专利名称：一种甲状旁腺激素类似物及其重组制备的制作方法
本专利涉及一种甲状旁腺激素类似物的蛋白质氨基酸序列、重组制备以及用途。
甲状旁腺激素(Parathyroid hormone，PTH)是体内最重要的调钙激素，通过骨骼、肾脏和小肠三个主要靶器官调节血钙平衡，直接或间接影响钙离子在细胞内外及细胞器与胞浆之间的流动，从而发挥钙在各种细胞功能和代谢活动中的重要作用。近年来发现PTH具有成骨作用，尤其在动物实验和临床研究中发现PTH可有效恢复骨质疏松患者所失去的无机骨质。
PTH在体内最初合成时，是一个含115个氨基酸的前体前甲状旁腺激素原(PreproPTH)，其N末端25个氨基酸的引导肽(Pre部分)在内质网中被立即水解，形成90个氨基酸的无活性激素原(ProPTH)，后者又在高尔基体内切去N端6肽(Pro部分)，最终形成成熟的PTH。成熟的PTH为含84个氨基酸的单股多肽链，分子量9600道尔顿。在低钙条件下，PTH从甲状旁腺释放。血中的PTH主要以三种形式存在完整PTH(iPTH)、N端1-34肽段[PTH(1-34)]及C端56-84肽段(cPTH)。iPTH和PTH(1-34)均有通过骨骼和肾脏等靶器官调节机体血钙浓度的完全生物活性，主要受体结合位点在N端1-6肽段，切除后会导致全部活性的丧失。cPTH占循环PTH的80％左右，半衰期较长，但没有生物活性。
构效关系研究表明，PTH(1-34)包含了在各种测定系统中表现全部生物活性的所有必需结构，N端氨基酸为活性所必需，将其去除后PTH的生物活性明显下降甚至完全丧失。如3-34肽段虽不表现活性，但含有与受体结合的必要结构并携带由代谢酶所识别的信息。同时，由于PTH(1-34)较短，体内代谢较iPTH快，符合天然激素作用特性。因此，PTH(1-34)在一定程度上可以完全取代iPTH而成为医用甲状旁腺激素的选择PTH在医药市场上有巨大的价值，用于治疗多种原因引起的骨质疏松及甲状旁腺功能减少等疾病。美国的NPS公司用大肠杆菌表达并生产的iPTH[即PTH(1-84)]已经进入三期临床试验，其结果证明了该药明确的安全性和有效性。国内外已有多家研制单位应用大肠杆菌系统开发PTH(1-34)，以美国、日本和英国为主的临床研究结果表明，PTH(1-34)在治疗骨质疏松和甲状旁腺机能减退症疗效方面显示出与iPTH同样的作用。
由于PTH(1-34)为短肽类激素，未见用酵母体系进行重组制备的相关文献报道，目前的研制单位均用大肠杆菌融合表达体系进行。融合表达的重组蛋白必须经过相应的蛋白酶酶切后才能得到目的蛋白。文献中用于大肠杆菌融合表达PTH(1-34)的蛋白酶主要有Thrombin、Factor Xa、KEX2、DDP等，通过一定特异性识别位点进行有效的酶切而获得重组PTH(1-34)，但在其N末端不可避免地留下1到2个多余的氨基酸，从而造成结构的变化和生物活性的下降。由于基因工程产品的特点，特别是在进行融合表达目的蛋白时，需要考虑融合蛋白的特性、工程菌对融合蛋白的适应能力、最后纯化时所选择蛋白酶的可能范围以及蛋白酶酶切后对目的蛋白氨基酸序列的影响等。本发明的目的在于建立一种氨基酸数量和结构、生物活性和产率稳定的重组PTH类似物制备方法。通过对氨基酸的序列和结构分析，对PTH(1-34)N末端第1位氨基酸Ser进行包括Gly、Ala、Leu、Ile、Val、Thr在内的中性氨基酸同源替代，第26位替代成Gln、Asn，使其在工程菌中的稳定性和产量得到明显的提高，同时在选用特殊的融合表达体系时更有利于操作控制。
在本发明的实例中有对PTH(1-34)N末端第1位和第26位氨基酸分别改造为Gly1、Gln26的具体说明。由于EK酶的识别位点为Asp-Asp-Asp-Asp-Lys↓，TEV酶的识别位点为Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-↓Gly(↓为酶切位点)，这两种酶作用后均可在目的蛋白的N末端留下Gly，便于表达后目的蛋白的获得且不影响其生物活性，终产物重组PTHa的N末端与理论设计完全一致，不含有多余的氨基酸。天然型PTH第25、26、27位氨基酸分别为Arg25-Lys26-Lys27，该序列在表达PTHa的宿主菌中被其体内的yscF蛋白酶识别并在Lys26-Lys27间切割(酵母表达系统更加明显)，使PTH的稳定性及含量显著下降，回收率低。因此，本专利将天然型PTH第26位氨基酸替换为Gln或Asn，有效地避开蛋白酶的切割。经过生物活性、免疫印迹、蛋白含量和分子量测定证明，改造后的1-34PTH(Gly1Gln26)融合表达体系可按照设计通过EK酶和TEV酶酶切后纯化，生物活性与天然PTH(1-34)完全一致。实例一甲状旁腺激素类似物PTHa[1-34PTH(Gly1Gln26)]基因的获得1-34PTH(Gly1Gln26)(以下简称PTHa)的氨基酸序列如下Seq 1(PTHa蛋白质的氨基酸序列)Gly-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-AsnSer-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Gln-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe。
在合成基因序列时根据氨基酸的密码子简并原则和大肠杆菌偏爱型密码子原则，设计的模板单链如下(102bp)Seq 2(PTHa基因单链模板序列)5’GGT GTT TCC GAA ATC CAG TTG ATG CAT AAC TTG GGT AAA CAT TTG AACTCC ATG GAG AGA GTT GAA TGG TTG AGA CAA AAG TTG CAG GAT GTT CACAAT TTT3’。
可根据不同的融合表达需要设计引物1.用于烟草蚀刻病毒蛋白酶(TEV)酶切的DsbA融合表达PTHa的PCR引物设计Seq 3(正向引物的核苷酸序列，65bp)5’TA GGA TCC TTA GGC ATT GAC ACA ACC GAA AAC CTG TAC TTT CAAGGT GGT GTT TCC GAA ATC CAG 3’(引入BamH I限制性内切酶酶切位点，TEV蛋白酶的Spacer和酶切位点)。
Seq 4(反向引物的核苷酸序列，38bp)5’AT GAA TTC TAA TAG AAA ATT GTG AAC ATC CTG CAA CTT 3’(引入EcoR I限制性内切酶酶切位点和2个终止密码子)2.用于肠激酶(EK)酶切的GST融合表达PTHa的PCR引物设计Seq 5(正向引物的核苷酸序列，41bp)5’TA GGA TCC GAC GAT GAC GAT AAG GGT GTT TCC GAA ATC CAG 3’(引入BamH I限制性内切酶酶切位点和EK蛋白酶酶切位点)。
Seq 6(反向引物的核苷酸序列，38bp)5’AT GAA TTC TAA TAG AAA ATT GTG AAC ATC CTG CAA CTT 3’(引入EcoR I限制性内切酶酶切位点和2个终止密码子)以上2对引物分别和单链模板进行PCR扩增，经5％的变性PAGE电泳检验，得到一条150bp左右含相应蛋白酶切位点的PTHa基因片段。实例二重组PTHa融合表达载体的构建表达1.用于TEV酶切的DsbA融合表达PTHa载体的构建及工程菌的获得用Seq3和Seq4引物扩增的PCR产物用BamHI和EcoRI双酶切后，与BamHI和EcoR I双酶切后的pFG925质粒用在14℃用T4连接酶进行连接，重组质粒命名为pFG925-PTHa(
图1)。然后用CaCl2法转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，涂布在含有50ug/ml氨苄青霉素和35ug/ml氯霉素的SOB平板，挑选阳性菌落在SOB中培养至OD600为0.6-0.8时加入IPTG 1.0mM诱导3-4小时离心收集菌体，8M尿素破菌后10％SDS-PAGE电泳时出现一条52KD左右的蛋白带，表达量为45-50％。经天然型PTH(1-34)的单克隆抗体(DSL产品，美国)免疫印迹检定，显示阳性反应。所获得的高效表达PTHa的工程菌命名为BL-PTHa。2.用于EK酶切的GS融合表达PTHa载体的构建及工程菌的获得用Seq5和Seq6引物扩增的PCR产物用BamHI和EcoRI双酶切后，与BamHI和EcoR I双酶切后的pGEX-4T-1质粒用在14℃用T4连接酶进行连接，重组质粒命名为pGEX-PTHa(图2)。然后用CaCl2法转化大肠杆菌JM109，涂布在含有100ug/ml氨苄青霉素的LA平板，挑选阳性菌落在LA中培养至OD600为0.6-0.8时加入IPTG 0.5mM诱导3-4小时离心收集菌体，超声破菌后10％SDS-PAGE电泳时出现一条32KD左右的蛋白带，表达量为20-25％。经天然型PTH(1-34)的单克隆抗体(DSL产品，美国)免疫印迹检定，显示阳性反应。所获得高效表达PTHa的工程菌命名为JM-PTHa。实例三重组PTHa的纯化1.DsbA融合表达PTHa的纯化重组PTHa蛋白表达是采用本公司构建的BL-PTHa工程菌来完成。20LM9CA发酵后收集菌体，超声破菌并用6M尿素溶解离心后50mM Tris-HCl(pH8.0)稀释4倍。样品通过Ni+螯合亲和层析柱Chelating Sepharose Fast Flow后再用50mM-200mM Imidazone梯度洗脱收集融合蛋白，纯度达90％，经TEV酶(GIBCO公司产品)30℃酶切1hr，再通过Chelating Sepharose Fast Flow除去DsbA蛋白，切下的重组PTHa经C8反相层析获得纯度大于95％的重组PTHa。
2.GST融合表达PTHa的纯化重组PTHa蛋白表达由JM109-PTHa工程菌来完成。发酵后发酵液离心收集菌体，压力匀浆破菌，收集上清上Glutathione Sepharose层析柱，用还原型谷胱甘肽(GSH)洗下融合蛋白，加入EK酶(Invitrogen I公司产品，美国)37℃酶切2小时，然后通过Glutathione Sepharose除去GST蛋白，切下的重组PTHa经C8反相层析获得纯度大于95％的重组PTHa。实例四重组PTHa的生物特性检测1.N末端氨基酸序列检测以上实例中的两种表达体系及相应蛋白酶酶切后经纯化得到的重组PTHa，N末端15个氨基酸的测序结果均为Gly-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu，与设计值一致。2.分子量和纯度15％Tricine电泳显示以上两种方法所得的重组人PTHa经纯化后为4K D左右的单一蛋白条带。用高效液相(HPLC)C18反相柱检测分析，本发明获得的重组人PTHa纯度大于95％。
3.生物活性采用体外实验测定培养的wistar新生大鼠成骨细胞腺苷酸环化酶含量确定PTHa的生物活性。取出生24小时内的Wistar大鼠颅骨，去除骨膜及软组织后用0.05％胰酶和1M胶原酶II在37℃消化2小时，经140目的尼龙网过滤，1000rpm离心10min，收集细胞并重悬于含10％胎牛血清的DMEM中，调整计数1×105/ml至细胞长满瓶底。消化1代末细胞，按4×103/ml加入24孔板，细胞贴壁后换含10％去类固醇胎牛血清的DMEM，平衡12h后在1、6、12、24、48h加入PTHa，共8个循环。之后各孔加50mM二乙醇胺200ul和2.5mM对硝基酚磷酸钠100ul，37℃反应30min+用0.1M的NaOH100ul终止反应。405nm处比色。标准曲线为分别加入0-50ul对硝基苯酚。
经测定，本发明中两种方法所得的重组PTHa[即1-34PTH(Gly1Gln26)]与Sigma公司PTH(1-34)生物活性相同。
权利要求
1.本发明中甲状旁腺激素类似物的氨基酸序列是X1-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-X2-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe其特征是X1位氨基酸为中性氨基酸，第X2位氨基酸为酰胺类氨基酸。其通式为(1-34)PTH(X11X226)。
2.权利要求1中甲状旁腺激素类似物氨基酸序列中X1指Gly、Ala、Leu、Ile、Val、Thr6个氨基酸，X2指Gln、Asn。
3.权利要求1、2中X1主要指Gly，X2主要指Gln。
4.权利要求1、2、3中的重组甲状旁腺激素类似物由基因工程重组表达载体经转化、发酵和纯化而制得。
5.权利要求4中重组载体的宿主细胞包括细菌、酵母和哺乳动物细胞。
6.权利要求1中的甲状旁腺激素类似物的临床应用包括骨质疏松和甲状旁腺机能减退疾病的治疗。
全文摘要
甲状旁腺激素(Parathyroid hormone,PTH)在体内由甲状旁腺分泌,是由84个氨基酸组成的多肽激素,为调节机体血钙浓度的主要因子。本发明为一种甲状旁腺激素的类似物,含有34个氨基酸,其特征是N末端第1位氨基酸为中性氨基酸,第26位氨基酸为酰胺类氨基酸。本发明中的重组甲状旁腺激素类似物(PTHa)由人工合成相对应的基因序列,构建重组表达载体,经发酵和纯化而制得,具有与甲状旁腺激素相同的生物活性。
文档编号A61P5/00GK1365984SQ0110291
公开日2002年8月28日 申请日期2001年1月19日 优先权日2001年1月19日
发明者范开, 黄洪涛, 田峰, 马素永, 聂李亚 申请人:重庆富进生物医药有限公司