专利名称：病毒株的制作方法
技术领域：
本发明涉及例如疱疹病毒(诸如HSV)的非实验室病毒株，与实验室病毒株相比，所述非实验室病毒株具有改进的溶瘤能力和/或基因传递能力。
已经提出单纯疱疹病毒(HSV)既可用作神经系统和其它系统中的基因传递载体，又可用于溶瘤法治疗癌症。然而，在这两种应用中，必须使病毒成为缺陷型的，使它不再具有致病性，但是使它仍能进入细胞并执行所需功能。因而，对于利用HSV使无毒基因传递至靶细胞，显然在大多数情况下，必须阻止病毒的立即早期基因表达或将其表达减至最小。对于溶瘤法治疗癌症(该疗法也可以包括传递增强所述治疗效应的基因)，已经鉴定出HSV的许多突变，HSV的这些突变仍允许病毒在培养物或在体内活跃分裂的细胞内(例如肿瘤内)复制，但是阻止其在正常组织内的有效复制。这样的突变包括破坏ICP34.5、ICP6和胸苷激酶的编码基因。迄今为止，在这些突变病毒中，具有ICP34.5突变或者ICP34.5突变以及例如ICP6突变的病毒已经显示最为有利的安全分布图。已经显示仅缺失ICP34.5的病毒在体外在许多肿瘤细胞类型中复制并且在人工诱导的小鼠脑肿瘤内选择性复制，而不伤害周围组织。早期临床试验也表明它们在人类中是安全的。
然而，虽然有希望将各种病毒(包括HSV)用于基因传递/治疗或者用于溶瘤法治疗癌症，但该项工作中的绝大多数工作一直使用已经在组织培养细胞内保持许多年的病毒株。在仅需要病毒进入细胞以传递基因的应用中，这可以证明是不成问题的，因为在细胞培养中保持也需要病毒进入细胞，虽然通常与载体的可能靶细胞相比是不同类型或物种的细胞。然而，在需要其它特性的应用中，应用实验室病毒株不可能使病毒在需利用的具体应用中具有全部潜能。
在目前正作为载体开发的病毒中HSV具有独特的能力，这是由于HSV天然进化成感染神经元并在此中潜伏。HSV也进化成从感染部位(通常在外周)沿神经以高效率运输至通常位于脊神经节中的神经元胞体。在细胞培养物中不需要这种能力，由于这种能力需要HSV的特殊进化的特性，进一步适应在培养物中生长可能导致丧失最有效的轴突运输能力。如果以最大效率一直保留轴突运输特性，则用于将基因传递至中枢神经系统或周围神经系统的HSV载体可能显示最大效率。在此，在外周部位接种则可以允许最有效地将基因传递至外周神经元胞体，而在脑内接种则可能允许最有效地将基因传递至多个连接的部位。目前基于实验室HSV毒株的载体可能不容许以可能的最大效率发生这一事件。事实上，因为HSV沿神经运输的能力强，因此在需要保守的特性和可能在培养物中保留的特性之间可能存在特别大的差异。
HSV和其它病毒(例如腺病毒或rheovirus)也在溶瘤法治疗癌症方面具有潜在的效用。然而，在正在开发用于这些目的病毒先前一直广泛地在培养物中保持。由于溶瘤法治疗癌症需要在通常相对缓慢生长的人肿瘤细胞内有效复制，因此预期使实验室病毒株适应在特定培养细胞内生长，可能降低了在可能最适发生人肿瘤细胞内裂解性复制的效率或感染人肿瘤细胞的效率。
发明概述本发明提供开发基因传递和/或裂解性破坏肿瘤细胞的体内能力改进的病毒的机会。在此，基于合适病毒的最新临床分离株而不是先前一直使用的连续传代的实验室毒株，构建适用于这些目的的病毒株。因此，本发明的潜力是提供具有以下特性的病毒体内感染人细胞的能力改进、在这类细胞内复制/裂解的能力改进以及(就HSV而论)从接种部位沿神经运输至神经元胞体的能力改进。本发明利用HSV举例说明，但同样适用于目前正开发作为载体和/或用于溶瘤法破坏癌症细胞的其它病毒。
我们已经证明，与HSV1毒株17+(标准实验室毒株)相比，两种HSV1临床分离株(毒株JS1和BL1)增强了在某些人肿瘤细胞系内的复制。
我们使临床分离株JS1缺失ICP34.5，然后再与其中也缺失ICP34.5的HSV1毒株17+(标准实验室毒株)相比，比较在人肿瘤细胞类型中的复制潜能。该毒株(JS1/ICP34.5-)是一种来源于临床分离株的经修饰的毒株，并因此是一种本发明的经修饰的非实验室毒株。
与具有相同修饰的HSV1 ICP34.5缺失毒株17+(即标准实验室病毒株)相比，具有ICP34.5缺失的JS1显示出在某些被测人肿瘤细胞内生长增强。然而，与来源于毒株17+的实验室毒株相比，JS1/ICP34.5-病毒在所有被测肿瘤细胞系中增强细胞杀伤能力。
因此，可以观察到应用非实验室病毒株增强这类病毒的抗肿瘤能力，并且已在所有至今被测的肿瘤细胞系中得到证实。这将适用于人类患者的癌症治疗。
如果这些病毒随后用来传递具有抗肿瘤活性的基因，则也可以预期进一步增强活性。这样的基因包括编码前体药物激活蛋白、肿瘤抑制蛋白或促细胞凋亡因子(pro-apoptotic factors)或免疫刺激蛋白的基因。
对于该目的，我们产生了表达人GMCSF的HSV1的ICP34.5缺失型临床分离株。该病毒用来在肿瘤内注射后增强抗肿瘤免疫应答。
本发明也提供携带一种或多种异源基因的本发明病毒。术语异源基因包括在所述病毒基因组中不存在的任何基因。所述异源基因可以是野生型基因的任何等位基因变异体，或者它可以是突变基因。最好将异源基因与允许所述异源基因体内在细胞内表达的控制序列有效连接。因此，本发明的病毒可用来将一种或多种异源基因体内传递至将让其表达的细胞内。对于溶瘤病毒疗法，这样的基因通常编码能够增强病毒的肿瘤破坏特性的蛋白。这些基因可以编码其自身具有细胞毒性的蛋白、可以编码前体药物激活蛋白或者可以编码能够刺激/增强抗肿瘤免疫应答的蛋白。对于利用HSV将基因传递至周围神经系统，所述一种或多种异源基因可以编码能够改变对疼痛刺激应答或缓解慢性疼痛的多肽，例如能够隔绝例如神经生长因子、其它疼痛调节神经营养因子或神经营养因子样分子的蛋白或物质P或其它神经肽。所述一种或多种异源基因也可以编码能够刺激变性性疾病中损伤神经再生长或防止神经进一步变性的多肽。在中枢神经系统中，异源基因可以包括那些在神经变性性疾病(例如帕金森氏病或早老性痴呆)中具有潜在益处的基因，并且在这类疾病中通常可以包括编码能够增强其余细胞活性的神经营养因子和/或酶的基因。在所有情况下，一种病毒可以携带一种或多种异源基因。
因此，本发明提供应用经修饰的非实验室溶瘤病毒株生产溶瘤法治疗癌症的药物；应用经修饰的、无复制能力的、包含一种异源基因的非实验室病毒株生产用于将所述基因传递至受治疗者的药物；一种确定一种基因是否对与周围神经系统疾病相关的表型或对与周围神经系统疾病有关的周围神经系统的细胞有影响的方法，所述方法包括(i)将包含一种异源基因、无复制能力的本发明疱疹病毒接种到外周神经中；和(ii)监测所述疾病的表型或所述基因的表达对所述细胞的影响，由此确定所述基因是否具有与所述疾病有关的效应；一种确定一种基因是否对与中枢神经系统疾病相关的表型或对与中枢神经系统疾病有关的中枢神经系统的细胞有影响的方法，所述方法包括(i)将无复制能力的本发明疱疹病毒接种到中枢神经系统的细胞内；和(ii)监测所述疾病的表型或所述基因的表达对所述细胞的影响，由此确定所述基因是否对所述细胞或所述表型有影响；一种确定一种基因是否编码与致病感染或癌症相关的抗原的方法，所述方法包括用包含一种编码抗原的异源基因、无复制能力的本发明病毒感染树突细胞或巨噬细胞，并且监测所述基因的多肽产物的抗原呈递、或所述基因的表达效应、或所述致病感染或癌症的表型，由此确定所述基因是否编码与所述感染或癌症相关的抗原及其自身是否具有治疗潜能或者是治疗性干涉的靶；一种测定非实验室病毒株对于修饰成如本文所限定的经修饰的毒株的适应性的方法，所述方法包括(i)任选地从宿主中分离非实验室病毒株；(ii)提供所述非实验室病毒株；(iii)评价所述病毒在一种或多种理想特征方面的特性；并且任选地，(iv)选择供修饰用的具有理想特性的病毒株；一种测定非实验室病毒株对于修饰成本发明经修饰的溶瘤毒株的适应性的方法，所述方法包括(i)任选地从宿主中分离非实验室病毒株；(ii)评价所述病毒在一种或多种类型的肿瘤细胞内的生长；并且任选地(iii)选择供修饰用的具有高生长速率或细胞杀伤能力的病毒株；一种测定非实验室病毒株对于修饰成经修饰的溶瘤毒株的适应性的方法，所述方法包括(i)提供一种非实验室病毒株，任选地用刚才限定的方法对其进行选择；(ii)修饰所述毒株，使其变成溶瘤毒株；和(iii)评价所述经修饰的非实验室溶瘤毒株杀伤肿瘤细胞的能力；并且任选地(iv)选择表现出高肿瘤细胞杀伤能力的毒株，用于进一步修饰；并且任选地(v)进行进一步修饰；一种确定一种基因是否增强病毒的抗肿瘤效应的方法，所述方法包括(i)提供一种本发明经修饰的非实验室溶瘤毒株；(ii)将所述基因作为异源基因插入到所述病毒中；和(iii)与步骤(i)中提供的前体毒株的能力相比，评价所述经修饰的非实验室溶瘤毒株杀伤肿瘤细胞的能力；一种产生经修饰的非实验室溶瘤病毒株的方法，所述方法包括(i)从宿主中分离一种非实验室病毒株；(ii)任选确定对其进行如上所限定的修饰的适应性；和(iii)对其进行修饰，使其成为溶瘤病毒；并且任选地(iv)进行进一步修饰；一种产生经修饰的非实验室病毒株的方法，所述方法包括(i)提供一种非实验室病毒株；(ii)对其进行修饰，使其成为无复制能力的病毒和(iii)插入一种异源基因；
一种如本文定义的、经修饰的非实验室溶瘤病毒株；一种如本文定义的、包含一种异源基因的、经修饰的非实验室病毒株；应用通过如上限定的方法鉴定为对与周围神经系统疾病相关的表型或对与周围神经系统疾病有关的周围神经系统的细胞有影响的基因或者由所述基因编码的基因产物，生产治疗周围神经系统疾病的药物；应用通过如上限定的方法鉴定为对与中枢神经系统疾病相关的表型或对与中枢神经系统疾病有关的中枢神经系统的细胞有影响的基因或者由所述基因编码的基因产物，生产治疗中枢神经系统疾病的药物；应用通过如上限定的方法鉴定为编码与致病感染或癌症相关的抗原的基因或者由所述基因编码的抗原，生产治疗或预防所述感染或癌症的药物；一种通过本发明方法鉴定或者在本发明方法中产生的非实验室病毒株；应用通过如上限定的方法鉴定为增强病毒的抗肿瘤效应的基因或者由所述基因编码的基因产物，生产治疗或预防癌症的药物；一种通过本发明方法获得或者可通过本发明方法获得的经修饰的非实验室病毒株；HSV1毒株JS1，保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，临时保藏号为01010209；或由其衍生的HSV1毒株；包含这种病毒的药用组合物；用于治疗人或动物的这种病毒；一种治疗需要所述治疗的个体体内肿瘤的方法，所述方法包括给予所述个体有效量的本发明溶瘤病毒；一种将一种基因传递至需要所述基因的个体的方法，所述方法包括给予所述个体有效量的本发明非溶瘤病毒；和一种治疗或预防中枢周围神经系统疾病的方法，所述方法包括将有效量的本发明亲神经病毒给予需要所述治疗或预防的个体的外周神经。
(2)ICP34.5-17+和JS1在肿瘤细胞上的生长。左图LNCaP细胞。右图MDA-MB-231细胞。
(3)JS1/34.5-在HSV ICP34.5突变株的非许可细胞上不生长。左图3T6细胞-17+，JS1。右图3T6细胞-17+，JS1ICP34.5-。图3.ICP34.5缺失型HSV临床分离株显示在所有被测肿瘤细胞内裂解增强肿瘤细胞系以指定的MOI进行模拟感染、用HSV1毒株17+/34.5-感染或者用HSV1毒株JS1/34.5-感染，然后在感染后于不同时间点用结晶紫染色，使细胞显现。照片中的每个方框代表一种细胞类型。从上到下，分别为HT29结肠直肠腺癌、LNCaP.FGC前列腺癌、MDA-MB-231乳腺癌、SK-MEL-28恶性黑素瘤和U-87MG成胶质细胞瘤星形细胞瘤。左方框代表HSV1毒株17+/34.5-的结果。右方框代表HSV1毒株JS1/34.5-的结果。中间方框代表模拟受感染的细胞。在每个方框中，最上一行代表24小时时间点，第二行代表48小时时间点，第三行代表72小时时间点，在每个方框中，左边一栏代表MOI＝0.2，中间一栏代表MOI＝0.1，右边一栏代表MOI＝5。
发明详述A.病毒本发明的病毒株本发明总的来讲适用于病毒。优选本发明的病毒株为疱疹病毒毒株、腺病毒毒株、微小RNA病毒毒株、反转录病毒毒株或甲病毒毒株。更优选本发明的病毒株为疱疹病毒毒株。再更优选本发明的病毒株为单纯疱疹病毒(HSV)毒株、通常为HSV1毒株或HSV2毒株。
当本发明的病毒为单纯疱疹病毒时，所述病毒可以来源于例如HSV1毒株或HSV2毒株或者它们的衍生毒株，最好是HSV1。衍生毒株包括含有来自HSV1毒株和HSV2毒株的DNA的型间(inter-type)重组体。这种型间重组体在本领域有描述，例如Thompson等(1998)和Meignier等(1988)描述了这类型间重组体。衍生毒株与HSV1基因组或HSV2基因组的序列同源性优选为至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％或95％。更优选的是，衍生毒株与HSV1基因组或HSV2基因组的序列同一性为至少70％，更优选至少80％同一性，甚至更优选至少90％、95％或98％同一性。
例如UWGCG程序包提供可以用来计算同源性的BESTFIT程序(例如用其缺省设置)(Devereux等(1984)Nucleic Acids Research 12，第387-395页)。PILEUP和BLAST算法可以用来计算同源性或将序列排列(通常用其缺省设置)，例如如在Altschul(1993)J.Mol.Evol.36290-300；Alschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-10中所述。
用于进行BLAST分析的软件公众可通过National Centre forBiotechnology Information(http∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)得到。该算法包括首先通过鉴定在查询序列中与数据库序列中相同长度的字串比对时或者匹配或者满足某些正数值最低分值T的长度W的短字串，来鉴定高分序列配对(HSP)。T被称为相邻字串分值阈值(Altschul等，1990)。这些原始相邻字串命中作为起始搜索以发现含有它们的HSP的种子。字串命中以两个方向沿每个序列延伸，只要累积序列比对分值可以增加。在每个方向的字串命中延伸当遇到以下情况之一时终止累积序列比对分值比其获得的最大值低数量X；累积分值为零或以下，这是由于一个或多个负打分残基比对的累积所致；或到达每个序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定所述比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用的缺省字长(W)为11，使用BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915-10919)比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，并且比较两条链。
BLAST算法对两个序列之间的相似性进行统计学分析；参见例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad Sci.USA905873-5787。BLAST算法提供的一种相似性测定是最小和概率(P(N))，它提供了在两个核苷酸序列或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指标。例如，如果在将一个序列与另一序列进行比较时最小和概率小于约1、优选小于约0.1、更优选小于约0.01、最优选小于约0.001，则认为所述第一序列与第二序列相似。
衍生毒株可以具有通过核苷酸取代例如1、2或3至10、25、50或100个而取代修饰的HSV1基因组序列或HSV2基因组序列。HSV1基因组或HSV2基因组可以或者或另外通过一个或多个插入和/或缺失和/或通过在任一末端或两个末端进行延伸来修饰。本发明病毒株的特性本发明病毒株是“非实验室”毒株。它们也可以被称为“临床”毒株。本领域技术人员能够容易地将实验室毒株和非实验室毒株或临床毒株区分开来。此外，下文给出了病毒株可能表现出的特性指南。
实验室毒株和非实验室毒株之间的关键区别在于目前常用的实验室毒株已经在培养物中保持了相当长时间，在有些情况下为许多年。病毒(例如HSV)的培养涉及被称为连续传代的技术。为了使病毒生长和保持，用病毒感染合适的细胞，病毒在细胞内复制，然后收获病毒；然后重新感染新鲜细胞。该过程构成连续传代的一个周期。就HSV而论，每个这样的周期可能需要例如几天。如上所讨论的，这种连续传代可能导致病毒株特性的改变，因为发生对有利于在培养物中生长的特性(例如快速复制)的选择，而不是选择与可用于实际应用的特性，例如就HSV而论为保持沿轴突运输的能力。
本发明病毒株是非实验室毒株，因为它们来源于从受感染个体中最新分离的毒株。与原始临床分离株相比，本发明毒株是经修饰的，可能需要培养一段时间，但是培养所用时间比较短。用这样的方法制备本发明毒株，使其基本上保留它们所来源的原始临床分离株的理想特性。
本发明的病毒能够有效感染人类靶细胞。这样的病毒刚从受感染个体中分离，然后根据与标准实验室毒株相比增强在体外和/或体内在肿瘤细胞和/或其它细胞内复制的所需能力进行筛选，或者(就亲神经病毒例如HSV而论)采用体内模型根据与标准实验室毒株相比增强沿神经运输的能力进行筛选。与实验室病毒株相比，具有改进特性的这类病毒是本发明的病毒。然后可以对具有这种所需改进特性、经鉴定的病毒通过合适基因的突变进行工程改造，使它们可以选择性地杀伤肿瘤细胞，或者将其突变，使它们可以在非溶瘤性应用中将基因传递至靶组织而没有毒性效应。这些经修饰的病毒也是本发明的病毒。或者，病毒株也可以从受感染个体中分离，并且对其进行预期适用于溶瘤法治疗和/或基因传递的突变。然后对这些经修饰的病毒根据与实验室毒株相比的所需改进特性进行筛选，具有这种改进特性的病毒提供其它的本发明病毒。
如下提供本发明病毒株的可能特性的进一步指南。
优选本发明病毒株从其宿主中分离其未经修饰的临床前体毒株算起已经在培养物中经历三年或三年以下。更优选本发明毒株已经在培养物中经历一年或一年以下，例如九个月或九个月以下、六个月或六个月以下、三个月或三个月以下、或二个月或二个月以下、一个月或一个月以下、二周或二周以下、或一周或一周以下。在培养物中时间的这些定义，是指在培养物中实际所用的时间。因此，例如，通常的做法是将病毒株冷冻，以便保存它们。显然，通过冷冻保存或以等同方式保存并不看作是在培养物中保持毒株。因而，冷冻保存所用时间或用其它方法保存所用时间不包括在培养物所用时间的上述定义的范围内。在培养物中所用时间通常是实际经历连续传代所用的时间，即在可以发生选择不想要的特征期间的时间。
优选本发明的病毒株从其宿主中分离其未经修饰的临床前体毒株算起经历了1,000个或更少的连续传代周期。更优选它已经历了500个或更少、100个或更少、90个或更少、80个或更少、70个或更少、60个或更少、50个或更少、40个或更少、30个或更少、20个或更少、或者10个或更少这样的周期。
最好是，据标准统计学检验测定，本发明病毒比具有等同修饰的参比实验室毒株执行某些可用于目前应用的功能的能力强。例如，就用于肿瘤治疗的溶瘤病毒而论，优选本发明的病毒株比具有等同修饰的参比实验室毒株感染任何肿瘤细胞或在其中复制、杀伤肿瘤细胞或在组织中的细胞间传播的能力强。更优选这种更强的能力是具统计学显著性的更强的能力。例如，按照本发明，就待测特性而论，本发明的病毒株的能力可以是所述参比毒株的能力的至多1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。
最好是，就一种或多种特征为可用于目前应用的特性而论，本发明的病毒基本上具有(即保留)其未经修饰的临床前体毒株的能力。例如，就计划用来治疗肿瘤的溶瘤病毒而论，本发明的病毒株优选基本上具有其未经修饰的临床前体毒株感染任何肿瘤细胞或在其中复制、杀伤肿瘤细胞或在组织中的细胞间传播的能力。
最好是，按照本发明，病毒基本上保留其未经修饰的临床前体毒株的特性，如果在定量试验中，就待测特性而论，它保留未经修饰的临床前体毒株能力的75％、更优选80％、90％、95％、98％、99％或100％。更优选就待测特性而论，所述未经修饰的临床前体毒株和本发明经修饰的毒株之间的任何差异都不具有统计学显著性。
可以用标准检验，例如t-检验、ANOVA或x2检验，对本文所述特性进行统计学分析。通常，测量的统计学显著性水平为p＝0.05(5％)、更优选p＝0.01、p＝0.001、p＝0.0001、p＝0.000001。修饰本发明的病毒与其前临床毒株相比通常是经修饰的。具体地说，通常使得某些基因无功能，并且所述病毒也包含异源基因。通常，使本发明的病毒减毒。
根据本文所述目的改变的病毒区域或者可以被消除(完全或部分)或者成为无功能的、或者被其它序列取代、尤其是被异源基因序列取代。可以使一种或多种基因成为无功能基因，并且可以插入一种或多种异源基因。本发明的溶瘤病毒在一个实施方案中，本发明的病毒是经修饰的非实验室溶瘤病毒。这些病毒可用于溶瘤法治疗癌症。这类病毒感染肿瘤细胞并在所述肿瘤细胞内复制，随后杀伤所述肿瘤细胞。因此，这类病毒是具有复制能力的病毒。最好是它们选择性在肿瘤细胞内具有复制能力。这意味着它们在肿瘤细胞内复制而在非肿瘤细胞内不复制，或者它们在肿瘤细胞内比在非肿瘤细胞内更为有效地复制。选择性复制能力的测定可以通过本文所述用以测定复制能力和肿瘤细胞杀伤能力的试验来进行，如有需要，也可以通过本文列举的统计学技术对其进行分析。
优选本发明的溶瘤病毒比具有相同修饰的参比实验室毒株感染肿瘤细胞或在肿瘤细胞内复制、杀伤肿瘤细胞或在组织中的细胞间传播的能力强。更优选这种能力为如本文所述的具统计学显著性的更强能力。所述病毒株关于肿瘤细胞的特性可以用本领域已知的任何方法进行测定。
例如，病毒感染肿瘤细胞的能力可以通过测量为测量出给定的细胞百分率(例如50％或80％细胞)所需的病毒剂量进行定量。在肿瘤细胞内复制的能力可以通过生长测量进行测定，例如在实施例中所进行的测定(参见图2)，例如通过测量在6小时、12小时、24小时、36小时、48小时或72小时或更长时间的时间周期内在细胞内的病毒生长。
病毒杀伤肿瘤细胞的能力可以通过肉眼大致定量(参见图3)，或者通过对在规定时间内对于给定细胞类型在给定时间点和MOI下保留的活细胞数进行计数而更准确地定量。例如，可以在24小时、48小时或72小时内并且使用任何已知肿瘤细胞类型进行比较。具体地说，可以使用HT29结肠直肠腺癌细胞、LNCaP.FGC前列腺癌细胞、MDA-MB-231乳腺癌细胞、SK-MEL-28恶性黑素瘤细胞或U-87 MG成胶质细胞瘤星形细胞瘤细胞。可以使用这些细胞类型中的任一种或这些细胞类型的任何组合，也可以使用其它肿瘤细胞类型。可能最好构建用于该目的的一组标准肿瘤细胞类型。为了对在给定时间点保留的活细胞数进行计数，可以对排除锥虫蓝的细胞(即活细胞)的数目进行计数。也可用荧光激活细胞分类术(FACS)或MTT分析进行定量测定。也可以体内测定肿瘤细胞杀伤能力，例如通过测量由于特定病毒引起的肿瘤体积的减小。
病毒在组织、尤其在实体组织内传播的能力也可以通过测定与原始感染部位相连部位的细胞数来进行测定。
为了测定本发明病毒的特性，一般而言，最好使用标准实验室参比毒株进行比较。可以使用任何合适的标准实验室参比毒株。就HSV而论，最好使用HSV1毒株17+、HSV1毒株F或HSV1毒株KOS中的一种或多种。所述参比毒株通常具有与本发明待测毒株等同的修饰。因此，所述参比毒株通常具有等同修饰，例如基因缺失和/或异源基因插入。例如，就HSV毒株而论，如果在本发明的病毒中已经使ICP34.5和ICP47编码基因变成无功能的，则在参比毒株中也使它们变成无功能的。对参比毒株进行的修饰可以与对本发明的毒株进行的修饰相同。为此，意味着在参比毒株中的基因破坏位于与本发明毒株中的基因破坏完全等同的位置，例如缺失为相同大小并位于相同位置。同样，在这些实施方案中，异源基因会在相同位置插入、由相同启动子驱动等等。然而，不一定需要进行相同的修饰。重要的是参比基因具有功能上等同的修饰，例如使相同的基因变成无功能的和/或插入相同的一种或多种异源基因。
在本发明的溶瘤病毒中，可以对所述病毒进行合适的修饰，使其具有溶瘤活性，如果它是非天然存在的，最好使其具有选择性溶瘤活性。
就HSV而论，提供选择性溶瘤活性的这类突变包括ICP34.5、ICP6和/或胸苷激酶(TK)、最好是ICP34.5编码基因的突变。尽管可以使用其中ICP34.5为无功能的任何突变，但是有关HSV的实验室毒株的ICP34.5编码基因的这类突变在Chou等1990、Maclean等1991中有描述。
因此，在HSV毒株中，最好对所述病毒进行修饰，使其缺乏功能性ICP34.5编码基因、功能性ICP6编码基因、功能性糖蛋白H编码基因、功能性胸苷激酶编码基因中的一个或多个；或者在非HSV毒株中，所述病毒缺乏与所述HSV基因之一等同的功能性基因。
更优选所述病毒缺乏功能性ICP34.5编码基因。
也可以进行其它修饰。具体地说，就HSV而论，可以对所述病毒进行修饰，使其缺乏功能性ICP47基因。这是因为ICP47通常的功能是阻断受HSV感染的细胞内的抗原呈递，所以其破坏产生这样的病毒该病毒并不赋予受感染的肿瘤细胞特定特性，即可以保护受这种HSV感染的细胞抵抗宿主免疫系统的特性。
提供溶瘤特性(即与周围组织相比在肿瘤内选择性复制)的任何其它基因缺失/突变的病毒也是本发明的病毒，正如本领域技术人员会认识到的，上述列表为非穷尽性的，对上述任一病毒的其它基因功能的鉴定可能提示构建也是本发明病毒的新病毒。
也可用本领域已知的技术和/或本文描述的技术，将异源基因插入到本发明的这类病毒中。在溶瘤病毒中，所述异源基因通常是增强所述病毒对抗肿瘤的能力的基因。因此可以插入赋予病毒抗肿瘤特性的任何基因。具体地说，所述异源基因可以是能够以有益方式改进针对肿瘤细胞的免疫应答的基因，尤其是免疫刺激多肽例如CD40L、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、其它细胞因子或趋化因子(例如RANTES)、B7.1或B7.2或IL12。或者，所述异源基因可以编码前体药物激活蛋白，例如硝基还原酶或细胞色素P450。在本发明的正文中，设想用被所述前体药物激活蛋白激活的前体药物和本发明病毒来联合治疗肿瘤。或者，所述异源基因可以编码肿瘤抑制蛋白，例如p53。本发明的其它病毒株在其它实施方案中，非溶瘤病毒是合乎要求的。这些病毒可以是无复制能力的病毒。其功能通常是将异源基因传递至个体。
具体地说，对于在非溶瘤性应用中用作载体，可以进行突变，使得病毒调节性立即早期基因的表达减至最小。因而，可以单独或联合使ICP4、ICP27、ICP22和/或ICP0编码基因失活或缺失，或者在病毒体反式激活蛋白vmw65中的突变包括阻止/降低其反式激活能力。在用于非溶瘤性应用的特别优选的实施方案中，使ICP27、ICP0和ICP4编码基因缺失(具有或不具有额外的ICP22和/或ICP47缺失/失活)，或者将ICP27和ICP4缺失加上vmw65中的失活，或者ICP4缺失加上vmw65中的失活。这类病毒的实例包括Samaniego等1998、Krisky等1998或Thomas等1999报道的病毒。亲神经病毒在将异源基因传递至神经系统时，按照本发明可以使用亲神经病毒、尤其是单纯疱疹病毒例如HSV1和HSV2。
按照本发明这一实施方案的病毒通常比具有等同修饰的参比实验室毒株感染神经元的能力、在神经组织中的细胞间传播的能力或在轴突内运输的能力强。感染神经元的能力总的来讲可以按照上述关于细胞的所述方法来测定。在轴突内运输的能力或在神经组织中的细胞间传播的能力可以通过测定与原始感染部位相连部位的神经系统中细胞的感染来测定。可以如上所述对结果进行统计学分析。
在这些实施方案中，最好在HSV毒株中，对所述病毒进行修饰，使其缺乏功能性ICP27编码基因、功能性ICP4编码基因、功能性ICP0编码基因或功能性ICP22编码基因中的一个、两个、三个或全部；或者在非HSV毒株中，所述病毒缺乏一种与所述HSV基因之一等同的功能性基因；和/或在HSV毒株中，所述病毒缺乏功能性vmw65基因，这是由于在所述基因中消除其转录激活活性的一个突变所致；或者在非HSV毒株中，所述病毒缺乏与vmw65基因等同的功能性基因，这是由于在所述基因中消除其转录激活活性的一个突变所致。
优选使ICP27、ICP4、ICP0和ICP22编码基因中的两个或两个以上变成无功能的，更优选使三个、再更优选使全部四个编码基因变成无功能的。最好是，按照这些实施方案，本发明的病毒既缺乏功能性ICP4编码基因，又缺乏功能性ICP27编码基因，并且本发明的病毒在vmw65编码基因中具有一个消除其转录激活活性的失活突变。
这类病毒可以用来治疗周围神经系统疾病或中枢神经系统疾病。在中枢神经系统疾病的情况下，特别优选使选自ICP0、ICP4、ICP22和ICP27的至少两个立即早期基因变成无功能的。免疫治疗性病毒在免疫治疗应用领域，用本发明的疱疹病毒感染树突细胞或免疫系统的其它细胞，例如巨噬细胞。通常，疱疹病毒感染树突细胞，降低所述树突细胞刺激免疫应答的能力。因此，对本发明的病毒进行修饰，使它们能够有效感染树突细胞，但不阻止所述树突细胞刺激免疫系统(WO00/08191)。在这种应用中，本发明的病毒通常包含编码抗原基因产物的异源基因。这可能是与致病感染或癌症相关的抗原。所述基因在树突细胞内表达，并且所述基因产物在所述树突细胞表面作为抗原呈递。这通过激活T细胞刺激针对所述抗原的免疫应答，所述T细胞寻找在其表面显现该抗原的细胞，即肿瘤或病原体细胞或受病原体感染的细胞，然后将其破坏。
最好是，在HSV毒株中，所述病毒缺乏功能性UL43基因和/或功能性vhs基因，或者在非HSV毒株中，所述病毒缺乏功能性UL43和/或vhs的等同基因；并且任选在HSV毒株中，所述病毒由于在与vmw65等同的基因中有一个消除其转录激活活性的突变，因而缺乏所述与vmw65等同的功能性基因；或者在非HSV毒株中，所述病毒由于在与vmw65等同的基因中有一个消除其转录激活活性的突变，因而缺乏所述与vmw65等同的功能性基因；并且任选缺乏选自ICP0、ICP4、ICP22和ICP27的至少一个功能性立即早期基因。
在本发明的正文中，最好是本发明的病毒比具有等同修饰的参比实验室毒株感染树突细胞或刺激免疫应答的能力强，一般而言，可以按照上述关于细胞的所述方法，评价对树突细胞的感染。具体地说，本发明的非实验室病毒株与参比实验室毒株相比，当所述两种毒株用量相同时感染树突细胞的百分率通常更高。可以用以上所述方法进行统计学分析。B.互补细胞系当本发明的病毒是一种缺乏特定功能性必需基因(例如ICP4或ICP27编码基因)的单纯疱疹病毒时，让本发明的病毒在表达该必需基因的细胞系上繁殖。例如，当病毒缺乏功能性ICP27基因时，所述病毒可以在V27细胞(Rice和Knipe，1990)、2-2细胞(Smith等，1992)或B130/2细胞(Howard等，1998)上繁殖。当病毒缺乏功能性ICP4基因时，所述病毒可以在表达ICP4的细胞系例如E5细胞(DeLuca等，1985)上繁殖。当病毒缺乏功能性ICP4基因和功能性ICP27基因时，所述病毒在表达ICP4和ICP27两者的细胞系(例如E26细胞；Samaniego等，1995)上繁殖；而当病毒还缺乏功能性vmw65基因时，所述病毒可以在也含有vmw65的非HSV同源物的细胞系(例如得自马疱疹病毒，Thomas等，1999)上繁殖。在病毒生长所用的培养基中包括六亚甲基双乙酰胺(HMBA)，也可以部分代偿vmw65的突变(MacFarlane等，1992)。
表达ICP27的细胞系可以通过用包含能够在所述细胞内表达的功能性HSV ICP27基因的载体最好是质粒载体编码一种选择标记(例如新霉素抗性)的载体最好是质粒载体共转染哺乳动物细胞(例如Vero细胞或BHK细胞)来产生。然后采用本领域技术人员已知的方法(例如，Rice和Knipe中所述的方法，1990)，筛选具有所述选择标记的克隆，进一步确定哪些克隆还表达功能性ICP27，例如基于其支持ICP27-HSV毒株生长的能力来确定。
如上所述产生不能让ICP27-突变型HSV毒株回复为具有功能性ICP27毒株的细胞系，确保包含功能性ICP27基因的载体不含与ICP27突变型病毒中其余序列重叠的序列(即与所述序列同源的序列)。
在本发明的HSV毒株在其它必需基因(例如ICP4)中包含失活修饰的情况下，互补细胞系将以有关ICP27所述的相同方式包含互补经修饰的必需基因的功能性HSV基因。例如，在ICP27和ICP4两者中均包含突变的HSV毒株的情况下，使用表达ICP27和ICP4两者的细胞系(例如Samaniego等，1995或Thomas等，1999所述)。可以以与有关ICP27所述方式的相似方式，构建表达其它必需基因的HSV毒株。再者，如果确保没有所述其余病毒DNA和插入到供病毒生长的细胞系之间重叠的序列，则可将所述病毒在生长期间回复为缺陷程度降低形式的可能性减至最小。C.突变方法可以通过本领域众所周知的多种技术使所述各种病毒基因无功能活性的基因。例如，可以通过缺失、取代或插入、最好是通过缺失使它们无功能活性。缺失可以去除基因的一部分或完整的基因。例如，可以进行仅一个核苷酸的缺失，导致移码。然而，优选进行较大的缺失，例如整个编码和非编码序列的至少25％、更优选至少50％(或者，用绝对的术语，至少10个核苷酸、更优选至少100个核苷酸、最优选至少1000个核苷酸)。特别优选去除所述完整的基因和某些侧翼序列。插入序列可以包括下文所述的一种或多种异源基因。就vmw65基因而论，不缺失整个基因，由于它编码必需的结构蛋白，但进行小的失活突变，以消除vmw65转录激活IE基因的能力(例如，Ace等，1989或Smiley等，1997)。
按照本领域技术人员熟知的同源重组方法，对所述疱疹病毒进行突变。例如，将HSV基因组DNA与包含邻接HSV同源序列的突变序列的载体、最好是质粒载体一起转染。所述突变序列可以包含缺失、插入或取代，所有这些突变序列都可以通过常规技术来构建。插入可以包括选择标记基因，例如lacZ或GFP，用于通过例如β-半乳糖苷酶活性或荧光筛选重组病毒。D.异源基因和启动子可以对本发明的病毒进行修饰，以携带一种或多种异源基因。术语“异源基因”包括任何基因。虽然异源基因通常是在疱疹病毒基因组中不存在的基因，但是可以使用一种或多种疱疹基因，前提是所述编码序列不是与其天然相关的所述病毒控制序列有效连接。所述异源基因可以是野生型基因的任何等位基因变异体，或者它可以是突变基因。术语“基因”包括能够至少被转录的核酸序列。因而，该定义包括mRNA、tRNA和rRNA编码序列。然而，本发明涉及多肽的表达，而不是tRNA和rRNA的表达。mRNA编码序列任选包括部分或全部与被翻译的编码序列天然相连或者与其相关的5’和/或3’转录但非翻译的侧翼序列。可以任选还包括通常与转录序列相关的相关转录控制序列，例如转录终止信号、聚腺苷酸化位点和下游增强子元件。
通过HSV毒株与例如携带邻接HSV序列的一种或多种异源基因的质粒载体进行同源重组，可以将所述一种或多种异源基因插入到病毒基因组中。采用本领域众所周知的克隆技术，可以将一种或多种异源基因导入包含疱疹病毒序列的适宜质粒载体中。可以将一种或多种异源基因插入到病毒基因组的任何位置上，前提是所述病毒仍可以繁殖。最好是将一种或多种异源基因插入到必需基因中。可以在所述病毒基因组内的多个位点上插入异源基因。
最好将一种或多种异源基因的转录序列与允许所述一种或多种异源基因在哺乳动物细胞、最好是肿瘤细胞或神经系统的细胞内表达的控制序列有效连接。术语“有效连接的”是指一种并列，其中所述组分之间的关系允许它们以其计划的方式起作用。与编码序列“有效连接的”控制序列的连接方式，使得在与所述控制序列匹配的条件下所述编码序列的表达得以实现。
所述控制序列包含允许所述一种或多种异源基因表达的启动子和用于终止转录的信号。所述启动子选自在哺乳动物、最好是人神经系统的细胞或肿瘤或免疫系统的细胞内有功能的启动子。所述一种或多种启动子可以来源于真核基因的启动子序列。例如，启动子可以来源于其中要发生所述异源基因表达的细胞、最好是哺乳动物细胞、最好是人细胞的基因组。就真核启动子而论，它们可以是以普遍存在的方式起作用的启动子(例如β-肌动蛋白、微管蛋白的启动子)，或者是以组织特异性方式起作用的启动子(例如神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子)。它们也可以是对特定刺激应答的启动子，例如结合类固醇激素受体的启动子。也可以使用病毒启动子，例如莫洛尼鼠类白血病病毒长末端重复序列(MMLV LTR)启动子或其它逆转录病毒启动子一人或鼠巨细胞病毒(CMV)IE启动子或疱疹病毒基因启动子，包括驱动表达潜伏相关转录物的疱疹病毒基因启动子。
采用本领域技术人员已知的常规克隆技术(参见例如Sambrook等，1989，Molecular Cloning-A laboratory manual；Cold Spring HarborPress)，可以构建包含一种或多种异源基因和控制序列的表达盒和其它适宜构建体。
所述启动子可能最好是诱导型启动子，使得所述异源基因的表达水平可以在细胞的生存期受调节。诱导型的是指可以调节采用所述启动子所获得的表达水平。例如，在其中超过一个异源基因插入到所述HSV基因组的一个优选实施方案中，一个启动子可以包括对先前报道的tet阻抑蛋白/VP16转录激活蛋白融合蛋白应答的启动子(Gossen和Bujard，1992，Grossen等，1995)并且驱动待调节的异源基因表达的启动子。第二个启动子可以包括驱动tet阻抑蛋白/VP16融合蛋白表达的强启动子(例如CMV IE启动子)。因此，在该实施例中，第一个异源基因的表达将取决于是否存在四环素。
异源基因通常编码具有治疗用途的多肽。例如，在神经系统中，在非溶瘤性应用时，可以调节疼痛的基因刺激神经再生长或防止神经变性。在溶瘤性应用中，异源基因可以编码其自身有细胞毒性的蛋白、编码前体药物激活酶或能够刺激或增强抗肿瘤免疫应答的蛋白。
异源基因也可以包括标记基因(例如，编码β-半乳糖苷酶或绿色荧光蛋白或其它荧光蛋白)或其产物调节其它基因表达的基因(例如包括上述tet阻抑蛋白/vmw65转录激活融合蛋白的转录调节因子)。
基因治疗和其它治疗应用可能非常需要给予多种基因。多种基因的表达对于治疗各种各样的病症可能是有利的。疱疹病毒特别适合，因为它们不具有其它病毒载体系统的有限包装能力。因而，在其基因组中可以容纳多种异源基因。例如，可以将2-5种基因插入到所述基因组中。
例如有至少两种其中可以实现该结果的方式。例如，可以在所述病毒基因组的单一位点或多个位点上将不止一种异源基因和相关控制序列导入特定HSV毒株中。也有可能应用成对的启动子(相同或不同的启动子)，所述启动子相互为相反定向，分别驱动一种如上所述的异源基因(相同或不同的异源基因)的表达。E.治疗应用本发明的病毒可以用于治疗方法中。具体地说，本发明的溶瘤病毒可以用于包括溶瘤法治疗癌症的应用中，例如通过直接肿瘤内注射。在所述病毒包含编码前体药物激活蛋白的异源基因的情况下，可以进行另外的前体药物疗法。另外，可以通过本领域已知的任何方式将治疗与免疫应答的刺激联合。本发明的病毒可以用来治疗性治疗哺乳动物、最好是人体内的任何实体瘤。例如，可以将本发明的病毒给予患有以下疾病的受治疗者前列腺癌、乳癌、肺癌、肝癌、子宫内膜癌、膀胱癌、结肠癌或宫颈癌；腺癌；黑素瘤；淋巴瘤；神经胶质瘤；或肉瘤，例如软组织肉瘤和骨肉瘤。
本发明的无复制能力病毒可以用来将基因传递至需要基因治疗的个体。具体地说，本发明的亲神经病毒可以用来治疗中枢神经系统疾病或周围神经系统疾病。用于治疗或预防的优选中枢神经系统疾病包括神经变性性疾病。用于治疗或预防的特别优选的中枢神经系统疾病是中风、帕金森氏病、早老性痴呆、泰-萨病(Tay Sachs disease)和粘多糖病。用于治疗或预防的优选周围神经系统疾病包括运动神经元病、慢性疼痛和外周神经损伤。
本发明的免疫治疗性病毒可以用来预防或治疗其抗原与所插入的异源编码基因有关的致病感染或癌症。F.给药因此，本发明的病毒可以用于需要治疗的患者、最好是人类患者。本发明的病毒可以用来溶瘤法治疗癌症，而本发明的疱疹病毒(除溶瘤性应用外)可以用来治疗例如疼痛、神经系统的变性性疾病或用来刺激神经再生长。治疗性治疗的目的是改善所述患者的病症。通常，采用本发明的病毒治疗性治疗会缓解所述待治疗患者的疾病或病症的症状。因此，按照本发明的治疗方法包括给予患有癌症、疼痛、神经变性性疾病或神经损伤的患者治疗有效量的本发明病毒。
将本发明的溶瘤病毒给予肿瘤患者通常会杀伤肿瘤细胞，因而减少肿瘤大小和/或防止恶性肿瘤细胞的播散。将本发明的病毒给予患有其它疾病(例如疼痛、变性性疾病或神经损伤)的患者通常会改善所述患者的病症。例如减轻疼痛的严重程度、减慢神经组织的变性或促进神经再生长。
一种给药治疗的方法包括将所述病毒和药学上可接受的载体或稀释剂组合，以制备药用组合物。合适的载体和稀释剂包括等渗盐溶液，例如磷酸缓冲盐溶液。
然后，可以采用将所述载体组合物直接注射到所述靶组织，进行溶瘤法治疗和/或将基因传递至细胞内以供治疗。就HSV而论，给予的病毒量范围为104-1010pfu、优选105-108pfu、更优选约106-108pfu。对于溶瘤法治疗或非溶瘤法治疗，当注射时，基本上由所述病毒和一种药学上可接受的合适载体或稀释剂组成的药用组合物的注射用量通常至多500μl、通常1-200μl、优选1-10μl。然而，对于某些溶瘤法治疗应用，根据所述肿瘤和接种部位，也可以使用至多10ml的较大体积。
因为技术人员能够容易地确定最佳给药途径和剂量，所以所述给药途径和剂量仅作为指南。所述剂量可以根据各种参数、尤其根据待治疗患者的年龄、体重和病症、疾病或病症的严重程度以及给药途径来确定。
对于癌症患者优选的给药途径是直接注射到肿瘤内。也可以系统给予所述病毒，或通过注射将所述病毒给予给所述肿瘤供血的血管内。最适给药途径将取决于所述肿瘤的位置和大小。所述剂量可以根据各种参数、尤其是根据肿瘤的位置、肿瘤的大小、待治疗患者的年龄、体重和病症以及给药途径来确定。G.非治疗方面也提供可供按照本发明进行修饰的合适临床毒株的鉴定方法。另外，还提供靶证实的方法。这些涉及对适用于如上所述的本发明治疗应用的基因进行鉴定。
也提供本发明病毒的制备方法。
以下实施例说明本发明。
先前已经显示其中神经毒力因子ICP34.5被失活的I型单纯疱疹病毒(HSV1)在体外和体内两种肿瘤模型中均指导肿瘤特异性细胞裂解。这类病毒在通过直接注射到晚期神经胶质癌患者的大脑内进行的I期临床试验中，也显示出是安全的。
早期研究一直使用连接传代的HSV1的实验室分离株(来源于HSV1毒株17+或HSV1毒株F的病毒)，与最新的临床分离株相比，可以预期所述病毒在人肿瘤细胞方面的裂解能力被减弱。
在目标是产生具有增强的溶瘤潜能和抗肿瘤潜能的ICP34.5缺失型HSV的研究中，我们使HSV1临床分离株缺失了ICP34.5，并比较与HSV1毒株17+(标准实验室毒株)相比的在多种人肿瘤细胞类型中的复制潜能和裂解潜能。病毒构建(参见
图1)所用的病毒或者基于HSV1毒株17+(标准实验室毒株)或者基于来源于唇疱疹、得自HSV1的常见复活物(frequent re-activator)的两株临床分离株。这些毒株命名为BL1和JS1。使毒株17+和JS1完全缺失ICP34.5并且插入CMV-GFP盒。通过插入人GM-CSF或小鼠GM-CSF，以便置换ICP34.5基因，对JS1也进行进一步工程改造。因此，BL1和JS1为临床分离株或“非实验室”毒株。本文所讨论的JS1衍生毒株也是非实验室毒株，即本发明经修饰的非实验室毒株。病毒在肿瘤细胞内的生长(参见图2)与HSV1 ICP34.5缺失型毒株17+相比，当在72小时内测试时，JS1和BL1显示在某些被测人肿瘤细胞内生长增强(图2)。选择JS1以供进行进一步研究用，并且对其进行如上所述的修饰(参见图1和上文)。病毒的裂解能力(参见图3)在所有被测肿瘤细胞系中，用JS1衍生的非实验室毒株衍生病毒增强裂解(细胞杀伤)能力。更具体地说，参照图3，JS1/ICP34.5-病毒，即通过缺失去除ICP34.5的JS1，显示在以下细胞内裂解能力增强HT29结肠直肠腺癌、LNCaP.FGC前列腺癌、MDA-MB-231乳腺癌、SK-MEL-28恶性黑素瘤和U-87 MG成胶质细胞瘤星形细胞瘤。
与毒株17+相比，在用BL1、JS1感染后，通过对受感染细胞进行锥虫蓝排除测定，也评价在各种剂量和时间在SK-MEL-28、MDA-MB-231和HT29细胞内的裂解能力。活细胞排除锥虫蓝，因此，通过该方法可以评价在培养物中剩余的活细胞数。以MOI为0.1或1用或者17+、BL1或者JS1，对在六孔平皿的复份孔中培养的肿瘤细胞系感染24小时、48小时或72小时，然后对活细胞数进行计数。在等同的未感染对照孔中的活细胞数百分率示于表1中。
因此，当在人类患者中用于治疗癌症时，在所有情况下，用临床分离株病毒BL1和JS1比实验室分离株17+杀死更多的肿瘤细胞，达到溶瘤活性增加，因此应用最新的临床病毒株可能增强这类经修饰以获得肿瘤选择性复制(例如通过缺失ICP34.5)的病毒的抗肿瘤能力。表1
进一步增强的抗肿瘤活性如果这些病毒用来传递具有抗肿瘤活性的基因，则也可以预期进一步增强的活性。这样的基因包括编码前体药物激活蛋白或免疫刺激蛋白的基因。
为此，我们由JS1构建了一种表达人GM-CSF或小鼠GM-CSF的HSV1的ICP34.5缺失型临床分离株，GM-CSF是一种有效的免疫刺激蛋白。该病毒设计用以在肿瘤内注射后增强抗肿瘤免疫应答。
参考文献Chou等，1990，Science 2501262-1266Maclean等，1991，J.Gen.Virol.72631-639Samaniego等，1998，J.Virol.723307-3320Krisky等，1998，Gene Therapy 51593-1603Thomas等，1999，J.Virol.737399-7409MacFarlane等，1992，J.Gen.Virol.73285-292Howard等，1998，Gene Therapy 51137-1147Samaniego LA等，1995，J.Virol.695705-5715Ace CI等，1989，J.Virol.632260-2269Smith IL等，1992，Virol.18674-86Rice，SA和Knipe DM，1990，J.Virol.641704-1715DeLuca NA等，1985，J.Virol.56558-570Gossen M和Bujard H，1992，PNAS 895547-5551Gossen M等，1995，Science 2681766-1769Smiley，J.R.和Duncan J.，1997，J.Virol.716191-6193Thompson等1998，Virus Genes 1(3)；275-286Meignier等1998，J.Infect.Dis.159；602-614保藏信息HSV1毒株JS1已经于2001年1月2日保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，CAMR，Salisbury，Wiltshire SP4 0JG，英国，临时保藏号为01010209。
权利要求
1.一种经修饰的非实验室溶瘤病毒株的用途，所述病毒株用于生产溶瘤法治疗癌症的药物。
2.权利要求1的用途，其中所述非实验室毒株(a)从其宿主中分离其未经修饰的前体毒株算起，在培养物中经历了1年或1年以下，或(b)从其宿主中分离其未经修饰的前体毒株算起，经历了100个连续传代周期或100个连续传代周期以下，或(c)比具有等同修饰的参比实验室毒株感染肿瘤细胞或在肿瘤细胞内复制、杀伤肿瘤细胞或在组织中的细胞间传播的能力强，或(d)就(c)中限定的一种或多种特性而论，基本上具有其未经修饰的前体毒株的能力。
3.权利要求2的用途，其中在(c)中所述更强的能力为具统计学显著性的更强的能力；或者其中在(d)中所述能力基本上是相同的能力或没有统计学显著性差异的能力。
4.前述权利要求中任一项的用途，其中所述非实验室病毒株是疱疹病毒毒株、腺病毒毒株、微小RNA病毒毒株、反转录病毒毒株或甲病毒毒株。
5.权利要求4的用途，其中所述非实验室病毒株是疱疹病毒毒株。
6.权利要求5的用途，其中所述非实验室病毒株是单纯疱疹病毒(HSV)毒株。
7.权利要求6的用途，其中HSV毒株是HSV1毒株或HSV2毒株。
8.权利要求5-7中任一项的用途，其中在HSV毒株中，对所述病毒进行修饰，使其缺乏功能性ICP34.5编码基因、功能性ICP6编码基因、功能性糖蛋白H编码基因、功能性胸苷激酶编码基因中的一个或多个；或者在非HSV毒株中，所述病毒缺乏与所述HSV基因之一等同的功能性基因。
9.权利要求5-8中任一项的用途，其中所述毒株是HSV毒株，并且所述病毒缺乏功能性ICP34.5编码基因。
10.权利要求9的用途，其中所述病毒还缺乏功能性ICP47基因。
11.前述权利要求中任一项的用途，其中所述非实验室病毒株还包含一种异源基因。
12.权利要求11的用途，其中所述异源基因是能够改进免疫应答的基因。
13.权利要求12的用途，其中所述能够改进免疫应答的异源基因编码免疫刺激多肽或能够改进免疫应答的其它基因产物、前体药物激活蛋白、肿瘤抑制蛋白或促细胞凋亡的(pro-apoptotic)基因产物。
14.权利要求13的用途，其中所述免疫刺激多肽是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、其它细胞因子或趋化因子、RANTES、B7.1或B7.2或IL12，或者其中所述前体药物激活蛋白是硝基还原酶或细胞色素p450，或者其中所述肿瘤抑制蛋白是p53。
15.权利要求2-14中任一项的用途，其中所述非实验室毒株是HSV毒株，权利要求2中限定的参比毒株是具有与所述非实验室毒株等同修饰的HSV1毒株17+、HSV1毒株F或HSV1毒株KOS。
16.一种经修饰的、无复制能力的、包含一种异源基因的非实验室病毒株的用途，所述病毒株用于生产将所述基因传递至受治疗者的药物。
17.权利要求16的用途，其中所述非实验室病毒株(a)从其宿主中分离其未经修饰的前体毒株算起，在培养物中经历了1年或1年以下，或(b)从其宿主中分离其未经修饰的前体毒株算起，经历了100个连续传代周期或100个连续传代周期以下，或(c)比具有等同修饰的参比实验室毒株感染靶细胞的能力强，或(d)比具有等同修饰的参比实验室毒株感染神经元、在神经组织中的细胞间传播、在轴突内运输、感染树突细胞或诱导免疫应答的能力强，或(e)就(c)或(d)中限定的一种或多种特性而论，基本上具有其未经修饰的前体毒株的能力。
18.权利要求17的用途，其中在(c)中所述更强的能力为具统计学显著性的更强的能力；或者在(d)中所述能力基本上是相同的能力或没有统计学显著性差异的能力。
19.权利要求18的用途，其中所述非实验室病毒株如权利要求4-7中任一项所限定。
20.权利要求19的用途，其中在HSV毒株中，对所述病毒进行修饰，使其缺乏功能性ICP27编码基因、功能性ICP4编码基因、功能性ICP0编码基因或功能性ICP22编码基因中的一个、两个、三个或全部；或者在非HSV毒株中，所述病毒缺乏与所述HSV基因之一等同的功能性基因；和/或，在HSV毒株中，所述病毒由于在vmw65基因中有一个消除其转录激活活性的突变，因而缺乏功能性vmw65基因；或者在非HSV毒株中，所述病毒由于在与vmw65等同的基因中有一个消除其转录激活活性的突变，因而缺乏所述与vmw65等同的功能性基因。
21.权利要求16-20中任一项的用途，其中所述药物用来通过将所述药物给予外周神经而治疗或预防周围神经系统疾病，并且所述异源基因编码在治疗所述周围神经系统疾病方面具有治疗用途的多肽或反义RNA。
22.一种确定一种基因是否对与周围神经系统疾病相关的表型或对与周围神经系统疾病有关的周围神经系统的细胞有影响的方法，所述方法包括(i)将包含一种异源基因、如权利要求16-21中任一项限定的无复制能力的疱疹病毒接种到外周神经中；和(ii)监测所述疾病的表型或所述基因的表达对所述细胞的影响，由此确定所述基因是否具有与所述疾病有关的效应。
23.权利要求16-20中任一项的用途，其中所述药物用来治疗或预防中枢神经系统疾病，所述异源基因编码在治疗所述疾病方面具有治疗用途的多肽或反义RNA，并且所述无复制能力的疱疹病毒包含(a)一个或多个突变，所述突变阻止或降低至少两种立即早期基因的表达；和(b)一种异源基因，所述异源基因与在疱疹病毒的潜伏期有活性的启动子有效连接。
24.权利要求27的用途，其中所述毒株是HSV毒株，所述一种或多种立即早期基因是ICP0、ICP4、ICP22和ICP27编码基因中的一个、两个、三个或全部。
25.一种确定一种基因是否对与中枢神经系统疾病相关的表型或对与中枢神经系统疾病有关的中枢神经系统的细胞有影响的方法，所述方法包括(i)将权利要求23或24中限定的无复制能力的疱疹病毒接种到中枢神经系统的细胞内；和(ii)监测所述疾病的表型或所述基因的表达对所述细胞的影响，由此确定所述基因是否对所述细胞或所述表型有影响。
26.权利要求16-20中任一项的用途，其中所述疱疹病毒是能够有效感染树突细胞但不阻止受感染细胞刺激免疫应答的减毒疱疹病毒；所述药物用于治疗或预防致病感染或癌症的方法中；所述方法包括用所述病毒感染树突细胞；并且所述异源基因编码与所述感染或癌症相关的抗原。
27.权利要求26的用途，其中，在HSV毒株中，所述病毒缺乏功能性UL43基因和/或功能性vhs基因，或者在非HSV毒株中，所述病毒缺乏一种UL43和/或vhs的功能性等同基因；并且任选的是，在HSV毒株中，所述病毒还缺乏功能性ICP34.5基因，或者在非HSV毒株中，所述病毒还缺乏ICP34.5的功能性等同基因；并且任选的是，在HSV毒株中，所述病毒由于在vmw65基因中有一个消除其转录激活活性的突变，因而缺乏功能性vmw65基因，或者在非HSV毒株中，所述病毒由于在与vmw65等同的基因中有一个消除其转录激活活性的突变，因而缺乏所述与vmw65等同的功能性基因；并且任选缺乏至少一种功能性立即早期基因。
28.权利要求27的用途，其中所述毒株是HSV毒株，所述一种或多种立即早期基因是ICP0、ICP4、ICP22和ICP27编码基因中的一个、两个、三个或全部。
29.一种确定一种基因是否编码与致病感染或癌症相关的抗原的方法，所述方法包括用权利要求26-28中任一项限定的病毒感染树突细胞或巨噬细胞，并且监测所述基因的多肽产物的抗原呈递、或所述基因表达的效应、或所述致病感染或癌症的表型，由此确定所述基因是否编码与所述感染或癌症相关的抗原以及其自身是否具有治疗潜能或者是治疗性干涉的靶。
30.一种测定非实验室病毒株对于修饰成如前述权利要求中任一项限定的经修饰的毒株的适应性的方法，所述方法包括(i)任选地从宿主中分离非实验室病毒株；(ii)提供所述非实验室病毒株；(iii)就权利要求2中的步骤(c)或(d)或者权利要求17中的步骤(c)、(d)或(e)限定的一种或多种特征而论，评价所述病毒的特性；并且任选地，(iv)选择供修饰用的具有理想特性的病毒株。
31.一种测定非实验室病毒株对于修饰成权利要求1-15中任一项限定的经修饰的溶瘤毒株的适应性的方法，所述方法包括(i)任选地从宿主中分离非实验室病毒株；(ii)评价所述病毒在一种或多种类型的肿瘤细胞内的生长；并且任选地(iii)选择供修饰用的具有高生长速率的病毒株。
32.权利要求31的方法，其中所述病毒如权利要求4-7中任一项所限定。
33.一种测定非实验室病毒株对于修饰成经修饰的溶瘤毒株的适应性的方法，所述方法包括(i)提供一种非实验室病毒株，任选地通过权利要求31或32中的步骤(ii)的方法对其进行选择；(ii)修饰所述毒株，使其变成溶瘤毒株；和(iii)评价所述经修饰的非实验室溶瘤毒株杀伤肿瘤细胞的能力；并且任选地(iv)选择表现出高肿瘤细胞杀伤能力的毒株用于进一步修饰；并且任选地(v)进行进一步修饰。
34.一种权利要求33的方法，其中所述病毒如权利要求4-7中任一项所限定。
35.一种权利要求33的方法，其中所述病毒是疱疹病毒，并且在HSV毒株中，通过使得一种或多种选自ICP34.5、ICP6和胸苷激酶编码基因的基因变成无功能的对其进行修饰；或者在非HSV毒株中，通过使得与所述一种或多种HSV基因等同的一种或多种基因变成无功能的对其进行修饰。
36.一种权利要求33-35中任一项的方法，其中通过与其相同的基因变成无功能的参比实验室毒株的肿瘤细胞杀伤能力进行比较，测定所述经修饰的非实验室溶瘤毒株的肿瘤细胞杀伤能力。
37.一种权利要求36的方法，其中所述非实验室毒株是HSV毒株，所述参比毒株是HSV1毒株17+、HSV毒株F或HSV毒株KOS。
38.一种确定一种基因是否增强病毒的抗肿瘤效应的方法，所述方法包括(i)提供一种权利要求1-15中任一项限定的经修饰的非实验室溶瘤毒株；(ii)将所述基因作为异源基因插入到所述病毒中；和(iii)与步骤(i)中提供的前体毒株的能力相比，评价所述经修饰的非实验室溶瘤毒株杀伤肿瘤细胞的能力。
39.一种经修饰的非实验室溶瘤病毒株的制备方法，所述方法包括(i)从宿主中分离一种非实验室病毒株；(ii)任选测定其对如权利要求33所述的修饰的适应性；和(iii)对其进行修饰，使其成为溶瘤病毒；并且任选地(iv)进行进一步修饰。
40.权利要求39的方法，其中所产生的经修饰的非实验室溶瘤病毒如权利要求2-15中任一项所限定。
41.一种经修饰的非实验室病毒株的制备方法，所述方法包括(i)提供一种非实验室病毒株；(ii)对其进行修饰，使其成为无复制能力的病毒株，和(iii)插入一种异源基因。
42.权利要求41的方法，其中所产生的经修饰的非实验室病毒株如权利要求16-29中任一项所限定。
43.一种权利要求1-15中任一项限定的、经修饰的非实验室溶瘤病毒株。
44.一种权利要求16-29中任一项限定的经修饰的非实验室病毒株，所述病毒株包含一种异源基因。
45.一种权利要求43或44的经修饰的非实验室病毒株，所述病毒株是疱疹病毒毒株。
46.一种权利要求45的经修饰的非实验室病毒株，所述病毒株是单纯疱疹病毒(HSV)毒株。
47.一种基因或由所述基因编码的基因产物在生产治疗周围神经系统疾病的药物方面的用途，其中所述基因通过权利要求22的方法鉴定为对与周围神经系统疾病相关的表型或对与周围神经系统疾病有关的周围神经系统的细胞有影响。
48.一种基因或由所述基因编码的基因产物在生产治疗中枢神经系统疾病的药物方面的用途，其中所述基因通过权利要求23的方法鉴定为对与中枢神经系统疾病相关的表型或对与中枢神经系统疾病有关的中枢神经系统的细胞有影响。
49.一种基因或由所述基因编码的抗原在生产治疗或预防致病感染或癌症的药物方面的用途，其中所述基因通过权利要求29的方法鉴定为编码与所述感染或癌症相关的抗原。
50.一种非实验室病毒株，所述病毒株通过权利要求30-42中任一项的方法鉴定或在所述方法的过程中产生。
51.一种基因或由所述基因编码的基因产物在生产治疗或预防癌症的药物方面的用途，其中所述基因通过权利要求38的方法鉴定为增强病毒的抗肿瘤效应。
52.一种经修饰的非实验室病毒株，所述病毒株通过权利要求39-42中任一项的方法获得或者可通过所述方法获得。
53.HSV1毒株JS1或由其衍生的HSV1毒株，所述HSV1毒株JS1保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，临时保藏号为01010209。
54.一种HSV1毒株，所述HSV1毒株由权利要求53中限定的JS1衍生并且具有权利要求2-29中任一项所述的特征。
55.一种HSV1毒株，所述HSV1毒株由权利要求54中限定的JS1衍生并且经过修饰，使其缺乏功能性ICP34.5基因、并且任选地缺乏功能性ICP47基因；并且任选地还包含一种编码GMCSF的异源基因。
56.一种药用组合物，所述组合物包含权利要求53-55中任一项限定的病毒。
57.一种用来治疗人或动物的权利要求53-55中任一项限定的病毒。
58.一种治疗需要所述治疗的个体的肿瘤的方法，所述方法包括给予所述个体有效量的权利要求1中限定的病毒。
59.一种将基因传递至需要所述基因的个体的方法，所述方法包括给予所述个体有效量的权利要求16中限定的病毒。
60.一种治疗或预防周围神经系统疾病的方法，所述方法包括将有效量的权利要求21中限定的病毒给予需要所述治疗或预防的个体的外周神经。
61.一种治疗或预防中枢神经系统疾病的方法，所述方法包括给予需要所述治疗或预防的个体权利要求23中限定的病毒。
全文摘要
本发明涉及非实验室病毒株，例如疱疹病毒(诸如HSV)的非实验室病毒株，与实验室病毒株相比，所述病毒株具有改良的溶瘤能力和/或基因传递能力。
文档编号A61K35/76GK1425073SQ01806750
公开日2003年6月18日 申请日期2001年1月22日 优先权日2000年1月21日
发明者R·S·科芬 申请人:拜奥维克斯有限公司