专利名称：治疗腺病毒眼感染的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及腺病毒眼感染和生殖器感染领域，特别涉及用于它们的治疗和预防的组合物和方法。
背景技术：
腺病毒属于多面体DNA病毒类，其特征在于具有二十个相同面的二十面体衣壳及总体的六边形形状。在腺病毒中，衣壳是裸露的，表示它没有许多其它病毒中常见的脂质被膜。这一事实可以解释它对大多数消毒剂的抵抗力以及抗脱水的能力。
侵害人类的腺病毒表现出51种不同的血清型，可以取决于不同的症状而分为六组。六个亚属A到F的趋向是由腺病毒纤维的结构差异而确定的。腺病毒纤维对细胞的科萨奇腺病毒受体(CAR)具有特异性，此受体也称作第一步受体。因此当证明A，C，D，E和F亚属的代表性腺病毒都与CAR结合时是令人惊讶的。
在病毒颗粒中，起初是由六邻体、五邻体基底和纤维与易感细胞相互作用。衣壳蛋白也与被感染宿主的免疫系统相互作用。腺病毒通过纤维远端部分-纤维结与第一步受体结合。这种具有174-191个氨基酸残基的球形结构的等电点是4.5-9.1。
内化步骤可能涉及第二受体-配体相互作用。配体是腺病毒顶角壳粒的可变部分，宿主细胞上的受体为α-v-整联蛋白异二聚体。
已知D组导致生殖器和眼感染，后者可以涉及结膜(结膜炎)，或在更严重的感染中，也涉及角膜(角结膜炎)。已知腺病毒眼感染在全球范围内发生基于社区和办公室的流行。确信主要传播途径为直接眼-手-眼，或间接眼-手-手-眼。也发生性传播。其它传染源被认为有游泳池、眼诊所或眼科。
人口密集区明显容易发生疾病的流行，因此过去十年中在亚洲国家观察到了一些流行。终止已经发生的流行可以很困难。一些基于眼诊所或眼科的流行的例子经过数月后才彻底根除。
角膜炎的爆发主要是由以下腺病毒血清型导致的Ad8，Ad19和Ad4，以及1型疱疹病毒。另外，结膜炎主要由Ad3，Ad4和Ad7引起，但也由肠道病毒70和其它腺病毒引起。
已经开发了抗病毒化合物用于治疗疱疹病毒导致的眼感染。尝试用局部抗疱疹的抗病毒药物治疗腺病毒眼感染是不成功的。所以目前应用的治疗针对缓解症状并限制疾病传播。缓解疗法包括冷敷、黑眼镜、血管收缩剂，以及，尽管没有被广泛接受，也使用环孢菌素A和皮质类固醇。还没有证明单独或结合使用抗生素和皮质类固醇的有效性以及与可能发生副作用的危险的相关性。
腺病毒相关眼感染的综述见Gordon et al.，AdenovirusKeratoconjunctivitis，Ocular Infection and Immunology，Ed，J.S.Pepsose Mosby，1996，877-894。
先有技术已知肝素或肝素盐可以用于过敏性结膜炎的预防和治疗(DE 19547 972 A1)。在1995年提交的此专利申请中，公开了肝素通过激活清除因子和脂蛋白脂酶从内皮细胞的分泌而促进脂解作用。而且，也讨论了肝素在过敏性和变态反应性反应中的作用。然而，没有提到将发现对病毒结合的抑制。
EP 502 550公开了作为抗炎药的包含多聚乙酰神经氨酸和多聚乙酰神经氨酸的部分水解产物的药物制剂。
也已经表明，MUC1和其它唾液酸糖结合物抑制腺病毒介导的到上皮细胞的基因转移(Arcasoy et al.，Am J Resp Cell and Molec Biol，17(4)422)。
然而目前还没有临床上有效的抗病毒药能够抑制在眼表面和生殖粘膜复制并产生临床疾病的许多血清型的腺病毒。已经证明腺病毒眼感染是难治的，因此需要改进这方面的方法和组合物。所以本发明的目的是提供满足这一需要的有效药物组合物和方法。
发明概述上述目的是通过所附权利要求中公开的组合物和方法而实现的。已经很惊讶地发现此组合物预防病毒与眼细胞的结合，对于一些类型的腺病毒已经证实了此结果。
附图简述在下面的详述中将参考实施例和附图对本发明进行更详细的描述，其中
图1表示用神经氨酸酶治疗某些依赖于唾液酸而感染人类上皮A549细胞的腺病毒(图1A-Ad8；图1B-Ad9；图1C-Ad19p；图1D-Ad19a；图1E-Ad37)；图2表示A)通过用(2-3)连接的唾液酸的特异性神经氨酸酶预处理细胞而抑制Ad37与A549细胞的结合，以及B)通过用a)与(2-3)和(2-6)连接的唾液酸结合的一种凝集素即麦胚凝集素(WGA)和b)(2-3)连接的唾液酸的特异性高丽槐(MA)凝集素预孵育细胞而抑制Ad37与A544细胞的结合，但(2-6)连接的唾液酸的特异性西洋接骨木凝集素不能抑制；图3表示125I标记的Ad37与鞘糖脂在微量滴定孔中的结合。
发明详述本发明惊讶地发现导致流行性角结膜炎(EKC)的腺病毒的结合可以通过干扰它们与唾液酸的结合而受到抑制。这是基于以下发现，即唾液酸似乎是导致EKC腺病毒的第一步受体。为了阻断病毒与结膜、角膜和生殖器上皮细胞的结合，将有效治疗量的干扰病毒和唾液酸受体之间相互作用的物质给予感染位点。
因此本发明关注用于治疗腺病毒感染，尤其是眼和生殖器腺病毒感染的药物组合物，其特征在于所述组合物包含干扰病毒和唾液酸受体之间相互作用的物质，所述物质以有效治疗量存在。这种干扰病毒和唾液酸受体之间相互作用的物质选自于酸性分子和负电性分子，特别是唾液酸化的糖，它们的类似物及其衍生物，以及葡糖胺聚糖，如肝素和硫酸乙酰肝素，它们的类似物及其衍生物。
优选地，干扰病毒和唾液酸受体之间相互作用的物质选自唾液酸、硫酸葡聚糖、肝素、硫酸乙酰肝素、N-羟乙酰神经氨酸、N-乙酰神经氨酸、多聚乙酰神经氨酸、3’N-乙酰神经氨酰N-乙酰乳糖胺、N-乙酰神经氨酰-3-岩藻糖基乳糖、N-乙酰神经氨酰乳糖、粘蛋白、血清类粘蛋白，其混合物或衍生物。
根据本发明的一种优选实施方案，药物组合物包含有效治疗量的唾液酸作为干扰病毒和唾液酸受体之间相互作用的物质。
根据另一种实施方案，干扰病毒和唾液酸受体之间相互作用的物质选自3’N-乙酰神经氨酰N-乙酰乳糖胺、N-乙酰神经氨酰-3-岩藻糖基乳糖、N-乙酰神经氨酰乳糖、多聚乙酰神经氨酸、及其混合物或衍生物。
根据另一种实施方案，干扰病毒和唾液酸受体之间相互作用的物质选自硫酸葡聚糖、葡糖胺聚糖，如肝素和硫酸乙酰肝素。
根据另一种实施方案，干扰病毒和唾液酸受体之间相互作用的物质是带负电的糖蛋白，如粘蛋白、血清类粘蛋白，优选粘蛋白。
此药物组合物被配制为凝胶、液体或糊剂，或包含在缓释产品中，成形并适于插入眼睑下或阴道内。对于眼部应用，组合物优选为透明的，以便尽量少影响视野。本发明的药物组合物可以包含其它有效治疗物质。
此组合物可以进一步包含通常用于眼和生殖医学领域的适当载体和佐剂，如cetrimid，aq.ster.，卡波姆，稀释氢氧化钠、凡士林等。
概括地说，本发明涉及唾液酸受体阻断在生产治疗腺病毒感染的药物组合物中的用途。
具体地，本发明涉及一种化合物在生产治疗腺病毒感染，特别是角结膜炎的药物组合物中的用途，所述化合物选自唾液酸、硫酸葡聚糖、肝素、硫酸乙酰肝素、N-羟乙酰神经氨酸、N-乙酰神经氨酸、多聚乙酰神经氨酸、3’N-乙酰神经氨酰N-乙酰乳糖胺、N-乙酰神经氨酰-3-岩藻糖基乳糖、N-乙酰神经氨酰乳糖、粘蛋白、血清类粘蛋白，及其混合物或衍生物。
具体地，本发明涉及下列任意一种物质在生产治疗腺病毒感染的药物组合物中的用途多聚乙酰神经氨酸、3’N-乙酰神经氨酰N-乙酰乳糖胺、N-乙酰神经氨酰-3-岩藻糖基乳糖及N-乙酰神经氨酰乳糖。
此外，本发明也涉及下列任意一种物质在生产治疗角结膜炎和生殖器腺病毒感染的药物组合物中的用途多聚乙酰神经氨酸、3’N-乙酰神经氨酰N-乙酰乳糖胺、N-乙酰神经氨酰-3-岩藻糖基乳糖及N-乙酰神经氨酰乳糖。
本发明包含一种治疗腺病毒感染，特别是眼和生殖器腺病毒感染的方法，其特征在于局部给予感染位点有效治疗量的干扰病毒和唾液酸受体之间相互作用的物质。
优选地，干扰病毒和唾液酸受体之间相互作用的物质选自唾液酸、硫酸葡聚糖、肝素、硫酸乙酰肝素、N-羟乙酰神经氨酸、N-乙酰神经氨酸、多聚乙酰神经氨酸、3’N-乙酰神经氨酰N-乙酰乳糖胺、N-乙酰神经氨酰-3-岩藻糖基乳糖、N-乙酰神经氨酰乳糖、粘蛋白、血清类粘蛋白，或其混合物或衍生物。通过凝胶、液体、糊剂或缓释眼和生殖器嵌入剂等方式将有效治疗量的干扰病毒和唾液酸受体之间相互作用的物质给予感染位点。
唾液酸受体的一价类似物将涵盖位于病毒颗粒的十二个角的十二条纤维中的大多数，可以有效阻断病毒颗粒与宿主细胞受体的结合。二价或多价类似物将通过与一些纤维的相互作用，使许多病毒颗粒聚集为网格。这将以更高的效率妨碍或抑制病毒感染，即每微摩尔配体产生更多抑制。在本发明者进行的实验中，发现多价配体，即粘蛋白对抑制腺病毒粘连非常有效。
所以在本发明的一种实施方案中，使病毒粒聚集为网格的多价配体被用作干扰因素。因此可以基于这些配体生产治疗病毒感染，特别是腺病毒眼感染和生殖器感染的有效药物。
因此本发明的一种实施方案包含多价物质，如包含一种附着至少两个，优选三个或更多结合基团的连接体。多价物质优选具有3到5个结合基团，与一个中间结或连接体连接。这种化合物现在可以合成为所阐述的结合结构。
实施例实施例1对Ad37结合的干扰用硫酸葡聚糖和葡糖胺聚糖，如肝素和硫酸乙酰肝素研究对腺病毒37亚型(Ad37)与第一步细胞受体结合的干扰。已经表明这种带负电的分子可以妨碍病毒的结合。而且，已经证明Ad37不与D亚属腺病毒的特征性受体CAR结合。实际上，已经表明Ad37与不表达CAR的中国仓鼠卵巢细胞结合。这种结合可以被(2-3)连接的唾液酸的特异性神经氨酸酶抑制，而不被(2-6)连接的唾液酸的神经氨酸酶抑制。另外，从高丽槐得到的(2-3)连接的唾液酸的特异性凝集素和与所有类型唾液酸结合的麦胚凝集素阻断了结合。然而，(2-6)连接的唾液酸的特异性西洋接骨木凝集素不能阻断结合。因此证明Ad37的细胞受体是(2-3)连接的唾液酸。见图2。
使用肝素得到的结果见表1。表1.用肝素对腺病毒与Chang C结膜细胞结合的非特异性电荷依赖性抑制以百分数表示的使结合抑制 对结合的最大抑制腺病毒类型 50％的肝素浓度(μM) ％(670μM 肝素)8 30 9219a25 9037 20 87在一项扩展实验中，比较了已知引起流行性角结膜炎(EKC)的Ad8，Ad19a和Ad37型腺病毒和不引起EKC的Ad9和Ad19p。研究了与人上皮A549细胞的结合。用10个单位的神经氨酸酶处理(去掉唾液酸)的细胞明显抑制Ad8，Ad19a和Ad37的结合和随后由它们引起的感染。而在对照的Ad9和Ad19p中没有观察到这一作用。这表示Ad8，Ad19a和Ad37可以通过与细胞表面的唾液酸结合而感染A549细胞，而Ad9和Ad19p不能。这些结果见图1。实施例2.唾液酸化糖蛋白的抑制作用用下列糖蛋白研究了糖蛋白抑制Ad37与Chang C结膜细胞结合的作用胎球蛋白、粘蛋白、血清类粘蛋白和血型糖蛋白A。结果见表2。表2.用唾液酸化糖蛋白对Ad37与Chang细胞结合的特异性抑制以百分数表示的使Ad37结合抑制 Ad37结合的最大抑制糖蛋白类型50％的糖蛋白浓度(μM) (500μM)胎球蛋白 420 62粘蛋白 8 89血清类粘蛋白 7577血型糖蛋白A ＞500 45这些结果表明用非常低浓度的糖蛋白可以获得显著抑制，如8μM粘蛋白就足以达到50％的抑制，500μM的浓度产生89％的抑制。实施例3.不同糖抑制Ad37结合的能力本发明者使用37型腺病毒和Chang C结膜细胞，通过判断不同糖得到的抑制而证明了此创造性概念。
表明浓度为160mmol的乳糖、半乳糖、甘露糖或乙酰半乳糖胺、乙酰葡糖胺和乙酰甘露糖胺不干扰Ad37与唾液酸表达细胞的结合。然而，N-羟乙酰神经氨酸、N-乙酰神经氨酸、多聚乙酰神经氨酸、3’N-乙酰神经氨酰N-乙酰乳糖胺、6’N-乙酰神经氨酰N-乙酰乳糖胺、N-乙酰神经氨酰-3-岩藻糖基乳糖和N-乙酰神经氨酰乳糖都可有效抑制Ad37与唾液酸表达细胞的结合。结果见表3。表3.用唾液酸糖对Ad37与Chang细胞结合的特异性抑制以百分数表示的使Ad37结合抑制 Ad37结合的最大抑制糖类型 50％的糖浓度(mM) (160mM)N-羟乙酰-神经氨酸 40 91N-乙酰-神经氨酸 18 823’-N-乙酰-神经氨酰-N-乙酰乳糖胺 5 -*6’-N-乙酰-神经氨酰-N-乙酰乳糖胺 7 -*N-乙酰神经氨酰-3-岩藻糖基乳糖 5 -*多聚乙酰神经氨酸 8 79N-乙酰-神经氨酰乳糖 5 95*未判断所有数据均体现为抑制50％的腺病毒结合和最大程度抑制腺病毒结合所需要的剂量。
这些结果明确表明用非常低的糖浓度可以达到显著抑制。很明显，剂量小于10mM的3’N-乙酰神经氨酰N-乙酰乳糖胺、6’N-乙酰神经氨酰N-乙酰乳糖胺、N-乙酰神经氨酰-3-岩藻糖基乳糖、N-乙酰神经氨酰乳糖和多聚乙酰神经氨酸可以导致50％的抑制。另外，用浓度为160mM的特异性糖，尤其是N-乙酰神经氨酰乳糖几乎可以达到完全抑制。
其它还未检验的候选糖包括2-O-甲基-α-β-N-乙酰神经氨酸和N-乙酰神经氨酸甲酯。
N-羟乙酰神经氨酸和N-乙酰神经氨酸为单糖。N-乙酰神经氨酰-岩藻糖基-乳糖以下式表示α-Neu-5-Ac-(2-3)-β-D-Gal(1-4)-(α-Fuc-(1-3))-Glc。3’-N-乙酰-神经氨酰-N-乙酰-乳糖胺以下式表示α-NeuNAc-(2-3)-β-D-Gal-(1-4)-D-GlcNAc。6’-N-乙酰-神经氨酰-N-乙酰-乳糖胺以下式表示α-Neu-5Ac-(2-6)-β-D-Gal-(1-4)-D-GlcNAc。N-乙酰-神经氨酰-乳糖是α-Neu-5Ac-(2-3)-β-D-Gal-(1-4)-D-Glc和α-Neu-5Ac-(2-6)-β-D-Gal-(1-4)-D-Glc的混合物。
图3所示薄层层析初步结果提示下列结构对Ad37病毒结合有效α-NeuAc-(2-3)-β-D-Gal-(1-3)-β-GalNAcNeuAc-GD1b或Ga1β3GalNAcβ4(NeuAcα8NeuAcα3)Galβ4Glcβ1NeuAc-GD1a或NeuAcα3Galβ3GalNAcβ4(NeuAcα3)Galβ4Glcβ1NeuAcGM2或GalNAcβ4(NeuAcα3)Galβ4Glcβ1NeuAc-GD2或GalNAcβ4(NenAcα3NeuAcα3)Galβ4Glcβ1根据这个资料，可以开发干扰病毒和唾液酸受体间相互作用的药物组合物。具体地说，可以根据上述结构构建可以与一些病毒颗粒相互作用而导致病毒聚集的多价物质。
尽管本发明的描述是关于构成本发明者目前所知的最佳方式的优选实施方案，应该理解，对于本领域的普通技术人员是很明显的是，可以进行各种改变和修饰而不离开所附权利要求所阐述的本发明的范围。
权利要求
1.用于治疗腺病毒感染的药物组合物，其特征在于所述组合物包含干扰病毒和唾液酸受体间相互作用的物质，所述物质以有效治疗量存在。
2.用于治疗流行性角结膜炎的药物组合物，其特征在于所述组合物包含干扰病毒和唾液酸受体间相互作用的物质，所述物质以有效治疗量存在。
3.用于治疗生殖器腺病毒感染的药物组合物，其特征在于所述组合物包含干扰病毒和唾液酸受体间相互作用的物质，所述物质以有效治疗量存在。
4.权利要求1-3的任意一项的药物组合物，其特征在于干扰病毒和唾液酸受体间相互作用的物质为酸性或带负电的分子。
5.权利要求1-3的任意一项的药物组合物，其特征在于干扰病毒和唾液酸受体间相互作用的物质选自唾液酸化的糖、它们的类似物及其衍生物、葡糖胺聚糖、它们的类似物及其衍生物。
6.权利要求1-3的任意一项的药物组合物，其特征在于干扰病毒和唾液酸受体间相互作用的物质选自唾液酸、硫酸葡聚糖、肝素、硫酸乙酰肝素、N-羟乙酰神经氨酸、N-乙酰神经氨酸、多聚乙酰神经氨酸、3’N-乙酰神经氨酰N-乙酰乳糖胺、6’N-乙酰神经氨酰N-乙酰乳糖胺、N-乙酰神经氨酰-3-岩藻糖基乳糖、N-乙酰神经氨酰乳糖、粘蛋白、血清类粘蛋白，或其混合物或衍生物。
7.权利要求1-3的任意一项的药物组合物，其特征在于干扰病毒和唾液酸受体间相互作用的物质选自3’N-乙酰神经氨酰N-乙酰乳糖胺、6’N-乙酰神经氨酰N-乙酰乳糖胺、N-乙酰神经氨酰-3-岩藻糖基乳糖、N-乙酰神经氨酰乳糖和多聚乙酰神经氨酸。
8.权利要求1-3的任意一项的药物组合物，其特征在于干扰病毒和唾液酸受体间相互作用的物质为N-乙酰-神经氨酰乳糖、肝素和粘蛋白。
9.一种干扰病毒和唾液酸受体间相互作用的物质在生产治疗腺病毒感染的药物组合物中的用途，所述物质选自唾液酸、硫酸葡聚糖、肝素、硫酸乙酰肝素、N-羟乙酰神经氨酸、N-乙酰神经氨酸、多聚乙酰神经氨酸、3’N-乙酰神经氨酰N-乙酰乳糖胺、6’N-乙酰神经氨酰N-乙酰乳糖胺、N-乙酰神经氨酰-3-岩藻糖基乳糖、N-乙酰神经氨酰乳糖、粘蛋白、血清类粘蛋白，或其混合物或衍生物。
10.肝素在生产治疗角结膜炎的药物组合物中的用途。
11.肝素在生产治疗生殖器腺病毒感染的药物组合物中的用途。
12.N-乙酰-神经氨酰乳糖在生产治疗角结膜炎的药物组合物中的用途。
13.N-乙酰-神经氨酰乳糖在生产治疗生殖器腺病毒感染的药物组合物中的用途。
14.粘蛋白在生产治疗角结膜炎的药物组合物中的用途。
15.粘蛋白在生产治疗生殖器腺病毒感染的药物组合物中的用途。
16.治疗腺病毒感染，特别是眼部腺病毒感染的方法，其特征在于局部给予感染位点有效治疗量的干扰病毒和唾液酸受体间相互作用的物质。
17.权利要求16的方法，其特征在于干扰病毒和唾液酸受体间相互作用的物质选自唾液酸、硫酸葡聚糖、肝素、硫酸乙酰肝素、N-羟乙酰神经氨酸、N-乙酰神经氨酸、多聚乙酰神经氨酸、3’N-乙酰神经氨酰N-乙酰乳糖胺、6’N-乙酰神经氨酰N-乙酰乳糖胺、N-乙酰神经氨酰-3-岩藻糖基乳糖、N-乙酰神经氨酰乳糖、粘蛋白、血清类粘蛋白，及其混合物或衍生物。
18.权利要求16的方法，其特征在于干扰病毒和唾液酸受体间相互作用的物质为N-乙酰-神经氨酰乳糖。
19.权利要求16的方法，其特征在于干扰病毒和唾液酸受体间相互作用的物质为肝素。
20.权利要求16的方法，其特征在于干扰病毒和唾液酸受体间相互作用的物质为粘蛋白。
21.治疗腺病毒感染的药物组合物，其特征在于所述组合物包含一种多价物质，该多价物质可以与一些纤维相互作用，导致许多病毒颗粒聚集，所述物质以有效治疗量存在。
全文摘要
可以通过给予有效治疗量的干扰病毒和唾液酸受体间相互作用的物质而治疗或缓解腺病毒感染，特别是眼腺病毒感染，如角结膜炎。
文档编号A61K31/715GK1399552SQ0081617
公开日2003年2月26日 申请日期2000年11月23日 优先权日1999年11月26日
发明者戈兰·韦德尔, 尼克拉斯·阿恩贝格 申请人:戈兰·韦德尔, 尼克拉斯·阿恩贝格