专利名称：用于治疗糖尿病溃疡的药的配方及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗糖尿病溃疡，尤其是足部溃疡的药的配方及其制备方法。
糖尿病是危害人类健康的三大杀手之一，同时它的并发症，给患者的生理和心理都带来极大的痛苦。溃疡，尤其是足部溃疡是常见的一种并发症，据美国统计数据表明，在美国1600万糖尿病人中，有25％的人会发生足部溃疡的并发症。在中国，糖尿病病人的人数也因近年生活水平的提高而逐年增加。
一般人伤口可于一至两周内自行复元，但糖尿病患者，缺乏自行修补伤口能力，加上血糖极高，增加细菌感染机会，初期糖尿病患者，可能一至两个月后伤口才会复元，长期患者，伤口可能三个月以上亦未能复元，并有扩散感染情况。
糖尿病患者一旦不慎出现溃疡，由于身体高血糖及抵抗能力低，容易导致伤口不能复元，甚至出现严重感染而须进行切除脚部手术，以保存性命。
现时糖尿病患者接受治疗较被动，包括清理溃疡伤口、服食抗生素消炎、定期控制血糖浓度及对严重感染者进行切除手术。
本发明的目的在于根据我们已有的动物实验结果，提出一种治疗糖尿病溃疡的药的配方及制备方法。
本发明解决了目前临床上糖尿病溃疡主要采用被动治疗的问题，采取主动治疗以局部给药的方式，1)利用VEGF促进糖尿病溃疡部位的血管生长，UK促进糖尿病溃疡部位的血管和神经生长，氧化氟沙星的消炎作用，加快病患部位的修补，避免扩散感染机会，取得理想的治疗效果。
2)利用基因工程的方法生产VEGF和UK，减少天然提取带来病毒污染的机会，降低生产成本。
具体实施例方式一、用酵母细胞系统生产pro-UK，pro-UK经固定化的纤溶酶(plasmin)酶切获得UK。
1、重组质粒的构建以含有pro-UK编码序列的pSAT-UK质粒为模板进行PCR扩增，引物15′-CTCTCGAGAAAAGAAGCAATGAACTTCATCAAGTTCCATCG-3′引物25′-AATCTAGATCAGAGGGCCAGGCCATTCTC-3′5′端引物包含XhoI限制性酶切位点，α-因子信号序列，和proUK的第一个密码子前的Kex2切割位点，3′端的引物在终止子后包含了一个XhaI限制性酶切位点。以XhoI、XbaI双酶切pro-UK DNA片段及pPICZα载体，纯化，T4DNA连接酶连接构建pPICZα-proUK表达载体。pPICZα载体含用甲醇调节的强启动子(AOX1)，α-因子信号序列(分泌作用)和Zeocin抗性基因。
2、酵母转化proUK-pPICZα质粒经PmeI酶切线性化后，用EasyComptransformation kit(Invitrogen)转化KM71或GS115酵母菌株，转化后用YPDS平板(1％yeast extract，2％peptone，2％glucose，1Msorbitol，2％agar，100μg/ml Zeocin)筛选发生同源重组的克隆，监测分泌物中的纤溶活性。
3、重组蛋白的表达及纯化挑取表达proUK的克隆接种至BMGY培养基中30℃培养至对数生长期，按以1/5体积的含甲醇0.5％的BMMY培养基诱导重组蛋白表达，诱导96h后(每隔24h补加甲醇至0.5％)。收集BMMY培养上清加入50mM醋酸，0.2M NaCl，0.01％Tween 80预平衡的carboxymethyl cellulose柱，pro-UK用50mM HAc，0.5M NaCl，0.01％Tween80的缓冲液洗脱。二、用酵母细胞系统生产VEGF1651、重组质粒的构建以含有VEGF165编码序列的TA3.1质粒为模板进行PCR扩增，5′端引物包含XhoI限制性酶切位点，α-因子信号序列，和VEGF165的第一个密码子前的Kex2切割位点，3′端的引物在终止子后包含了一个XhaI限制性酶切位点。以XhoI、XbaI双酶切VEGF165 DNA片段及pPICZα载体，纯化，T4DNA连接酶连接构建pPICZα-VEGF165表达载体。pPICZα载体含用甲醇调节的强启动子(AOX1)，α-因子信号序列(分泌作用)和Zeocin抗性基因。
2、酵母转化VEGF165-pPICZα质粒经PmeI酶切线性化后，用EasyComptransformation kit(Invitrogen)转化KM 71或GS115酵母菌株，转化后用YPDS平板(1％yeast extract，2％peptone，2％glucose，1Msorbitol，2％agar，100μg/ml Zeocin)筛选发生同源重组的克隆。
3、重组蛋白的表达及纯化挑取表达VEGF165的克隆接种至BMGY培养基中30℃培养至对数生长期，按以1/5体积的含甲醇0.5％的BMMY培养基诱导重组蛋白表达，诱导96h后(每隔24h补加甲醇至0.5％)。收集BMMY培养上清，用heparin-binding亲和层析柱纯化。三、生物活性的测定1、Bovine capillary endothelial cells(BCE)测定法取生长良好的BCE细胞，经PBS洗涤，胰酶消化，用含DMEM+1％GPS培养液配成25,000个/ml的悬液，加入24孔板，每孔0.5mL，37℃，10％CO2条件下培养24小时，细胞贴壁后弃上清液，加入0.5mLDMEM+5％小牛血清+10％GPS及待测样品，37℃培养20分钟后，加入bFGF至终浓度1ng/ml。72小时后，XTT法测活细胞数。
2、Calf pulmonary arterial endothelial cells(CPAE)测定法方法同上。
3、Human Umbilical Vein Endothelial Cells(HUVEC)测定法将在EBM+2％小牛血清培养基中生长的细胞加至96孔板，每孔0.1mL(50,000 Cells)，37℃，10％CO2条件下培养24小时，细胞贴壁后弃上清液，加入0.1mL EBM+2％小牛血清+4ng/mL bFGF，继续培养48小时，弃上清，加入0.1mL EBM+2％小牛血清及待测样品，37℃培养20分钟后，补加0.1ml培养基(EBM+2％小牛血清+2ng/mL bFGF)，24小时后，XTT法测活细胞数。
4、小鼠模型测定法取8周龄的C57BL/KsJ(db+/db+)小鼠(Jackson Lab，Bar Harbor，ME USA)，麻醉后，在其背部中央造成8mm深的创口，并在整个研究过程中让其暴露在外，连续用药5天，用经校正的Jameson caliper测定其伤口愈合程度。对照组采用C57BL/KsJ(db+/+m)小鼠。四、动物实验结果采用糖尿病的小鼠C57BL/KSJ(db+/db+)和正常非糖尿病的小鼠C57BL/KSJ(db+/+m)比较了含0.5％氧氟沙星凝胶与含0.01％VEGF、0.01％UK和0.5％氧氟沙星凝胶对伤口愈合的影响。
结果表明糖尿病的小鼠C57BL/KSJ(db+/db+)用含0.5％氧氟沙星凝胶与含0.01％VEGF、0.01％UK和0.5％氧氟沙星凝胶连续用药5天后，伤口愈合的百分率分别为7.5％和35.2％。对照组正常非糖尿病的小鼠C57BL/KSJ(db+/+m)用含0.5％氧氟沙星凝胶与含0.01％VEGF、0.01％UK和0.5％氧氟沙星凝胶连续用药5天后，伤口愈合的百分率分别29.7％和60.8％。
权利要求
1.一种用于治疗糖尿病溃疡的药的配方，其特征在于含有血管上皮生长因子(VEGF，Vascular Endothelial Growth Factor)、尿激酶(UK，urokinase)、氧氟沙星三种活性成分。
2.根据权利要求1所述的治疗糖尿病溃疡的药的配方含有上述活性成分中的一种或任意二种的组合。
3.根据权利要求1所述的配方中VEGF的含量为0.001～0.5％，UK的含量为0.001～0.5％，氧氟沙星的含量为0.2％～1.0％。
4.根据权利要求1所述的配方采用局部给药，剂型可以是药液、药膏、药膜、气雾剂、透皮吸收剂等。
5.根据权利要求1所述的配方中的VEGF或者是天然提取的，或者是基因重组方法采用原核细胞、酵母细胞或真核细胞系统生产的。
6.根据权利要求1所述的配方中的UK或者是天然提取的，或者是基因重组方法采用原核细胞、酵母细胞或真核细胞系统生产的。
7.根据权利要求5所述的VEGF用基因重组方法采用酵母系统生产，其特征在于PCR扩增基因，克隆至pPICZα质粒，转化KM71或GS115酵母细胞，在所述培养液中诱导表达，用heparin-binding亲和层析柱纯化目标蛋白质。
8.根据权利要求6所述的UK用基因重组方法采用酵母系统生产，其特征在于PCR扩增基因，克隆至pPICZα质粒，转化KM71或GS115酵母细胞，在所述培养液中诱导表达，用carboxymethyl cellulose柱纯化目标蛋白质。
9.根据权利要求4所述的药剂用Bovine capillary endothelialcells(BCE)、Human Umbilical Vein Endothelial Cells(HUVEC)、Calf pulmonary arterial endothelial cells(CPAE)等细胞及C57BL/KsJ(db+/db+)小鼠进行其生物活性测定。
全文摘要
本发明涉及一种治疗糖尿病溃疡,尤其是足部溃疡的药的配方及其制备方法,属于生物技术制药中的基因工程生产蛋白质药物的技术领域。其目的是创造出含有血管上皮生长因子(VEGF,Vascular Endothelial Growth Factor)、尿激酶(UK,urokinase)、氧氟沙星三种活性成分,具有促进血管生长、神经生长和消炎作用的药物,用于治疗糖尿病溃疡,尤其是糖尿病足部溃疡。其中VEGF和UK是用基因工程方法生产的蛋白质,利用酵母细胞系统高效表达,经分离纯化获得目标蛋白质。
文档编号A61P17/02GK1389267SQ0112278
公开日2003年1月8日 申请日期2001年7月24日 优先权日2001年6月5日
发明者刘建宁, 刘蓓钫, 张菁 申请人:刘建宁