)、牛瘟病毒和仙台病毒(SeV)(参见，如，Garcin等，EMBO J.146087-6094，1995；Lawson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.924477-4481，1995；Radecke等，EMBO J.145773-5784，1995；Schnell等，EMBO J.134195-4203，1994；Whelan等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.928388-8392，1995；Hoffman等，J.Virol.714272-4277，1997；Pecter等，J.Virol.735001-5009，1999；Kato等，Genes to Cells 1569-579，1996；Roberts等，Virology 247(1)1-6，1998；Baron等，J.Virol.711265-1271，1997；国际申请WO 97/06270；1995年9月27日的US临时专利申请60/007,083；1996年9月27日的US专利申请08/720,132；1996年7月15日的60/021,773；1997年5月9日的US临时专利申请60/046,141；1997年5月23日的US临时专利申请60/047,634；1999年11月30日的US专利申请5,993,824(相应于公布的国际申请WO 98/02530)；1999年4月13日的US临时专利申请60/129,006；Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9211563-11567，1995；Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996；Juhasz等，J.Virol.71(8)5814-5819，1997；Durbin等，Virology 235323-332，1997；He等，Virology 237249-260，1997；Baron等，J.Virol.711265-1271，1997；Whitehead等，Virology 247(2)232-239，1998a；Whitehead等，J.Virol.72(5)4467-4471，1998b；Jin等，Virology251206-214，1998；Whitehead等，J.Virol.73(4)3438-3442，1999；Bukreyev等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.962367-2372，1999；Bucholz等，J.Virol.73251-259，1999；Collins等，Virology 259251-255，1999，为各种目的在此分别全文引用作为参考)。
基于重组DNA技术的这些发展，现在可能从cDNA中获得感染性RSV，并对RSV克隆设计和实施各种遗传操作以构建新的候选疫苗。因此，可以评价减毒和表型稳定性，以及其它期望表型特征的水平。
发展重组疫苗的研究途径之一是工程化病毒，使其表达一种或多中细胞因子或其它潜在的抗病毒分子。研究的大部分都包括野生型痘苗病毒的参与，其目标在于增加对宿主免疫和病毒致病性的基本了解(参见，如Ramshaw等，Immunol.Rev.127157-182，1992；在此引用作为参考)。很早就考虑到细胞因子共表达以提高免疫应答在疫苗发展中的潜在应用(Ramshaw等，Trends Biotechol.10424-426，1992；在此引用作为参考)。但使用痘病毒作为研究客体降低了这一概念的实际应用，因为天花已在人群体中被消灭，而且痘病毒疫苗已不在被使用。
这些利用细胞因子共表达发展疫苗的早期研究范例包括工程化地表达细胞因子白介素2(IL-2)的一个痘苗病毒。据报道这种重组病毒在免疫缺陷型无胸腺裸鼠中是减毒的(Flexner等，Nature 330259-262，1987；Ramshaw等，Nature 329545-546，1987在此引用作为参考)。对各种免疫效应物在清除和回收中的作用也进行了研究(Karupiah等，J.Ex.Med.1721495-1503，1990；Karupiah等，J.Immunol.144290-298，1990；Karupiah等，J.Immunol.1474327-4332，1991；在此引用作为参考)。该痘苗病毒重组体表达的IL-2可极大地降低该疫苗病毒在灵长类引起的皮肤损伤，表明其显著地减毒。尽管有这些初步的发现，在存在或不存在IL-2的情况下抗体的产生量被确定是相等的(Flexner等，Vaccine 817-21，1990；在此引用作为参考)。
重组痘苗病毒共表达其它细胞因子的例子包括白介素4(IL-4)，有报道其负调节抗病毒细胞因子的表达和细胞毒T细胞应答，也恶化病毒感染(Sharma等，J.Virol.707103-7107，1996；在此引用作为参考)。另一个研究中，重组痘苗病毒表达氧化氮合成酶是高度减毒性的，显示宿主防御机制对于控制痘苗病毒感染的重要性(Rolph等，J.Virol.707678-7685，1996；在此引用作为参考)。重组痘苗病毒共表达IL-5或IL-6使局部IgA产生4倍的增加(Ramsay等，Reprod.Fertil.Dev.6389-392，1994；在此引用作为参考)。重组痘苗病毒共表达的α肿瘤坏死因子(TNF)使小鼠控制感染能力增加，暗示该分子参与宿主对于该病毒的防御(Sambhi等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.884025-4029，1991；在此引用作为参考)。重组痘苗病毒表达的鼠IFNγ在正常或无免疫应答的小鼠中极大地降低病毒的复制(Kohonen-Corish等，Eur.J.Immunol.20157-161，1990；在此引用作为参考)。
这些研究也扩展到逆转录病毒。最近，构建了表达IL-2的猴免疫缺陷病毒(SIV)(Gundlach等，J.Virol.712225-2232，1997；在此引用作为参考)。感染这种表达IL-2的病毒的猕猴中，SIV特异的T细胞增殖应答和抗体效价与对照病毒的相似。感染这种表达IL-2病毒的猴和4只对照动物中的两只被发现存在SIV特异的CTL。另一项研究中，缺少nef基因但包含IFNγ基因的SIV重组体在体内是减毒的，但该细胞因子基因在体内复制几周后不稳定，此外，这种减毒伴随着降低的免疫原性(Giavedoni等，J.Virol.71866-872，1997；在此引用作为参考)。
对大的双链痘病毒(约有185个ORF，并且编码许多干扰宿主防御的蛋白)或人免疫缺陷病毒(也干扰宿主防御)的研究不适用于非区段化负链RNA病毒。早已表明外源基因可以从重组呼吸道合胞病毒(RSV)的基因组中表达，并且可以稳定维持(Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996，在此引用作为参考)。这表明可以共表达蛋白，如细胞因子，趋化因子，配基和其它分子，其可以改变、增加或增强宿主对RSV的应答。从重组RSV中表达免疫调节分子是期望的，因为其可以在RSV抗原产生的局部位点表达。此外，共表达不需要分别制备并给药免疫调节物。从非逆转录病毒(即正义、双链或反义RNA病毒)基因组中表达免疫调节物的策略先前没有进行过探索。
因此需要增强和改变宿主对RSV的免疫应答。因为RSV疫苗可以被给药年幼的幼儿，已知该年龄组中累积免疫无效，并且在一些方面不同于成人。例如，对RSV的中和抗体应答和细胞毒T细胞应答在年幼者中降低(Kovarik和Siegrist，Immunol.Today 19150-152，1998；Kovarik和Siegrist，Immunol.Cell.Biol.76222-236，1998；Murphy等，J.Clin.Microbiol.24894-989，1986；Risdon等，Cell.Immunol.15414，1994；在此引用作为参考)。一般认为，新生儿的免疫系统倾向于Th-2型辅助T细胞应答(即，IL-4分泌所限定的辅助T细胞亚群)(Early和Reen，Eur.J.Immunol.262885-2889，1996；在此引用作为参考)。新生儿的T细胞具有降低的对B细胞的辅助细胞活性，并产生低量的细胞因子，包括IL-2、γ干扰素(IFNγ)和IL-4(Splawski等，J.Clin.Invest.87454，1991；Hassan和Reen，Scand.J.Immunol.39597，1994；Wilson等，Pediatr.54118，1991；在此引用作为参考)。年幼的幼儿典型的也具有经胎盘获得的RSV特异性IgG，其可以干扰或改变免疫应答(Murphy等，J.Clin.Microbiol.24894-989，1986和231009-1014，1986；Siegrist等，Eur.J.Immunol.284138-4148，1998；在此引用作为参考)。最后，某些RSV的免疫与免疫病理并发症相关(Murphy等，Vaccine8497-502，1990；Waris等，J.Virol.716935-6939，1997；在此引用作为参考)。尽管典型地这在活减毒病毒感染中未观察到，有证据表明单个的RSV抗原，最值得注意的是G蛋白，即使在由活病毒表达时，也具有诱导免疫病理学效应的潜力(Johnson等，J.Virol.722871-2880，在此引用作为参考)。这些参与RSV免疫应答、免疫介导的保护和免疫病理反应的许多因素表明，需要发展调节对RSV疫苗的宿主应答的方法。
总之，本领域迫切需要发展其它的工具和方法，以工程化制造安全有效的疫苗，减轻RSV导致的严重的健康问题。文中，需要发展一个广泛而多样的遗传修饰的菜单，其可以单独或组合地与其它类型遗传操作一起使用，构建可用于广泛疫苗应用的感染性减毒RSV候选疫苗。对活的减毒RSV疫苗病毒有用的操作可包括使重组RSV克隆共表达调节宿主免疫应答和由免疫介导的保护的一种或更多因子。令人惊讶地，本发明提供了构建感染性减毒RSV候选疫苗的其它工具，满足了这些需要。
发明简述本发明提供了被工程化表达一种或更多免疫调节分子的重组的RSV(rRSV)。该重组病毒具有包含编码该免疫调节分子的多核苷酸的经修饰的基因组或反基因组，该免疫调节分子由病毒在感染细胞中表达。优选用于本发明的免疫调节分子包括细胞因子。但是包括趋化因子或细胞因子拮抗剂、表面或可溶性受体、附着分子、配基等在内的其它多种免疫调节分子也可以改变病毒生物学和/或宿主对RSV的免疫应答的一些方面。在更详细的实施方案中，该免疫调节剂是细胞因子，选自白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、γ干扰素(IFNγ)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
细胞因子和其它免疫调节分子可以被引入本发明重组RSV中，由病毒在感染细胞中表达，并改变病毒生物学的一个或多个方面。例如，免疫调节剂的引入和表达可能改变病毒感染性、复制和/或致病性，并能诱导或改变一种或多种宿主免疫应答，例如抗RSV的中和抗体应答、辅助T细胞应答、细胞毒T细胞(CTL)应答和/或自然杀伤(NK)细胞应答。
本发明利用重组DNA技术提供从重组RSV中细胞内共表达广泛的天然或工程化蛋白。这些蛋白典型地影响造血细胞，或阻断造血细胞之间的天然信号和相互作用。病毒基因组或反基因组被修饰，引入编码细胞因子或其它免疫调节分子的多核苷酸，以构建这些重组病毒。该核苷酸序列在该基因组或反基因组中添加或替代，典型地是作为单独的基因，有自己的基因起始(GS)和终止(GE)信号。一般，编码免疫调节分子的多核苷酸序列添加或替代到重组RSV基因组或反基因组的基因间隔区或其它非编码区中，在任何适当的不破坏该基因组或反基因组中读码框的位点。
细胞因子或其它免疫调节分子的表达水平可通过改变该重组基因组或反基因组中编码该细胞因子的多核苷酸的基因排序进行调整。例如，编码该细胞因子的多核苷酸可以在RSV基因的任何基因间隔区或其它非编码区中引入。引入的位点越上游或“接近启动子”，该调节分子的表达水平就越高。
在RSV中插入编码免疫调节因子的基因组或基因组区段的其它方法是，将cDNA置于如上所述的RSV基因起始和末端信号控制之下，插入该cDNA使其从反基因组而非从基因组中表达。理想的，外源基因放置于紧邻反基因组3’末端启动子下游，这种靠近启动子的位置保证其高水平表达。
从RSV中表达细胞因子或其它免疫调节分子的其它方法是，将基因的ORF置于哺乳动物内部核糖体进入位点的控制下，将该ORF插入任何一个或多个RSV基因非编码区下游。
表达的另一种方法是通过构建嵌合或融合蛋白。例如，希望表达于感染细胞和毒粒表面的蛋白胞外域可以添加于SH ORF或其它非必需基因的下游末端，从而其阅读框不受干扰并产生嵌合蛋白。以这种方式，SH部分提供信号和膜锚点，C末端附着的结构域被显示于细胞外。
重组RSV表达一种或更多免疫调节分子是所希望的，因为其提供免疫调节分子于RSV抗原产生局部位点的表达。根据本发明的指导，共表达免疫调节分子不需要单独制备和给药免疫调节分子。此外，本发明重组RSV具有其它在发展疫苗中有用的特性。使该重组基因组或反基因组表达一种细胞因子的这种改变产生表现一个或更多如下新特征的候选疫苗，所述特征选自(i)在细胞培养中病毒生长的改变，(ii)在感染宿主的上和/或下呼吸道中病毒减毒的变化，(iii)病毒噬菌斑大小的改变，和/或(iv)免疫原性的改变，或另外具有，或同时伴随有，与野生型或亲本(即，不表达细胞因子的)RSV诱导的宿主应答相比，诱导改变的宿主应答的能力，如增加抗RSV中和抗体应答、辅助T细胞应答、细胞毒T细胞(CTL)应答和/或自然杀伤(NK)细胞应答。
本发明优选的方面中，重组RSV高水平表达引入的细胞因子或其它免疫调节分子，如最高可达感染组织培养细胞培养基中2.5μg/ml。这种重组病毒在体内和体外都减毒，同时也在接种个体中表现抗野生型RSV的高保护效率。其经过工程化，表达的病毒抗原量未减少，典型的是增加，同时也表现减毒表型。由于未降低或被增加的mRNA转录和抗原表达，其保存了免疫原的潜能，且通过RNA复制和病毒生长的同时降低达到了减毒。这一套新的表型特点对于发展疫苗是非常有利的。在被工程化表达免疫调节分子的重组RSV中的其它有利的表型改变包括与野生型或突变亲本RSV株相比，噬菌斑大小的改变和致细胞病变性改变。
与被修饰为表达细胞因子或其它免疫调节分子的重组RSV中提供的表型效果组合，经常期望通过引入增加或降低该重组病毒减毒性的额外的突变，调整减毒表型。因此，候选疫苗株可因引入的至少一个，优选两个或多个不同的减毒突变(例如来源于已知的生物学来源的突变RSV株中的一组突变)而进一步减毒。优选的人突变RSV株是冷传代(cp)和/或温度敏感(ts)突变体，例如命名如下的突变株cpts RSV 248(ATCC VR 2450)；cpts RSV 248/404(ATCC VR 2454)；cpts RSV 248/955(ATCC VR 2453)；cpts RSV 530(ATCC VR 2452)；cpts RSV 530/1009(ATCC VR 2451)；cpts RSV 530/1030(ATCC VR2455)；RSV B-1 cp52/2B5(ATCC VR 2542)；RSV B-1 cp23(ATCCVR 2579)；遵循布达佩斯条约，各材料保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，Virginia20110-2209，USA，并给出以上的保藏号)。从该生物学来源的突变体模式组中，获得了一个减毒的“菜单”，每个都可以与该组中其它任何减毒突变组合，在本发明用于疫苗的重组RSV中调整减毒和其它所希望的表型的水平。可引入或转移到被修饰为表达细胞因子或其它免疫调节分子的RSV克隆中的其它突变，可以从各种温度敏感(ts)、冷传代(cp)、小噬菌斑(sp)、冷适应(ca)或宿主范围限制(hr)的突变RSV株中获得。其中减毒突变可在非RSV负链RNA病毒中发现，并也可以引入本发明RSV突变体中，方法是将该突变定位到受体RSV基因组或反基因组相应的同源位点处，将受体中现存序列突变为突变基因型的(通过等同或保守突变)，如1999年4月13日美国临时专利申请60/129,006所述。其它有用的突变可以用上述引用参考文献中所述的重组微基因组分析和感染性病毒，通过突变分析经验性地确定。
选择用做疫苗的本发明重组RSV常具有至少两个、有时三个或多个减毒突变，以获得可广泛地进行临床应用的满意的减毒水平。一个实施方案中，至少一个减毒突变发生在RSV聚合酶L基因中(在供体或受体基因中)，涉及到决定该聚合酶蛋白的氨基酸改变的核苷酸替代，其特定导致产生减毒表型，可以包括或不包括一种温度敏感表型(ts)。被修饰为表达细胞因子或其它免疫调节分子的重组RSV在除L之外的其它RSV基因中包含一个ts突变，如在M2基因中。但文中优选的候选疫苗包含大聚合酶基因L内的核苷酸替代，导致氨基酸位点Asn43、Cys319、Phe521、Gln831、Met1169、Tyr1321和/或His1690处的氨基酸改变，例如由Ile替代Asn43，由Leu替代Phe521，由Leu替代Gln831，由Val替代Met1169，由Asn替代Tyr1321。这些位置其它氨基酸改变，尤其是相对于所发现的突变残基保守的改变，也可以产生，以得到与发现的突变替代相似的效果。引入本发明重组RSV的其它期望突变包括决定RSV N基因Val267、RSV F基因Glu218和/或Thr523的氨基酸替代的减毒突变，和M2基因起始序列内的一个核苷酸替代。此处发现的减毒突变中一个或多个直至全部的任何组合，可以引入被修饰为表达免疫调节分子的RSV中，产生适当减毒的重组病毒，用于选择的群体或广泛的疫苗受体群。
减毒突变可被选择在重组RSV基因组或反基因组的编码部分，或非编码区，如顺式调节序列。模式的非编码区突变包括基因起始序列内单个或多个碱基改变，以M2基因起始序列内核苷酸7605处(在一个模式重组序列中是7606)单个或多个碱基替代为例。
除了上述突变，根据本发明修饰的感染性RSV还可包含来自任何RSV或RSV类病毒的异源的编码或非编码核苷酸序列，如人、牛、羊、鼠(小鼠肺炎病毒)或鸟肺病毒，或其它任何有包膜病毒，如副流感病毒(PIV)。模式的异源序列包括来自一种人RSV株的RSV序列，其与来自一种不同的人RSV株的序列组合在被修饰为表达细胞因子或其它免疫调节分子的RSV中。例如，本发明的重组RSV可能包括来自两种或多种野生型或突变RSV株中的序列，例如选自cptsRSV 248、cpts RSV 248/404、cpts RSV 248/955、cpts RSV 530、cpts530/1009或cpts530/1030的突变株。这些新突变株也可包含来自两个或更多野生型或突变人RSV亚型的序列，例如人RSV亚型A和亚型B序列的组合(参见国际申请PCT/US/08802和相关的美国专利申请60/021,773；60/046,141；60/047,634；08/892,403；09/291,894；在此分别引用作为参考)。其它方面中，一个或更多人RSV编码或非编码多核苷酸被异源RSV或非RSV病毒的对应序列所替代，单独或与选择的减毒突变(如cp和/或ts突变)组合，产生新的减毒疫苗株。
在本发明相关方面，有关引入细胞因子编码序列的修饰被引入嵌合人-牛RSV中，其被工程化重组，同时包含了来自人和牛RSV株的核苷酸序列，产生感染性嵌合的病毒或亚病毒颗粒。本发明模式的人-牛嵌合RSV包含一个同时具有人和牛多核苷酸序列的嵌合RSV基因组或反基因组，以及主要核壳蛋白(N)、核壳磷蛋白(P)、大聚合酶蛋白(L)和RNA聚合酶延伸因子。其它的RSV蛋白可以各种组合包括在内，产生从感染性亚病毒颗粒到完整的病毒颗粒或具有多余蛋白、抗原决定簇或其它附加成分的病毒颗粒。
本发明使用的嵌合人-牛RSV一般述于名为“减毒人-牛嵌合呼吸道合胞病毒疫苗的生产”的2000年6月23日Bucholz等的美国专利申请(案卷号015280-398100US)，和之前的美国临时专利申请60/143,132(分别在此引用作为参考)。这些嵌合重组RSV包括部分或完整的“背景”RSV基因组或反基因组，其来源于，或其构建依据与不同RSV株的一个或更多异源基因或基因组区段组合的人或牛RSV株或亚型病毒，以形成人-牛嵌合RSV基因组或反基因组。在本发明的某些方面，嵌合RSV包含与来自人RSV的一个或更多异源基因或基因组区段组合的部分或完整的牛背景RSV基因组或反基因组。本发明其它一些方面，被修饰为表达免疫调节分子的RSV包含与来自牛RSV的一个或更多异源基因或基因组区段组合的部分或完整的人背景RSV基因组或反基因组。
本发明其它一些方面包括改变基因的位置或改变基因的排序，以创造或改变被修饰为表达免疫调节分子的RSV。文中，前述许多引用文献都集中于改变RSV和其它病毒的天然排序。例如，RSV中、NS1、NS2、SH和G基因被单个地缺失，以及NS1和NS2被一同缺失，由此改变各下游基因相对于启动子的位置。例如当NS1和NS2被一同缺失，N从3移至1，P从4移至2，等等。或者，基因排序内任何其它基因的缺失只会影响其更靠近下游基因的位置(相对于启动子)。例如SH占据野生型病毒的位点6处，其缺失不会影响位点5处的M(或任何其它上游基因)，但将G从相对于启动子的位置7移至6。应该说明基因缺失也可在生物学来源的突变病毒中产生(但极少)。例如，在细胞培养中被多次传代的亚型B RSV自发地缺失SH和G基因(Karron等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9413961-13966，1997；在此引用作为参考)。注意“上游”和“下游”分别指“接近启动子”和“远离启动子”方向(启动子在反义基因组RNA 3’前导区末端)。
基因排序转变性修饰(即，在重组病毒基因组中将基因移动到接近启动子或远离启动子的位置)，创造或改变表达细胞因子的本发明RSV，产生具有改变的生物学性质的病毒。例如，同时缺少NS1、NS2、SH和G，NS1和NS2，或者同时缺少SH和G的RSV表现在体内减毒、体外减毒或体内体外都减毒。可能这种表型主要因为特定病毒蛋白表达的丧失。但改变的基因图可能也赋予这种观察到的表型。缺失SH的病毒充分说明了这一点，可能由于基因缺失，基因排序变化，以及可能由于基因组大小的变化，导致转录、复制或二者的效率同时的增加，使其在一些细胞类型中比野生型更有效生长。其它一些病毒中，如NS1和/或NS2缺失的RSV，因基因排序改变而产生的生长变化，可能被因该RSV蛋白表达丧失而产生的更主导的表型所掩盖。
也将引入其它变化，改变表达细胞因子的RSV的基因排序，以改善该重组病毒作为活的减毒疫苗的特性(参见，名为“从近启动子基因表达保护性抗原的呼吸道合胞病毒疫苗”的2000年6月23日Krempl等的美国专利申请(案卷号015280-424000US)，在此引用作为参考)。特别的，G和F基因可被单独或以串联形式，移动到相对于其野生型座位更靠近启动子的位置。这两个蛋白通常占据RSV基因次序(NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L)中7(G)和8(F)处。在SH基因缺失的RSV中进行模式的移动突变，以增加成功回收的可能性(Whitehead等，J.Virol.733438-42，1999)。这促进回收，因为该病毒在体内产生较大的噬斑。(Bukreyev等，J.Virol.718973-82，1997，在此引用作为参考)。然后将G和F基因单独移动到位置1，或一同移动到位置1和2。令人惊讶地，当G或F基因移动到位置1，或一同移动到位置1和2时，重组RSV可以很容易地回收。
在两个高度减毒的候选疫苗(其中NS2基因自身缺失，或NS1和NS2基因被同时缺失)中也得到用于引入表达细胞因子的RSV中的相似广泛的基因排序的修饰。这两种候选疫苗中，G和F糖蛋白被一同移动，分别移动到位置1和2，而G、F和SH糖蛋白从其最初的下游位置处缺失。因此回收的病毒G1F2/ΔNS2ΔSH和G1F2/ΔNS1ΔNS2ΔSH除了G和F基因的移动外，分别有两个和三个基因的缺失。为了表明参与改变的程度，可以比较野生型RSV(NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L)和G1F2/ΔNS2ΔSH(G-F-NS1-N-P-M-M2-L)或ΔNS1ΔNS2ΔSH(G-F-N-P-M-M2-L)的基因次序。这表明大多数或所有基因相对于启动子的位置都发生了改变。这些高度减毒的衍生物仍保持其在细胞培养中生长的能力。
本发明其它更详细的方面，被修饰为表达免疫调节分子的重组RSV被用做其它病原的保护性抗原的“载体”，特别是如副流感病毒(PIV)的呼吸道病原。例如，被修饰为编码细胞因子的重组RSV可被工程化引入编码来自PIV的保护性抗原的序列。PIV cDNA的克隆化和作为本发明补充的描述在以下文献中表述名为“从克隆的核苷酸序列制备副流感病毒疫苗”的1998年5月22日的美国专利申请09/083,793(相应于国际申请WO98/53078)，和其优先权1997年5月23日的美国临时专利申请60/047,575；名为“减毒人-牛嵌合副流感病毒疫苗”的1999年7月9日Bailly等的美国专利申请(案卷号015280-399000)，以及名为“通过缺失或消除非必需基因而减毒的人-牛嵌合副流感病毒疫苗”的1999年7月9日Durbin等的美国专利申请(案卷号015280-394000)，分别在此引用作为参考。这些公布包括对可用于产生感染性PIV病毒克隆或提供用于本发明的PIV基因或基因组区段来源的以下载体的描述p3/7(131)(ATCC97990)；p3/7(131)2G(ATCC97989)；p218(131)(ATCC97991)；遵循布达佩斯条约，各材料保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，USA，并给出以上的保藏号。
根据本发明这一方面，提供了这种被修饰为表达免疫调节分子的重组RSV，其包含至少一种PIV序列，例如一种包含来自PIV1和PIV2中任一或二者，或PIV1和PIV3中任一或二者的多核苷酸。RSV的单个基因可能被人PIV的对应部分所替代，如PIV1，PIV2，或PIV3的F糖蛋白基因。或者，一个选择的异源基因组区段(如，编码一个免疫原蛋白的胞质尾，跨膜结构域或胞外域的基因组区段)可能替代例如RSV中同一基因的，或RSV中不同基因内，或RSV基因组或反基因组非编码序列内对应的基因组区段。一个实施方案中，HPIV3 F基因的一个基因组区段替代对应的人RSV基因组区段，产生编码嵌合蛋白的构建体，这种嵌合蛋白如具有RSV胞质尾和/或跨膜结构域与PIV胞外域融合的融合蛋白，以产生新的减毒病毒，和/或同时抗PIV和RSV的多价疫苗。或者，一个或更多PIV基因或基因组区段可以被添加到部分或完整的嵌合或非嵌合的RSV基因组或反基因组中。
异源基因可以被整体或部分地添加到该背景基因组或反基因组中，以构建本发明使用的嵌合RSV。对于由替代产生的嵌合体，编码人或牛RSV蛋白或蛋白区域(如胞质尾，跨膜结构域或胞外域，表位或区域，结合位点或区域，活性位点或具有活性位点的区域)的选择的基因或基因组区段替代背景RSV基因组或反基因组中对应的基因或基因组区段，产生与相应的野生型(或突变亲本)RSV株相比，具有所期望表型改变的新重组体。此处所述“对应”基因或基因组区段指不同RSV来源的对应的多核苷酸，其编码同源或等同的蛋白或蛋白结构域，表位，或氨基酸残基，或其代表同源或等同的顺式作用信号，顺式作用信号包括但不限于不同RSV亚型或株中的种间和等位变体。
其它实施方案中，表达细胞因子的RSV被用做携带异源抗原决定簇的载体，其包含非RSV病原如人副流感病毒(HPIV)的一个或更多抗原决定簇。一个模式实施方案中，编码一个或更多HN和/或F糖蛋白或其抗原结构域、片段或表位的一个或更多HPIV1、HPIV2或HPIV3基因被添加或引入部分或完整的HRSV载体基因组或反基因组中。更详细的实施方案中，一个具有HPIV1，HPIV2，或HPIV3 HN或F基因读码框(ORF)的转录单位被添加或引入该嵌合的HRSV载体基因组或反基因组中。
本发明cDNA、载体和病毒颗粒中引入的突变可以单独引入，也可以组合引入被修饰为编码细胞因子或其它免疫调节因子的RSV中，并且具有这些引入突变的被拯救病毒的表型可以很容易地确定。模式实施方案中，减毒的生物学来源的病毒与野生型RSV比较，其表现的氨基酸改变(如cpRSV和tsRSV显示的改变)被组合地引入表达细胞因子的重组RSV中，以产生用于疫苗的期望的减毒水平。
本发明因此提供了修饰为表达细胞因子或其它免疫调节因子的重组RSV，以及新的载体和病毒颗粒，其具有以选择的组合引入该重组基因组或反基因组中的多种表型特异性突变，获得适当减毒的感染性病毒或亚病毒颗粒。这一过程，与常规的表型检测联合，提供具有期望表型特征的重组RSV，如具有减毒，温度敏感，改变的免疫原性，冷适应，小噬菌斑，宿主范围限制等。由此检出的突变可集合成一个“菜单”，并以各种组合引入，使疫苗病毒调整到所选择的减毒、免疫原性和稳定性水平。
本发明其它方面，被修饰以表达细胞因子或其它免疫调节因子的RSV，有或无减毒突变，被构建具有额外的核苷酸修饰，以产生期望的表型、结构或功能的变化。典型的，这种选择的核苷酸修饰将特定产生表型变化，如生长特性，减毒，温度敏感，冷适应，噬菌斑大小，宿主范围限制或免疫原性的变化等。文中的结构变化包括在编码cDNA的RSV内引入或消除限制性位点，以便于操作和检测。
优选的实施方案中，表达细胞因子或其它免疫调节因子的RSV重组基因组或反基因组中核苷酸改变包括，基因部分或完全缺失，或基因表达被降低或消除(剔除)引起的病毒基因的修饰。文中突变的靶基因包括附着蛋白(G)，融合蛋白(F)，小疏水蛋白(SH)，RNA结合蛋白(N)，磷蛋白(P)，大聚合酶蛋白(L)，转录延伸因子(M2 ORF1产物)，转录/翻译调节蛋白(M2 ORF2产物)，基质蛋白(M)，和两个非结构蛋白NS1和NS2的编码基因。这些蛋白中任何一个都可被整体或部分地，单独或与其它期望的修饰组合，被缺失，替代或重排，以获得新的RSV重组体。
本发明一个方面中，一个SH，NS1，NS2，或G基因或M2 ORF2在表达细胞因子或其它免疫调节因子的重组病毒中被修饰。例如，这些基因中任何一个都可被整体或部分地缺失，或其表达(因引入的终止密码子或移码突变，或转录、翻译起始位点的改变)被降低或消除，改变所获得的重组克隆表型，改善其生长，减毒，免疫原性或其它期望的表型特征。例如，在重组基因组或反基因组中缺失SH基因将产生具有新表型特征的候选疫苗，如在体外生长增强，和/或在体内减毒。相关方面中，SH基因的缺失，或其它选择的非必需基因或基因组区段(如NS1或NS2基因)的缺失，被单独或与一个或多个其它特定于减毒表型的突变(如直接来源于生物学来源的减毒RSV突变体中的点突变，或以修饰的形式，如在特定于该突变的密码子内引入多个核苷酸的变化)组合，构建于表达免疫调节因子的病毒中。例如，SH，NS1，NS2，或M2-2基因缺失可以与源于cpts248/404，cpts530/1009，cpts530/1030或其他选定突变RSV株的一个或多个cp和/或ts突变组合，产生重组RSV，由于组合了不同突变的效果，其表现病毒产量增加、减毒增强、免疫原性提高和对减毒表型回复的遗传抗性。
本发明重组RSV中的其它核苷酸修饰包括该重组基因组或反基因组中一个选定基因的顺式作用调节序列的缺失、插入、添加或重排。一个例子中，一个RSV基因的顺式作用调节序列被改为相应的异源调节序列，其可以是不同RSV中相同基因的对应顺式作用调节序列，也可以是不同RSV基因的顺式作用调节序列。例如，基因末端信号可以经转变或替代而修饰为相同RSV株不同基因的基因终止信号。其它实施方案中，核苷酸修饰可能包括该重组基因组或反基因组中一个翻译起始位点的插入，缺失，替代或重排，如消除蛋白所选择形式的其它翻译起始位点。一个例子中，RSV G蛋白分泌形式的翻译起始位点被消除，从而改变这种形式G蛋白的表达，因此在体内产生了期望的效果。其它实施方案中，经微复制子或感染病毒的经验性分析发现的突变也可以被引入(参见，如Kuo等，J.Viro.714944-4953，1997；Whitehead等，J.Viro.733438-3442，1999；在此引用作为参考)。
本发明的相关方面，提供了产生表达细胞因子或其它免疫调节分子的分离的感染性重组RSV的组合物(如具有RSV编码cDNA的分离的多核苷酸或载体)和方法。本发明的这些方面中包括了包含具有修饰为编码免疫调节分子的RSV基因组或反基因组的新的一个或更多分离的多核苷酸分子和载体。也提供了具有编码N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白的分离的多核苷酸分子的相同或不同的表达载体。这些蛋白也可以直接由基因组或反基因组cDNA表达。载体优选在细胞或无细胞裂解液中表达或共表达，从而产生感染性RSV病毒粒子或亚病毒颗粒。
由以上产生被修饰为表达细胞因子或其它免疫调节分子的RSV的方法和组合物可获得感染性病毒粒子或亚病毒颗粒，或其衍生物。感染性病毒相当于天然的RSV毒粒，并有同样的感染性。可直接感染新鲜细胞。感染性亚病毒颗粒典型的是病毒粒子的一个亚成分，在适当条件下可引发感染。例如，具有基因组或反基因组RNA和N、P、L和M2(ORF1)蛋白的核壳是亚病毒颗粒的一个范例，当其进入细胞质中，可以引发感染。本发明提供的亚病毒颗粒包括缺少一个或多个蛋白质、蛋白质区段或其它病毒成分的病毒粒子。
其它实施方案中，本发明提供了含有一种具有包含上述被修饰编码免疫调节分子的RSV基因组或反基因组的经分离的多核苷酸分子的表达载体，和具有包含编码RSV N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白的分离的一个或更多多核苷酸分子的(与前一个相同或不同的)表达载体的细胞或无细胞裂解液。这些蛋白质中的一个或更多个也可以从基因组或反基因组cDNA表达。表达后，基因组或反基因组和N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白组合产生感染性RSV病毒粒子或亚病毒颗粒。
本发明的重组RSV以各种组合物形式用于在对RSV敏感的宿主中产生期望的抗RSV免疫反应。本发明减毒RSV能在感染的哺乳动物宿主中诱导保护性免疫应答，且足够地减毒，不会在免疫化宿主中引发不可接受的严重呼吸道疾病的症状。减毒的病毒或亚病毒颗粒可能存在于细胞培养物的上清中，从培养物中分离，或部分或完全纯化。病毒也可以冷冻干燥，根据需要与多种其他成分组合以储藏或给药宿主。
本发明进一步提供了新疫苗，其包含一种生理上可接受的载体和/或佐剂，以及修饰为表达细胞因子的分离的RSV病毒粒子或亚病毒颗粒。优选实施方案中，该疫苗包含具有至少一个，优选两或多个减毒突变或以上所述的其它核苷酸修饰的被修饰为编码细胞因子的突变RSV，使减毒和免疫原性达到合适的平衡。疫苗配制为每剂103-106PFU或更多的减毒病毒。该疫苗病毒可能诱导抗单RSV株，或抗抗原亚型如A或B，或抗多RSV株或亚型的免疫应答。这方面，本发明重组RSV在制剂中可与具有不同免疫原特性的其它PIV疫苗株或亚型组合，更有效地抗一种或多种RSV株或亚型。
在相关方面，本发明提供了在哺乳动物中刺激免疫系统，以诱导抗RSV免疫应答的方法。该方法包含以足够的免疫量，给药存在于生理上可接受的载体和/或佐剂中的修饰为表达细胞因子或其它免疫调节分子的RSV制剂。一个实施方案中，免疫原组合物是包含具有至少一个，优选两或多个，减毒突变或以上所述的其它核苷酸修饰的，修饰为表达细胞因子的RSV疫苗。疫苗配制为每剂103-106PFU，或更多的减毒病毒。该疫苗病毒可能具有诱导抗单RSV株，或抗抗原亚型如A或B，或抗多RSV株或亚型的免疫应答。本发明RSV重组体也与具有不同免疫原特征的RSV组合于疫苗混合物中，或在协同治疗方案中分别给药，诱导抗一种RSV株，或抗抗多RSV株或亚型更有效的保护。优选的，免疫原组合物通过喷洒、滴入或气雾剂给药于上呼吸道。该组合物经常给药对RSV抗体血清反应阴性的个体，或具有经胎盘获得的母体抗RSV抗体的个体。
附图简述

图1显示被修饰为表达鼠IFNγ的重组RSV干扰素γ(rRSV/mIFNγ)嵌合基因组的构建。mIFNγ的cDNA(矩形阴影部分，用小写字母显示了两端的起始和终止密码子)的XmaI片段被修饰，侧翼为RSV基因起始和末端信号。这个转录盒被插入预先插入了8个核苷酸的XmaI接头(黑体斜体)的反基因组cDNA中G-F基因间隔区的唯一的StuI位点(StuI位点的两半，AGG和CCT，被下划线)，XmaI位点下划线。
CCCGGGATGGGGAAATAATG(SEQ ID NO.5)；TGAAGTTATTAAAAATTCCCGGG(SEQ ID NO.6)；AGGCCCCGGGGCCT(SEQ ID NO.7)。
图2显示rRSV/mIFNγ，rRSV/CAT(包含一个氯霉素乙酰转移酶基因)，和wt RSV在HEp-2细胞中的生长动力学。细胞单层被以2PFU/每个细胞感染(每个病毒两份重复)，在指定的时间点取200μl的上清，调整使其包含100mM硫酸镁和50mM HEPES缓冲液(pH7.5)，快速冷冻并储存在-70℃直到测定效价。每份上清都替代以等量的新鲜培养基。每个单步生长曲线代表两个感染细胞单层病毒效价的平均。感染wt RSV的单层细胞在感染后72小时有超过90％被破坏(*)，而rRSV/mIFNγ或rRSV/CAT感染的细胞几乎无损，显示嵌合病毒在体外的减毒。
图3表明感染了rRSV/mIFNγ或rRSV/CAT的HEp-2细胞培养液体中累积mIFNγ的动力学。细胞单层被以2PFU/每个细胞感染(每个病毒两份重复)，在指定的时间点取样品，使用Quantikine M小鼠IFNγ免疫分析(R&D系统，MN)，经ELISA确定各样品中mIFNγ的含量。
图4表明病毒在鼻内接种了106PFU rRSV/mIFNγ、rRSV/CAT或wt RSV的BALB/c小鼠上和下呼吸道中复制的动力学。各组中5只小鼠在指定日处死，取出鼻甲和肺组织，并匀浆，通过对单个组织样品的噬菌斑分析确定感染性病毒的浓度。显示了具有标准偏差的每克组织的平均log10效价。并表示了病毒在上和下呼吸道中的检测极限。
图5显示用核酶保护分析检测肺mIFNγ、IL-2 p40和L-32(管家基因)mRNA的存在。小鼠(各组5只)分别被鼻内接种单独的培养基(模拟)或每只动物接种106PFU rRSV/mIFNγ或wt RSV。免疫后4天，取出肺，纯化总RNA。RNA与放射性RNA探针(由mCK-2B模板系统合成，PharMingen RiboQuant Multi-Probe RNase ProtectionAssay System)杂交，用核酶A处理，纯化，在5％变性丙烯酰胺凝胶中电泳。显示了具有被保护种(相应于指定的mRNA)的凝胶区域的放射自显影图。对三个mRNA各采取不同的暴光时间。正常鼠RNA和酵母被用做附加的阴性对照。
图6显示rRSV/mIFNγ或wt RSV初次感染，并且后来被wt RSV攻击后，小鼠肺中细胞因子mRNA的水平。小鼠分别被鼻内接种每只动物106PFU的rRSV/mIFNγ，wt RSV或单独的培养基。免疫后1或4天，处死各组的5只动物，分离肺RNA。其它被免疫的动物在第28天接受106PFU wt RSV的攻击，在第29或32天分别从各组的5只动物中分离总肺RNA。选定细胞因子mRNA的累积用图5注解中的核酶保护分析(PharMingen，CA，模板组mCK-1和mCK-2B)检测。各mRNA的放射活性用磷光成像分析量化，减去背景，各值以放射活性相对于L-32管家基因mRNA的百分比表示，显示为5只动物的平均，并附加标准偏差。没有指定细胞因子可检测的mRNA的样品用星号表示。
图7显示了rRSV/mIL-2的基因组图谱。mIL-2 ORF的cDNA，(其翻译起始和终止位点以黑体表示)经PCR修饰，侧翼为RSV特异的基因起始和基因末端转录信号(框内)，以及XmaI位点(下划线)。得到的mIL-2转录盒利用先前引入其中的XmaI位点，被插入G和F基因间隔区(Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996，在此引用作为参考)。CCCGGGATGGGGCAAATATG(SEQ ID NO.9)；TAAAGTTATTAAAAATTCCCGGG(SEQ ID NO.10)。
图8显示表明rRSV/mIL-2、rRSV/CAT和wt RSV在BALB/c小鼠上(鼻甲)下(肺)呼吸道中的复制。动物分别在鼻内接种106PFU指定的病毒。各组中5只小鼠在指定日处死，取出鼻甲和肺，通过噬菌斑分析确定病毒的效价。数据显示了具有标准偏差的病毒平均浓度(log10PFU/g组织)。斯氏t检验表明rRSV/mIL-2与wt RSV相比效价降低是统计学显著的鼻甲第3天，P＜0.01，第4天，P＜0.02，第5天P＜0.1；肺第3天P＜0.05，第4天P＜0.05，第5天P＜0.001。
图9显示感染了每只动物106PFU的rRSV/mIL-2或wt RSV或仅接受到培养基(模拟)的小鼠中肺中IL-2，IFNγ，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-13和IL-12 p40的mRNA累积。免疫后1和4天，处死4或5 只小鼠，分离肺的总RNA，用前述方法(Bukreyev等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.962367-2372，1999)进行RNA酶保护分析，并利用RiboQuant Multi-Probe RNAse Protection Assay System(PharMingen)和两套不同的探针模板，即mCK-1和mCK-2B。分别对每只小鼠进行分析，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测出的各被保护种进行磷光成像定量分析，以本样品中L-32管家基因mRNA量的百分比表示，显示了每组每天的平均值，并附加标准偏差。注意各y轴有不同的刻度。
图10是表达IL-4(IL4 PE)或IFNγ(IFNγ FITC)的CD4+淋巴细胞的流式细胞计数分析点状图。小鼠感染了106PFU wt RSV(左图)，rRSV/mIL-2(中图)或仅受模拟感染(右图)。10天后处死动物，收集肺CD4+细胞，流式细胞计数分析。以每个图显示了CD4+细胞在三个象限中的百分比。各图代表来自单个鼠的细胞。
图11显示了rRSV/mGMCSF的基因组图谱。mGM-CSF的cDNA，(其翻译起始和终止位点以黑体表示)经前述的限制性片段替代所修饰，侧翼为RSV特异的基因起始和基因末端转录信号(框内)以及XmaI位点(下划线)。得到的mIL-2转录盒利用先前引入其中的XmaI位点，被插入G和F基因间隔区(Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996；在此引用作为参考)。
AGTTACTTAAAAACATATTATCACAAAAGGCCCCGGGGCCTTGACCAAACTTAAACAGAATCAAAATAAACTCTGGGGCAAAT(SEQ ID NO.8)；CCCGGGATGGGGCAAATATG(SEQ ID NO.9)；TAAAGTTATTAAAAATTCCCGGG(SEQ ID NO.10)。
图12显示rRSV/mGMCSF、rRSV/CAT和wt RSV在HEp-2细胞中的生长动力学。细胞单层被以2PFU/每个细胞感染(每个病毒两份重复)，在指定的时间点取出200μl的培养基并替换。样品快速冷冻，以后利用噬菌斑分析测定感染性病毒的效价。显示了各时间点两个细胞单层的平均。
具体实施方案的说明本发明提供了被工程化表达一个或更多免疫调节分子的分离的感染性重组RSV(rRSV)，以改善该重组RSV候选疫苗治疗或预防RSV感染的作用。该重组病毒具有包含编码一个或更多免疫调节分子的多核苷酸序列的修饰的基因组或反基因组。
各种细胞因子和其它免疫调节分子可引入本发明重组RSV中，以使其在感染细胞中被表达，并改变病毒生物性状的一个或多个方面，如感染性、复制、病原性和/或改变一种或多种宿主免疫应答，如抗RSV中和抗体应答、辅助T细胞应答、细胞毒T细胞(CTL)应答和/或自然杀伤(NK)细胞应答。该免疫调节分子包括细胞因子，或其它任何免疫调节分子，如趋化因子或细胞因子拮抗剂，酶(如氧化氮)，表面或可溶性受体，附着分子，配基等。当引入并在本发明重组病毒中表达时，该细胞因子，或其编码多核苷酸可以改变，即增加、降低，或增强病毒生物性状的方面和/或宿主对RSV的免疫应答。
本发明基本的方面中，提供了从重组RSV中细胞内共表达多种免疫调节蛋白(天然存在或由重组DNA技术工程化)中任何一种。这些调节分子典型地影响造血细胞，或阻断造血细胞与其环境(包括感染的病毒)间的信号和相互作用。许多分子适用于以这种方式表达。例如，作为可溶信使的蛋白，或作为拮抗或隔绝可溶信使的蛋白，或与免疫系统的细胞相互作用的蛋白。分子包括细胞因子/趋化因子的各成员，包括白介素、干扰素和趋化因子的各个亚族、集落刺激因子(CSF)、某些分子如Flt3配基以及其它调节造血细胞的分子。可用于本发明的细胞因子和趋化因子可在以下参考文献中找到细胞因子手册(The Cytokine Handbook)，A.Thomson(ed.)，学术出版社，SanDiego，1998；和细胞因子(Cytokiness)，A.Mire-Sluis和R.Thorpe(eds)，学术出版社，San Diego，1998，在此引用作为参考。
本发明使用的合适的细胞因子和趋化因子包括但不局限于IL-1α和β、IL-2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。也包括γ干扰素(IFNγ)和其它干扰素，如干扰素α、β、ω。本发明重组病毒中使用的其它分子包括肿瘤坏死因子(TNF)和其相关的配基和受体，包括Fas配基(CD95)、CD40配基，以及近来报道的B细胞刺激BlyS蛋白(Moore等，Science 285260-263，1999)。其它分子包括Flt3配基。文中指出，如Flt3和CD40的配基应在感染细胞的表面表达，可改变或增强感染细胞的免疫识别。如Flt3的配基可被工程化引入重组RSV粒子的包膜中，可改变病毒的趋向性，在该例中靶向树状细胞。
本发明重组RSV病毒中使用的其它免疫调节分子包括集落刺激因子(CSF)，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和干细胞因子。模式趋化因子包括CXC组(其包括IL-8、γ-INF诱导的单核因子(Mig)、细胞因子应答基因2(Crg-2))(Mahalingam等，J.Virol.731479-1491，1999)、血小板因子-4(PF-4)、嗜中性白细胞活化蛋白-2(NAP-2)、黑体瘤生长刺激活性(GRO)α、β和γ、上皮细胞衍生的嗜中性白细胞吸引剂-78(ENA-78)、粒细胞趋化蛋白-2(GCP-2)、诱导IFNγ的蛋白10(IP-10、基质细胞衍生因子1(SDF-1)α和β。第二组趋化因子，C趋化因子，包括淋巴趋化因子(lymphotactin)。近来了解的第三组，CC趋化因子，包括eotaxin、单核趋化蛋白(MCP)1、2、3、4和5、RANTES(regulated on activation，normal T-cell expressed and secreted)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)1α和β以及胸腺和激活调节趋化因子(TARC)。
其它有用的免疫调节分子包括细胞因子拮抗剂，如天然存在的分泌型IL-1受体拮抗剂(Aredn等，Ad.Immunol.54167-227，1993，在此引用作为参考)，其结合受体因此封闭它而不激活。其它例子包括肿瘤坏死因子(TNF)受体胞外结构域和IgG的恒定区之间遗传工程化的融合蛋白，其可结合并隔绝可溶性TNF(Fisher等，N.Eng.J.Med.3341697-1702，1996)。第三例是隔绝IL-1的重组IL-1受体(Takebe等，J.Interferon Cytokine Res.18321-326，1998，在此引用作为参考)。其它适合在rRSV中表达的细胞因子/趋化因子拮抗剂包括，如衍生自完整分子的肽，如针对IL-1的(Palaszynski等，Biochem.Biophys.Res.Commun.14724-209，1987，在此引用作为参考)，或对功能必需的残基定点诱变后产生的灭活形式，如针对TNF的(von Feldt等，Immunol.Res.1396-109，1994，在此引用作为参考)。其它分子包括各种源于病毒的类似物和调节分子。因此，显示大量的多肽免疫调节分子，均可用于在本发明重组RSV中插入以进行表达，并在啮齿类或灵长类动物和临床实验中直接检测其对免疫原性，疗效和疾病的效果。
病毒基因组或反基因组被修饰，引入编码细胞因子或其它免疫调节分子的多核苷酸，以构建工程化表达免疫分子的重组RSV，该多核苷酸一般作为具有自身基因起始(GS)和终止(GE)信号的单独的基因被添加。一般，编码免疫调节分子的多核苷酸序列添加或替代入重组RSV基因组或反基因组中的基因间隔区或其它非编码区，在任何适当的不破坏该基因组或反基因组中读码框的位点。典型的，编码免疫调节分子的多核苷酸序列作为额外的基因引入重组基因组或反基因组，尽管也可能该基因组或反基因组中的非编码元件被去除，且编码细胞因子的多核苷酸替代其缺失的位置处。
典型的，构建被修饰为编码细胞因子或其它免疫调节分子的本发明重组RSV需要将编码细胞因子的多核苷酸添加或替代在该基因组或反基因组中选择的位置。细胞因子或其它免疫调节分子的表达水平可以通过改变编码细胞因子的多核苷酸在该基因组或反基因组中的排列位置进行调整。例如，编码细胞因子的多核苷酸可被引入任何RSV基因的基因间隔区或非编码区。编码细胞因子的多核苷酸的引入可以选择在相对于这些基因或ORF更接近或远离启动子的位置，分别增强或降低该细胞因子或其它免疫调节分子的表达。
此处所述“RSV基因”一般指RSV基因组编码mRNA的部分，典型的在上游末端以10核苷酸的基因起始(GS)信号开始，在下游末端以12-13核苷酸的基因末端(GE)信号终止。本发明中使用的RSV的10个这种基因是NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2和L。术语“基因”，在此也用做“翻译读码框(ORF)”。ORF更具体的定义是编码重要RSV蛋白的翻译读码框，现在已发现11个NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2-1(或M2(ORF1))、M2-2(或M2(ORF2))和L。因此术语“基因”可互换地指编码亚基因组RNA的基因组RNA序列，指一个ORF(后者特别用于RSV M2基因的情况，其中一个单mRNA含有编码不同的蛋白的两个重叠ORF)(Collins等，J.Gen.Virol.713015-3020，1990；Bermingham和Collins，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9611259-11264，1990；Ahmadian等，EMBO J.192681-2689，2000；Jin等，J.Virol.7474-82，2000；分别在此引用作为参考)。术语“基因”在文中确定基因相对于启动子位置时，该术语一般局限于指以转录基因起始和基因末端信号基元为边界的mRNA编码序列(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.834594-4598，1986；Kuo等，J.Virol.706892-6901，1996；分别在此引用作为参考)。
“基因组区段”指来自RSV基因组的任意长度的连续核苷酸，可能是ORF的一部分，基因或一个基因外区域或其组合。
在RSV中插入异源基因，包括编码免疫调节因子的基因的其它方法是，将cDNA置于如上所述的RSV基因起始和末端信号控制之下，插入该cDNA使基因从反基因组而非从基因组中表达。优选的，外源基因放置于紧邻反基因组3’末端启动子下游，这种靠近启动子的位置保证其高水平表达。这种方式在狂犬病病毒中有过说明，异源氯霉素乙酰转移酶基因被放置于反基因组的链中，此外该反基因组的启动子被基因组的所替代(Finke和Conzelmann，J.Virol.717281-7288，1997，在此引用作为参考)。但RSV反基因组的启动子可有效地指导转录，所以一般不需要替换反基因组的启动子。事实上，我们构建了其中异源基因由反基因组表达的微复制子。
表达异源基因的其它方法是，将基因的ORF置于哺乳动物内部核糖体进入位点的控制下，将该ORF插入任何一个或多个RSV基因非编码区下游。这种方式在流感病毒中有过说明(Garcia-Sastre等，J.Virol.686254-6261，1994，在此引用作为参考)。这导致mRNA的表达，其中mRNA 5’末端的真正的病毒ORF未受干扰，下游非编码区具有因内部核糖体进入而表达的异源ORF。或者，下游ORF可放置于可被核糖体终止-重新开始所接触到的位置(Horvath等，EMBOJ.92639-2674，1990，在此引用作为参考)。
表达的其它方法是通过构建嵌合或融合蛋白。例如，期望将表达于感染细胞和毒粒表面的蛋白胞外域可以添加于SH ORF的下游，从而阅读框不受干扰并产生嵌合蛋白。以这种方式，SH部分提供信号和膜锚点，该C末端附着的结构域被显示于细胞外。这种方式是基于发现SH在免疫预防中并非重要抗原，在体外和体内的有效复制中非必需。这种方式特别适合这种情况当如Flt3之类的配基在毒粒表面表达，以使病毒靶向表达Flt3的细胞，即树状细胞。不过其它病毒基因也可以用于构建嵌合蛋白。例如，G蛋白的C末端可容易地缺失或插入，因此可以容纳异源多肽成分。此外，任何RSV基因都可以第二拷贝插入，由此在构建嵌合蛋白时的蛋白功能失活变得可以忍受。
本发明其它实施方案中，重组病毒修饰为编码多于一种的免疫调节分子，如多种细胞因子或者一种细胞因子和一种趋化因子，以提供更好的表型特征。其它方面中，多于一种的RSV被工程化，分别表达一种不同的细胞因子，如一种细胞因子增强CTL应答，另一种细胞因子增强NK应答，这些不同种的病毒可以同时或在协调的治疗方案中给药，以增强疫苗的有效性。
RSV一般定义为副粘病毒科中的有包膜的非区段化负链RNA病毒(Collins等，Fields Virology 21313-1352，1996，在此引用作为参考)。其基因组，在常见的A2株中为15,222个核苷酸，转录出10个先前显示为编码10个蛋白的信使RNA(Collins等，Fields Virology 21313-1352，1996；Atria等，J.Virol.721452-1461，1998；Bukreyev等，J.Virol.718973-8982，1997；Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9381-85，1996；Ten和Collins，J.Virol.725707-5716，1998；Ten和Collins，J.Virol.73466-473，1999Whitehead等，J.Virol.733438-3442，1999，分别在此引用作为参考)。
近来发现的4个RSV蛋白是核壳/聚合酶蛋白，即，主要核壳蛋白N、磷蛋白P、聚合酶蛋白L和转录抗终止蛋白M2-1(M2基因第一个读码框(ORF)编码的)。这些蛋白中3个是表面糖蛋白，即附着G蛋白，在穿透和形成合胞中作用的融合F糖蛋白，以及未知功能的小疏水蛋白SH。基质蛋白M是参与毒粒形成的内在毒粒蛋白。非结构蛋白NS1和NS2未知功能。G和F蛋白是主要的中和和保护性抗原(Collins等，Fields Virology 21313-1352，1996；Connors等，J.Virol.661277-1281，1992)。对RSV再次感染的抗性主要由特定抗这些蛋白的血清和粘膜抗体介导。RSV感染也诱导RSV特异的细胞毒T细胞，并可以导向多种不同蛋白，但没有证据表明该效应物主要作用是赋予对再次感染的长期抗性。但CD8+和CD4+细胞可以在调节免疫应答中有重要作用，都参与病毒的致病性(Johnson等，J.Virol.722871-2880，1998；Srikiatkhachorn和Braciale，J.Exp.Med.186421-432，1997)。因此F和G是最重要的抗原决定簇，但其它蛋白也参与免疫应答。
最后，M2 mRNA第二个ORF编码一种RNA调节分子M2-2。这种在其它副粘病毒和rhabdovirus中未发现的M2-2 mRNA包含两个重叠的各表达一种蛋白的翻译读码框(ORFs)(图1A)(Collins等，J.Gen.Virol.713015-20，1990，在此引用作为参考)。上游ORF1编码作为毒粒成分的194个氨基酸的M2-1蛋白(Peeples等，Virology 95137-45，1979，在此引用作为参考)，也是促进转录链延伸并增加在基因连接处通读频率的抗终止因子(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9381-5，1996；Fearns和Collins，J.Virol.735852-5864，1999；Collins等，Virology 259251-255，1999；Hardy等，J.Virol.72520-6，1998；分别在此引用作为参考)。A2株的ORF2在密码子1、3、7处有三个潜在的起始位点，三者都和ORF1重叠(图1A)。其中第一位点的引发产生90个氨基酸的M2-2蛋白。M2 ORF2存在于目前已知的所有肺病毒中(Collins等，J.Gen.Virol.713015-20，1990；Ling等，J.Gen.Virol.731709-15，1992；Zamora等，J.Gen.Virol.73737-41，1992，分别在此引用作为参考)。M2 mRNA在无细胞体系中翻译出M2-1蛋白和一个分子大小与M2-2蛋白近似的11kDa蛋白(Collins等，J.Gen.Virol.713015-20，1990)。M2-2在模式的微复制子系统中的共表达对RNA的合成有强效的负调节效果(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9381-5，1996；Hardy等，J.Virol.72520-6，1998)。目前，在RSV感染细胞中发现作为非主要类别的RSV M2-2蛋白。因此，一些证据表明M2-2 ORF是第11个RSV基因。但对于ORF编码重要病毒的确定的证据包括，发现在感染性病毒中的该ORF的表达介导一种生物学效应。根据本发明的方法证明了M2-2的这一作用，即消除或缺失M2-2ORF的部分或全部，其后发现表型改变，包括对于RNA转录和复制间平衡的移动。尽管先前的研究暗示M2-2蛋白通常负调节转录和RNA复制，现在已知M2-2可以将RNA合成的平衡从转录移向复制(参见Collins等2000年7月9日的美国专利申请“包含M2 ORF2修饰的减毒呼吸道合胞病毒疫苗的产生”，案卷号015280-403100US，以及优先权美国临时申请60/143,097；Bermingham等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9611259-11264，1999；Jin等，J.Virol.7474-82，2000，分别在此引用作为参考)相应的，本发明其它方面，表达免疫调节分子的重组RSV中M2ORF2的表达被降低或消除。使M2 ORF2整体或部分缺失，或降低或消除M2 ORF2的表达的修饰，在得到的病毒或亚病毒颗粒中特定产生多种期望的表型变化。优选的实施方案中，M2 ORF2缺失和剔除突变体，与相应的野生型或亲本突变RSV株的生长相比，表现减弱的生长。例如在细胞培养时的生长，与相应的野生型或亲本突变RSV株相比，可以降低约2倍，经常是约5倍，优选约10倍或更高(如培养7-8天后测量)。更详细的方面，本发明重组RSV表现病毒生长延迟的动力学，与相应的野生型或亲本突变RSV株的生长动力学相比，其在最初2-5天时生长降低约100倍和多至1000倍或更多。这些期望的效果是M2 ORF2的表达降低或消除所赋予的。M2 ORF2蛋白合成的降低产生介于其间的效果。此外，因M2-2是调节蛋白，也可通过增加而非降低M2 ORF2的表达，使病毒生长和基因表达发生改变。如上所述，这可通过将M2 ORF2作为单独的基因表达，如需要，可将其移动到接近或远离启动子的位置表达，而容易地实现。
优选修饰该重组RSV基因组或反基因组，使M2 ORF2中有一个移码突变，或一个或更多终止密码子，从而降低或消除M2 ORF2的表达。本发明更详细的方面，诱导M2 ORF2产生特定的移码突变，即上述引用文献中的NdeI突变。NdeI突变中ORF2内的限制性位点在基因组8299处，该移码突变(加入两个核苷酸)位于预期90个氨基酸的蛋白的密码子47处。相应的，NdeI突变株(实例是重组的rA2-NdeI)编码与该移码突变所编码的18个异源氨基酸融合的M2-2N末端46个氨基酸。产生M2 ORF2剔除突变株的任选的移码突变可以容易地鉴定。
本发明其它更详细的方面，M2 ORF2剔除突变的第二个实例，K5突变，被引入表达细胞因子的RSV中，其通过将M2 ORF2中三个潜在的起始密码子改为ACG终止子，消除了M2 ORF2的表达。也可以在ORF1终止子后的每个寄存器(register)内加入一个终止子，使M2ORF2在密码子13处终止，以降低回复突变或非AUG起始的可能。文中M2 ORF2剔除突变株的实例是rA2-K5重组株(也称为rA2ΔM2-2)，在以上引用文献中有详细描述。破坏M2 ORF2表达或M2蛋白的表达或功能以产生减毒RSV候选疫苗的其它改变包括部分或完全缺失M2 ORF2编码序列整体或部分，以使M2蛋白部分或完全地丧失功能，或终止其表达。改变M2 ORF2表达水平的其它方法是改变其翻译起始位点或相对于上游ORF1的间隔。例如，M2 ORF2可作为单独的基因在基因组或反基因组的任何座位上表达，如将带有其自身基因起始和末端信号的M2 ORF2插入基因组或反基因组的基因间隔区或其它非编码区。这些有关M2 ORF2的操作范例可以被应用，以改变或消除本发明重组候选疫苗中其它RSV基因的表达。
如上所述，工程改造为表达免疫调节分子的本发明重组RSV具有发展疫苗所期望的表型特征。模式实施方案中，表达免疫调节分子的重组基因组或反基因组变化也产生具有一个或更多以下新特征的候选疫苗，选自(i)在细胞培养中病毒生长的改变，(ii)在感染宿主的上和/或下呼吸道中病毒减毒的变化，(iii)病毒噬菌斑大小的改变，和/或(iv)免疫原性的改变，或另外具有，或同时伴随有，与野生型或突变亲本RSV相比，诱导改变的宿主应答的能力，如增加抗RSV中和抗体应答、辅助T细胞应答、细胞毒T细胞(CTL)应答和/或自然杀伤(NK)细胞应答。
本发明优选的方面中，重组RSV高水平表达引入的细胞因子或其它免疫调节分子，如最高可达如感染组织培养细胞培养基中所测得的2.5μg/ml。这种重组病毒在体内和体外都减毒，同时也在接种个体中表现抗野生型RSV的高保护效率。其经过工程化，表达的病毒抗原量未减少，典型的是增加，同时也表现减毒表型。由于未降低或被增加的mRNA转录和抗原表达，其保存了免疫原的潜能，且通过RNA复制和病毒生长的同时降低达到了减毒。这一套新的表型特点对于发展疫苗是非常有利的。在被工程化表达免疫调节分子的重组RSV中的其它有利的表型改变包括与野生型或突变亲本RSV株相比，噬菌斑大小的改变和致细胞病变性改变。
其它优选的实施方案中，工程化表达免疫调节分子的重组RSV，与相应的野生型或亲本突变RSV株的生长相比，表现细胞培养时的病毒生长减弱和体内减毒。例如在细胞培养中的生长，与相应的野生型或亲本突变RSV株的生长和复制相比，可以降低约2倍，经常是约5倍，优选约10倍-约20倍或更高(如培养7-8天后所测得的)，并且在体内的复制也有相当程度的减弱。更详细的方面，本发明重组RSV表现病毒生长延迟的动力学，与相应的野生型或亲本突变RSV株的生长动力学相比，其在最初2-5天时生长降低约100-1000倍或更多。其它方面，该重组病毒的抗原表达增加。本发明最优选的实施方案中，工程化表达免疫调节分子的重组RSV显著减毒，同时具有高的免疫原性，可在接种宿主的体内诱导对RSV的高度保护性免疫应答。
本发明是用于开发表达免疫调节分子的活减毒RSV候选疫苗。这些重组病毒以cDNA中间体和基于cDNA的回收系统介导构建。从cDNA获得的重组病毒独立复制并以与生物学来源病毒相似的方式繁殖。本发明重组RSV可被进一步修饰，引入额外的减毒突变，以及多种其它突变和核苷酸修饰，以产生期望的结构和表型效果。
用于从cDNA获得重组RSV以及制造和检测此处作为本发明附加方面所述的全部突变和核苷酸修饰的材料和方法的详细描述，在以下文献中有详细说明1995年9月27日美国临时专利申请60/007,083；1996年9月27日美国临时专利申请08/720,132；1996年7月15日美国临时专利申请60/021,773；1997年5月9日美国临时专利申请60/046,141；1997年5月23日美国临时专利申请60/047,634；1999年11月30日美国专利5,993,824(相应于国际申请WO98/02530)；1999年4月13日Collins等的美国专利申请09/291,894；1999年4月13日Murphy等的美国临时专利申请60/129,006；Crowe等，Vaccine12691-699，1994；Crowe等，Vaccine 12783-790，1994；Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9211563-11567，1995；Bukrevev等，J.Virol.706634-6641，1996；Juhasz等，J.Virol.71(8)5814-5819，1997；Durbin，Virology 235323-332，1997；Karron等，J.Infect.Dis.1761428-1436，1997；He等，Virology 237249-260，1997；Baron等，J.Virol.711265-1271，1997；Whitehead等，Virology 247(2)232-239，1998a；Whitehead等，J.Virol.72(5)4467-4471，1998b；Jin等，Virology 251206-214，1998；Bukreyev等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.962367-2372，1999；Bermingham和Collins，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9611259-11264，1999；Juhasz等，Vaccine 171416-1424，1999；Juhasz等，J.Virol.735176-5180，1999；Teng和Collins，J.Virol.73466-473，1999；Whitehead等，J.Virol.739773-9780，1999；Whitehead等，J.Virol.73871-877，1999；Whitehead等，J.Virol.733438-3442，1999；为各种目的分别在此全文引用作为参考。
从cDNA获得重组RSV的模式方法包括细胞内共表达，典型的是从共转染到组织培养细胞中的质粒共表达RSV反基因组RNA和RSV N、P、M2-1和L蛋白。这引发有效感染，产生感染性cDNA来源的病毒，即重组病毒，一旦产生，重组RSV可容易地以与生物学来源的病毒相似的方式增殖，并且重组病毒和对应的生物学来源的病毒不易区分，除非前者被修饰为包含作为标记被引入的一种或多种变化。
从cDNA中获得感染性RSV的能力提供了通过cDNA中间体在感染性病毒中引入预先确定的改变的方法。显示这种方法可以产生多种感染性、减毒的RSV衍生物，例如那些候选重组疫苗，其具有病毒蛋白内一个或更多氨基酸替代，一个或更多基因的缺失或基因表达的消除，和/或顺式作用RNA信号中一个或更多核苷酸替代，对病毒表型产生期望的效果(参见Bukreyev等，J.Virol.718973-8982，1997；Whitehead等，J.Virol.724467-4471，1998；Whitehead等，Virology247232-239，1998；Bermingham和Collins，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9211259-11264，1999；Juhasz等，Vaccine.171416-1424，1999；Juhasz等，J.Virol.735176-5180，1999；Teng和Collins，J.Virol.73466-473，1999；Whitehead等，J.Virol.73871-877，1999；Whitehead等，J.Virol.733438-3442，1999；Collins等，Adv.Virus Res.54423-451，1999；分别在此引用作为参考)。
上面的内容说明了可用于本发明的诱变、分离和定性PIV以获得减毒突变株(如温度敏感(ts)、冷传代(cp)、冷适应(ca)、小噬斑(sp)和宿主范围限制(hr)突变株)的方法和步骤，以及鉴别特定产生该减毒表型的遗传变化的方法和步骤。与这些方法一致，前述文件详细说明了，在认可的模型系统中(包括鼠和非人灵长类动物模型系统)，确定生物学来源的和重组产生的减毒人RSV(包括人RSVA和B亚型)的复制、免疫原性、遗传稳定性和有效保护性的方法。此外，这些文件说明发展和检测用于预防和治疗RSV感染的免疫原组合物(包括单价和二价疫苗)的一般方法。
以上引用的文件中也说明了产生感染性重组RSV的方法，即，构建和表达编码RSV基因组或反基因组的cDNA并与必需的RSV蛋白基因共表达(参见1995年9月27日的美国临时专利申请60/007,083；1996年9月27日的美国专利申请08/720,132；1996年7月15日的美国临时专利申请60/021,773；1997年5月9日的美国临时专利申请60/046,141；1997年5月23日的美国专利申请60/047,634；1997年7月15日的美国专利申请08/892,403(相应于国际申请WO98/02530)；分别在此引用作为参考)。
也公布了构建和检测感染性重组RSV的方法，其被修饰以引入生物学来源RSV突变体中发现的表型特异性突变，如来自如下生物学来源RSV突变体中并引入重组RSV的cp和ts突变，所述生物学来源突变体命名如下cpts RSV 248(ATCC VR 2450)；cpts RSV 248/404(ATCC VR 2454)；cpts RSV 248/955(ATCC VR 2453)；cpts RSV 530(ATCC VR 2452)；cpts RSV 530/1009(ATCC VR 2451)；cpts RSV530/1030(ATCC VR 2455)；RSV B-1 cp52/2B5(ATCC VR 2542)；RSV B-1 cp-23(ATCC VR 2579)。由此产生的重组RSV可能包含一个，两个或多个来自相同或不同生物学来源RSV突变体(例如248/404，530/1009，或530/1030生物突变体中的一个或多个)的ts突变。后文中，多重减毒重组体可能具有来自两个，三个，或多个生物突变体中的减毒突变的组合，如来自RSV突变体530/1009/404，248/404/1009，248/404/1030，或248/404/1009/1030突变株的减毒突变的组合。模式实施方案中，一个或更多减毒突变特定产生在RSV聚合酶基因中氨基酸Phe521，Gln831，Met1169，或Tyr1321处的温度敏感替代，或在M2基因起始序列的温度敏感核苷酸替代。模式实施方案中，这些突变涉及到与生物学来源突变RSV的L基因中发现的一个或多个以下改变等同或保守的改变Ile替代Asn43，Leu替代Phe521，Leu替代Gln831，Val替代Met1169，Asn替代Tyr1321。
本发明近来发展的一个实施方案中，确定了除基因组前29个核苷酸(基因组3’末端)和后33个核苷酸(5’末端)外的RSV突变体cpts248/955的序列。将该序列与亲本cpts248的比较。突变病毒cpts248/955具有cpts248中发现的所有突变，还包含以下突变1.P基因末端信号核苷酸3236处插入A残基。这使多聚A序列由7个A增加到8个A。同样的插入在重组RSV rA2的病毒制备物中也出现，在小鼠体内不影响复制水平。2.因cpRSV核苷酸(nt)8626处由A改为U产生了L聚合酶蛋白氨基酸43处由Asn改为Ile。因此认为cpts248/955的表型由nt8626处错义突变所赋予。该结果与先前在RSV530，1030，1009和248突变中的结果一致。
其它可引入工程化表达免疫调节分子的重组RSV中的突变是在异源RSV或其它更远源的负链RNA病毒中发现的突变，如减毒突变。特别的，一个负链RNA病毒中发现的减毒或其它表型突变可以“转移”，如拷贝，到M2 ORF2缺失和剔除突变体基因组或反基因组内的相应位置。简述如下，一个异源负链RNA病毒中期望的突变被转移到RSV受体(例如人或牛RSV)。这包括在异源病毒中定位该突变，通过序列对比鉴别受体RSV中相应位点，将RSV受体的天然序列突变为该突变基因型(等同或保守突变)，在以下文献中进行了表述2000年4月12日的国际申请PCT/US00/09695，以及相应的优先权美国临时专利申请60/129,006，分别在此引用作为参考。如这些文献所述，优选修饰受体基因组或反基因组以使其在突变位点编码一种变化，其保守地相应于异源突变病毒中的变化。例如，如果突变病毒中相对于野生型序列的氨基酸替代标志突变的位点，则重组病毒相应残基处可工程化产生相似的替代。优选，该替代应包括与突变病毒蛋白中替代残基相同或保守的氨基酸。但对于突变蛋白中的替代残基，也可能非保守地改变突变位点的天然氨基酸(如利用任何其它氨基酸破坏或消弱野生型残基的功能)。在其中发现模式突变并将该突变转移于本发明重组RSV中的负链RNA病毒包括其它RSV(如鼠)、PIV、仙台病毒(SeV)、新城疫病毒(NDV)、猿猴病毒5(SV5)、麻疹病毒(MeV)、牛瘟病毒、犬瘟热病毒(CDV)、狂犬病病毒(RaV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)等。本发明使用的多种突变范例已经公开，包括但不限于RSV L蛋白521处苯丙氨酸的替代(相应于HPIV3 L蛋白456处苯丙氨酸替代)。在标志为缺失或插入的突变中，这些突变可以作为相应的缺失或插入，引入到重组病毒中。缺失或插入蛋白片段的大小和氨基酸序列可不一。
在前述引用的文献中表述了多种其它类型的突变，其可以容易地工程化引入本发明重组RSV中，调节减毒、免疫原性、和/或提供其它有利的结构和/或表型效果。例如，限制性位点标记可常规地引入重组反基因组或基因组中，以利于cDNA的构建和操作。前述引用的文献中也表述了除用于本发明的点突变或位点特异性突变外的多种核苷酸修饰。例如，公布了产生表达额外异源基因(如氯霉素乙酰转移酶(CAT)或荧光素酶基因)的重组RSV的方法和组合物。这种重组体一般表现与插入基因相关的生长降低。减毒随插入基因长度的增加而增加。异源基因插入重组RSV可降低其复制水平并在体外传代时稳定的这一发现，提供了使RSV减毒用于疫苗的另一有效方法。
前述引用的文献中表述的引入本发明重组RSV的其它核苷酸改变，包括一个或多个非必需(如对于复制和/或感染性而言)RSV基因或基因组区段部分或完全地缺失或消除。RSV基因或基因组区段可被缺失，包括RSV NS1，NS2，N，P，M，G，F，SH，M2 ORF1，M2 ORF2和/或L基因读码框和/或顺式作用调节序列的部分或完全地缺失。本发明这一方面中，可工程化核苷酸修饰，以使选择的基因缺失或沉默，获得在体外良好复制但在体内的复制降低的重组候选疫苗(Bukreyev等，J.Virol.718973-8982，1997；23]Teng等，J.Virol.73466-473，1999；分别在此引用作为参考)。例如，缺失SH导致病毒，即rA2ΔSH，在体外复制的效率与野生型rRSV(rA2)相当或略高，在小鼠和猩猩中略有减毒(Bukreyev等，J.Virol.718973-8982，1997；Whitehead等，J.Virol.733438-3442，1999；分别在此引用作为参考)。命名为rA2ΔNS2的缺失NS2基因的重组RSV在体外表现出降低的生长动力学和降低的感染性病毒产量，其在小鼠和猩猩中是显著减毒的(Teng等，J.Virol.73466-473，1999；Whitehead等，J.Virol.733438-3442，1999；分别在此引用作为参考)。相似的体外特性在NS2基因缺失的重组牛RSV中也有发现(Buchholz等，J.Virol.73251-259，1999；分别在此引用作为参考)。
一个例子中，重组RSV中SH基因表达的消除是因编码SH mRNA和蛋白的多核苷酸的去除。SH基因的缺失不仅产生可回收的感染性RSV，其也表现在组织培养中显著增加的生长，表现为感染性病毒产量和噬菌斑大小的改善。SH基因的缺失导致在组织培养中显著增加的生长，证明是发展工程化表达免疫调节分子的RSV疫苗病毒的有用工具，例如克服了RSV培养时产量低的问题。此外，这些缺失是高度稳定地抗遗传回复，使此来源的RSV克隆特别使用于疫苗制剂。
SH-负型(SH-minus)RSV重组体也在小鼠上呼吸道表现位点特异性减毒，这是发展疫苗的又一优势。某些正被检测用于活病毒疫苗的RSV株，如cp突变体，在组织培养中不表现显著改变的生长。这些是宿主范围突变，限制在猩猩和人呼吸道中的复制，在下呼吸道大约降低100倍。另一减毒突变的类型，ts突变，由于体温在呼吸道中从上到下的增加，倾向于优先限制在下呼吸道中的病毒复制。与cp和ts突变体相反，SH-负型突变RSV区别性的表型是在上呼吸道中更大的限制。这特别适合发展给药幼儿的疫苗病毒，因为在上呼吸道中复制的限制对于确保在脆弱年龄段人群的给药安全是必要的，该年龄段成员主要通过鼻呼吸。此外，任何年龄段中，病毒在上呼吸道中复制的限制可大大降低中耳炎的发病率。除了这些优点，SH缺失突变(涉及近400个核苷酸和全部mRNA的消失)的性质代表了非常难以回复的一类突变。
有关SH基因修饰的研究中还讨论了不同RSV(包括人和牛RSV)，以及其它肺病毒中SH基因的比较，以提供其他产生有用RSV重组疫苗的方法和工具。例如RSV的两个抗原亚型，A和B，在某些SH结构域表现非常高的保守性。两个这种结构域中，RSV A和B的N末端区域和可能的跨膜结构域在氨基酸水平表现84％的同一性，而C末端可能的胞外域差异较大(约50％的同一性)。对人RSV B亚型的两个不同株，即8/60和18537的SH基因比较仅发现一个氨基酸的差异(Anderson等，同上)。人和牛RSV SH蛋白有40％的同一性，并都具有以下主要结构特点(i)保守残基不对称分布；(ii)极相似的疏水结构；(iii)疏水区的两边均有一个N连接的糖基化位点；(iv)SH蛋白中心疏水区的C末端有一个单独的半胱氨酸残基(Anderson等，同上)。通过检测这些以及其它序列的相似和差异，可以选择能够替代或插入到例如感染性M2 ORF2缺失和剔除突变RSV克隆中的异源序列，例如产生具有多特异性免疫原效果和/或如减毒之类的其它期望效果的疫苗病毒。
在对基因缺失的描述中也公布了改变基因位置的效果。例如SH基因的缺失使下游基因位点移动到更接近启动子的位置。这可能伴随着重组病毒中下游基因转录的增加。或者，任何基因的位置都可以例如通过该基因插入或转位到上游或下游的基因间隔区或其它非编码区而改变，从而改变表达。因此，提供了通过改变基因在该基因组或反基因组中的次序或位置，使RSV基因表达水平改变的方法。下游基因表达水平的降低在许可宿主(如猩猩和人)中导致减毒表型，而表达水平的增加对重组RSV有相反的效果。
以上引用文献中说明的另一范例中，NS2基因的表达因其读码框(ORF)中引入的一个终止密码子而被消除。与野生型相比，这种NS2剔除突变体释放感染性病毒的速率降低。此外，对于该突变体和野生型病毒噬菌斑的比较发现，NS2剔除病毒的噬菌斑尺寸显著减小。因此，这种类型的突变可以引入工程化表达细胞因子或其它免疫调节分子的活的重组RSV中，以获得改变的表型，在此例中，是在体外病毒生长率和噬菌斑尺寸的降低。因此，基于体外噬菌斑尺寸的降低和体内减毒的相关性，这些和其它剔除方法和突变体提供了另外的重组RSV疫苗制剂。NS2基因的表达也因NS2基因完全去除而消除，产生的病毒具有相似表型。
其它被成功缺失的RSV基因包括NS1和G基因。前者的缺失通过其编码多核苷酸序列的去除而实现，后者是通过引入移码或改变翻译起始位点并引入终止密码子而实现。特别的，NS1基因是通过反基因组cDNA的122-630位核苷酸的去除而缺失的，因此将NS1上游非翻译区与NS2翻译起始密码子连接。该病毒rA2ΔNS1，表现RNA复制、噬菌斑尺寸、生长动力学的降低，以及在体外感染性病毒产量降低约10倍。有趣的是，回收的NS1-负型病毒在组织培养中产生小噬菌斑，但比缺失NS2的病毒稍大。NS1-负型病毒可以生长(尽管速率降低)的事实说明NS1是一个对于病毒生长非必需的附属蛋白。NS1-负型的病毒噬菌斑尺寸与NS2剔除突变体(NS2蛋白的表达因在其编码区中引入的翻译终止子而消除)的相似。小噬菌斑表型通常与减毒突变相关。因此，这种类型的突变可以引入活的重组RSV中，以获得改变的表型。因此，基于体外噬菌斑尺寸和体内减毒的相关性，这些和其它剔除方法和突变体提供了另外的本发明重组RSV疫苗制剂。年幼的猩猩中，NS2剔除突变体在其上呼吸道略有减毒，而在其下呼吸道表现高度减毒表型。这种突变体可极大地诱导猩猩中疾病症状的降低，并刺激对野生型攻击病毒的显著抗性(Whitehead等，J.Virol733438-3442，1999，在此引用作为参考)。
如上所述，另一可以引入表达免疫调节分子的本发明重组RSV中的剔除突变涉及到M2 ORF2的缺失或消除，M2 ORF2近来被确认为编码一个转录/复制调节因子M2-2(参见，Collins等，2000年7月9日美国专利申请“制备包含M2 ORF2修饰的减毒的呼吸道合胞病毒”案卷号015280-403100US和优先权美国临时专利申请60/143,097；Bermingham等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9611259-11264，1999；Jin等，J.Virol.7474-82，2000，分别在此引用作为参考)。本发明的这方面，优选地通过修饰重组RSV基因组或反基因组，引入一个移码突变，或在M2 ORF2中引入一个或更多终止子，或改变起始密码子，使M2ORF2的表达降低或消除。其它破坏M2 ORF2的表达或M2-2蛋白的表达或功能以产生减毒RSV候选疫苗的改变包括，部分或完全M2ORF2编码序列整体或部分地缺失，使M2-2蛋白部分或完全地丧失功能，或终止其表达。或者，通过将M2-2 ORF2放置于该重组基因组或反基因组更加接近或远离启动子的位置上，分别正或负调节M2-2在重组RSV中的表达。构建该基因组或反基因组，使之包含M2-2 ORF与其自身基因起始信号和终止信号一同作为一个独立的基因，这可以正调节M2-2。优选的实施方案中，M2 ORF2缺失和剔除突变体与相应野生型或突变亲本RSV株相比，表现减弱的病毒生长。此外，这些重组体表现病毒生长延迟的动力学。由于M2-2是一个调节蛋白，通过增加(而非降低)M2 ORF2的表达，也可以使病毒生长和表达方式改变。如上所述，这可以将M2 ORF2作为独立基因表达，如需要，也可以放置于更加接近或远离启动子的位置上，因此容易地实现。具有M2 ORF2缺失和剔除突变的重组疫苗病毒优选地表现在mRNA转录的改变。这种改变的一个方面是，与相应野生型或突变亲本RSV株mRNA合成的动力学相比，该病毒mRNA合成延迟的动力学。但一段时间之后(如感染后24小时)M2 ORF2缺失和剔除突变体表现mRNA合成累积量的增加。这种mRNA合成累积量的增加比相应野生型或突变亲本RSV株mRNA的累积高约50-100％，100-200％，200-300％或更高。
本发明也提供了具有M2 ORF2缺失和剔除突变的表达免疫调节分子的RSV，与相应野生型或突变亲本RSV株RNA的复制(基因组或反基因组的合成)相比，其病毒RNA的复制降低。因此，这种基因组RNA的累积量比相应野生型或突变亲本RSV株基因组RNA的累积(如感染后24小时)低约25-30％，15-25％，10-15％或更低。优选的方面，其mRNA与基因组RNA的累积摩尔比率比观察到的相应野生型或突变亲本RSV株mRNA与基因组RNA的累积摩尔比率增加2-5，5-10，10-20倍或更高。
除了有利的表型变化外，与相应野生型或突变亲本RSV株感染细胞中病毒蛋白的累积相比，M2 ORF2缺失或剔除突变引入本发明重组RSV，赋予并增加了感染细胞中病毒蛋白的累积。病毒蛋白水平的增加(如感染后36小时)可达到50-100％，100-200％，200-300％或更高。这是特别有用的，因为与相应野生型或突变亲本RSV株中抗原的表达相比，病毒抗原表达的增加导致免疫原性的增加，抵消了因重组病毒中期望的减毒表型所产生的抗原表达和免疫原性的降低。候选疫苗在不丧失免疫原潜力，甚至表现免疫原活性的增加的情况下，可以被适当的减毒，这种令人惊讶的表型特征非常有利于疫苗发展。
引用的文献中提供的在本发明中有用的其它方法和组合物涉及到被修饰为表达免疫调节分子的RSV重组体中不同的核苷酸修饰，其改变该重组基因组或反基因组中不同的顺式作用序列。如RSV G糖蛋白分泌形式的一个翻译起始位点可以被缺失，破坏这种形式G糖蛋白的表达。RSV G蛋白以两种形式合成一种锚定类型II整合膜蛋白和一种在N末端重切分的缺乏所有膜锚定点的分泌型(Hendricks等，J.Virol.622228-2233，1988)。这两种形式来源于两个不同位点的翻译起始长型的在G ORF第一个AUG位点起始，第二中从ORF密码子48处的第二个AUG位点起始，并进一步由蛋白酶解加工(Roberts等，J.Virol.684538-4546，1994)。第二个起始位点是非常保守的，在目前测序的所有人，牛和羊RSV株中都存在。这暗示G蛋白的这种可溶形式通过捕获中和抗体，使宿主免疫减弱。可溶G对于优先刺激偏向Th2的应答也有作用，而偏向Th2的应答似乎又与RSV以后入侵时免疫病理学增强相关。对于RSV疫苗病毒，降低抗体的捕获或免疫系统不平衡的刺激是需要的，因此希望消除G蛋白这种分泌形式的表达。这在该重组病毒中得以实现。因此，该突变特别适用于在数量和/或质量上改变重组病毒诱导的宿主免疫应答，而非直接使病毒减毒。G蛋白基因也可一同被缺失。产生的病毒显示宿主范围效果，在HEp-2细胞中生长率低但在Vero细胞中的生长和野生型一样有效。可能其它蛋白也提供附着功能，或附着功能随之去除。因此，本发明也提供了缺乏G蛋白并表达免疫调节分子以增强免疫原性的活的减毒RSV疫苗病毒。
引用的文献还描述了通过改变其它模式基因(如NS1和NS2)的顺式作用转录信号调节重组RSV表型的方法。这些核苷酸修饰的结果与通过改变顺式作用元件(如降低通读mRNA的水平和增加下游基因蛋白的表达)使蛋白表达的改变一致。产生的重组病毒优选地表现增加的生长动力学和噬菌斑尺寸的增加。顺式作用调节序列的模式修饰包括修饰与RSV基因相关的基因起始(GE)和终止(GS)信号。文中，模式改变包括NS1和NS2基因GS信号的改变，使这些信号与RSV N基因天然的GE信号相同。产生的重组病毒表现增加的生长动力学和噬菌斑尺寸的增加，因此提供了有利地改变表达免疫调节分子的RSV候选疫苗的表型的其它方法。
引用文献中所述在本发明中有用的方法和组合物，可产生表达免疫调节分子的减毒RSV，其具有来自RSV亚型A和B的序列，例如，以产生一个RSV A或B疫苗或一个二价的RSV A/B疫苗。因此，引用文献提供了可产生表达细胞因子的减毒RSV疫苗病毒的方法和组合物，所述病毒具有来自RSV亚型A和B的序列，例如，以产生一个RSV A或B疫苗或一个二价的RSV A/B疫苗(参见如Collins等1999年4月13日的美国专利申请09/291,894，在此引用作为参考)。一个例子中，提供了特异于RSV亚型B的疫苗病毒，其中，使用减毒的亚型A病毒表达RSV亚型B的F和/或G糖蛋白。因为F和G蛋白是主要的保护性抗原，并提供RSV亚型特异性中的多数部分，该嵌合病毒刺激抗亚型B的强的免疫应答。可以用其它两种方式实施该方法。一是将亚型B的G糖蛋白作为额外的基因插入亚型A背景中(或反之)。但由于F蛋白也表现显著的亚型特异性，优选在特异于RSV亚型B的疫苗中同时表达二者。此外，优选进一步改变亚型B病毒，以获得适当的减毒和免疫原性。因此，第二种，也是获得RSV亚型B疫苗的更好的方式，是从亚型A重组cDNA背景基因组或反基因组中去除G和F基因，替代以RSV亚型B的G和F基因。产生的A/B嵌合RSV具有亚型A的内在蛋白和亚型B的保护性抗原。这种病毒可通过系统地引入上述减毒突变而使减毒达到理想的水平。例如，引入嵌合RSV A/B病毒的特定减毒突变包括(i)5个cp突变中的3个，即N中的突变(V267I)和L中的两个(C319Y和H1690Y)，但不包括F中的两个，因其被B1 F基因替代所去除了；(ii)减毒的A2株中发现的248(Q831L)，1030(Y1321N)，和任选的，404-L(D1183E)；(iii)M2基因起始信号位置9处的单核苷酸替代；以及(iv)SH基因的缺失。其它嵌合RSV A/B中可得的突变包括，但不局限于，NS1，NS2，SH，或G基因的缺失，以及530和1009突变的单独或组合形式。
如上所述，本发明也包含在嵌合人-牛重组病毒内表达免疫调节分子的重组RSV的构建和应用。本发明这方面使用的嵌合人-牛RSV一般见于Bucholz等2000年6月23日美国专利申请“减毒的人-牛嵌合呼吸道合胞病毒的生产”(案卷号015280-398100US)及其优先权美国临时申请60/143,132，分别在此引用作为参考。这些嵌合重组RSV包括一个部分或完全的“背景”RSV基因组反基因组，其来自或其构建依据组合有另一RSV株或亚型病毒的一个或更多异源基因或基因组区段的人或牛RSV株或亚型病毒，形成人-牛嵌合RSV基因组或反基因组。本发明的某些方面，嵌合RSV含有组合了一个或多个异源的人RSV基因或基因组区段的牛RSV的背景基因组或反基因组。本发明的另一些方面，嵌合RSV含有组合了来自牛RSV一个或多个异源基因或基因组区段的人RSV的背景基因组或反基因组。
在模式实施方案中，本发明公布了感染性的表达细胞因子的RSV，其含有一个主要核壳蛋白(N)，核壳磷蛋白(P)，大聚合酶蛋白(L)，RNA聚合酶延伸因子，和组合有另一RSV株或亚型病毒的一个或更多异源基因或基因组区段的部分或完整的人或牛RSV的RSV背景基因组或反基因组，形成人-牛嵌合RSV基因组或反基因组。可用于本发明的异源基因和/或基因组区段包括RSV NS1，NS2，N，P，M，SH，M2(ORF1)，M2(ORF2)，L，F，或G基因或基因组区段中一种或多种。或者，引入本发明人-牛嵌合RSV的异源基因和基因组区段可能包括RSV基因组的前导区、非转录尾区或基因间隔区或其片段。有许多编码一个或更多细胞因子的核苷酸可引入该嵌合基因组或反基因组。
更详细的实施方案中，本发明重组RSV包含编码RSV F、G和/或SH糖蛋白或其免疫原结构域或表位的一个或多个异源基因和/或基因组区段。或者，该重组RSV可能具有同时包含人和牛糖蛋白结构域或免疫原性表位的嵌合糖蛋白。例如，后一类型的嵌合体通过在牛背景基因组或反基因组中以合适的阅读框引入编码糖蛋白胞外域的异源基因组片段和编码牛背景基因组或反基因组中相应糖蛋白其余功能部分的基因组区段，产生的嵌合病毒表达具有功能的嵌合糖蛋白。
本发明其它实施方案中，提供被修饰为表达免疫调节分子的人-牛嵌合RSV，其中一个人RSV“背景”因引入选择的牛基因，或基因组区段，或多个基因或基因组区段而减毒。某些实施方案中，选择的异源BRSV基因协同地转移到HRSV背景基因组或反基因组中。单独或协同转移的牛RSV基因包括RSV N，P，NS1，NS2，M2-1和M基因，在人RSV背景基因组或反基因组中，可以被牛RSV的一个或多个异源基因或基因组区段单独或组合地替代，产生减毒的嵌合衍生物。更详细的方面中，人RSV的N和P基因都可以被牛RSV的对应N和P基因协同地替代。RSV基因组中某些基因功能的协作性(如基因组中临近的基因对)使这种协同的基因替代更加便利。因此其它实施方案中，人RSV的NS1和NS2基因都可以被牛RSV的对应NS1和NS2基因协同地替代。其它实施方案中，HRSV的M2-1、M2-2和L基因中的两个或更多被牛RSV的对应基因协同地替代。对于希望具有高的宿主范围限制的本发明候选疫苗，人RSV的N、P、NS1、NS2、M2-1和M基因都可以被牛RSV的对应N、P、NS1、NS2、M2-1和M基因替代。各种构建体中，任何与此处所述细胞因子表达有关的选定的修饰都可以引入嵌合基因组或反基因组中。
本发明一个不同方面中，构建表达此处所述细胞因子的人-牛嵌合RSV，其中嵌合基因组或反基因组含有组合了人RSV的一个或更多异源基因和/或基因组区段的部分或完整的牛RSV背景基因组或反基因组。某些实施方案中，选自F、G和SH中的一个或更多人RSV糖蛋白基因，或编码F、G或/和SH胞质结构域、跨膜结构域、胞外域或免疫原性表位的一个或更多基因组区段，被添加或替代于部分或完整的牛RSV的背景基因组或反基因组内。例如，人RSV糖蛋白基因F和G中任一，或同时，用于替代部分牛RSV的背景基因组或反基因组内的F和G糖蛋白基因中任一，或同时替代。这些以及相关的实施方案中，人-牛嵌合RSV基因组或反基因组可以具有人RSV亚型A和B之一或二者的抗原决定簇。更详细的方面，人RSV糖蛋白基因F和G可以同时替代牛RSV的背景基因组或反基因组内的对应F和G糖蛋白基因。具有以上引用文献中描述的特征的人-牛嵌合RSV是rBRSV/A2。与在这种嵌合病毒中的一种或多种修饰组合，该候选疫苗将具有定向导致细胞因子表达的修饰。
本发明其它具有定向免疫调节分子表达的修饰的人-牛嵌合RSV，包含人RSV的F，G，和SH之一或更多，其在部分或完整牛RSV背景基因组或反基因组中，在相对于其相应基因或基因组区段的野生型基因次序，离启动子更近的位置被加入或替代。一个这种实施方案中，人RSV糖蛋白基因G和F可以在部分牛RSV的背景基因组或反基因组内替代于位置1和2处，分别代替了野生型位置7和8处缺失的G和F糖蛋白。具有以上引用文献中描述的特征的模式人-牛嵌合RSV是rBRSV/A2-G1F2。
人-牛嵌合RSV内协同的基因转移也涉及在牛背景基因组或反基因组中引入人的抗原基因。某些实施方案中，选自F，G，SH和M的一个或多个人RSV包膜相关基因被添加或替代到部分或完整牛RSV背景基因组或反基因组中。例如，选自F，G，SH和M的一个或多个人RSV包膜相关基因可以被添加或替代于缺失了选自F，G，SH和M的一个或多个包膜相关基因的部分牛RSV背景基因组或反基因组内。更详细的方面中，人RSV包膜相关基因F，G，和M中的一个或多个被添加到缺失了膜相关基因F，G，SH和M的部分牛RSV背景基因组或反基因组内。具有以上引用文献中描述的特征的模式人-牛嵌合RSV是rBRSV/A2-MGF。与在这种嵌合病毒中的修饰组合，该候选疫苗将具有定向导致细胞因子表达的选定的修饰。
引入异源免疫原蛋白、结构域和表位，产生同时表达免疫调节分子的嵌合RSV，尤其适用于在免疫化宿主中产生新的免疫应答。来自一个供体RSV的免疫原基因或基因组区段，对不同亚型或株的RSV受体基因组或反基因组的添加或替代，产生的免疫应答导向供体亚型或株、受体亚型或株、或针对二者。为达到这一目的，可构建表达嵌合蛋白的表达免疫调节分子的重组RSV，如表达特异于一种RSV的免疫原蛋白的细胞质尾和/或跨膜区与特异于另一种RSV胞外域融合产生的人-牛融合蛋白，或具有两种不同人RSV亚型或毒株的结构域的融合蛋白。优选实施方案中，表达免疫调节分子的RSV的基因组或反基因组在重组病毒颗粒或亚病毒颗粒中编码同时具有人和牛二者的糖蛋白结构域或免疫原性表位的嵌合糖蛋白。例如，编码人RSV F，SH或G糖蛋白的糖蛋白胞外域的异源基因组区段，可以与编码相应牛RSV F，SH或G糖蛋白的胞质结构域或胞内结构域的多核苷酸序列(即，基因组区段)相连，形成人-牛嵌合RSV基因组或反基因组。
其它一些实施方案中，用于疫苗制剂中的重组RSV可容易地被修饰，以适应循环病毒的抗原漂移。典型的，修饰发生在G和/或F蛋白中。这可能包括一种RSV株的完整G或F基因，或编码其特定免疫原区的基因组区段，通过替代不同RSV株或亚型受体克隆的相应区段，或通过添加该基因的一个或更多拷贝，引入嵌合RSV基因组或反基因组cDNA，产生多种抗原形式。修饰后的RSV克隆的子代病毒可以用于抗新兴RSV株的疫苗制剂。
本发明其它的方面，被修饰为表达免疫调节分子的重组RSV被容易地设计为具有不同病原的抗原决定簇的“载体”，所述病原包括多种RSV株或组(如人RSV A和B亚型)，人副流感病毒(HPIV)(包括HPIV1，HPIV2，HPIV3)，麻疹病毒以及其它病原(参见美国临时专利申请60/170,195；美国专利申请09/458,813；美国专利申请09/459,062，分别在此引用作为参考)。多种实施方案中，该重组基因组或反基因组包含部分或完全的RSV“载体基因组或反基因组”，组合了编码一个或多个异源病原的一个或多个抗原决定簇的一个或多个异源基因或基因组区段。该异源病原可能是异源RSV(即不同株或亚型的RSV)，该异源基因或基因组区段可能编码RSV NS1，NS2，N，P，M，SH，M2(ORF1)，M2(ORF2)，L，F，或G蛋白或蛋白片段(如其免疫原结构域或表位)。例如，该载体基因组或反基因组可能是部分或完全的RSV A基因组或反基因组，该异源基因或基因组区段可能编码RSV B亚型病毒的抗原决定簇。
其它实施方案中，RSV载体基因组或反基因组是部分或完全的牛RSV(BRSV)基因组或反基因组，编码抗原决定簇的异源基因或基因组区段是一个或多个人RSV(HRSV)的基因或基因组区段。例如，部分或完全的BRSV基因组或反基因组包含编码选自F、G和SH的一个或多个HRSV糖蛋白基因的一个或多个基因或基因组区段，或编码HRSV F、G和/或SH的胞质尾，跨膜区，胞外域或其免疫原性表位部分的一个或多个基因组区段。
其它实施方案中，作为携带异源抗原决定簇的“载体”的被修饰为表达免疫调节分子的RSV，包含非RSV病原(如人副流感病毒(HPIV))的一个或多个抗原决定簇。一个实施方案中，编码一个或多个HN和/或F糖蛋白或其免疫原结构域，片段或表位的一个或多个HPIV1，HPIV2，或HPIV3基因或基因组区段，被添加于或引入部分或完全的HRSV载体基因组或反基因组内。更详细的实施方案中，包含HPIV1，HPIV2，或HPIV3 HN或F基因读码框(ORF)的一个转录单位被添加或引入嵌合的HRSV载体基因组或反基因组内。
其它实施方案中，被修饰为表达免疫调节分子的RSV的重组基因组或反基因组包含部分或完全的HRSV或BRSV基因组或反基因组和异源病原，其选自麻疹病毒、呼吸道合胞病毒的亚型A和B、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒、人免疫缺陷病毒1型和2型、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病病毒、EB病毒、线状病毒、布尼亚病毒、黄病毒、甲病毒和流感病毒。基于这些模式候选病原，异源抗原决定簇选自麻疹病毒HA和F蛋白、呼吸道合胞病毒的亚型A和B的F、G、SH和M2蛋白、腮腺炎病毒HN和F蛋白、人乳头瘤病毒L1蛋白、人免疫缺陷病毒1型或2型的gp160蛋白、单纯疱疹病毒和巨细胞病毒的gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL和gM蛋白、狂犬病病毒G蛋白、EB病毒gp350蛋白、线状病毒G蛋白、布尼亚病毒G蛋白、黄病毒E和NS1蛋白、和甲病毒E蛋白，以及其抗原结构域、片段和表位。一个实施方案中，该异源病原是麻疹病毒，异源抗原决定簇选自麻疹病毒HA和F蛋白，以及其抗原结构域、片段和表位。包含麻疹病毒HA基因读码框(ORF)的一个转录单位被添加或引入嵌合的HRSV载体基因组或反基因组内，以获得这种嵌合构建体。
本发明所有包括构建嵌合RSV的实施方案中，异源或“供体”多核苷酸对受体或“背景”基因组或反基因组的添加或替代，可能仅涉及供体目的基因的一部分。一般，如顺式作用调节元件和基因间隔区这样的非编码核苷酸不需要和供体基因编码区一起转移。因此特定基因的编码序列(如部分或完全的读码框(ORF))可被添加或替代于部分或完全的背景基因组或反基因组中，受与供体序列对应的或不同的基因异源启动子(如背景基因组或反基因组中存在的启动子)控制之下。多种其它基因组区段提供了有用的供体多核苷酸，可引入嵌合基因组或反基因组内，表达具有新的有用性状的嵌合RSV。例如异源基因组区段可编码来自人或牛RSV选定蛋白的部分或全部的糖蛋白胞质尾区，跨膜结构域或胞外域，表位或区域，结合位点或具有结合位点的区域，活性位点或具有活性位点的区域等。这些或其它基因组区段可以添加到完全的背景基因组或反基因组中，或替代其对应的基因组区段，产生新的嵌合RSV重组体。某些重组体将表达一种嵌合蛋白，如具有一种RSV胞质尾区和/或跨膜结构域与另一种RSV胞外域融合的嵌合蛋白。
本发明其它详细的方面，重组RSV基因组或反基因组中，改变一个或多个基因或基因组区段的相对基因次序或空间位置，创造或改变了被修饰为表达免疫调节分子的RSV，以产生在人和其它哺乳动物中具感染性，减毒并具有免疫原性的重组疫苗病毒(Krempl等2000年6月23日的美国临时专利申请“从近启动子基因表达保护性抗原的呼吸道合胞病毒”，案卷号015280-424000US，在此引用作为参考)。本发明这些重组RSV典型地包含主要核壳蛋白(N)，核壳磷蛋白(P)，大聚合酶蛋白(L)，RNA聚合酶延伸因子，以及部分或完整的重组RSV基因组或反基因组，其在重组基因组或反基因组中具有一个或多个位置移动了的RSV基因或基因组区段。本发明的某些方面，该重组RSV的特征是位置移动的一个或多个基因或基因组区段，可能因移位的一个或多个多核苷酸在部分或完整的重组RSV基因组或反基因组中的插入、缺失或重排，被移动到远离或靠近启动子的位置。替位多核苷酸可能插入或重排到重组基因组或反基因组非编码区(NCR)内，或作为一个独立的基因单位(GU)引入重组RSV基因组或反基因组中。
本发明模式实施方案中，分离的感染性重组RSV通过一个或多个替位多核苷酸的添加、缺失或重排构建，替位多核苷酸选自以下一个或多个RSV基因或基因组区段，其选自RSV NS1、NS2、N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)、L、F和G基因或基因组区段，以及RSV基因组和其片段的前导、非转录尾和基因间隔区域。其它更详细的实施方案中，重组RSV基因组或反基因组中多核苷酸的添加，缺失或重排的元件选自一个或多个牛RSV(BRSV)或人RSV(HRSV)的基因或基因组区段，选自RSV NS1、NS2、N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)、L、F和G基因或基因组区段，以及RSV基因组或其片段的前导、非转录尾和基因间隔区域。
本发明某些方面，替位的多核苷酸被插入，以形成重组RSV基因组或反基因组，创造或添加引入编码细胞因子的该核苷酸中的突变。以这种方式插入的替位多核苷酸，使重组基因组或反基因组内一个或多个“已经被移动的”RSV基因或基因组区段移向，与野生型RSV(如HRSV A2或BRSV kansas株)基因组或反基因组相应基因或基因组区段的位置相比，更加接近启动子的位置。
或者，替位多核苷酸可在本发明重组RSV内缺失，形成重组RSV基因组或反基因组，以容纳或补充编码细胞因子的基因的引入。文中重组基因组或反基因组内替位多核苷酸的缺失使一个或多个“已经被移动的”RSV基因或基因组区段，与野生型RSV内相应基因或基因组区段的位置相比，移向更加接近启动子的位置。从编码细胞因子的重组RSV中缺失的替位多核苷酸选自RSV NS1，NS2，SH，M2(ORF2)或G基因中的一种或多种或其基因组区段。
本发明更详细的实施方案中，包含RSV NS1基因的替位多核苷酸被缺失，形成重组RSV基因组或反基因组。或者，包含RSV NS2基因的替位多核苷酸被缺失，形成重组RSV基因组或反基因组。或者，包含RSV SH基因的替位多核苷酸被缺失，形成重组RSV基因组或反基因组。或者，包含RSV M2(ORF2)基因的替位多核苷酸被缺失，形成重组RSV基因组或反基因组。或者，包含RSV G基因的替位多核苷酸被缺失，形成重组RSV基因组或反基因组。
其它实施方案中，包含RSV基因或基因组区段的多种替位多核苷酸，在表达细胞因子的突变RSV中缺失。例如，RSV F和G可同时缺失，使具有编码免疫调节分子的基因插入序列的重组RSV基因组或反基因组进一步被修饰。或者RSV NS1和NS2可同时在重组RSV基因组或反基因组中缺失。或者RSV SH和NS2可同时在重组RSV基因组或反基因组中缺失。或者，RSV SH，NS1和NS2可同时在重组RSV基因组或反基因组中缺失。
本发明不同的实施方案中，提供编码细胞因子或其它免疫调节分子的分离的感染性重组RSV，其中，一个或多个替位多核苷酸在重组RSV基因组或反基因组内的添加、缺失或重排，引起已被移动的一个或多个RSV基因或基因组区段的位置移动。这些修饰中，基因和基因组区段的插入和重排，与相应(人或牛)的野生型RSV基因组或反基因组内客体(被插入或重排)基因或基因组区段的相应位置相比，使客体基因或基因组区段引入或重排于更靠近或更远离启动子的位置。可在重组RSV基因组或反基因组中添加，替代或重排的移位多核苷酸选自RSV NS1，NS2，SH，M2(ORF2)，F和/或G基因中的一种或多种或基因组区段。
更详细的实施方案中，选择在重组基因组或反基因组中插入或重排的替位多核苷酸，包括编码一个或多个RSV糖蛋白，或RSV糖蛋白免疫原结构域，或表位的一个或多个RSV基因或基因组区段。模式实施方案中，替位多核苷酸选自编码RSV F、G和/或SH糖蛋白中的一个或多个或其免疫原结构域或表位。例如，选自F、G和SH的一个或多个RSV糖蛋白基因，可在重组RSV基因组或反基因组中，被添加、替代或重排到与该基因在野生型中的基因排列位置相比，更加接近或远离启动子的位置。
模式实施方案中，RSV糖蛋白基因G，在重组RSV基因组或反基因组中重排到与G在野生型中的基因排列位置相比，更加接近启动子的位置。更详细的方面，RSV糖蛋白基因G被移动到所述重组RSV基因组或反基因组中基因排列位置1处。其它模式实施方案中，RSV糖蛋白基因F，在重组RSV基因组或反基因组中重排到更加接近启动子的位置，例如F基因被移动到重组RSV基因组或反基因组中基因排列位置1处。另一些模式实施方案中，RSV糖蛋白基因G和F，在重组RSV基因组或反基因组中同时重排，与其在野生型中的基因排列位置相比，更加接近启动子的位置。更详细的方面，RSV糖蛋白基因G被移动基因排列位置1处，RSV糖蛋白基因F被移动到基因排列位置2处。
其它以糖蛋白基因移动为特点的构建体中，产生重组的M2 ORF2缺失和剔除RSV，其具有选自F、G和SH的一个或多个RSV糖蛋白基因或其基因组区段，其添加，替代或重排到重组RSV基因组或反基因组中，其中RSV NS1、NS2、SH、M2(ORF2)或G基因中的一个或多个或其基因组区段缺失。因此，RSV F、G或SH的基因或基因组区段可被添加，替代或重排于这种背景中其中缺失了包含RSV NS1基因的替位多核苷酸，形成重组RSV基因组或反基因组。或者，RSV F、G或SH的基因或基因组区段可被添加，替代或重排于这种背景中其中缺失了包含RSV NS2基因的替位多核苷酸，形成重组RSV基因组或反基因组。或者，RSV F、G或SH的基因或基因组区段可被添加，替代或重排于这种背景中其缺失了包含RSV SH基因的替位多核苷酸，形成重组RSV基因组或反基因组。
一个实施方案中，RSV糖蛋白基因G，在缺失SH基因的重组RSV基因组或反基因组中，重排到与G在野生型中的基因排列位置相比，更加接近启动子的位置。更详细的方面，RSV糖蛋白基因G被移动到所述重组RSV基因组或反基因组中基因排列位置1处，其范例是以上引用文献中的重组候选疫苗G1/ΔSH。其它实施方案中，RSV糖蛋白基因F，在缺失SH基因的重组RSV基因组或反基因组中，重排到与F在野生型中的基因排列位置相比，更加接近启动子的位置。更详细的方面，RSV糖蛋白基因F被移动到所述重组RSV基因组或反基因组中基因排列位置1处，其范例是以上引用文献中的重组候选疫苗F1/ΔSH。另一模式实施方案中，RSV糖蛋白基因G和F，在缺失SH基因的重组RSV基因组或反基因组中同时重排，与G和F在野生型中的基因排列位置相比，更加接近启动子的位置。更详细的方面，RSV糖蛋白基因G被移动基因排列位置1处，RSV糖蛋白基因F被移动到基因排列位置1处，其范例是以上引用文献中的重组候选疫苗G1F1/ΔSH。
提供了其它以选自F、G和SH的糖蛋白基因移动为特点的本发明中使用的基因移位RSV的例子，其产生于具有多个基因或基因组区段(选自RSV NS1，NS2，SH，M2(ORF2)，和G基因或基因组区段)缺失的重组RSV基因组或反基因组中(Krempl等2000年6月23日的美国临时专利申请“从近启动子基因表达保护性抗原的呼吸道合胞病毒”，案卷号015280-424000US，在此引用作为参考)。一个例子中，RSV SH和NS2基因都缺失，形成重组RSV基因组或反基因组，RSV糖蛋白基因G和F同时或其一，在重组RSV基因组或反基因组中重排到更加接近启动子的位置。更详细的方面，G被移动到基因排列位置1处，F被移动到基因排列位置2，其范例是以上引用文献中的重组候选疫苗G1F1/ΔNS2ΔSH。另一个例子中，RSV SH，NS1和NS2基因都缺失，形成重组RSV基因组或反基因组，RSV糖蛋白基因G和F同时或其一，在重组RSV基因组或反基因组中重排到更加接近启动子的位置，其范例是以上引用文献中的重组候选疫苗G1F1/ΔNS1ΔNS2ΔSH。
##本发明其它方面中，被修饰表达细胞因子或其它免疫调节分子的基因移位RSV与人-牛嵌合RSV组合，或引入其中(Bucholz等2000年6月23日的美国专利申请“减毒的人-牛嵌合呼吸道合胞病毒的生产”，案卷号015280-398100US，和其优先权美国临时专利申请60/143,132，分别在此引用作为参考)。在这些方面中，该重组基因组或反基因组具有部分或完全的人RSV(HRSV)或牛RSV(BRSV)背景基因组或反基因组，其组合了来自不同RSV的一个或多个异源基因或基因组区段，形成人-牛嵌合RSV基因组或反基因组。来自不同HRSV或BRSV的异源基因或基因组区段在部分或完整HRSV或BRSV背景基因组或反基因组内，被添加，替代或重排到与该基因或基因组区段在野生型中的基因排列位置相比，更加接近或远离启动子的位置。一个例子中，人RSV糖蛋白基因G和F分别在部分或完整BRSV背景基因组或反基因组内基因排列位置1和2处，替代了在野生型中的基因排列位置7和8缺失的对应G和F基因，其范例是重组病毒rBRSV/A2-G1F2。其它实施方案中，人RSV包膜相关基因(选自F，G，SH，M)被添加或替代到部分或完全的牛RSV背景基因组或反基因组内。更详细的方面，一个或多个人RSV包膜相关基因(选自F，G，SH，M)，被添加或替代到缺失了选自F，G，SH和M的包膜相关基因的部分牛RSV背景基因组或反基因组内。一个实施方案中，人RSV包膜相关基因F，G和M被添加到缺失了所有的包膜相关基因F，G，SH，和M的部分或完全的牛RSV背景基因组或反基因组内，其范例是重组病毒rBRSV/A2-MGF。
工程化引入本发明重组RSV的期望的表型改变包括，但不局限于，细胞培养时或选择的宿主环境中减毒，对减毒表型回复的抗性，增强的免疫原性(如通过所诱导免疫应答的增强或降低确定)，选择的病毒产物转录和/或翻译的正调节或负调节等。本发明优选的方面，产生工程化表达免疫调节分子的RSV，其中重组基因组或反基因组被进一步修饰，包含特定产生减毒表型或使进一步减毒表型的一个或多个突变。这些突变可重新产生，根据以上引用文献所述的合理设计的诱变步骤，检测其减毒效果。或者，可从生物学来源的突变RSV中发现这些减毒突变，并引入本发明重组RSV。
表达一种或多种免疫调节分子的RSV疫苗株中引入的生物学来源RSV的减毒突变，可以天然存在，也可通过已知的诱变方法引入野生型RSV株。例如减毒RSV株可通过化学诱变产生，在细胞培养的病毒生长时加入化学诱变剂，选择在低于最适温度时传代的病毒，以引入生长限制突变，或选择在细胞培养中产生小噬菌斑或温度敏感表型的突变病毒，方法一般见USSN08/327,263，在此引用作为参考。
“生物学来源的RSV”是指任何不通过重组方式产生的RSV。因此生物学来源RSV包括所有天然产生的RSV亚型和毒株，包括如具有野生型基因组序列的天然存在的RSV，和具有与参照野生型RSV序列有基因组差异的RSV，例如具有特异产生减毒表型的突变的RSV。同样，生物学来源的RSV包括亲本RSV经非重组诱变和选择方法获得的RSV突变株(一般见国际申请WO93/21310，在此引用作为参考)。
在本发明使用的模式减毒RSV中，复制的温度敏感水平，是通过比较其在许可温度和在几种限制性温度时的复制来确定。将与其在许可温度时相比，复制下降100倍或更多倍的最低温度作为其截止温度。在实验动物和人中，RSV的复制和毒性都与该突变体截止温度相关。截止温度为39℃的突变体复制略有限制，而截止温度为38℃的突变体的复制较低，疾病症状主要局限在上呼吸道。截止温度为35℃到37℃的突变体典型地在猩猩中充分减毒，在人中显著减毒。因此本发明ts型减毒RSV截止温度范围是约35℃到39℃，优选35℃到38℃。ts突变添加到部分减毒株中产生适用于本发明疫苗组合物的多倍减毒的病毒。
利用多循环化学诱发突变向在冷传代中已经减毒的病毒中引入多个突变，发展了许多适合作为候选疫苗鼻内给药的减毒RSV株(如Connors等，Virology 208478-484，1995；Crowe等，Vaccine 12691-699，1994；Crowe等，Vaccine 12783-790，1994，在此引用作为参考)。在啮齿类、猩猩、成人和幼儿中的检测显示，这些候选疫苗株的某些是相对遗传稳定、高免疫原性和满意地减毒的。对这些减毒病毒中的一些进行的核苷酸序列分析显示，减毒增加的每个水平都与特定核苷酸和氨基酸替代相关。上述引用文献也公布了如何常规地区分沉默的偶发突变和产生因感染性RSV克隆基因组或反基因组中引入独立或组合形式突变所产生的表型差异的突变。该过程还包括对亲本和衍生病毒的表型特征进行评估，检测出导致如减毒、温度敏感、冷适应、小噬菌斑和宿主范围限制等这些期望性状的突变。
这样鉴定的突变被集结成一个“菜单”，可以按需要以单独或组合形式引入，以调整表达细胞因子的重组RSV的相关性状，如减毒、免疫原性、对减毒表型回复突变的遗传抗性等。优选的，本发明重组RSV通过至少一个、优选两个或多个此菜单中鉴别的减毒突变的引入而减毒，所述突变可被定义为生物学来源突变RSV株中一组已知突变，所述的突变RSV株优选冷传代(cp)和/或温度敏感(ts)突变株，例如cpts RSV 248(ATCC VR 2450)；cpts RSV 248/404(ATCC VR2454)；cpts RSV 248/955(ATCC VR 2453)；cpts RSV 530(ATCC VR2452)；cpts RSV 530/1009(ATCC VR 2451)；cpts RSV 530/1030(ATCCVR 2455)；RSV B-1 cp52/2B5(ATCC VR 2542)；RSV B-1 cp23(ATCCVR 2579)(遵循布达佩斯条约，各材料保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，Virginia20110-2209，USA，并给出以上的保藏号)。
从该生物学来源的突变体模式组中，获得了一个减毒突变的菜单，其中每个都可以与该组中其它任何减毒突变组合，在用于疫苗的表达免疫调节分子的重组RSV中调整减毒和其它期望表型的水平。其它突变可来自具有非ts和非cp减毒突变的RSV，如在小噬菌斑(sp)，冷适应(ca)，或宿主范围限制(hr)的突变株中所鉴定的。减毒突变可选择在供体或受体RSV基因的编码区或如顺式调节序列的非编码区。例如，减毒突变可能包括基因起始位点中一个或多个碱基突变，如M2基因起始序列中核苷酸7605处一个或多个碱基替代。
设计并选择用做疫苗的本发明表达免疫调节分子的RSV常具有至少两个，有时三个或更多个减毒突变，以获得可广泛地进行临床应用的满意的减毒水平。一个实施方案中，至少一个减毒突变发生在RSV聚合酶基因中，涉及特定于该聚合酶蛋白的氨基酸改变的核苷酸替代，其特定产生温度敏感表型(ts)。文中的重组体还包含大聚合酶基因L内的核苷酸替代，导致氨基酸位点Asn43、Phe521、Gln831、Met1169或Tyr1321处的氨基酸改变，例如由Ile替代Asn43，由Leu替代Phe521，由Leu替代Gln831，由Val替代Met1169，由Asn替代Tyr1321。此外，本发明的重组RSV可能具有另一个RSV基因中的ts突变，如M2基因。优选的，在特定于减毒突变的密码子(如特定于ts突变的密码子)内引入两个或多个核苷酸改变，由此降低减毒表型回复的可能。
与本发明的方法一致，可以容易地构建和定性表达免疫调节分子的重组RSV，其包含至少一个到全部的生物学来源突变RSV株中发现的减毒突变。因此，突变可汇集成选定突变株中的突变组合，所述突变株如cpts RSV 248(ATCC VR 2450)；cpts RSV 248/404(ATCC VR2454)；cpts RSV 248/955(ATCC VR 2453)；cpts RSV 530(ATCC VR2452)；cpts RSV 530/1009(ATCC VR 2451)；cpts RSV 530/1030(ATCCVR 2455)；RSV B-1 cp52/2B5(ATCC VR 2542)；RSV B-1 cp23(ATCCVR 2579)。以这种方式，候选疫苗的减毒可以适当地调整用于一类或几类患者，包括血清反应阴性幼儿。
更具体的实施方案中，本发明选用做疫苗的重组RSV包含至少一个到全部的减毒突变，其特定产生温度敏感或其它在RSV聚合酶基因L的Asn43、Phe521、Gln831、Met1169或Tyr1321处减毒的氨基酸替代，或在M2基因起始位点处温度敏感性核苷酸替代。或者，或附加性的，本发明重组RSV可能包含至少一个到全部的来自冷传代减毒RSV的减毒突变，例如特定产生RSV N基因Val267、RSV F基因Glu218和/或Thr523、RSV聚合酶基因L Cys319或His1690处氨基酸替代的一个或多个突变。
其它更详细的实施方案中，本发明重组RSV被进一步修饰，包含选自以下的突变(i)特定产生RSV聚合酶基因L的Gln831到Leu，和Tyr1321到Asn的温度敏感的氨基酸替代的突变；(ii)M2基因起始序列中温度敏感的核苷酸替代；(iii)特定产生来自冷传代RSV中RSV N基因Val267到Ile，RSV聚合酶基因L Cys319到Tyr和His1690到Tyr的氨基酸替代的一组减毒突变；(iv)RSV SH、NS1、NS2、G、和M2-2基因中一个或多个的表达的缺失或消除。优选，这些和其它表达免疫调节分子的RSV至少包含两个来自生物学来源突变RSV的减毒突变，其可能源于相同或不同的生物学来源突变RSV株。也优选，这些突变株具有经特定针对突变的密码子中的多个核苷酸改变使其稳定的一个或多个减毒突变。
与以上说明一致，从cDNA中产生感染性RSV的能力使可以在表达细胞因子或其它免疫调节分子的RSV重组体中引入特定工程化的改变。特别的，使用感染性重组RSV鉴别生物学来源减毒RSV株中的特定突变，如特定产生ts、cp、att和其它表型的突变。因此检测出期望的突变，引入重组RSV疫苗株中。从cDNA中产生病毒的能力许可将突变，单独或以各种选择的组合，常规地引入全长cDNA克隆中，随后具有这些引入突变的拯救重组病毒的表型可被容易地确定。
通过检测并向感染性RSV克隆中引入与期望表型(如cp或ts表型)相关的特定生物学来源的突变，本发明提供其它位于该检出的突变处或位于其附近的位点特异性修饰。尽管生物学来源RSV产生的大多减毒突变是单核苷酸改变，其它“位点特异性”突变也可以通过重组技术引入生物学来源的或重组RSV中。此处所述位点特异性突变包括从1-3，直至约5-15或更多的改变的核苷酸(如改自野生型RSV序列，选定的突变RSV株的序列或接受诱变的亲本重组RSV克隆)的插入，替代，缺失或重排。这些位点特异性突变可被引入选择的生物学来源突变处或其区域内。或者，突变可被引入RSV克隆的各种其它序列中，如顺式作用调节序列处或其附近，编码蛋白活性位点、结合位点、免疫原性表位等的核苷酸序列处或其附近。使用微复制子系统可以促进有用突变的检测。
位点特异性RSV突变体典型地保持其中期望的减毒表型，但也可能还有与减毒无关的改变的表型特征，如增强或扩大的免疫原性，和/或改善的生长。期望的位点特异性突变体的其他实例包括在特定于减毒突变的密码子内设计引入额外的稳定核苷酸突变的重组RSV。如可能，在特定于减毒氨基酸变化的密码子内引入两个或多个核苷酸替代，改变亲本突变体或重组RSV克隆，产生对减毒表型的回复具有遗传抗性的生物学来源的或重组的RSV。其它实施方案中，位点特异性核苷酸替代、添加、缺失或重排可引入相对于靶核苷酸位置的上游(N末端方向)或下游(C末端方向)例如从1-3、5-10直到15个核苷酸处或更接近5’和3’末端的位置，例如，以构建或消除现存的顺式作用调节元件。
除了单点和多点突变以及位点特异性突变外，表达免疫调节分子的重组RSV的改变包括整个基因或基因组区段的缺失，插入，替代或重排。基于变化的特点(即，少量碱基可能被改变以插入或消除免疫原性表位或改变一个小基因区段，而大片段的碱基参与基因或大的基因组区段的添加、替代、缺失或重排)，这些突变可以改动供体或受体基因组或反基因组中少量碱基(如，从15-30碱基，到35-50碱基或更多)，大段的核苷酸(如，50-100，100-300，300-500，500-1000碱基或更多)，或几乎全部或全部基因(如，1000-1500，1500-2500，2500-5000核苷酸，500-65000个核苷酸或更多)。
本发明其它方面中，表达免疫调节分子的重组RSV被用做呼吸道瞬时基因治疗的载体。根据这种实施方案，重组RSV基因组或反基因组被进一步修饰，包含编码目的基因产物的多核苷酸。该目的基因产物的启动子可以与控制RSV表达的相同或不同。由重组RSV基因组或反基因组与N，P，L，M2(ORF1)蛋白共表达产生并具有编码目的基因产物的序列的感染性RSV被给药患者。这可以是具有完全感染性的重组RSV(即，能够感染培养细胞并产生感染性子代)，也可以是一种重组RSV，例如，其缺少G，F，和SH表面糖蛋白基因中一个或多个，可以在由稳定或瞬时表达反式补充这些蛋白中一个或多个的细胞中增殖。这种情况时产生的重组病毒可有效感染，但不能有效地产生感染性颗粒。缺乏被表达的细胞表面糖蛋白也降低宿主免疫系统对排除感染细胞的效率。这些特点增加了外源基因表达的持续性和安全性。
在其它方面，本发明用于将来自生物学来源RSV的突变(如cp和ts突变)附加于重组RSV克隆中，在这进一步修饰的RSV克隆中伴随有涉及相同或不同基因的其它类型突变。RSV编码10个mRNA和11个蛋白。其中3个是跨膜表面蛋白，即，附着蛋白G，参与穿透的融合蛋白F，以及小疏水蛋白SH。G和F是病毒的主要中和和保护抗原。4种其它蛋白与病毒核壳有关，即，RNA结合蛋白N，磷蛋白P，大聚合酶蛋白L，和转录延伸因子M2 ORF1。M2 ORF也编码M2-2蛋白，其是转录/翻译调节因子。基质蛋白M是内毒粒的一部分，可能介导核壳和包膜间的相关性。最后是两个非结构蛋白NS1和NS2，功能未知。各蛋白都可选择性地在表达水平被改变，或可整体或部分，单独或与其它期望的修饰组合地添加，缺失，替代或重排于表达免疫调节分子的重组RSV中，以产生新的候选疫苗。
因此，除了来自生物学来源RSV突变体的减毒突变外，或与之组合，本发明也提供了减毒或改变工程化表达免疫调节分子的重组RSV的表型的方法—基于感染性RSV克隆的重组工程。编码供体基因或基因组区段的分离的多核苷酸序列，或背景基因或反基因组上可产生多种改变，以引入感染性克隆。更特定的，本发明为了在重组RSV中获得期望的结构和表型改变，许可引入使来自亲本基因组或反基因组中的一个选定核苷酸或多个核苷酸的缺失、替代、引入或重排的修饰，以及缺失、替代、引入或重排工程化表达免疫调节分子的重组RSV内整个基因或基因组区段的突变。
根据本发明，期望的感染性RSV的修饰典型地被选择为特定导致期望的表型改变，如病毒生长，温度敏感，诱导宿主免疫应答能力，减毒等的改变。这些改变可通过例如对亲本RSV克隆诱发突变，以使特定基因或基因组区段(如编码蛋白结构域如胞质、跨膜或胞外结构域、免疫原性表位、结合位点、活性位点等或顺式作用信号的基因组区段)消除、引入或重排，产生在供体或受体基因组或反基因组内。这类目的基因包括RSV基因组的所有基因3’-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M21/M2-2-L-5’，以及其它RSV、其它病毒和此处所述多种其它非RSV来源的异源基因。
还提供了在工程化表达免疫调节分子的重组RSV内引入的改变选择基因表达的修饰，如，在选定RSV的编码序列中引入终止子，改变RSV基因与可操作连接启动子的相对位置，引入或去除上游起始密码子以改变其表达速率，修饰翻译起始位点，修饰(如，通过改变位置、变动现有序列或用一个异源序列替代现有序列)GS和/或GE转录信号以改变其表型(如生长和转录时的温度限制等)，和其它特异导致如病毒复制、选定基因的转录或选定蛋白的翻译在程度或性质上改变的缺失、替代、添加和重排。
在工程化表达免疫调节分子的重组RSV内分析和引入其它类型减毒突变以发展疫苗的能力，延伸到在RSV克隆中广泛的靶改变。例如，SH基因的缺失产生了具有新表型特征的重组RSV，包括增强的生长。本发明中，SH，NS1，NS2或G基因(或任何其它被选择的非必需基因或基因组区段)在重组RSV中缺失，其可能也包括其它特定导致产生减毒表型的突变，如生物学来源减毒RSV突变体中的一个或更多突变。模式实施方案中，SH，NS1，NS2或G基因缺失与来自cpts248/404，cpts530/1009，cpts530/1030或其它选择的重组RSV株的一个或多个cp和/或ts突变组合，或与其它经验性确定的改变组合，由于不同突变的组合效果，产生的重组RSV病毒产量增加，减毒性增强，并抗表型回复。
任何在生长中不必需的RSV基因，如SH，NS1，NS2或G基因，可以在重组RSV中被消除或修饰，以产生期望的效果，如毒性，病原性，免疫原性，和其它表型特征。例如，非必需基因(如SH)的缺失导致病毒在培养中生长增强。不希望受理论的束缚，该效果可能部分因为病毒基因组核苷酸长度的减少。以一个SH-负型克隆为例，修饰的病毒基因组长为14,825nt，比野生型短398个核苷酸。在RSV基因组其它编码或非编码区内工程改造那些降低基因组大小的相似突变，如在P，M，F，和M2基因内，本发明提供了改善RSV生长的几种易得的方法和材料。
此外，RSV基因组或反基因组中可产生多种其它遗传改变，单独或与来自生物学来源突变RSV中的一个或多个减毒突变组合，引入工程化表达免疫调节分子的重组RSV内。其它的异源基因和基因组区段(如来自不同RSV基因，不同RSV株或型，或非RSV来源)可以整体或部分插入，基因排序被改变，基因重叠被消除，RSV基因组启动子由其反基因组的对应物替代，基因的部分被消除或替代，甚至整个基因被缺失。可在序列中制造不同或额外的修饰，以使操作更便利，如在各种基因间隔区域或其它地方插入唯一的限制性位点。可消除不翻译的基因序列，以增加插入外源基因的能力。
本发明还提供了在工程化表达免疫调节分子的重组RSV内的遗传修饰，其改变或消除选定基因或基因组区段的表达，但未从RSV克隆中消除该基因或基因组区段。例如，可通过引入移码突变，或在选择的编码序列引入终止密码子，改变基因的位置，或引入上游起始密码子以改变其表达速率，或改变GS和/或GE转录信号以改变表型(如生长，转录的温度限制)。本发明更详细的方面，提供了工程化表达免疫调节分子的重组RSV，其中在翻译水平消除了NS2基因的表达，但基因或其区段未被去除，如通过在翻译读码框(ORF)中引入两个串联翻译终止子。这产生其中选定的基因在翻译水平沉默但未缺失的活的病毒。这种形式的剔除病毒在组织培养时表现生长速率降低和噬菌斑尺寸减小。因此，这些方法提供了其它新型的减毒突变，消除非主要病毒保护抗原之一的病毒基因表达。文中，在未缺失基因或基因组区段情况下产生的剔除突变表型，也可通过此处所述的缺失诱变产生，有效地排除可能恢复靶蛋白合成的纠正性突变。引入工程化表达免疫调节分子的重组RSV内的几种其它基因剔除突变，使用本领域内熟知的设计方案和方法进行(参见，如，Kretschmer等，Virology216309-316，1996；Radicle等，Virology 217418-412，1996；Kato等，EMBOSS J.16178-587，1987；Sckhneider等，Virology 277314-322，1996，分别在此引用作为参考)。
可用于本发明重组RSV中的其它突变包括针对顺式作用信号的突变，这可以例如利用RSV微基因组突变分析检测出。例如对前导序列、非转录尾序列和侧翼序列的插入和缺失分析检测出病毒的启动子和转录信号，并提供了一系列与RNA复制或转录下降的各种水平相关的突变。该顺式作用信号的饱和诱变(每个位点轮流改为各种核苷酸)也检测出许多降低(或者，在一例中为增加)RNA复制或转录的突变。任何这些突变都可插入此处所述的基因组或反基因组中，使工程化表达免疫调节分子的重组RSV被进一步修饰。利用RSV微基因组，可辅助完整的反基因组cDNA对反式作用蛋白和顺式作用RNA序列的评价和操作(参见，如，Grosfeld等，J.Virol.695677-5686，1995，在此引用作为参考)，这种依赖辅助的状态对于过于抑制而在非复制依赖性的感染性病毒中难以回收的突变的定性是有用的。
可引入工程化表达免疫调节分子的重组RSV内的其它突变包括基因组3’末端被其反基因组的对应部分替代，随之改变了RNA复制和转录。此外，利用此处所述方法，可以将基因间隔区缩短或延长，或改变序列内容(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.834594-4598，1986，分别在此引用作为参考)，自然存在的基因重叠可以被去除，或改变为不同的基因间隔区(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.845134-5138，1987，分别在此引用作为参考)。一个模式实施方案中，特定RSV蛋白(如保护性F和G抗原)的表达水平可因其天然序列被合成并设计的符合有效翻译的序列替代而增加。文中显示，密码子的使用是哺乳动物病毒蛋白翻译水平的主要影响因素(Haas等，CurrentBiol.6315-324，1996，在此引用作为参考)。对编码RSV F和G蛋白(二者是主要保护性抗原)的mRNA中使用的密码子的检测发现，这种密码子使用导致低效的表达。因此，通过本发明的重组方法，使用最适的密码子，可使所选择基因的表达增加。其它模式实施方案中，选定的RSV基因翻译起始位点周围的序列(优选包括-3位置的核苷酸)被单独或与引入的上游起始密码子组合，通过对翻译的正或负调节，调节RSV基因的表达。
作为一种选择，或与此处所述的其它RSV改变相组合，通过改变该病毒一个选定基因的转录GS信号可以调节被工程改造为表达免疫调节分子的重组RSV。一个模式实施方案中，改变了NS2的GS信号，在其中引入一个确定的突变(如此处所述的404(M2)突变)，对于病毒的复制添加一个ts限制。
其它实施方案中，工程化表达免疫调节分子的重组RSV的基因表达调节发生在转录水平。一个方面中，可将RSV基因图谱中选定基因的位置改为更为接近或远离启动子，从而该基因的表达将分别更高效或更低效。根据这方面，特定基因的表达得以调节，产生比野生型水平降低或增加2倍，更典型的是4倍，上至10倍或更高的基因表达，同时其交互地位置替代基因的表达水平有相当量的下降。一个实例中，NS2(RSV基因图谱中排序为2)替代了SH基因(第6位)的座位，产生了可预期的NS2表达的降低。其它模式实施方案中，F和G基因单独或同时转移到RSV基因图谱中更为接近或远离启动子的位置，分别使基因表达增加和降低。这些和其它移位变化产生具有减毒表型(如因参与RNA复制的选定病毒蛋白表达的降低)或其它期望表型(如抗原表达增加)的新的表达免疫调节分子的重组RSV。
本发明工程化表达免疫调节分子的感染性重组RSV也可根据这里公布的方法和组合物进行工程化，增强免疫原性并诱导比野生型RSV或亲本RSV感染所提供的更强的保护。例如，来自RSV异源株或型或如PIV的非RSV来源的免疫原性表位可通过在编码基因组或反基因组的多核苷酸序列上适当的核苷酸变化，被加入重组克隆。另外，RSV可被工程化地加入或消除(如通过氨基酸插入、替代或缺失)免疫原蛋白、蛋白结构域或与期望或不期望免疫反应相关的特殊蛋白形式(如G蛋白分泌形式)。
本发明方法中，额外的基因或基因组区段可能被插入重组RSV基因组或反基因组中，或其附近。这些基因可与接受基因受相同的调控，或受一套独立转录信号的调控。目的基因包括以上说明的RSV基因和非RSV基因。这能够在数量和质量上改变和提高抗RSV的免疫应答。本发明一个模式实施方案中，异源基因或基因组区段，或非编码的核苷酸序列，插入重组RSV基因组或反基因组中，导致基因组长度的期望的增加，引起额外的期望的表型效果。基因组长度的增加导致产生的RSV减毒，这部分取决于插入的长度。
工程化表达免疫调节分子的重组RSV内缺失、插入、替代和其它涉及全部病毒基因或基因组区段改变的突变，产生非常稳定的候选疫苗，这在免疫抑制个体中尤其重要。这些改变多数导致疫苗株的减毒，其它则特定导致不同类型的期望表型改变。例如，附属(非体外生长所必需的)基因编码特异地干扰宿主免疫的蛋白，是良好的候选疫苗(参见Kato等，EMBO J.16578-87，1997，在此引用作为参考)。疫苗病毒中消除这类基因将降低毒性和致病性，并/或提高免疫原性。
本发明其它方面，从表达cDNA的基因组或反基因组中产生的表达免疫调节分子的感染性RSV，可能是任何RSV或类RSV毒株，如人，牛，或鼠等RSV，或是任何肺病毒，如小鼠的肺炎病毒、鸟类肺病毒(原名火鸡鼻气管炎病毒)。为了创造保护性免疫应答，RSV株可能是对被免疫个体而言的内源物质，如用于免疫人的人RSV。但内源RSV的基因组或反基因组也可被改变，以表达不同来源RSV基因或基因组区段的组合，如不同RSV种，亚型，或株的基因或基因组区段的组合，或一个RSV和另一个呼吸道病原(如PIV)的组合。
本发明的某些实施方案，提供了工程化表达免疫调节分子的重组RSV，其中人或牛RSV(如人RSV背景基因组或反基因组)内的基因或基因组区段被来自非人、非牛的RSV(如鼠RSV)的对应异源基因或基因组区段所替代。其中RSV基因或基因组区段的替代，缺失或添加包括NS1，NS2，N，P，M，SH，M2(ORF1)，M2(ORF2)，和L基因中一种或多种的部分或全部，或G和F基因的部分或全部，优选其不包含主要中和和保护性表位。人或牛RSV顺式作用序列，如启动子或转录信号，也可被非人非牛的对应序列所替代。因此，除牛RSV之外，将给药于人的感染性重组RSV可以是被修饰的人RSV，其包含来自鼠RSV的基因。
人RSV的编码序列(如NS1、NS2、SH或G的编码序列)或非编码序列(如启动子，基因末端，基因起始，基因间隔区或其它顺式作用元件)用对应的牛RSV序列替代，产生具有多种可能的减毒和其它表型效果的嵌合RSV。特别的，宿主范围和其它期望的表型效果来源于用在人RSV背景中替代的牛RSV基因，其中牛RSV基因在人细胞中不能有效发挥功能，如，因为异源序列或蛋白与生物相互作用的人RSV序列或蛋白(即，通常与被替代序列或蛋白协同作用于病毒的转录，翻译，装配等)的不相容性，或更典型的，在宿主范围限制中，与细胞内蛋白或细胞环境(这种环境在许可和许可度较低的宿主中是不相同的)的其它一些方面的不相容性。一个这种实施方案中，嵌合的牛-人RSV包含人RSV NP基因或基因组区段用对应的牛NP基因或基因组区段替代，该嵌合体可任选地构建为具有额外遗传变化，如点突变或基因缺失。模式实施方案中，基于牛RSV结构和功能的已知方面，选择牛RSV序列引入人RSV中(Pastey等，J.Gen.Virol.76193-197，1993；Pastey等，Virus Res.29195-202，1993；Zamora等，J.Gen.Virol.73737-741，1992；Mallipeddi等，J.Gen.Virol.742001-2004，1993；Mallipeddi等，J.Gen.Virol.732441-2444，1992；Zamora等，VirusRes.24115-121，1992，分别在此引用作为参考，并于此处所述一致)。
本发明其它实施方案中，引入工程化表达免疫调节分子的重组RSV的目的突变，来自适应组织培养的非病原性鼠肺病毒株(人RSV的鼠对应物，其缺乏G蛋白的细胞质尾区)(Randhawa等，Virology207240-245，1995)。相应的，本发明的一个方面，嵌合RSV内的人RSV糖蛋白F，G和SH中的一个或多个的胞质和/或跨膜结构域可被添加，缺失，修饰，或被异源的对应序列(如牛或鼠RSV F，G或SH蛋白的胞质或跨膜结构域)替代，以获得期望的减毒。另一个例子，F蛋白剪切位点处或其附近的核苷酸序列，或G蛋白可能的附着区，可因点突变，位点特异性改变，或涉及整个基因或基因组区段的改变所修饰，使病毒在组织培养中的生长和/或感染性和病原性有新的效果。
本发明更详细的方面，工程化表达免疫调节分子的重组RSV被用做其它病原的保护性抗原的“载体”，所述病原特别是如副流感病毒(PIV)的呼吸道病原。例如，重组RSV可被工程化引入编码来自PIV的保护性抗原的序列，以产生感染性减毒疫苗病毒。PIV cDNA的克隆化和作为本发明补充的其它描述在以下文献中表述名为“从克隆的核苷酸序列制备副流感病毒疫苗”的1998年5月22日的美国专利申请09/083,793(相应于国际申请WO98/53078)，和其优先权1997年5月23日的美国临时专利申请60/047,575；名为“减毒人-牛嵌合副流感病毒疫苗”的1999年7月9日Bailly等的美国专利申请(案卷号15280-399000)，以及名为“通过缺失或消除非必需基因而减毒的人-牛嵌合副流感病毒疫苗”的1999年7月9日Durbin等的美国专利申请(案卷号15280-394000)，分别在此引用作为参考。这些公布包括对可用于产生感染性PIV病毒克隆，或提供用于本发明的PIV基因或基因组区段来源的载体p3/7(131)(ATCC97990)；p3/7(131)2G(ATCC97989)；p218(131)(ATCC97991)；遵循布达佩斯条约，各材料保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801 UniversityBoulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，USA，并给出以上的保藏号。
根据本发明这一方面，提供了这种工程化表达免疫调节分子的重组RSV，其包含至少一种PIV序列，例如包含来自PIV1和PIV2中任一或二者，或PIV1和PIV3中任一或二者的多核苷酸。RSV的单个基因可能被人PIV的对应部分所替代，如PIV1，PIV2，或PIV3的F糖蛋白基因。或者，选择的异源基因组区段(如，编码胞质尾，跨膜结构域或胞外域的基因组区段)可能替代如RSV中同一基因的或RSV中不同基因的对应基因组区段，或替代到RSV基因组或反基因组非编码序列内。一个实施方案中，HPIV3 F基因的一个基因组区段替代对应的人RSV基因组区段，产生编码嵌合蛋白的构建体，这种嵌合蛋白如具有RSV胞质尾和/或跨膜结构域与PIV胞外域融合的融合蛋白，以产生新的减毒病毒，和/或同时抗PIV和RSV的多价疫苗。或者，一个或多个PIV基因或基因组区段可以被添加到部分或完整的嵌合或非嵌合的RSV基因组或反基因组中。
除了上述对于工程化表达免疫调节分子的重组RSV的修饰外，可在RSV克隆中制造不同的或额外的修饰，以利于操作，如在各基因间隔区域或别处，插入唯一的限制性位点(如G和F基因间插入唯一的StuI位点)。不翻译的基因序列可以被去除已增加容纳外源基因的能力。
本发明其它方面中，提供了产生分离的感染性RSV疫苗病毒的组合物(如具有编码工程化表达免疫调节分子的重组RSV的一个或多个cDNA的分离的多核苷酸和载体)。利用该组合物和方法，感染性RSV来自RSV基因组或反基因组，核壳蛋白(N)，核壳磷蛋白(P)，大的聚合酶蛋白(L)和RNA聚合酶延伸因子。本发明相关方面中，提供了将前述结构和表型改变引入重组RSV中以产生感染性减毒的疫苗病毒的方法和组合物。
可利用多种已知方法，将之前定义的突变引入工程化表达免疫调节分子的重组RSV的感染性克隆中。关于DNA的“感染性克隆”，是指合成或其它来源的cDNA或其产物，其可转录出作为产生感染性病毒或亚病毒颗粒基因组的模板的基因组或反基因组RNA。因此，可以利用传统方式(如定点诱变)将定义的突变引入基因组或反基因组的cDNA拷贝。使用基因组或反基因组cDNA的亚片段装配此处所述的完整基因组或反基因组cDNA的优势是，每个区域都可以分别操作(越小的cDNA越易装配)，因此易于装配出完整cDNA。因此，该完整基因组或反基因组cDNA，或其任何亚片段可用作寡核苷酸定向诱变的模板。这可通过以下方式完成通过单链噬菌粒形式介导(如使用伯乐实验室(Richmond，CA)的Muta-gene试剂盒)，或通过直接用双链噬菌粒做模板(如使用Strategene(La Jolla，CA)的Chameleon诱变试剂盒)的方法，或通过用包含目的突变的寡核苷酸引物或模板中任何的一个进行聚合酶链式反应。然后可以将一个突变的亚片段装配于该完整基因组或反基因组cDNA中。还有许多已知并可得的产生突变的技术，可用于在RSV基因组或反基因组cDNA中产生目的突变。突变范围不一，可以从单核苷酸改变到包含一个或多个基因或基因组区段的大cDNA片段的替代。
因此，在一个作为范例的实施方案中，利用伯乐的Muta-gene噬菌粒体外诱变试剂盒引入突变。简述如下，编码RSV基因组或反基因组一部分的cDNA克隆进质粒pTZ18U中，并转化CJ236细胞(LifeTechnologies)。按生产商的建议制备噬菌粒制剂。通过在该基因组或反基因组的需要位点引入一个改变的核苷酸，设计出用于诱发突变的寡核苷酸。扩增带有遗传改变的基因组或反基因组的质粒，确认其序列，然后突变片段被重新引入该全长基因组或反基因组克隆。
在感染性RSV中引入确定的突变有多种应用，包括RSV分子生物学和病原性分析。例如，引入消除或降低其表达水平的突变，或引入产生突变蛋白的突变，可以研究和操纵RSV蛋白的功能。以下的一个模式实施方案中，构建了重组RSV，其中一个病毒基因(即SH基因)的表达因mRNA编码序列和侧翼转录信号的缺失而消除。令人惊讶的是，不仅该病毒可以回收，也可以在组织培养中有效生长。事实上，根据感染性病毒产量和噬菌斑大小，发现其生长显著高于野生型的生长。本发明SH缺失和其它RSV衍生物在组织培养中增加的生长提供了发展RSV疫苗的有用工具，其克服了RSV病毒在组织培养中产量低的问题(在其它系统中疫苗病毒的生产较为棘手)。这种缺失高度稳定地抗遗传回复，使由此获得的RSV克隆特别适合用做疫苗制剂。
本发明也提供了从分离的一种或多种多核苷酸分子(如一种或多种cDNA)产生工程化表达免疫调节分子的重组RSV。根据本发明，构建编码RSV基因组或反基因组的cDNA，使其与必需的病毒蛋白在细胞内或体外共表达以形成感染性RSV。“RSV反基因组”是指作为子代RSV基因组合成模板的分离的正义多核苷酸分子。优选，构建的cDNA是相应于复制中间体RNA的正义RSV基因组或反基因组，以降低其与编码产生转录复制核壳所必需蛋白的互补序列(即编码N，P，L，和M2(ORF1)蛋白的序列)的正义转录本杂交的可能。RSV微基因组系统中，基因组或反基因组在拯救中有同样的活性，无论由RSV或质粒补充，显示基因组或反基因组都可被使用，因此选择可以基于方法学或其它来进行。
天然的RSV基因组典型地包含一种负义多核苷酸分子，其通过互补的病毒mRNA，编码11个已知的病毒蛋白，即，非结构蛋白NS1和NS2，N，P，基质蛋白(M)，小疏水蛋白(SH)，糖蛋白(G)，融合蛋白(F)，M2(ORF1)，M2(ORF2)和L，主要说明于以下文献(Mink等，Virology 185615-624，1991；Stec等，Virology 183273-287，1991；Connors等，Virology 208478-484，1995；Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9381-85，1996，分别在此引用作为参考。认为这11个蛋白中的一种或多种可能以独特的结构形式(可能具有功能差异)表达，一个或多个独特蛋白种仍然未发现。
对本发明来说，重组RSV基因组或反基因组仅需要包含对所编码的病毒或病毒颗粒的感染性所必需的基因或其部分。此外，该基因或其部分可以多于一种多核苷酸分子的形式提供，即，基因可以通过互补或类似方法来源于单独的核苷酸分子，或可直接由基因组或反基因组cDNA表达。
重组RSV是指一种RSV或RSV类的病毒或亚病毒颗粒，其直接或间接来自重组表达系统，或由从重组表达系统中产生的病毒或亚病毒颗粒中增殖产生。该重组表达系统具有包含可操作地连接的转录单位的重组表达载体，该转录单位具有对RSV基因表达有调控作用的至少一个遗传元件，如启动子、可转录为RSV RNA的结构或编码序列，以及合适的转录起始和终止序列。
为了从已表达出cDNA的RSV基因组或反基因组中获得感染性RSV，将该基因组或反基因组与那些在以下情况中必需的RSV蛋白共表达，这些情况为(i)产生可进行RNA复制的核壳；(ii)使子代核壳可进行RNA复制和转录。这种基因组核壳的转录提供了其它RSV蛋白，并引发有效感染。另外，共表达也可提供有效感染所须的其它RSV蛋白。
通过排列克隆的cDNA区段(其集合代表了完整的反基因组)，RSV mRNA或基因组RNA反转录拷贝的聚合酶链式反应(PCR述于美国专利4,683,195和4,683,202中和PCR方案方法和应用指导(PCRProtocolsA Guide to Metheds and Applications.)，Innis等，学术出版社，San Diego，1990，分别在此全文引用作为参考)或同类，构建用于本发明的RSV反基因组。例如，具有从合适的启动子(如T7 RNA聚合酶启动子)和与SH基因互补的前导序列开始的反基因组左手末端的cDNA，可以在适当的表达载体中装配，如质粒(如pBR322)、各种可得的装配型质粒、噬菌体或DNA病毒载体。载体可通过诱变和/或合成多接头的插入而被修饰，这种多接头带有便于装配的唯一的限制性位点。例如，此处所述质粒载体来源于pBR322，其PstI-EcoRI片段被一段具有方便的限制性酶位点的合成DNA所替代。pBR322做载体可以稳定RSV序列的核苷酸3716-3732，否则其保持核苷酸的缺失或插入，质粒在细菌菌株DH10B中繁殖，以避免核苷酸4499附近产生的人造的重复和插入。G，F，和M2基因可以装配于分别的载体中，以便于制备，L和非转录尾序列也如此。反基因组质粒的右手末端(如L和非转录尾序列)可根据要求包含额外的序列，如侧翼的核酶和串联T7转录终止子。核酶可以是锤头型(产生具有单个非病毒核苷酸的3’末端) (如Grosfeld等，J.Virol.695677-5686，1995)，也可以是任何其它适合的核酶(如δ肝炎病毒的核酶，产生没有非病毒核苷酸的3’末端)(Perrotts等，Nature 350434-436，1995)。一个中间片段(如G到M2片段)被插入前导区-SH质粒上合适的限制性位点，该质粒又是L-尾区-核酶-终止片段的受体，产生一个完整的反基因组。此处所述的一个模式例子中，前导区末端构建为邻近T7 RNA聚合酶的启动子，其包括最优活性所需的3个转录的G残基；转录时贡献这三个非病毒的G到该反基因组5’末端。3个非病毒的G残基可被省略，以产生一个没有非病毒残基的5’末端。非转录尾区末端构建到锤头状核酶附近，当其剪切时，将贡献一个单3’-磷酸化的U残基到所编码RNA的3’末端，产生一个呼正确的3’末端。
本发明的某些实施方案中，编码生产转录和翻译的RSV核壳中必需蛋白的互补序列由一种或多种辅助病毒提供。辅助病毒可以是野生型或突变型。优选，该辅助病毒与RSV cDNA编码的病毒在表型上可区分。例如，希望提供与该辅助病毒免疫反应，而不与RSV cDNA编码的病毒反应的单克隆抗体。抗体可以是中和抗体。一些实施方案中，可使用抗体中和辅助病毒背景以便于重组病毒的检出和回收，或利用抗体亲和层析，将辅助病毒从重组病毒中分离。可将突变引入RSVcDNA，使该重组RSV与中和抗体无反应性或对其具有抗性。
可在工程化表达免疫调节分子的重组RSV基因组或反基因组中制造各种核苷酸插入和缺失，以产生合适减毒的克隆。野生型人RSV基因组的核苷酸长度(15,222个核苷酸)是6的倍数，副粘病毒和麻疹病毒属的成员典型地遵循“6规则”，即基因组(或微基因组)只有在其核苷酸长度是6的倍数(被认为是相对于包壳NP蛋白，核苷酸残基精确间隔的要求)才能有效复制。单个残基的增加对于RSV基因组长度的改变没有复制效率的影响，传代后对几种不同微基因组突变体的序列分析显示长度的差异因没有补偿性改变而保持。因此，RSV缺乏基因组长度作为6的倍数的限制要求，可以在RSV基因组中进行核苷酸插入或缺失而不破坏本发明重组RSV的复制。
构建编码工程化表达免疫调节分子的重组RSV基因组或反基因组的cDNA的其它方法，包括以改进PCR条件以使亚单位cDNA成分降低至一或两个的反转录PCR(如，在Cheng等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 915695-5699，1994；Samal等，J.Virol.705075-5082，1996中所述的，在此引用作为参考)。其它实施方案中使用不同的启动子(如T3，SP6)或不同的核酶(如δ肝炎病毒的核酶)。增殖可使用不同的DNA载体(如装配型质粒)，以更能容纳大的基因组或反基因组。
RNA复制所必需的N，P，和L蛋白的进行性转录需要如M2(ORF1)蛋白的RNA聚合酶延伸因子。产生感染性RSV需要M2(ORF1)或在负链RNA病毒中基本上等价的转录延伸因子，其在有效感染过程中也是功能性核壳的成分之一。对M2(ORF1)蛋白的需要与其作为转录延伸因子是符合的。负链RNA病毒需要表达RNA聚合酶延伸因子蛋白是本发明的一个特点。M2(ORF1)可由完整M2-基因的表达提供，通过基因组或反基因组，或二者的共表达(尽管这种形式时第二个ORF2也可能表达，并因此对病毒的回收有抑制效果)。因此，对于利用完全的M2基因产生感染性病毒，应平衡两个ORF的活性，使M(ORF1)足量表达，提供转录延伸的活性，而M(ORF2)表达量少，不足以抑制RNA的复制。或者可以由工程化改变的缺乏ORF2或编码缺陷型ORF2的cDNA提供ORF1蛋白。病毒生产的有效性可因额外病毒蛋白基因的共表达而提高，如编码包膜组分的蛋白(即SH，M，G，F蛋白)。
为获得工程化表达免疫调节分子的感染性重组RSV，编码重组M2 ORF2缺失和剔除突变RSV基因组或反基因组的分离的多核苷酸(如cDNA)，被独立或顺式地与N，P，L，M2(ORF1)一同表达，包括从cDNA基因组或反基因组表达。该多核苷酸通过转染、电穿孔、机械插入、转导或其它类似方式插入合适的细胞，转染细胞是能够支持有效PIV感染的，如HEp-2、FRhL-DBS2、MRC和Vero细胞。分离的多核苷酸序列的转染可通过磷酸钙介导的转染(Wigler等，Cell14725，1978；Corsaro和Pearson，Somatic Cell Genetics 7603，1981；Graham和Van der Eb，Virology 52456，1973)、电穿孔(Neumann等，EMBO J.1841-845，1982)、DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等，ed.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，NewYork，1987)、阳离子脂介导的转染(Hawley-Nelson等，Focus 1573-79，1993)、或商业化转染试剂LipofectACE(Life Technologies)引入培养细胞中(上述文献在此全文引用作为参考)。
N，P，L和M2(ORF1)蛋白由一个或多个cDNA和表达载体编码，或由二者组合编码，表达载体可能与编码该基因组或反基因组的相同，也可能不同。此外，一种或多种蛋白，特别是M2-1蛋白，可直接由该反基因组或基因组提供(Collins等，Virology 259251-258，1999，在此引用作为参考)。也可根据需要包含其它蛋白，由其自身载体编码，或由编码N，P，L或M2(ORF1)蛋白和/或该完整的基因组或反基因组的载体编码。转染质粒中该基因组或反基因组和蛋白可由T7 RNA聚合酶启动子控制下的各cDNA表达，而T7 RNA聚合酶启动子又由T7 RNA聚合酶表达系统的感染，转染或转导提供，例如表达T7 RNA聚合酶的痘苗病毒MVA株重组体(Wyatt等，Virology210202-205，1995，在此引用作为参考)。这些病毒蛋白和/或T7 RNA聚合酶也可通过转染哺乳动物细胞，或构造的mRNA或蛋白的转染提供。
或者，反基因组或基因组的合成可以在体外(无细胞)组合的转录-翻译反应中进行，然后转染细胞。或者反基因组或基因组RNA可以在体外合成，并转染表达RSV蛋白的细胞。
根据本发明选择候选疫苗病毒时，用已知的方法决定活性、减毒性和免疫原性的标准。最希望用于本发明疫苗的病毒必须有活性，稳定的减毒表型，在免疫宿主体内有复制(即使水平低)，并在受接种者中有效地诱导免疫应答的产生，足以赋予对之后野生型病毒感染所导致的严重疾病的抵抗性。与基于其它已知的减毒RSV的报道结果相反，本发明的病毒不仅有活性，比先前的候选疫苗更适合地减毒，而且在体内遗传上更稳定----仍具有刺激保护性免疫应答的能力，有时，因多重修饰的存在可将这种保护扩展，如，诱导抗不同病毒株系或亚型的保护，或由不同的免疫基础赋予这种扩展的保护，如分泌型与血清型免疫球蛋白，细胞免疫，以及其它类似情况。在本发明之前，ts表型在体内复制后的遗传不稳定性对于ts病毒是非常普遍的(Murphy等，Infect.Immunol.37235-242，1982)。
使用许可RSV生长的多种细胞系，以繁殖工程化表达免疫调节分子的重组RSV，用做疫苗或其它方面。RSV可在多种人和动物细胞中生长。繁殖用于疫苗的减毒RSV病毒的优选细胞系包括DBS-FRhL-2，MRC-5和Vero细胞。在表皮细胞系，如Vero细胞中，通常可获得最高的病毒产量。典型的，细胞接种感染复数约0.001到1.0或更高的病毒，在许可病毒复制的状态下培养，如约30-37℃培养约3-5天，或直到达到足够的效价。病毒从细胞培养物中获取，与细胞成分分离，典型的是通过已熟知的分离方法，如离心，并可能利用本领域技术人员熟知的方法进一步纯化。
工程化表达免疫调节分子的重组RSV，以及那些被满意减毒和此处所述其它修饰的重组RSV，可以在多种被熟知并普遍认可的体内和体外模型中检测，以确认疫苗使用中的足够减毒、对表型回复的抗性、和免疫原性。体外分析中，对修饰了的病毒(如多重减毒的，生物学来源，或重组RSV)测试如病毒复制的温度敏感性(即ts表型)或小噬菌斑表型。修饰了的病毒进一步在RSV感染的动物模型中测试。在此引用的文献中描述了多种动物模型(Meignier等编辑，呼吸道合胞病毒感染的动物模型(Animal Models of Respiratory Syncytial VirusInfection)，Merieux Foundation Publication，1991，在此引用作为参考)。US4,800,078和Prince等，Virus Res.3193-206，1985(在此引用作为参考)中描述了RSV感染的一种棉鼠模型，其被认为可预测在人和非人灵长类中的减毒和效果。此外，利用猩猩的RSV感染灵长类模型可预测其在人中的减毒和效果，以下文献做了描述(Richardson等，J.Med.Virol.391-100，1978；Wright等，Infect.Immun.37397-400，1982；Crowe等，Vaccine 111395-1404，1993，分别在此引用作为参考)。
评价RSV候选疫苗的减毒和感染性的RSV模型系统(包括啮齿类和猩猩)在本领域被广泛认可，从中获得的数据与RSV感染和减毒是非常一致的。对于候选疫苗在猩猩体内生长较差的情况(如RSV亚型B病毒)，特别应使用小鼠和棉鼠模型。
与以上所述一致并基于以下的实施例，本发明还提供含有用于疫苗的、工程化表达免疫调节分子的、分离的感染性重组RSV病毒的组合物。作为疫苗一个成分的减毒病毒是分离的和(典型的)纯化的形式。分离的是指处于非野生型病毒所处的天然环境的RSV，如被感染人的鼻咽处。更常见的，分离的是指包括该减毒病毒为细胞培养或其它人工培养基成分，在其中其可复制，并在控制的背景下定性。例如，本发明的减毒RSV可在感染的细胞培养物中产生，从细胞培养物中获得分离，并加入稳定剂。
本发明RSV疫苗包含作为活性成分的按此处所述方法产生的具有效免疫原性量的RSV。生物学来源的或重组的RSV可直接用于疫苗制剂中，或冷冻干燥。冻干的病毒典型的保存在约4℃。使用前，冻干的病毒重溶于稳定性溶液中(如盐溶液、SPG、Mg++和HEPES)，也可能存在或不存在佐剂，以下将进一步说明。重组地修饰的病毒可与一种生理上可接受的载体和/或佐剂共同引入宿主。本领域已知的可用的载体有例如，水、缓冲的水、0.4％盐、0.3％甘氨酸、透明质酸等。得到的水溶液可以立即包装使用，或冷冻干燥，冻干的制剂在给药之前与无菌溶液混合，方法如上所述。根据要求，组合物可能包含药学上可接受的辅助物质以使其接近生理状态，如pH调节和缓冲剂、渗涨度调节剂、湿润剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。可接受的佐剂包括本领域已知的不完全弗氏佐剂、磷酸铝、氢氧化铝或明矾。优选的佐剂也包括StimulonQS-21(Aquila Biopharmaceuticals，Inc.，Farmingham，MA)，MPL(3-O-去乙酰单磷酸脂质A；RIBIImmunoChem Research，Inc，Hamilton，MT)和IL-12(遗传研究所，剑桥，MA)。
用如上所述的重组RSV疫苗组合物经喷雾、滴加、口服、局部或其它途径免疫后，宿主的免疫系统产生特异于一种或多种RSV病毒蛋白(如F和/或G糖蛋白)的抗体作为应答。接种后，宿主对RSV的感染具有至少部分或完全的免疫，或具有对轻微或严重PIV感染的抗性，尤其在下呼吸道中。
本发明RSV疫苗可包括减毒病毒，其诱导抗单RSV株或抗原亚型(如A或B)，或抗多个RSV株或抗原亚型的免疫应答。文中，RSV可诱导单特异性的免疫应答，或抗多种RSV株或抗原亚型的多特异性免疫应答。此外，具有不同免疫原特性的RSV可组合成疫苗混合物，或在协同治疗方案中分别给药，以引发更有效的抗一个RSV毒株或抗多个RSV毒株或亚型的保护。
疫苗给药的宿主可以是任何对RSV或其它近源病毒感染敏感，且能对接种病毒的抗原产生保护性免疫应答的哺乳动物。因此，合适的宿主包括人，非人灵长类，牛，马，猪，绵羊，山羊，兔，啮齿类等。相应的，本发明提供了制作多种用于人和动物的疫苗的方法。
包含工程化表达免疫调节分子的减毒重组RSV的疫苗组合物以“有效免疫原性量”给药对RSV敏感或易受RSV感染攻击的宿主，以诱导或增强该宿主抗RSV的免疫应答能力。对人而言，本发明减毒的病毒的给药依据成熟的人RSV疫苗方案，如以下文献所述(Wright等，Infect.Immun.37397-400，1982；Kim等，Pediatrics 5256-63，1973；Wright等，J.Pediatr.88931-936，1976，分别在此引用作为参考)。简述如下，成人或儿童经鼻内滴剂接种有效免疫原性量的RSV疫苗，典型地是在0.5ml生理可接受的稀释剂或载体中。与腹膜内免疫不复制性病毒相比，其简单和安全。也提供对局部呼吸道免疫的直接刺激，这对RSV的抗性非常重要。此外，这种方式的免疫有效地避免了RSV特异的母体来源血清抗体的免疫抑制效果(典型地存在于极小的幼儿中)。RSV抗原的腹膜内给药有时产生免疫病理的并发症，而这在活病毒中从未观察到。
所有个体中，给药的RSV精确剂量及给药间隔和次数依赖于患者健康状态和体重、给药方式、制剂性质等，但一般范围是从每个患者约103-106噬菌斑形成单位(PFU)或更多PFU，如107-108PFU病毒，常见的是每个患者约104-105噬菌斑形成单位PFU的病毒。任何情况时，疫苗制剂应提供足量的减毒RSV，以有效刺激或诱导抗RSV的免疫应答，如可通过补体活化、噬菌斑中和和/或酶联免疫分析，及其它方法进行确定。这方面，也需要监视个体是否有上呼吸道疾病出现的迹象和症状。对给药猩猩，该减毒的疫苗病毒在受接种者鼻咽中的复制水平，比野生性病毒低约10倍或更低，比不完全减毒RSV低约10倍或更低。
新生儿和幼儿中，需要多次给药以诱导足够水平的免疫。给药开始于出生后第一个月，儿童期按需要间隔给药，如隔2个月，6个月，1年，2年，以维持对天然(野生型)RSV感染的足够抗性。相似的，对重复性或严重RSV感染特别敏感的成人可能需要多次免疫以建立和/或维持保护性免疫应答，包括医务工作者、护理工作者、家庭中有儿童的成员、老人、心肺功能损坏的个体。诱导的免疫水平可通过检测中和分泌和血清抗体确定，并需要调整剂量或重复接种以维持合适的保护水平。进一步，不同的疫苗病毒给药不同的受体组。例如，表达细胞因子或其它富含T细胞表位的蛋白的工程化RSV株可能特别适宜成人，而非幼儿。或者对于年老的受接种者选择低水平的减毒的疫苗。根据本发明产生的RSV疫苗，可与表达其它RSV株或亚型抗原的病毒组合，达到抗多种RSV株或亚型的保护。或者，该疫苗病毒可将多种RSV株或亚型的保护性表位，工程化引入此处所述的一个RSV克隆中。
典型的，当使用不同疫苗病毒时，将以混合物形状同时给药，但也可以单独给药。例如，两种RSV亚型的F糖蛋白仅有约10％的氨基酸序列差异，这种相似性是免疫了RSV或F抗原并受一种异源株攻击的动物中观察到的交叉保护免疫应答的基础。因此，一种株系的免疫可产生抗相同或不同亚型的不同株的保护。但最佳的保护可能需要同时抗两亚型的免疫。
工程化表达免疫调节分子的重组RSV可诱导抵抗因后来感染野生型RSV所产生的严重下呼吸道疾病(如肺炎和细气管炎)的免疫应答。尽管这种自然循环的病毒仍有感染性，特别在上呼吸道，其接种导致鼻炎发病几率的降低，以及对后来的野生型感染增强的抗性。接种后，出现可检测水平的宿主产生的可在体外和体内中和同源(同一亚型)野生型病毒的血清和分泌型抗体。许多情况下宿主抗体也能中和不同的非疫苗亚型的野生型病毒。
本发明优选的RSV候选疫苗显示比在人体内自然循环的野生型病毒显著降低的毒性。该病毒足够减毒使感染症状在大多数免疫个体中不发生。一些情况时，该减毒病毒仍然可能传播到未经免疫的个体中。但由于其毒性充分消除，在免疫和偶见宿主中不会发生严重的下呼吸道感染。
工程化表达免疫调节分子的重组RSV减毒水平的确定是通过例如定量被免疫宿主呼吸道中的病毒量，并将其与野生型PIV或其它被认为是候选疫苗株的减毒PIV的相应量比较。例如，在高度敏感的宿主(如猩猩)上呼吸道中，本发明的减毒病毒复制与野生型病毒复制水平相比，被很大程度地限制，如降低5-10，20-50，100-1000倍或降低更多倍。减毒RSV疫苗株在猩猩上呼吸道中的复制水平比RSV A2ts-1突变体(之前的研究表明其在血清反应阴性的幼儿中不完全减毒)低。为了进一步降低鼻液溢的发展(其与病毒在上呼吸道中的复制相关)，一个理想的候选疫苗病毒应表现在上和下呼吸道复制水平都降低的性质。但为了赋予免疫个体以保护效果，本发明的减毒病毒应在人中有足够的感染性和免疫原性。确定RSV在感染宿主鼻咽中的水平的方法是本领域所熟知的。样品获自抽吸或冲洗鼻咽分泌物，病毒在组织培养或其它培养中通过实验室方法定量。参见，如Belshe等，J.Med.Virology 1157-162，1977；Friedewald等，J.Amer.Med.Assoc.204690-694，1968；Gharpure等，J.Virol.3414-421，1969；Wright等，Arch.Ges.Virusforsch 41238-247，1973，分别在此引用作为参考。可方便地检测宿主动物(如猩猩)鼻咽中的病毒。
有时可能需要将包含工程化表达免疫调节分子的重组RSV的本发明RSV疫苗，与诱导对其它物质(特别是其它的儿童期病毒)抗性的保护性应答的疫苗组合。例如，本发明的一个重组RSV可与PIV疫苗同时给药，如Clements等所述(J.Clin.Microbiol.291175-1182，1991，在此引用作为参考)。本发明的另一方面，重组RSV可用做其它呼吸道病原如PIV的保护性抗原的载体，方法是在用于产生感染性RSV的RSV基因组或反基因组中引入编码这些保护性抗原的序列。
以下为说明目的提供了一些实施例，并非是对本发明的限制。简述如下实施例I构建并定性表达γ干扰素的重组RSVγ干扰素(IFNγ)，一种II型干扰素，由T细胞和自然杀伤(NK)细胞产生，具有多种生物学效果(综述参见文献1和2)。IFNγ具有内在的抗病毒活性，正调节主要组织相容性I型和II型分子的表达，激活巨噬细胞和NK细胞，对于T辅助(Th)细胞的增殖具有重要的调节作用。基于细胞因子分泌的方式，区分出两个鼠Th细胞亚型Th1亚型，其标志细胞因子包括IL-2和IFNγ，Th2亚型，其标志包括IL-4，IL-5，IL6，和IL-10。IFNγ优选的抑制Th2细胞的增殖，因此有利于Th1应答。
本实施例中，构建了一种感染性重组(r)人RSV(rRSV/mIFNγ)，其作为独立基因插入到G-F基因间隔区编码鼠(m)IFNγ。感染了rRSV/mIFNγ的培养细胞分泌的mIFNγ为22mg/106细胞。rRSV/mIFNγ在小鼠上下呼吸道中的复制比野生型(wt)RSV的分别降低63倍和20倍，而不是具有氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因作为添加基因的对照嵌合rRSV的复制。因此，体内rRSV/mIFNγ减毒归功于mIFNγ的活性，而非该添加基因本身的存在。小鼠对随后野生型RSV的攻击有完全的抗性。尽管其生长限制，rRSV/mIFNγ对小鼠的感染在第56天诱导RSV特异的抗体水平相当于，或高于wt RSV感染所诱导的抗体水平。与通过wt RSV诱导相比，感染了rRSV/mIFNγ的小鼠在其肺部产生高水平的IFNγ mRNA和增加IL-12 p40 mRNA量，而其它被检测的细胞因子mRNA没有改变。由于RSV的减毒典型地伴随有免疫原性的降低，由rRSV表达IFNγ代表一种减毒方法，其免疫原性可被保持而非降低。质粒构建利用寡核苷酸通过PCR方法将RSV基因起始和基因终止信号连接到mlFNγ cDNA上，TATA ATGGGGCAAAT (SEQ ID NO．1) (正义，XmaI位点黑体表示，RSV基因起始序列下划线，特异于mIFNγ基因5’末端部分的序列斜体，起始密码子为黑体斜体)，以及ATTA AATTTTTAATAACT (SEQ ID NO.2) (反义，XmaI位点黑体表示，RSV基因终止序列下划线，特异于mlFNγ基因3’末端部分的序列斜体，终止密码子的补码为黑体斜体)。PCR产物克隆在质粒pUC19中，确认其序列，再次克隆于先前所述反基因组质粒D46/1024 XmaI位点中(13，图1)。RSV特异性和Ig同种型特异性的酶联免疫吸附分析(ELISA)覆盖纯化RSV F糖蛋白(4gg/ml)的96孔板于四倍稀释度的小鼠血清共同培养，然后与以下生物素偶连的同种型特异性大鼠抗小鼠抗体(i)IgGlκ抗IgG1重链，(ii)IgG2aκ，异型IgΚ-1A，抗IgG2a重链，和(iii)IgM单克隆抗体克隆LO-MA-7抗IgA重链(精确化学和科学公司，NY)。平板与连接到碱性磷酸酶的链亲和素(LifeTechnologies，MD)培养，然后与对硝基苯基磷酸溶液反应(Sigma，MO)。试剂与指定同种型的特异性用抗以下商业来源的纯化鼠单克隆抗体ELISA确认，SC)；IgG1(MOPC21)，IgG2a(RPC5)，IgG3(FLOPC21)(Cappel/Organon Teknika，PA)，IgG2b(MOPCI41)，IgA(TEPCI5)，和IgM(MOPCI04E)(Litton Bionetics，SC)。用被测试血清的稀释液与F覆盖的平板孵育，再与特异于小鼠IgG、并连接到碱性磷酸酶(Capple)的羊IgG孵育，最后与对硝基苯基磷酸溶液反应，检测总IgG。使用Vmax动力微效价读取仪(Molecular Devices)进行ELISA测定。构建和回收表达mIFNγ,的rRSV编码mlFNγ的一个cDNA克隆被修饰，使其侧翼为RSV基因起始和基因终止转录信号(图1)。该嵌合的转录盒被插入反基因组cDNAD46的G-F基因间隔区，该区已被修饰，含有一个唯一的XmaI位点13.Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996。具有mIFNγ插入的该嵌合RSV反基因组RNA全长15,729个核苷酸，编码11个mRNA，从3’到5’的排列计算mIFNγ是第8个。如前所述，从转染的cDNA中回收得到rRSV/mIFNγ(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 9211563-11567，1995)。
rRSV/mIFNγ形成的噬菌斑大小与前述嵌合病毒rRSV/CAT(以前称为D46/1024CAT))的相当，Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996，rRSV/CAT与rRSV/mIFNγ相同，区别仅在于其外源基因编码氯霉素乙酰转移酶(CAT)而非mIFNγ，并且其插入的长度略长(762对507核苷酸)。各嵌合病毒的噬菌斑大小略小于wt RSV的，但噬菌斑形态没有区别。
感染了rRSV/mIFNγ或wt RSV的细胞中分离的多聚(A+)mRNA的Northern印迹分析表明，前者表达预期大小的mIFNγ mRNA。以前曾表明放在非片段化负链RNA病毒中的外源序列在细胞培养中非常稳定(Schnell等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 9311359-11365，1996；Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996)。与之一致，在rRSV/mIFNγ8次传代过程中，对mIFNγ基因的Northern印迹和反转录PCR分析证明其无缺失。体外rRSV/mIFNγ的生长和mIFNγ的生产在HEp-2细胞中比较rRSV/mIFNγ，rRSV/CAT，wt RSV的生长特征(图2)。rRSV/CAT被选用作为额外的对照，因为其在相同的基因组位置具有相似大小的插入。这两个嵌合病毒生长比wt RSV慢，最终效价也低。例如，rRSV/mIFNγ在感染后40小时获得的最高效价为106.4PFU(噬菌斑形成单位)/ml，比较wt RSV在感染后48小时的最高效价为107.6PFU，显示降低了16倍。
在感染后不同时间点，分析覆盖感染rRSV/mIFNγ或rRSV/CAT的HEp-2细胞的培养基中mIFNγ(图3)。感染后8小时(最早的检测时间)mIFNγ的浓度为0.1ng/ml，40小时后为1.8mg/ml，在120小时达到最大值4.4mg/ml，相当于22mg/106细胞。rRSV/mIFNγ在BALB/c小鼠中的复制，免疫原性和保护效率为评价rRSV/mIFNγ在体内的复制，小鼠鼻内感染106PFU的rRSV/mIFNγ、rRSV/CAT或wt RSV。动物在感染后3，4或5天被处死，噬菌斑分析测定病毒在上(鼻甲)、下(肺)呼吸道的浓度。rRSV/mIFNγ在上下呼吸道中的复制分别比wt RSV降低63倍和20倍(图4)。相反，rRSV/CAT与wt RSV的复制无显著区别，表明相当大小的额外外源基因的存在其本身并不能使RSV复制在小鼠中减毒。
在第0，28，56天从感染了rRSV/mIFNγ、rRSV/CAT或wt RSV的小鼠中采集血清，并进行RSV特异性和抗体同种型特异性的ELISA分析和RSV中和分析(表1)。病毒诱导的IgA抗体水平没有显著不同。与感染wt RSV或rRSV/CAT的动物相比，感染rRSV/mIFNγ的小鼠中特异于RSV F蛋白的总IgG在第56天有显著的增加(4倍)，而第28天没有此现象。第28天病毒间IgG1抗体的效价无显著差异，但第56天以rRSV/mIFNγ免疫小鼠IgG1的平均效价高于以wt RSV(倒数12.1 log2对9.3 log2；p＜0.05)或rRSV/CAT免疫小鼠。相反，第56天以rRSV/mIFNγ免疫小鼠IgG2a的平均效价与以wt RSV免疫小鼠相比降低了(9.6 log2对11.6 log2；p＜0.001)。与wt RSV和rRSV/CAT相比，以RSV/mIFNγ感染小鼠中和抗体效价在第28天有少量减低，但在第56天则偏高(12.3对11.6，log2；p＜0.2)。
为评价保护效率，第56天从上述组中取出5只小鼠，攻击每只小鼠，在其鼻内滴加106PFU的wt RSV。4天后处死小鼠，收集鼻甲和肺用于病毒定量分析。在先前感染rRSV/mIFNγ的小鼠中未检测到攻击病毒，在先前感染wt RSV的动物上呼吸道仅发现极低水平的复制。
表1.在第0(免疫前)，28，56天RSV血清抗体效价(倒数平均值log2±标准误差)a
a各组使用8只小鼠。第56天的抗体效价在独立的分析中测定。
b由于个体样品的高度多样性，相对于wt RSV对照的差异在统计学上不显著(斯氏t-检验)c，d，e，f与wt RSV对照相比斯氏t-检验计算统计学的差异cp＜0.05；αp＜0.001；ep＜0.02；fp＜0.2。肺细胞因子mRNA在感染了rRSV/mIFNγ或wt RSV的小鼠肺中检测编码所选的细胞因子的mRNA水平，以确定mIFNγ的mRNA合成水平是否增加，以及其合成是否影响其它Th1或Th2细胞因子mRNA的水平。感染了rRSV/mIFNγ、wt RSV或安慰剂的每组5只的小鼠在感染后1和4天被处死，或在第28天接受wt RSV攻击的后1和4天(第29和32天)被处死。分离总的肺RNA，利用商品化的核糖核酸酶保护分析，测定选定细胞因子mRNA(图5)。这种直接分析反映在特定时间目的位点上的mRNA浓度，并排除了由于收集细胞的体外操作所产生的可能假象。测定mRNA水平包括Th1标志细胞因子IL-2和IFNγ，Th2的标志细胞因子IL-4，IL-6，和IL-10，和IL-12 p40蛋白，其是IL-12异源二聚体的可诱导成分。
图5是以所示病毒免疫后4天收集的5只动物肺部IFNγ和IL-12p40 mRNA的放射自显影。在感染了rRSV/mIFNγ的动物中见到mIFNγ的累积增加，并且与感染wt RSV相比，感染了rRSV/mIFNγ的动物中IL-12 p40 mRNA有微量但也是统计学显著的增加。用磷光计定量此处以及其它凝胶中的结果，各组5只小鼠的平均值用相同凝胶道中小鼠L-32管家基因mRNA的百分比来表示(图6)。
wt RSV感染后1或4天观察到(i)Th1细胞因子IFNγmRNA表达，但IL-2不表达；(ii)IL-12 p40 mRNA水平增加；和(iii)Th2细胞因子IL-6和IL-10 mRNA表达。rRSV/mIFNγ感染诱导的细胞因子模式类似wt RSV诱导，除了IFNγmRNA水平在第1和4天更高，尤其在第4天，并且IL-12 p40 mRNA水平在第1和4天也更高。因此，除了在IFNγ和IL-12 p40量的差异，wt RSV和rRSV/mIFNγ诱导相似的Th1和Th2细胞因子模式。病毒攻击(第29和32天)后，免疫了wt RSV或rRSV/mIFNγ的小鼠与模拟免疫的小鼠比较，IFNγ、IL-2、IL-10和IL-12 p40，但不是IL-6，水平也增加了。
作为额外的对照，在同一实验中在腹膜内以福尔马林灭活的RSV免疫另一组动物(Connors等，J.Virol.667444-7451，1992)，并进行相同的收集和攻击方案。初始免疫或感染后，在这种组和其它组中未发现IL-4 mRNA。在被攻击后，接受福尔马林处理的疫苗的组IL-4mRNA极大地增加，而其它组中未发现。
以上的实施例详述了嵌合病毒rRSV/mIFNγ的构建，其从基因顺序位于第8的位置上，介于G-F基因间，一个额外的转录单位以独立mRNA表达mIFNγ基因。该病毒在细胞培养中定向指导高水平的mIFNγ的合成。与wt RSV相比，rRSV/mIFNγ在细胞培养中的生长降低16倍。但这种效果与在rRSV/CAT(在相同的基因位置含CAT基因)中观察到的程度相当。因此，这种体外生长的限制是因外源基因的存在，而非因为其编码产物的活性。并不惊讶mIFNγ表达不抑制人HEp-2细胞中病毒的生长，因为人IFNγ和mIFNγ仅具有40％的氨基酸序列同一性。
rRSV/mIFNγ在BALB/c小鼠上下呼吸道中的复制分别比wt RSV降低63倍和20倍。相反，对rRSV/CAT的平行分析与wt RSV相比无限制，表明rRSV/mIFNγ在体内的减毒并非因为额外基因的存在本身，而是mIFNγ表达的结果。由于这种体内的生长限制发生在感染早期，可能由于表达的mIFNγ对内在免疫的影响，如诱导寡腺苷酸合成酶和产生的抗病毒级联效应，或可能激活NK细胞和巨噬细胞，而非对适应性免疫的影响。rRSV/mIFNγ的生长仅限制了63倍或更少暗示IFNγ不是抗RSV的主要效应物。其它呼吸道病毒，流感A病毒，宿主IFNγ表达对于有效的免疫应答是不需要的，尽管其存在导致偏向Th2的抗体和细胞因子应答(Gramham等，J.Exp.Med.1781725-1732，1993)。
在RSV感染过程中IFNγ共表达是否能进一步使T细胞增殖偏向Th1应答的问题，通过分析细胞因子mRNA模式和RSV特异的抗体同种型得以解决。wt RSV的感染与Th1标志IFNγ(但不是IL-2)，Th2标志IL-6和IL-10，和主要由单核细胞和巨噬细胞产生的IL-12 p40mRNA水平的增加相关。与wt RSV的感染所观察到的相比，rRSV/mIFNγ的感染导致IFNγ mRNA水平的增加，以及稍高(小于两倍)的IL-12 p40 mRNA水平。IFNγmRNA的增加大概至少是部分因为重组病毒的表达。IL-12 p40 mRNA的增加可能是单核细胞/巨噬细胞来源IFNγ介导激活的结果，尽管先前在体外未发现这种情况(D’Andrea等，J.Exp.Med.1761387-1398，1992)。
感染rRSV/mIFNγ的动物和感染wt RSV的动物在其它Th1标记，IL-2，其它Th2标记IL-6或IL-10 mRNA的水平没有显示差异。免疫rRSV/mIFNγ的小鼠和免疫wt RSV的相比，总IgG和IgG1 RSV特异抗体略有增加，后者抗体是Th2应答的一个标志(Snapper等，Fundamental Immunology，ed.Paul，W.E.(Raven Press，New York)，pp.837-863，1993)。IgG2a也略有增加，其是Th2应答的一个标志(Snapper等，Fundamental Immunology，ed.Paul，W.E.(Raven Press，New York)，pp.837-863，1993)。因此，细胞因子和抗体应答都与rRSV/mIFNγ的最初感染或wt RSV后来攻击所增加的对Th1标志的偏向不一致。
wt RSV或rRSV/mIFNγ免疫的小鼠对RSV的攻击有强的抗性。尽管其在体内的生长限制，rRSV/mIFNγ诱导的抗RSV F蛋白的总IgG和中和RSV的血清抗的效价比wt RSV诱导的更高。先前研究(Crowe等，Vaccine 12，783-790，1994)显示以一个候选活减毒病毒疫苗，RSVcpts248/404，接种的猩猩与wt RSV免疫的动物相比，产生的RSV中和抗体的效价较低(7.9log2对11.1log2，9.2倍的差异)，暗示了RSV复制水平与其免疫原性的相关性。尽管病毒复制水平降低，对rRSV/IFNγ的抗体应答总体略有增加，这标志发展活的减毒RSV疫苗非常理想的表型。
如小鼠或棉鼠的啮齿动物积聚有效的抗RSV抗原的免疫应答(Collins等，Vaccine 8164-168，1990)，而当在非人灵长类或人志愿者中评价时，其免疫原性通常更低。这对于小婴儿特别重要，因其抗RSV的抗体应答显示降低(Murphy等，J.Clin.Microbiol.24894-898，1986)。因此由于啮齿类动物对RSV抗原具有更强的免疫应答，对于人非常重要的抗原性差异在啮齿类动物中不经常被发现。此外，RSV在啮齿类动物中的复制被极大地限制了，因此仅小部分肺部细胞被感染，典型地不会产生疾病。很有可能在充分许可的宿主中IFNγ对于减毒，免疫原性或反应原性的影响更大。为评价这一点，本发明构建表达人的IFNγ而非鼠IFNγ的重组RSV。对病毒在猩猩，在RSV复制、疾病和免疫原性方面与人最相似的动物中的评价可以用于调整候选疫苗的减毒及其它特征。使用来自不同种的细胞可以消除一种复杂情况，即在被感染的灵长类培养细胞中表达人细胞因子可能阻碍疫苗的制备。
如上所述，多种细胞因子基因插入了重组DNA病毒，主要是疫苗病毒，表现出减毒、致病性和免疫原性的效应(Ramshaw等，Nature329545-546，1987；Flexner等，Nature 330259-262，1987；Rolf等，Curr.Opin.Immunol.9517-524，1997，综述参见Rolf等，Curr.Opin.Immunol.9517-524，1997)。痘病毒中，表达IFNγ或I型IFN为宿主减毒，但这种减毒伴随有体液免疫应答的降低(Leong等，J.Virol.688125-8130，1994；Bembridge等，J.Virol.724080-4087，1998；Karaca等，Vaccine161496-1503，1998)。缺乏nef基因的猿猴免疫缺陷病毒(SIV)表达IFNγ导致该SIV突变体在猴子中进一步减毒，但该细胞因子插入在复制几周后非常不稳定，减毒也伴随有对SIV糖蛋白体液免疫应答的降低(Giavedoni等，J.Virol.71866-872，1997)。本发明扩展了这种方案，提供抗负链病毒的疫苗。此处的结果表明减毒病毒，同时保持其免疫原性是可能的，先前仅在痘苗病毒载体表达IL-2的这个独特的例子中获得这种结果(Flexner等，Vacinne 817-21，1990)。因此在重组RSV中共表达IFNγ代表非区段化负链RNA病毒减毒的一个新类型，为一种既降低病毒的生长又不危及免疫原性类型。实施例II编码鼠IL-2的重组RSV的构建和定性本实施例中，构建了一种重组RSV，其含有以转录盒插入到G-F基因间隔区的鼠白介素2(mIL-2)的编码序列。该回收病毒(rRSV/mIL-2)在细胞培养中高水平表达mIL-2(达2.8μg/ml)。与野生型(wt)重组RSV(rRSV)相比，rRSV/mIL-2在体外的复制降低达13.6倍，这种效果是由于外源基因的插入而非特异于mIL-2。rRSV/mIL-2病毒在BALB/c小鼠上下呼吸道中的复制降低达6.3倍，这种效果是特异于mIL-2的。其抗体应答，包括RSV特异的血清IgG1、IgG2a、IgA，和总IgG的水平，以及抗wt RSV攻击的保护效率的水平，与wt rRSV无显著不同。rRSV/mIL-2感染后1和4天分离的总肺细胞因子mRNA的分析表明，与wt rRSV相比，IL-2、IFNγ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13和IL-12 p40的mRNA水平提升。流式细胞仪分析rRSV/mIL-2感染10天后分离的总肺单核细胞表明，与wt rRSV相比，单独表达IFNγ或IL-4的CD4+T淋巴细胞水平增加。这些相对于填满wt rRSV的动物细胞因子mRNA或表达细胞因子CD4+细胞的增加，在28天用wtRSV攻击后未被观察到。因此重组RSV表达mIL-2与下列活动相关，病毒在体内生长的适度减毒，与wt rRSV相比血清抗体的诱导，以及与wt rRSV相比，Th1和Th2 CD4+淋巴细胞和细胞因子mRNA的瞬时增加。
IL-2是一种先前已知的是“T细胞生长因子”的原型细胞因子。由Th1和Th2 CD4+细胞产生(Th1水平更高)，当CD8+受到抗原或促细胞分裂原刺激时也能产生(Gaffen等，细胞因子手册，A.W.Thomson(ed.)，p 73-103，学术出版社，1998；和Thorpe，细胞因子，A.Mire-Sluis和R.Thore(eds)，p19-33，1998)。人IL-2蛋白的合成以153个氨基酸作前体，剪切一段20氨基酸的信号肽后加工成为133氨基酸的成熟蛋白。其鼠的类似物大小相似，有63％的氨基酸相同(Kashima等，Nature3 13402-4，1985Yokota等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8268-72，1985，分别在此引用作为参考)。幼稚T细胞表达IL-2包含β和γ链的低亲和的受体，用与α链相关物修饰使其成为高亲和受体。受体结合IL-2后，通过与该受体相关的JAK1激酶引发多种转录因子的激活。
IL-2的调节网非常复杂。IL-2有多效的生物学效果，主要但不完全局限于白细胞。IL-2刺激活化T细胞急剧生长和增殖，高浓度时可引起静息T细胞的增殖。IL-2刺激T细胞细胞裂解活性。也刺激活化B细胞的增殖和促进免疫球蛋白的分泌。IL-2刺激自然杀伤(NK)细胞和淋巴细胞活化的杀伤(LAK)细胞的活性。也促进单核细胞的增殖和分化。趋化因子受体CCR1，CCR2，CCR5由IL-2诱导。IL-2被用于治疗某些病毒感染，包括乙肝病毒，人免疫缺陷病毒，以及单纯性疱疹病毒(Gaffen等，细胞因子手册，A.W.Thomson(ed.)，p73-103，学术出版社，1998；和Thorpe，细胞因子，A.Mire-Sluis和R.Thore(eds)，p19-33，1998)。IL-2给药AIDS患者诱发显著和持续的CD4+细胞的增加(Kovacs等，New Eng.J.Med.3351350-1356，1996，在此引用作为参考)。
本实施例显示被含有编码鼠白介素2(mIL-2)基因，其侧翼为RSV特异的基因起始(GS)和基因终止(GE)信号修饰的重组RSV的构建和评价。图7显示了rRSV/mIL-2的基因组图谱。含有鼠IL-2基因cDNA拷贝的质粒被线性化，并用以下引物进行PCR扩增TATA ATGGGGCAAAT TACAGCATGCAGCTCGC(SEQID NO.3)(XmaI限制性内切酶位点斜体表示，RSV基因起始序列下划线，IL-2翻译起始密码子为黑体)，以及ATTA AATTTTTAATAACT TTGAGGGCTTGTTGAGA(SEQ ID NO.4) (XmaI限制性内切酶位点斜体表示，RSV基因终止序列补码下划线，IL-2翻译终止密码子补码为黑体)。天然产生的IL-2 mRNA在该mRNA3’不翻译区具有“不稳定序列”，其介导转录后水平的调节。插入rRSV中的IL-2 cDNA特别设计为缺失该序列。扩增的片段用XmaI限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳进行纯化，克隆于质粒pUC19的XmaI位点，进行完全测序以确定正确的初始结构。该质粒用XmaI消化，纯化插入片段并克隆于前述的RSV反基因组质粒D46/1024(Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996)唯一的XmaI位点中，其编码15,231核苷酸长的RSV反基因组，XmaI连接体插入G-F基因间隔区。该rRSV/mIL-2反基因组质粒编码15,772核苷酸的反基因组RNA，分别比生物学来源RSV的15,222和重组RSV的15,223核苷酸的反基因组，长549-550个核苷酸。
该反基因组质粒如前述方法用于指导重组病毒的回收(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 9211563-11567，1995，在此引用作为参考)。病毒在HEp-2细胞中传代，并用前述的噬菌斑分析法定量(Murphy等，Vaccine 8497-502，1990)。rRSV/mIL-2病毒形成的噬菌斑略小于野生型RSV，但在形态上难以区分。rRSV/mIL-2略微降低的噬菌斑大小与前述rRSV/CAT和rRSV/mIFNγ的噬菌斑相当(Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996，和Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962367-2372，1999，分别在此引用作为参考)。
含有IL-2的病毒(rRSV/mIL-2)在感染的组织培养细胞培养基中发现高水平表达(达2.8微克/ml)IL-2。这对应于每106细胞中14微克的IL-2，与rRSV/mIFNγ病毒每106细胞中22微克IFNγ的产量相当(Bukreyev等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962367-2372，1999)。
为确定rRSV/mIL-2病毒生长的动力学，以每个细胞MOI为2 PFU用该重组或野生型RSV感染HEp-2细胞。以8小时为时间点采取培养基样品，冷冻，之后进行噬菌斑分析。发现rRSV/mIL-2病毒在HEp-2细胞的生长减毒，最大产量与野生型相比降低约14-17倍。这种减毒水平与观察到的，在相同反基因组位置上含有CAT基因或mIFNγ基因的rRSV结果相似(Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996，和Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962367-2372，1999，分别在此引用作为参考)。因此，细胞培养中减毒的效果似乎由于插入的存在，但与插入物的性质无关。mIL-2和mIFNγ在HEp-2细胞中没有体外生物学效果，这个结果并不令人惊讶，因为细胞因子来自鼠而细胞来自人。
使用Northern印迹杂交分析外源IL-2基因，以及G，F，和L基因的转录。用rRSV/mIL-2或wt RSV感染HEp-2细胞，5天后收获细胞，纯化总RNA，分离多聚(A+)部分。Northern印迹分析确定rRSV/IL-2定向mIL-2 mRNA的表达，以及小的种类表达，这些小种类为来自临近基因转录通读产生的合适大小的IL-2-G和F-IL-2双顺反子mRNA。用G和F探针杂交确定这些双顺反子mRNA。与F，G和L探针的杂交显示二者均表达这些mRNA，正如预期那样。
分析了外源基因的稳定性。rRSV/mIL-2病毒在HEp-2细胞中8次传代。分离第8次传代的总细胞RNA，用分别对应于插入(G和F基因)位点上下游基因组片段的正向和反向引物对其进行RT-PCR。这导致产生对应于预期的867核苷酸长度的单一的可检测PCR产物，没有反映该插入部分或完全缺失的更短的可检测PCR产物。结果与先前的发现一致，即8次传代后从25个回收的rRSV/CAT噬菌斑分离物中任何一个都保有CAT基因，以一种能表达酶活性的CAT形式(Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996，在此引用作为参考)。
为定量mIL-2的表达，以MOI为2 PFU/每细胞用rRSV/mIL-2(第8次传代)感染HEp-2细胞，用Quantikine M鼠IL-2免疫分析仪(R&D系统)所收集的培养基样品。感染后8小时分泌的mIL-2浓度为1.7ng/ml，在感染后120小时增加超过1000倍，达到最大值2.8μg/ml。
在BALB/c鼠中评价rRSV/mIL-2的复制。第0天小鼠鼻内以0.1ml接种量分别含有106PFU的rRSV/mIL-2、rRSV/CAT或wt RSV免疫小鼠，或用0.1ml接种量的Opi-MEM培养基模拟感染。每组5只小鼠在感染后3，4和5天被处死，收集鼻甲和肺组织，用噬菌斑分析稀释的组织抽提液，分析感染性RSV(Murphy等，Vaccine 8497-502，1990，在此引用作为参考)。与野生型RSV相比，rRSV/mIL-2病毒在上下呼吸道中的复制是减毒的，以程度很小，但统计学显著的方式减毒，唯一的例外的是第5天鼻甲中病毒效价与野生型RSV相比没有显著差异(图8)。复制的最大差异是5倍和6.3倍，分别是在第3天的上呼吸道和第5天的肺中。相反，除了第3天在肺中，这儿与rRSV/mIL-2相当，rRSV/CAT与野生型RSV没有显著差异。第3天的肺样品是一个例外，该RSV/CAT的效价与wt rRSV相比是降低的，但与rRSV/mIL-2相似。
rRSV/CAT病毒含15,984核苷酸的基因组，而野生型RSV是15,222核苷酸，rRSV/IL-2病毒是15,772核苷酸。因此，rRSV/CAT和野生型RSV效价间的接近一致显示仅有插入，至少在该大小范围内的插入，不能使RSV在小鼠内显著减毒。先前的工作也有相似的报道(Bukreyev等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 962367-2372，1999，在此引用作为参考)。相反，rRSV/IL-2效价在体内6个样品中的5个都显示显著降低。因此，携带549个核苷酸在相同的基因组位置插入mIL-2基因的rRSV/IL-2的减毒表现为特异于mIL-2。
为评价rRSV/mIL-2的免疫原性，如上所述，用rRSV/mIL-2、rRSV/CAT或wt RSV感染小鼠，在0天(感染前)，28天和56天采集血清样品(表2)。各病毒都诱导高效价的RSV中和的血清抗体，在此方面，这三个病毒没有区别。此外，如用纯化RSV F蛋白做抗原采用ELISA方法测定一样，在诱导RSV特异的血清IgA、IgG1、IgG2a和总IgG方面，这三个病毒间也没有显著差异(表2)。第56天各组小鼠被鼻内接种的每只动物106PFU的wt RSV攻击。4天后，即第60天，处死小鼠，测定病毒在上下呼吸道内的效价。所有先前感染的动物都表现对攻击病毒复制的高水平抗性。在先前感染了rRSV/CAT或rRSV/mIL-2的动物中未发现攻击病毒的复制(鼻甲中平均效价为＜2.0log10PFU/g，肺中为＜1.7log10PFU/g)，而免疫了wt rRSV的动物中发现了低水平的RSV(鼻甲中平均效价为2.3 log10PFU/g，肺中为＜1.7log10PFU/g)。相反，先前未被感染的动物在鼻甲和肺中平均效价为4.7log10PFU/g。因此，这3种病毒诱导对再感染高水平抗性的能力没有区别。
在106PFU的rRSV/mIL-2或wt rRSV感染或模拟感染后，测定所选定的细胞因子肺mRNA的水平。这种分析的优点在于其不要求体外细胞的刺激或操作，并检测所用肺细胞的累积应答。每组4或5只的小鼠在感染后1和4天被处死前收集肺。天的选择与活性RSV复制的时期一致，在这一时期细胞因子mRNA显示有大量的表达(Graham等，J.Immunol.1512032-2040，1993，在此引用作为参考)。分离总的肺RNA，采用前述方法，进行RNA酶保护法分析(Bukreyev等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962367-2372，1999，在此引用作为参考)。将来自单个动物的RNA分别分析。测序胶中显示的细胞因子特异性胶带用磷光计定量，各鼠每一条带的量用同一鼠来自同一胶道的L-32管家基因mRNA的百分比表示。就确定了各组小鼠的平均值和标准误差(图9)。
表2.抗rRSV/mIL-2感染的RSV血清抗体应答a
a在0天以0.1ml接种量的指定病毒106PFU/每只动物感染各组8只小鼠。第56天的抗体效价在独立的分析中测定。
b如文献描述，测定了特异于RSV F蛋白的同种型特异的血清ELISA抗体的效价(Bukreyev等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962367-2372，1999)。
c利用补体增强60％的噬菌斑减小分析(Crowe等，Vaccine 111395-1404，1993)测定了RSV中和血清抗体。
分析表明wt rRSV感染刺激Th1细胞因子IFNγ和Th2细胞因子IL-6的mRNA大量的积累，也刺激IL-12 p40 mRNA，为IL-12异源二聚体的可诱导亚单位的积累。IL-12由除T淋巴细胞外的在其他细胞中的单核细胞和巨噬细胞产生，IFNγ可以增强其产生。这三种丰富mRNA也出现于rRSV/IL-2感染的小鼠，并累积到高于wt rRSV的水平。rRSV/mIL-2的感染也导致IL-2 mRNA的累积，这在wt rRSV感染的动物中不存在，可能直接由该病毒编码。rRSV/mIL-2的感染，但不是wt rRSV也刺激几种不太丰富的Th2细胞因子mRNA的积累，即IL-4，IL-5，IL-10和IL-13。因此，重组RSV共表达IL-2与Th1和Th2标志细胞因子mRNA积累的增加相关。
相同组的各小鼠在第28天接受wt RSV的攻击，在29和32天(攻击后1或4天)收集肺样品进行分析。感染wt rRSV并在28天后接受wt RSV攻击的小鼠表现IL-6，mIFNγ，和IL-12 p40 mRNA水平的升高，IL-2和IL-10mRNA也升高但程度较弱，而未检测到IL-4，IL-5，和IL-13的mRNA。感染rRSV/mIL-2并接受wt RSV攻击的小鼠表现相同的现象，只有一个例外，对于IL-12 p40 mRNA，在第29天没有显著不同，但在32天，rRSV/mIL-2已接触抗原组与wt rRV已接触抗原组相比，有小的降低(32％，P＜0.01)。
也检测了rRSV/mIL-2比对wt rRSV的总肺CD4+T淋巴细胞应答。特别地，细胞内的细胞因子免疫染色和流式细胞计数分析被用来定量表达Th1标志IFNγ或表达Th2标志IL-4的肺CD4+T淋巴细胞(Hussell等，J.Gen.Virol.772447-2455，1996；Openshaw等，J.Exp.Med.1821357-1367，1995；Prussin等，J.Immunol.Methods 188117-128，1995；分别在此引用作为参考)。106PFU的rRSV/mIL-2或wt rRSV感染或模拟品感染小鼠，在第4和10天各组的4只动物被处死，收集肺并按以下所述加工。各组中剩余的小鼠在第28天鼻内攻击接种106PFU的wt RSV，攻击后4和10天(第32和38天)，每组4只动物被处死，收集肺部进行处理。肺部切碎并用DNAseI和胶原酶消化，离心并与Ficoll-Paque Plus介质(Amersham Pharmacia Biotech)结合，以分离总肺单核细胞，来自每个动物的材料都单独处理。与非特异性促细胞分裂原(2.5ng/ml佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸和250ng/ml离子霉素)在莫能菌素(阻碍胞吐作用，使细胞因子在细胞内累积)存在下37℃培养4小时，以体外刺激细胞。Fc受体通过与纯化的大鼠抗-小鼠CD16/CD32(FcγIII/II受体)在4℃预先孵育细胞15分钟被封闭。细胞用低聚醛溶液(Cytofix Buffer，PharMingen，4℃ 20分钟)固定，透化(Perm Wash，PharMingen，4℃20分钟)并染色CD4+(三色偶连的大鼠IgG2a克隆CT-CD4，Caltag Laboratories)，IFNγ(FITC-偶连的大鼠IgG1克隆XMG1.2，PharMingen)和IL-4(R-PE-偶连的大鼠IgG2b克隆BVD4-1D11，PharMingen)分子。用各标记抗体预先最优化的量，在黑暗中进行免疫染色4℃30分钟。染色的特异性与对照比较确定，其中(i)与相同抗体未经偶连的制备物预先孵育4℃30分钟，反应活性被封闭，和(ii)当一级抗体被相同同种型但具有异源特异性的抗体替代时，反应活性消失。发表的研究显示体外刺激步骤并不改变细胞因子表达模式(Hussell等，J.Gen.Virol.772447-2455，1996，在此引用作为参考)。淋巴细胞部分如文献描述受到门控(Hussell等，1996，同上)，并用FACS Calibur流式细胞仪(Becton Dickinson)进行三色流式细胞仪分析。每个样品分析近60,000门控淋巴细胞。值得注意的是检测的是总肺淋巴细胞而非灌洗分离的亚群。
约一半的总肺单核细胞被作为淋巴细胞门控，与未感染的对照比较，在对rRSV/mIL-2或wt rRSV的初次感染或攻击后的应答中，这种百分比没有显著改变。鉴定为CD4+淋巴细胞在单核细胞中的百分比在两种病毒中的任一病毒初始感染后，与未感染的对照相比平均百分比(第4、10天分别为9.0和7.2)，基本没有改变(对wt rRSV在4和10天的平均百分率分别是7.6和7.9；对rRSV/mIL-2在4和10天的平均百分率分别是7.5和10.7)。但在攻击后32和38天，与未感染的对照(同上)相比，该百分率几乎增加一倍(对wt rRSV在32和38天的平均百分率分别是18.2和15.4；对rRSV/mIL-2在32和38天的平均百分率分别是15.7和14)。这显示了一种强的二级免疫应答，尽管攻击病毒复制被极大地限制。检测CD4+群体用于表达的IFNγ对IL-4。图10显示了三只动物感染rRSV/mIL-2，wt rRSV或模拟品处理并在第10天进行分析的实验数据。完整实验总结在表3中。
表3流式细胞分析从感染wt RSV或rRSV/mIL-2的小鼠中表达IFNγ，IL-4或表达二者的肺CD4+淋巴细胞a
a0天时在小鼠鼻内接种感染106PFU/每只动物的指定病毒，或模拟感染。各组动物如表所示在第4和10天处死。剩余动物(包括模拟感染组)在28天接受106PFU wt RSV/每只动物的攻击，在32和38天处死动物(攻击后4和10天)，如表所示。对CD4，IFNγ和IL-4免疫染色，用流式细胞分析总肺单核细胞。值以CD4+淋巴细胞的百分比表示。每组有4只小鼠，以下除外wt RSV组在第4天有3只动物；模拟感染组第4天有2只动物；模拟感染组第10天和38天各有3只动物。各动物的细胞被单独处理，每组以2-4个小鼠的单个数据的平均值和标准误差(SE)表示。
bc与wt rRSV对照相比，斯氏t检验计算统计学显著性。
d备注模拟组动物在0天模拟感染，但在28天接受攻击。因此，第38天的点相应于wt RSV组的第10天点。
最初感染后4天，接种rRSV/mIL-2或wt rRSV的动物表现出CD4+淋巴细胞(IFNγ阳性、IL-4阳性或双阳性)水平的增加，但两个病毒应答程度相似。第10天，IFNγ阳性、IL-4阳性或双阳性细胞的平均数量在rRSV/mIL-2感染的小鼠中，比在wt rRSV感染的小鼠中统计学显著地增加分别为2.1倍(P＜0.05)、3.6倍(P＜0.001)、4.1倍(P＜0.001)。因此第4天观察到的Th1和Th2细胞因子mRNA的增加(图9)是第10天时通过CD4+淋巴细胞细胞因子合成的反映，但非第4天。这种延迟可能反映了后一分析低敏感性，或表达的延迟，或对于IFNγ而言，除了CD4+淋巴细胞以外的合成，如NK细胞的合成(Hussell等，J.Gen.Virol.792593-2601，1998，在此引用作为参考)。
动物在28天接受攻击以及在32天检测肺CD4+细胞时，已接触rRSV/mIL-2的动物中IFNγ阳性细胞的数量比wt rRSV免疫的动物中数量低3倍((P＜0.001)。IL-4阳性或双阳性细胞的百分比在两组小鼠中相似。所观察到的表达IFNγ的CD4+的减少并未反映在总肺IFNγmRNA的量上，表明除了CD4+以外，还有其它细胞有助于该mRNA的总水平，如NK细胞。IFNγ阳性细胞的减少是瞬时的，在第38天最初已接触rRSV/mIL-2或wt rRSV的小鼠之间表达IFNγ或表达IL-4细胞的数目没有显著差异。在该时间点，表达IFNγ或表达IL-4的总肺CD4+细胞百分比分别是～19％和～0.5。
总而言之，重组RSV在BALB/c鼠模型中共表达mIL-2(i)导致病毒生长的适量减毒，(ii)通过分析总肺mRNA，发现Th1和Th2细胞因子的表达增加，和(iii)增加了表达IFNγ或IL-4的总肺CD4+淋巴细胞的应答。提高的抗rRSV/mIL-2的免疫应答可能说明与wtrRSV比较的适量减毒。病毒生长的减毒可能因为CD4+淋巴细胞应答增加的结果，或IFNγ产量的增加，或可能包括其它在此未监测到的因子，如CD8+或NK细胞的激活和增殖，或其它抗病毒细胞因子分泌的刺激，如I型IFNs或αTNF(Karupiah等，J.Exp.Med.1721495-1503，1990；Karupiah等，J.Immunol.144290-298，1990；Karupiah等，J.Immunol.1474327-4332，1991，分别在此引用作为参考)。Th1和Th2细胞因子mRNA和CD4+T淋巴细胞累积量的增加仅在rRSV/mIL-2的初始感染中发现，而在随后的wt RSV攻击过程中未发现。事实上，在攻击后4天IFNγ阳性的CD4+T淋巴细胞和IL-12 p40 mRNA略有降低，二者可能相关。但IFNγ阳性的CD4+T淋巴细胞的减少是瞬时的，在攻击后10天没有被观察到。
rRSV/mIL-2的初始感染中免疫应答升高，由细胞因子mRNA和CD4+T淋巴细胞的增加所证明，没有反映为增加RSV特异的血清抗体或增加保护效率。但RSV特异抗体的效价和RSV在小鼠中感染诱导的保护性免疫水平非常高，以至于不清楚它们是否对进一步的刺激敏感。例如，当先前感染了RSV的小鼠受到攻击，极少或绝无观察到攻击病毒的复制，因此可能也观察不到保护免疫的进一步增加。为使这种效果更特异，进一步在非人的灵长类中评价rRSV/mIL-2的复制和免疫原性，其中对RSV的免疫应答较弱。所得的rRSV/mIL-2病毒能容易用于该目的，因为在人和小鼠之间存在有众多的种交叉IL-2活性(Flexner等，Nature 330259-262，1987；Hugin等，Cell Immunol152499-509，1993，分别在此引用作为参考)。或者，表达人IL-2的重组RSV可根据本发明容易地构建。实施例III编码鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF)的重组RSV的构建和定性本实施例中，检测了RSV共表达鼠GM-CSF(mGM-CSF)对鼠中RSV免疫应答的效果。依据上述关于rRSV/mIL-2和rRSV/mIFNγ病毒的一般策略，构建了反基因组cDNA，其含有在RSV基因起始和终止信号控制下的，插入G-F基因间隔区的mGM-CSF基因。该反基因组cDNA被用于回收rRSV/mGM-CSF病毒。该重组病毒在细胞培养中生长略有减毒，复制效率与rRSV/CAT、rRSV/IL-2和rRSV/mIFNγ病毒基本上没有区别。培养细胞感染rRSV/mGM-CSF病毒后，高水平的mGM-CSF被分泌到细胞培养基。rRSV/GM-CSF病毒接种到BALB/c小鼠后，表现轻微的减毒，生长表型介于rRSV/IL-2病毒(减毒约为上述的5倍)，rRSV/CAT和野生型RSV病毒之间，野生型RSV病毒在体内不减毒。以rRSV/GM-CSF免疫的小鼠对野生型RSV后来的攻击有强的抗性。有趣的是，如上所述用F特异的ELISA法分析血清抗体应答，rRSV/mGM-CSF病毒诱导的血清IgG1和总IgG的效价比野生型RSV诱导，分别高10倍和6倍。因此，RSV共表达mGM-CSF与增强的免疫原性有关。
GM-CSF由多种细胞产生，包括T和B淋巴细胞，巨噬细胞，表皮和内表皮细胞，以及成纤维细胞，经常是对抗原(T和B淋巴细胞)，或炎症介质(巨噬细胞，表皮细胞以及成纤维细胞)刺激的应答(综述参见如Quesniaux和Jones，pp.35-670，in The Cytokines，A.W.Thomas(ed.)，Academic Press，1998，在此引用作为参考)。GM-CSF对于造血细胞增殖和分化，宿主防御，和免疫应答有重要作用。例如，它刺激粒细胞-巨噬细胞前体的增殖和分化，诱导神经轴突的迁移，以及抗微生物活性，并诱导产生树突细胞。尽管其主要应用于抗肿瘤免疫领域，也显示当用作佐剂可以增加初次和再次免疫应答(Tarr等，pp.219-232，in Manual of GM-CSF，M.Marty(ed.)，Blackwell Science，1996，在此引用作为参考)。但这些前期的实施例没有提供在呼吸道复制的RSV疫苗病毒共表达GM-CSF对宿主免疫应答可能影响的信息。
mGM-CSF的成熟形式是一个124氨基酸的糖蛋白。由其前体切除N末端17个氨基酸的信号序列而合成mGM-CSF。GM-CSF ORF的cDNA可克隆在pUC18中而获得，在质粒中其两端使用唯一的限制位点，并插入以来自合成的寡核苷酸DNA双螺旋替代短的限制性片段进行修饰。在该GM-CSF质粒中，ORF前是HindIII位点，在紧邻ATG起始密码子的下游具有一个MluI位点。该HindIII和MluI限制性片段被切除，用合成的回收了GM-CSF编码序列的HindIII-MluI片段替代，并将其放置于RSV基因起始信号控制下，该信号之前按顺序是XmaI位点。在GM-CSF ORF的下游末端，一个BsrI位点在其终止密码子之前，该终止密码子之后是BamHI位点。切除该BsrI-BamHI片段，用合成的回收编码序列的BsrI-BamHI片段替代，并加入下游的RSV基因终止信号和一个XmaI位点(图11)。该转录盒被插入完整RSV反基因组cDNA的G-F基因间隔区，该区被插入的XmaI位点修饰。重组RSV基因组的长度增加465个核苷酸，从15,223到15,688，并且编码mRNA的数量由10增加到11。
使用如上所述的rRSV/mIFNγ和rRSV/mIL-2病毒的实验策略和方法，表达mGMCSF的重组RSV(rRSV/mGMCSF)病毒被回收，生长并且分析。来自感染细胞的胞内RNA的RT-PCR分析确认了在回收的rRSV/mGMCSF病毒基因组中GM-CSF转录盒的存在以及体外连续传代中该插入的稳定性。Northern印迹分析确认了mGM-CSF作为一种独立的，丰富mRNA表达。此外，感染了rRSV/mGMCSF的HEp-2细胞表达分泌的mGM-CSF，每毫升培养上清中数量接近1ug。
该回收的嵌合rRSV/mGMCSF病毒形成的噬菌斑略小于wt rRSV(大小降低10-15％)。以MOI为2PFU感染HEp-2细胞，测定感染性病毒产生和释放的动力学，检测rRSV/mGMCSF、rRSV/CAT和wtrRSV病毒的体外生长(图12)。这表明rRSV/mGMCSF和rRSV/CAT病毒的生长基本上没有区别，与wt重组RSV相比，有一定程度的延迟和降低(最大差异是感染40小时后rRSV/CAT和wt rRSV间相差52倍)。这些结果与一般观察一致额外基因插入RSV基因组使其体外生长减毒，如在前述实施例中的详细说明。该效果可能因为基因组长度的增加，或转录盒数量的增加，或两种情况都有，但似乎不特异于GM-CSF蛋白。此外，人和鼠GM-CSF在生物学活性和受体结合方面没有交叉反应性(Quesniaux和Jones，pp.35-670，in The Cytokines，A.W.Thomas(ed.)，Academic Press，1998)，因此，该鼠细胞因子在人细胞系，HEp-2细胞中应无活性。
为评价rRSV/mGMCSF在体内的复制，在每只动物鼻内以106PFU的rRSV/mGMCSF、rRSV/CAT或wt rRSV感染BALB/c小鼠。注意，在相同实验中，评行分析了rRSV/mIFNγ和rRSV/mIL-2，结果如上述。各组动物在感染后3，4，和5天被处死，噬菌斑分析检测病毒在上(鼻甲)下(肺)呼吸道的浓度(表4)。如上所述，除了第3天在肺中，低0.4log10，尽管小但也是统计学显著的差异(p＜0.01)，rRSV/CAT与wt rRSV在所有时间点任何位点的复制都没有明显差异。rRSV/mGMCSF的效价在任何时间点两个位点都低于两种其它病毒，但仅第5天在肺中与rRSV/CAT和wt rRSV相比的差异是统计学上显著的(比wt rRSV和rRSV/CAT大约降低5倍，p分别小于0.01和0.001)。表4.BALB/c小鼠上(鼻甲)下(肺)呼吸道中野生型rRSV、rRSV/CAT和rRSV/mGMCSF的复制a
a0天光麻醉下在小鼠鼻内施用106PFU/每只动物的指定病毒，并在3，4和5天处死动物。
b确定鼻甲和肺组织中病毒效价，以平均效价±标准误差(log10Pfu/g组织)，n＝5表示。
c-f斯化t-检验同一列值值中统计学显著性c.p＜0.05；d.p＜0.01；e.p＜0.02；f.p＜0.001；其它p值超过0.05。
为了评价rRSV/mGMCSF的免疫原性，如上所述用rRSV/mGMCSF、rRSV/CAT或wt rRSV感染小鼠，在0天(即在感染前)，28和56天采集血清样品(表5)。各病毒都诱导高效价的RSV中和血清抗体。与rRSV/mGMCSF病毒相关的效价比用wt rRSV或rRSV/CAT病毒观察到的高1.5-2倍。此外，利用纯化RSV F蛋白做抗原，ELISA测定RSV特异血清IgA，IgG1，IgG2a，和总IgG的效价(表5)。wt rRSV和rRSV/CAT病毒间抗体效价无显著差异。相反，rRSV/mGMCSF病毒诱导的IgG1和总IgG抗体效价分别比wt rRSV高9.2和4.9倍。作为对比，先前的实施例中，rRSV/IFNγ病毒诱导的IgG1和总IgG效价分别比wt rRSV高7倍和4倍。因此，小鼠中RSV的免疫原性因mIFNγ或mGM-CSF的共表达而增加。
表5.在第0(免疫前)，28，56天RSV血清抗体效价(倒数平均值log2±标准误差)α
a各组使用8只小鼠。第56天的抗体效价在独立的分析中测定。注意IG亚型的ELISA数据不能与先前实施例中接种rRSV/mIFNγ或RSV/mIL-2病毒的动物精确比较，因为使用了不同的ELISA切断。但可以进行定性比较。
各组中小鼠在56天受到攻击，每只动物鼻内接种106PFU的wtRSV。4天后，即第60天，处死小鼠，测定上下呼吸道的病毒效价(未发表资料)。先前感染的所有动物表现对攻击病毒复制的高水平抗性。先前感染了rRSV/CAT或rRSV/mGMCSF的动物中不能检测出攻击病毒的复制(鼻甲中平均效价为＜2.0 log10PFU/g和肺中为＜1.7 log10PFU/g)，而在先前免疫了wt rRSV的动物中检测出低水平的RSV(鼻甲中平均效价为2.3 log10PFU/g和肺中为＜1.7 log10PFU/g)。相反，先前未感染的动物鼻甲和肺中平均效价为4.7 log10Pfu/g。因此这三种病毒在诱导对再感染的高水平抗性的能力方面不能区别。
检测了rRSV/mGMCSF比对wt rRSV的总肺CD4+T淋巴细胞应答。106PFU的rRSV/mGMCSF或wt rRSV感染或模拟品感染小鼠。在第4和10天各组的4只动物被处死，收集肺并加工分离总肺单核细胞。各组中剩余的小鼠在第28天以106PFU的wt RSV鼻内攻击，攻击后4和10天(第32和38天)，每组4只动物被处死，收集肺并分离单核细胞。使用上述rRSV/mIL-2病毒中的方法，免疫染色CD4+标记，流式细胞分析总肺单核细胞，Th2标志细胞因子IL-4，或Th1标志细胞因子IFNγ在胞内的表达。来自动物个体的细胞被单独处理。
最初感染后4天，接种rRSV/mGMCSF或wt rRSV的动物表现CD4+淋巴细胞(IFNγ阳性，IL-4阳性或双阳性)百分比的增加(表6)，但两个病毒应答程度相似，不太高(IFNγ阳性3.43-3.79％，未感染对照为1.04％)。相反，第10天，接种rRSV/mGMCSF动物显示水平极高的IFNγ阳性的CD4+淋巴细胞(21.4％％，wt rRSV感染的动物为6.7％％，未感染对照为2.4％)。IL-4阳性CD4+细胞的百分比则低的多，在任意一天都表现少量增加(第10天值对rRSV/mGMCSF是1.72％，对RSV感染的动物是1.08％，未感染对照为1.15％)。小鼠被攻击时，接种wt rRSV或rRSV/mGMCSF的动物具有强的二级应答，在第38天，有大约20.5％的细胞是IFNγ阳性。相反，表达IL-4的CD4+淋巴细胞百分比与未感染RSV的动物相同。因此，感染时RSV基因组表达mGM-CSF导致Th1 CD4+淋巴细胞的强烈刺激，IFNγ阳性细胞的百分比比初次RSV感染产生的高3倍以上，与二次RSV感染相关的二级应答所产生的IFNγ阳性细胞的百分比相当。
表6.流式细胞分析从感染野生型RSV或rRSV/GMCSF的小鼠中分离到的总肺CD4+细胞a
a0天时在小鼠鼻内接种106PFU/每只动物的指定病毒，或模拟品感染。各组动物在第4和10天收集(多数情况下，每天处死每组动物中的4只)。剩余动物在28天接受106PFU wt RSV/每只动物的攻击，在32和38天处死每组4只的动物。免疫染色CD4，IFNγ和IL-4，用流式细胞分析总肺单核细胞。以CD4+淋巴细胞百分比表示数值，显示了标准误差。Dbl+表示IFNγ和IL-4都为阳性。
广泛地认为偏向Th1的T淋巴细胞应答是抗RSV的保护性免疫应答的标志，而非免疫病理学反应(Connors等，J.Virol.685321-5325，1994；Waris等，J.Virol.702852-2860，1996；Hussell等，Eur.J.Immunol.273341-3349，1997；Fischer J.E，J.Virol.718672-8677；在此引用作为参考)。分泌IFN的CD4+淋巴细胞增加的水平显示rRSV/mGMCSF病毒刺激一种极为偏向Th1亚型的免疫应答。事实上，RSV感染本身就刺激偏向Th1的应答，这可能是由于自然杀伤细胞和CD8+T淋巴细胞所产生的IFN(Hussell等，Eur.J.Immunol.273341-3349，1997；Srikiatkhachom等，J.Exp.Med.186421-432，1997；Spender等，J.Gen.Virol.791751-1758，1998，在此引用作为参考)。因此对rRSV/mGMCSF病毒的免疫应答类似自然的感染，但大大增强了。RNA酶保护实验对总肺mRNA的分析显示wt rRSV或rRSV/mGMCSF的感染导致IFN和IL-12 p40亚单位mRNA的增加，与偏向Th1的应答相一致，这种应答对rRSV/mGMCSF病毒更强。
总而言之，重组RSV在BALB/c小鼠模型中共表达mGMCSF(i)导致病毒生长的适量减毒，(ii)增加RSV特异的血清IgG1和总IgG的表达，和(iii)初始感染时增加表达IFNγ的总肺CD4+T淋巴细胞的应答。这种增加似乎依赖于mGM-CSF的进行性表达，因为其并不在wt rRSV后来的攻击中消失。病毒生长的减毒可能在CD4+T淋巴细胞应答的所观察增加的结果，IFNγ产量的增加，或RSV特异的抗体的增加，或可能包括其它在此不为监测到的因子，如CD8+或NK细胞的激活和增殖，或其它抗病毒细胞因子分泌的刺激，如I型IFNs或αTNF。因此，RSV感染中共表达GM-CSF增加了免疫应答的强度，并保持强烈的偏向CD4+淋巴细胞的Th1亚型。这些对于RSV疫苗是非常有利的，并且可能未被预测到。实施例IV编码鼠IL-4的重组RSV的构建人IL-4长153氨基酸，加工为129氨基酸的分泌形式。IL-4由活性T淋巴细胞，肥大细胞，和嗜碱性细胞产生，作用于多种细胞(Chopart等，细胞因子手册，A.W.Thomson(ed.)，p133-174，学术出版社，1998，在此引用作为参考)。IL-4的一个重要作用是诱导T辅助细胞前体分化为Th2亚型，而IFNγ和IL-2的效果是促进其分化为Th1亚型。Th1和Th2亚型被在小鼠和在较小程度上人中作了定性，并且作为泛化与细胞介导的细胞毒和炎症反应应答(Th1)，对偏向产生抗体，尤其是IgE，以及嗜酸性细胞增殖和功能(Th2)的应答相关(Mosmann andSad，Immunol.Today 17138-146，1996，在此引用作为参考)。
依据上述rRSV/mIL-2、rRSV/mIFNγ和rRSV/mGM-CSF总策略，构建了反基因组cDNA，其含有在RSV基因起始和基因终止信号控制下的，插入G-F基因间隔区的mIL-4基因。该反基因组cDNA用于回收rRSV/mIL-4病毒。该重组病毒在细胞培养中生长略有减毒，复制效率与包含CAT，mIFNγ，mIL-2和mGM-CSF的其它rRSV病毒基本没有区别。培养细胞感染rRSV/mIL-4病毒后，高水平的IL-4被分泌到细胞培养基。rRSV/mIL-4病毒接种BALB/c鼠后，其复制效率与rRSV/CAT和野生型RSV病毒(在体内不减毒)基本没有区别。因此，mIL-4的共表达不造成RSV复制的减毒。免疫rRSV/mIL-4的小鼠对野生型RSV后来的攻击有强的抗性。
以上这些实施例表述了由rRSV表达单个的鼠细胞因子，以及其在BALB/c鼠中的评价。这些结果表明一种作例证的细胞因子，即mIFNγ的表达，使RSV高度减毒。mIL-2的表达中度的减毒，mGM-CSF略有减毒，mIL-4不减毒。尽管rRSV/mIFNγ病毒高度减毒，其免疫原性没有降低。这可能反映了其表达的细胞因子，mIFNγ的生物活性。对于rRSV/mGM-CSF病毒也观察到免疫原性增强的证据。因此，由rRSV共表达免疫调节分子有两个优点即，减毒和免疫原性增加。这些都是RSV疫苗很理想的表型特征。
基于鼠模型中表明的结果，含有相应人细胞因子基因的其它重组RSV可被容易地在灵长类动物模型中使用并评价作为疫苗使用。由于小鼠是唯一对RSV感染是半许可性的，预期在小鼠模型中观察到的效果在灵长类将会增强，其中高水平的RSV复制和基因表达将产生更高水平的RSV抗原和细胞因子。除了本发明这些方面，多种其它的免疫调节分子可根据本发明，被引入重组RSV中。IL-8是一种有前景的候选者，其是一个Th1型细胞因子，在刺激IFNγ产生和刺激NK细胞和细胞毒T细胞中有重要作用(Dinarello等，J.Allergy Clin.Immunol.10311-24，1999，在此引用作为参考)。
微生物保藏信息以下材料已保藏在美国典型培养物保藏中心(10801 UniversityBoulevard，Manassas，Virginia 20110-2209)，遵循布达佩斯条约，并命名如下质粒 保藏号 保藏日期cpts RSV 248 ATCC VR 2450 1993年3月22日cpts RSV 248/404 ATCC VR 2454 1993年3月22日cpts RSV 248/955 ATCC VR 2453 1993年3月22日cpts RSV 530 ATCC VR 2452 1993年3月22日cpts RSV 520/1009ATCC VR 2451 1993年3月22日cpts RSV 530/1030ATCC VR 2455 1993年3月22日RSV B-1 cp 52/2B5ATCC VR 2542 1996年9月26日RSV B-1 cp 23ATCC VR 2579 1997年7月15日p3/7(131)ATCC979901997年4月18日p3/7(131)2G ATCC979891997年4月18日p218(131)ATCC979911997年4月18日尽管为清晰理解目的，上述发明通过实施例进行了详细描述，业内人士可以很清楚地了解，在不局限于其表述方式的附录的范围内，该公布可以有某些变化和修饰。
序列表<110>美国政府健康及人类服务部彼得·L·柯林斯亚历山大·布克列耶夫布赖恩·R·墨菲斯蒂芬·S·怀特黑德<120>表达免疫调节分子的重组呼吸道合胞病毒的制备<130>15280-388000PC<140><141><150>60/143,425<151>1999-07-13<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述针对MIFNy的基因起始附着寡核苷酸<400>1tatacccggg atggggcaaa tatgaacgct acacactgca t 41<210>2<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述针对MIFNy的基因末端附着寡核苷酸<400>2attacccggg aatttttaat aacttcagca gcgactcctt ttcc44<210>3<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述具有基因起始序列的IL-2PCR引物<400>3tatacccggg atggggcaaatatgtacagc atgcagctcg c41<210>4<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述具有基因末端序列的IL-2PCR引物<400>4attacccggg aatttttaat aactttattg agggcttgtt gaga44<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述具有基因起始序列的IFNy插入片段的侧翼序列<400>5cccgggatgg ggaaataatg 20<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述具有基因末端序列的IFNy插入片段的侧翼序列<400>6tgaagttatt aaaaattccc ggg 23<210>7<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述XmaI连接的序列详情<400>7aggccccggg gcct 14<210>8<211>83<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述具有基因起始序列的GMLsF插入片段的侧翼序列<400>8agttacttaa aaacatatta tcacaaaagg ccccggggcc ttgaccaaacttaaacagaa 60tcaaaataaa ctctggggca aat 83<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述具有基因末端序列的GMLsF插入片段的侧翼序列<400>9cccgggatgg ggcaaatatg 20<210>10<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述XmaI连接的序列详情<400>10taaagttatt aaaaattccc ggg 2权利要求
1.一种分离的感染性呼吸道合胞病毒(RSV)，包含重组RSV基因组或反基因组，核壳蛋白(N)、核壳磷蛋白(P)、大聚合酶蛋白(L)和RNA聚合酶延伸因子，其中该重组基因组或反基因组掺入了编码一种免疫调节分子的异源多核苷酸序列。
2.权利要求1的重组RSV，其中免疫调节分子是细胞因子、趋化因子、酶、细胞因子拮抗剂、趋化因子拮抗剂、表面受体、可溶性受体、附着分子或配基。
3.权利要求2的重组RSV，其中免疫调节分子是细胞因子，选自白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、γ干扰素(IFNλ)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
4.权利要求2的重组RSV，其中细胞因子是γ干扰素(IFNλ)。
5.权利要求2的重组RSV，其中细胞因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
6.权利要求2的重组RSV，其中细胞因子是白介素2(IL-2)。
7.权利要求2的重组RSV，其中细胞因子是白介素4(IL-4)。
8.权利要求1的重组RSV，其中细胞因子导入所述重组基因组或反基因组，使重组RSV与野生型或突变亲本病毒相比被赋予了一种或多种所需的表型改变，包括(i)在细胞培养中病毒生长的改变，(ii)在哺乳动物宿主的上和/或下呼吸道中减毒，(iii)病毒噬菌斑大小的改变，或(iv)细胞病原性的改变，或与野生型或突变亲本病毒引发的宿主免疫应答相比被赋予了一种或多种改变了的宿主免疫应答，选自抗RSV中和抗体应答，T辅助细胞应答，细胞毒T细胞(CTL)应答，和/或自然杀伤(NK)细胞应答。
9.权利要求1的重组RSV，其中病毒在细胞培养中的生长，与相应野生型或突变亲本RSV株相比，减毒约10-15倍或更多。
10.权利要求1的重组RSV，其中该重组病毒在细胞培养基中表达的免疫调节分子的水平约10-20微克/106细胞，或更多。
11.权利要求1的重组RSV，其中该病毒在细胞培养中的生长和在哺乳动物宿主的上下呼吸道的复制都是减弱的，并且其中该病毒在免疫接种的宿主内引发抗RSV的保护性免疫应答。
12.权利要求1的重组RSV，其中该病毒由感染细胞中表达的免疫调节分子的活性而减毒。
13.权利要求1的重组RSV，其中该病毒所诱导的血清IgG的效价比野生型RSV诱导的血清IgG的效价高2-10倍，或更多。
14.权利要求1的重组RSV，其中所述基因组或反基因组被进一步修饰，引入一种或多种生物学衍生突变人RSV中鉴定的减毒突变。
15.权利要求14的重组RSV，其中所述基因组或反基因组掺入一组生物学衍生突变人RSV株中存在的至少一个直至全套减毒突变，所述组包括cpts RSV 248ATCC VR 2450)；cpts RSV 248/404(ATCCVR 2454)；cpts RSV 248/955(ATCC VR 2453)；cpts RSV 530(ATCCVR 2452)；cpts RSV 530/1009(ATCC VR 2451)；cpts RSV 530/1030(ATCC VR 2455)；RSV B-1 cp52/2B5(ATCC VR 2542)和RSV B-1cp23(ATCC VR 2579)。
16.权利要求14的重组RSV，其中所述基因组或反基因组掺入至少一个直至全部决定以下氨基酸替代的减毒突变，包括RSV N基因内的Val267，RSV F基因内的Glu218和/或Thr523，RSV聚合酶基因L内的Asn43，Cys319，Phe521，Gln831，Met1169，Tyr1321，和/或His1690，和M2基因起始序列内的核苷酸替代。
17.权利要求14的重组RSV，其中所述基因组或反基因组掺入至少两个减毒突变。
18.权利要求14的重组RSV，其中所述基因组或反基因组至少包含一个减毒突变，指定该突变的密码子内多个核苷酸的改变使这种减毒突变得以稳定。
19.权利要求1的重组RSV，其中所述基因组或反基因组包含决定以下表型改变的额外的核苷酸修饰，表型改变选自细胞培养时的生长、减毒、温度敏感、冷适应、噬菌斑大小、宿主范围限制、抗原的表达或免疫原性的变化。
20.权利要求19的重组RSV，其中额外的核苷酸修饰改变了该重组RSV的SH，NS1，NS2，M2ORF2或G基因。
21.权利要求20的重组RSV，其中SH，NS1，NS2，M2 ORF2或G基因被整体或部分地缺失，或通过移码或在基因读码框内引入一个或多个终止子或翻译起始位点的修饰，基因的表达被降低或消除。
22.权利要求19的重组RSV，其中额外的核苷酸修饰在重组RSV基因组或反基因组中包括选定基因的顺式作用调节序列核苷酸的缺失，插入，替代，添加或重排。
23.权利要求19的重组RSV，其中NS1或NS2基因的基因终止(GE)信号被修饰。
24.权利要求19的重组RSV，其中额外的核苷酸修饰在重组RSV基因组或反基因组中包括翻译起始位点的插入，缺失，替代，或重排。
25.权利要求24的重组RSV，其中分泌形式的RSV G糖蛋白的翻译起始位点被去除。
26.权利要求19的重组RSV，其中所述基因组或反基因组被修饰成编码非RSV分子，这些非RSV分子选自一种或多个T辅助细胞表位，限制性位点标记，或在哺乳动物宿主中引发保护性免疫应答的微生物病原体的蛋白。
27.权利要求19的重组RSV，其中所述基因组或反基因组掺入来自副流感病毒(PIV)的基因或基因组区段。
28.权利要求27的重组RSV，其中基因组或反基因组区段编码PIV HN或F糖蛋白，或免疫原性的结构域或其表位。
29.权利要求27的重组RSV，其中基因组区段编码PIV1，PIV2，或PIV3 HN或F的胞内域或免疫原性表位。
30.权利要求1的重组RSV，其中基因组或反基因组包含人或牛RSV的部分或完整的RSV背景基因组或反基因组，其组合了不同RSV的异源基因或基因组区段，形成人-牛嵌合RSV基因组或反基因组。
31.权利要求30的重组RSV，其中异源基因或基因组区段编码RSV F，G或SH糖蛋白，或免疫原性的结构域或其表位。
32.权利要求30的重组RSV，其中异源基因或基因组区段替代在部分RSV背景基因组或反基因组内相对应的基因或基因组区段。
33.权利要求30的重组RSV，其中异源基因或基因组区段在靠近或在部分或完整RSV背景基因组或反基因组内的非编码区处添加。
34.权利要求30的重组RSV，其中嵌合基因组或反基因组包含部分或完整的人RSV背景基因组或反基因组，其组合了来自牛RSV的异源基因或基因组区段。
35.权利要求30的重组RSV，其中嵌合基因组或反基因组包含部分或完整的牛RSV背景基因组或反基因组，其组合了来自人RSV的异源基因或基因组区段。
36.权利要求34的重组RSV，其中一个或多个人RSV糖蛋白基因F，G，和SH，或编码胞质结构域，跨膜结构域，胞内域，或其免疫原性表位的基因组区段，替代了在牛RSV背景基因组或反基因组内相对应的基因或基因组区段。
37.权利要求36的重组RSV，其中一个或两个人RSV糖蛋白基因F和G替代在牛RSV背景基因组或反基因组内一个或两个相对应的F和G糖蛋白基因。
38.权利要求37的重组RSV，其中人RSV糖蛋白基因F和G均替代了在牛RSV背景基因组或反基因组内相对应的F和G糖蛋白基因。
39.权利要求36的重组RSV，其中异源基因或基因组区段来自人RSV亚型A或亚型B。
40.权利要求36的重组RSV，其中人-牛嵌合基因组或反基因组掺入来自人RSV亚型A和亚型B的抗原决定簇。
41.权利要求1的重组RSV，其是病毒。
42.权利要求1的重组RSV，其是亚病毒颗粒。
43.一种刺激个体免疫系统诱导抗RSV的保护的方法，包含以足够的免疫量的权利要求1的重组RSV组合生理学上可接受载体给个体施用。
44.权利要求43的方法，其中重组RSV的给药剂量为103-107PFU。
45.权利要求43的方法，其中重组RSV被给药于上呼吸道。
46.权利要求43的方法，其中重组RSV通过喷洒，小滴或气溶胶方式给药。
47.权利要求43的方法，其中重组RSV给药于对RSV抗体为血清反应阴性的个体，或给药于具有来自胎盘自母体的获得的抗RSV抗体的个体。
48.权利要求43的方法，其中与相应野生型或突变亲本RSV株的生长和抗原表达相比，重组RSV减毒并表现抗原表达的增加。
49.权利要求43的方法，其中重组RSV引发抗人RSV A，人RSVB，或抗这两者的免疫应答。
50.一种引发抗RSV免疫应答的免疫原性组合物，含有在生理学上可接受载体中包含的足够免疫量的权利要求1的重组RSV。
51.权利要求50的免疫原性组合物，配制剂量为103-107PFU。
52.权利要求50的免疫原性组合物，配制成用于通过喷洒，小滴或气溶胶方式给药于上呼吸道的形成。
53.权利要求50的免疫原性组合物，其中与相应野生型或突变亲本RSV株的生长和抗原表达相比，重组RSV表现减毒性和抗原表达的增加。
54.权利要求50的免疫原性组合物，其引发抗人RSV A，人RSVB，或抗这两者的免疫应答。
55.一种包括RSV基因组或反基因组的分离的多核苷酸分子，所述基因组或反基因组经修饰掺入了编码免疫调节分子的多核苷酸序列。
56.权利要求55的分离的多核苷酸，其中免疫调节分子是细胞因子。
57.权利要求56的分离的多核苷酸分子，其中细胞因子选自白介素2(IL-2)，白介素4(IL-4)，白介素5(IL-5)，白介素6(IL-6)，白介素18(IL-18)，α肿瘤坏死因子(TNF)，γ干扰素(IFNλ)，或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
58.权利要求55的分离的多核苷酸分子，其中所述基因组或反基因组被进一步修饰，引入了一个或多个在生物和衍生突变人RSV中鉴定的减毒突变，其中人RSV糖蛋白基因F和G均替代在牛RSV基因组或反基因组内相对应的F和G糖蛋白基因。
59.权利要求55的分离的多核苷酸分子，其中基因组或反基因组包含额外的核苷酸修饰，其决定以下表型变化选自生长特性，减毒，温度敏感性，冷适应，噬菌斑大小，宿主范围限制或免疫原性的改变。
60.权利要求59的分离的多核苷酸分子，其中通过整体或部分地缺失SH，NS1，NS2，G基因或M2-2 ORF，或通过引入移码或在基因的读码框中引入终止子，基因组或反基因组被修饰从而降低或消除基因的表达。
61.权利要求60的分离的多核苷酸分子，其中SH，NS1，NS2，G基因或M2-2 ORF被整体或部分地缺失。
62.权利要求59的分离的多核苷酸分子，其中核苷酸修饰包括在RSV基因组或反基因组内的选定的RSV基因的顺式作用调节序列核苷酸的缺失，插入，添加或重排。
63.一种从一个或多个分离的、编码RSV的多核苷酸分子中生产感染性减毒RSV颗粒的方法，包括在细胞或无细胞裂解液中表达表达载体，该载体包含分离的多核苷酸，该多核苷酸包含被修饰掺入编码免疫调节分子和RSV N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白的重组RSV基因组或反基因组。
64.权利要求63的方法，其中重组RSV基因组或反基因组和N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白由两个及多个的不同的表达载体表达。
65.权利要求1的分离的感染性重组RSV，其中重组基因组或反基因组包含部分或完整的RSV载体基因组或反基因组，其组合了编码一个或多个异源病原体的一个或多个抗原决定簇的一个或多个异源基因或基因组区段。
66.权利要求65的分离的感染性重组RSV，其中所述一个或多个异源病原体是异源RSV，而所述异源基因或基因组区段编码一个或多个RSV NS1，NS2，N、P、M、SH，M2(ORF1)，M2(ORF2)，L，F或G蛋白或其片段。
67.权利要求65的分离的感染性重组RSV，其中载体基因组或反基因是部分或完整的RSV A基因组或反基因组，并且编码抗原决定簇的异源基因或基因组区段是RSV B亚型病毒。
68.权利要求65的分离的感染性重组RSV，其中所述嵌合基因组或反基因组掺入一个或多个决定减毒的BRSV基因或基因组区段。
69.权利要求65的分离的感染性重组RSV，其中编码一个或多个HN和/或F糖蛋白或抗原结构域、片段或其表位的一个或多个HPIV1，HPIV2或HPIV3基因或基因组区段，被加入或掺入到部分或完整的HRSV载体基因组或反基因组。
70.权利要求65的分离的感染性重组RSV，其中载体基因组或反基因组是部分或完整的BRSV基因组或反基因组，并且编码抗原决定簇的异源基因或基因组区段是一个或多个HRSV。
71.权利要求70的分离的感染性重组RSV，其中部分或完整的BRSV基因组或反基因组掺入编码一种或多种选自F、G和SH的HRSV糖蛋白基因的一个或多个基因或基因组区段，或编码HRSV F、G和/或SH胞质结构域、跨膜结构域、胞内域或免疫原性表位的一个或多个基因组区段。
72.权利要求65的分离的感染性重组RSV，其中载体基因组或反基因组是部分或完整的HRSV或BRSV基因组或反基因组，异源病原体选自麻疹病毒、呼吸道合胞病毒的亚型A和B、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒、人免疫缺陷病毒1型和2型、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病病毒、EB病毒、线状病毒、布尼亚病毒、黄病毒、甲病毒和流感病毒。
73.权利要求72的分离的感染性重组RSV，其中所述一种或多种异源抗原决定簇选自麻疹病毒HA和F蛋白、呼吸道合胞病毒的亚型A和B的F、G、SH和M2蛋白、腮腺炎病毒HN和F蛋白、人乳头瘤病毒L1蛋白、人免疫缺陷病毒1型和2型gp160蛋白、单纯疱疹病毒和巨细胞病毒的gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL和gM蛋白、狂犬病病毒G蛋白、EB病毒gp350蛋白、线状病毒G蛋白、布尼亚病毒G蛋白、黄病毒E和NS1蛋白和甲病毒E蛋白，以及其抗原结构域、片段和表位。
74.权利要求72的分离的感染性重组RSV，其中异源病原体是麻疹病毒，而异源抗原决定簇选自麻疹病毒HA和F蛋白，以及其抗原结构域、片段和表位。
75.权利要求74的分离的感染性重组RSV，其中转录单位包括麻疹病毒HA基因读码框(ORF)的被添加或掺入HRSV载体基因组或反基因组中。
76.权利要求1的分离的感染性重组RSV，其中重组基因组或反基因组在所述重组基因组或反基因组内具有一个或多个移位的RSV基因或基因组区段，相对于在野生型RSV基因组或反基因组内的位置，其移动后的位置与所述RSV基因或基因组区段位置更接近或远离启动子。
77.权利要求76的分离的感染性重组RSV，其中所述一个或多个移位的基因或基因组区段，是在所述部分或完整的重组RSV基因组或反基因组内通过一个或多个移位多核苷酸缺失、插入或重排，移动到接近或远离启动子的位置。
78.权利要求77的分离的感染性重组RSV，其中所述移位的多核苷酸包括一种或多种长度为150核苷酸(nts)到4000核苷酸的多核苷酸的插入，其插入基因组或反基因组非编码区(NCR)内，或作为独立的基因单位(GU)，所述多核苷酸的插入缺少完整的读码框(ORF)并在所述重组RSV中决定一种减毒表型。
79.权利要求76的分离的感染性重组RSV，其中所述移位的多核苷酸包括一个或多个RSV基因或基因组区段，选自RSV的NS1，NS2，N，P，M，SH，M2(ORF1)，M2(ORF2)，L，F和G基因或基因组区段，以及RSV基因或其基因组区段的前导、非转录尾区和基因间隔区域。
80.权利要求76的分离的感染性重组RSV，其中所述移位的多核苷酸包括一个或多个牛RSV(BRSV)或人RSV(HRSV)基因或基因组区段，选自RSV的NS1，NS2，N，P，M，SH，M2(ORF1)，M2(ORF2)，L，F和G基因或基因组区段，以及RSV基因或其基因组区段的前导、非转录尾区和基因间隔区域。
81.权利要求80的分离的感染性重组RSV，其中所述移位的多核苷酸被缺失，形成重组RSV基因组或反基因组，导致在所述重组RSV基因组或反基因组内所述一个或多个移位的基因或基因组区段相对于所述RSV基因或基因组区段在野生型RSV基因组或反基因组内的位置，移动到更加接近或远离启动子的位置。
82.权利要求81的分离的感染性重组RSV，其中所述移位的多核苷酸被缺失，形成包含一个或多个RSV NS1，NS2，SH，M2(ORF2)，或G基因或其基因组区段的重组RSV基因组或反基因组。
83.权利要求76的分离的感染性重组RSV，其中RSV糖蛋白基因G在所述重组RSV基因组或反基因组内，与G的野生型基因顺序位置相比重排到更加接近启动子的基因顺序位置。
84.权利要求76的分离的感染性重组RSV，其中RSV糖蛋白基因F在所述重组RSV基因组或反基因组内，与F的野生型基因顺序位置相比，重排到更加接近启动子的基因顺序位置。
85.权利要求76的分离的感染性重组RSV，其中RSV糖蛋白基因G和F在所述重组RSV基因组或反基因组内，与G和F的野生型基因顺序位置相比均重排到更加接近启动子的基因顺序位置。
86.权利要求85的分离的感染性重组RSV，其中在所述重组RSV基因组或反基因组内，RSV糖蛋白基因G移动到基因顺序位置1，RSV糖蛋白基因F移动到基因顺序位置2。
87.权利要求76的分离的感染性重组RSV，其中RSV SH和NS2基因都缺失，形成重组RSV基因组或反基因组或反基因组。
88.权利要求76的分离的感染性重组RSV，其中RSV SH，NS1和NS2基因都缺失，形成重组RSV基因组或反基因组或反基因组。
全文摘要
提供了表达一种或多种免疫调节分子的重组呼吸道合胞病毒(RSV)。该重组病毒通过添加或替代编码免疫调节分子(优选细胞因子)的多核苷酸序列而修饰。细胞因子的增加、降低,或增强了病毒生物学和/或对RSV的宿主免疫应答的一些方面,使该病毒更便于用做疫苗。本发明使用的细胞因子包括但不局限于:白介素2(IL－2),白介素4(IL－4),白介素5(IL－5),白介素6(IL－6),或白介素18(IL－18),α肿瘤坏死因子(TNF),γ干扰素(IFN),和粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(GM－CSF)。多核苷酸或免疫调节分子优选地添加或替代到该重组病毒基因组或反基因组,典型地在基因间隔区或其它非编码位点,作为一个单独基因,也可以其它形式,如作为融合蛋白表达。
文档编号A61K48/00GK1384883SQ00810303
公开日2002年12月11日 申请日期2000年7月12日 优先权日1999年7月13日
发明者彼得·L·柯林斯, 亚历山大·布克列耶夫, 布赖恩·R·墨菲, 斯蒂芬·S·怀特黑德 申请人:美国政府健康及人类服务部