沙立朴吩或其衍生物在治疗心脏疾病中的应用及其制备方法

专利名称：沙立朴吩或其衍生物在治疗心脏疾病中的应用及其制备方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗和/或预防心脏疾病的药物组合物。更具体地说，本发明涉及沙立朴吩(thaliporphine)或其衍生物作为活性成分在治疗和/或预防心脏疾病中的应用。
背景技术：
近年来，在世界范围内老年人口不断增加，这主要是由于药物和生活方式的改善。但是，伴随老龄的通常是心血管疾病的逐渐增加。心脏疾病主要包括心绞痛(angina pectoris)、急性心肌梗塞及冠状动脉粥样硬化，其与血管收缩或栓塞有关。此外，冠状动脉栓塞常导致心脏肥大(cardiachypertrophy)，引起心衰竭并诱发心律不齐。同样地，心律不齐与心肌缺血相关。通常认为引起萎陷(collapse)的恶性心室心律不齐是导致猝死的主要机理。在冠状动脉阻塞放松后的再灌流也导致心律不齐。这类心律不齐可增加血栓治疗(thrombolytic therapy)和冠状血管成形术(coronary angioplasty)的死亡率和发病率。已经提出了该再灌流心律不齐的几个原因。其中，认为氧自由基的产生及其膜类脂的随后过氧化是再灌流心律不齐的主要原因。
用于治疗心衰竭(heart failure)的患者的药物包括利尿药(diuretic)、洋地黄、加压素转移酶抑制剂、交感神经激活剂以及磷酸二酯酶抑制剂，其中，洋地黄及交感神经激活剂或磷酸二酯酶抑制剂虽然对心脏收缩力有明显增强的效果，但这些药物可能会诱发心律不齐或使心跳过快(tachyhythmia)，故长期服用这些药物对患者的存活并无改善效果。最近，通过分别给药血管加压素受体阻断剂、血管内皮素受体阻断剂，以及同时对交感神经α-和β-肾上腺能受体有阻断作用的卡菲迪罗(Carvedilol)，证实对心衰竭患者的病情及存活率有改善的效果(Ye TL，等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.1992，26392-98；Bristow MR，等人，Circulation，1996，942807-2816；Colucci WS，等人，Circulation，1996，942800-2806)。
由于冠状动脉阻塞、心衰竭与心律不齐之间有密切的相关性，传统上治疗心衰竭的药物哇巴因(ouabain)可增强心肌收缩，但通常也造成患者的心律不齐。因此，对增加患者的存活率无益。因此，需要寻找一种有效的药物以抑制心律不齐、心肌梗塞、和急性冠状攻击(acute coronary attack)所引起的心衰竭的发展。
过去曾有研究报导提出，一些化合物如合成的2-苯基-4-氧代氢化喹啉(Su MJ，等人，Brit.J.Pharmacol.，1993，110310-316)、樟科(Lauraceae)或芸香科(Rutaceae)植物成分沙立朴吩(Thaliporphine)(Su MJ，等人，Eur.J.Pharmacol.，1994，254141-150)、白叶瓜馥木(Fissitigma glaucescens)成分鹅掌楸碱(Liriodenine)(Chang GJ，等人，Brit.J.Pharmacol.，1996，118503-512)、厚壳桂(Cryptocarya chinensis)成分(-)山核桃素(Caryachine)(Wu MH，等人，Brit.J.Pharmacol.，1995，1163211-3218)以及小檗碱衍生物，均有使心脏收缩力增强的作用；其中，已经证实Liriodenine、(-)-Caryachine及小檗碱衍生物同时具有抗心律不齐的效果。然而，过去抗心律不齐的效果都是以离体大鼠心脏进行30分钟结扎后再灌流来诱发心律不齐来评估的，但是其它动物中的K+外流电流与大鼠略有差异。因此，在这些试验中，天竺鼠也被用作试验对象来显示该K+外流电流的不同。此外，Su等人，Eur.J.Pharmacol.，1994，254141-150的研究显示，沙立朴吩(Thaliporphine)具有使心肌收缩、钙离子内流电流增加的功能。由于促进心肌收缩对于缺血性心肌坏死并无益处，因此理论上具有该功能的药物对于治疗心肌梗塞及心律不齐是无效的。但本发明的发明者却发现，沙立朴吩及其衍生物可用于治疗和/或预防心脏疾病，更特别地，沙立朴吩在低剂量下，即可具有上述的功能。

发明内容
本发明的一个方面是提供一种用于在哺乳动物中治疗和/或预防心脏疾病的药物组合物，包括有效量的式I的化合物 或其酯类衍生物，其中，R是氢、乙酰基、丙酰基、丁酰基或叔丁氧羰基，或其可药用的盐；和可药用的载体或赋形剂。
本发明的另一方面是提供一种式I的化合物 其中R是丙酰基、丁酰基或叔丁氧羰基，或其可药用的盐。
本发明的另一方面是提供一种式II的化合物，以及以式II化合物为活性成分的药物组合物，用于在哺乳动物中治疗和/或预防心脏疾病。该药物组合物包括有效量的式II的化合物或其酯类衍生物，其中，R1是氢、乙酰基、丙酰基、丁酰基或叔丁氧羰基，R2是乙基、烯丙基、丙基、丁基、异丁基或环丙基甲基，或其药学上可接受的盐类；以及可药用的载体或赋形剂。

本发明的再一方面是提供一种式III化合物，以及以式III化合物为活性成分的药物组合物，用于在哺乳动物中治疗和/或预防心脏疾病。该药物组合物包括有效量的式III的化合物 其酯类衍生物，其中，R是氢、乙酰基、丙酰基、丁酰基或叔丁氧羰基，或其可药用的盐；以及可药用的载体或赋形剂。
本发明的最后一个方面的特征在于一种治疗和/或预防哺乳动物中的心脏疾病的方法，包括给哺乳动物给药有效量的通式I、II或III的化合物或其衍生物，或其可药用的盐类。


参考下文对本发明的说明和附图，将会更全面地理解本发明，且本发明的其他好处将是显而易见的，其中图1是显示10μM的奎尼定在房室(AV)结传导的影响的原始记录图，右心房的刺激电极以每380毫秒刺激1次的频率，放置于右心房上腔静脉交接处的心房表面做刺激，其中，A心房去极化讯号，H喜氏(His)束极化讯号，S人为刺激讯号，V心室去极化讯号；图2是显示10μM的沙立朴吩对房室结传导的影响的原始记录图，其中，A心房去极化讯号，H喜氏(His)束极化讯号，S人为刺激讯号，V心室去极化讯号；图3是显示沙立朴吩对于由铜离子所引起的人类LDL的脂质过氧化作用的抑制效果，数据以平均值±SE表示，n＝4，其中，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，与对照物相比较；图4是显示沙立朴吩对于清除DPPH自由基的剂量反应曲线，数据以平均值±SE表示，n＝4；图5(A)是显示由10μM的沙立朴吩而将缺血-再灌流引起的多形心室过快回复成正常静脉窦跳动，上半图是心室心电图，下半图是右下心房的心电图，其中，A心房去极化，V心室去极化；图5(B)是显示沙立朴吩的抗心律不齐的功效；图6-7是显示在电驱动的天竺鼠心室标本中，由哇巴因所引起的心律不齐的图；图8是显示对照和沙立朴吩治疗的大鼠的收缩压(实心符号)及舒张压(空心符号)，其中，对照组及两种浓度的沙立朴吩之间的差异并无统计学上的意义(ANOVA)；以及图9是显示对照和沙立朴吩治疗的大鼠经受30分钟冠状结扎的心率，其中，其中，对照组及两种浓度的沙立朴吩之间的差异并无统计学上的意义(ANOVA)。
具体实施例方式
沙立朴吩(Thaliporphine；THP)是一种从诸如樟科的几种科的植物中分离的酚阿朴啡生物碱的天然化合物。先前的研究表明THP是具有很强的钠离子和钾离子阻断性能的部分钙离子通道激动剂。尽管THP的钠离子和钾离子阻断性能可以降低心肌缺血或缺血-再灌流期间的心律不齐的发病率和严重性，该药剂的钙离子通道激活可以增加钙离子的过载并诱导缺血或缺血-再灌流期间的心律不齐。
在本发明的一个实施方案中，采用天竺鼠的离体心脏，利用整体性缺血(global ischemia)再灌流，来评估THP及其衍生物的抗心律不齐的效果，并与采用大鼠进行结扎再灌流的传统模式相比较。
在本发明的一个实施方案中，利用0.6～0.8μM的哇巴因(ouabain)抑制钠/钾泵送(Na+/K+pump)，以增加天竺鼠的心脏收缩并诱发心律不齐，再给予THP或其衍生物，观察其对哇巴因诱发的心律不齐的效果。
在本发明的另一个可供选择的实施方案中，以静脉注射方式给药THP，观察其在活体中(in vivo)对心肌缺血或缺血再灌流期间的心律不齐的发生率和严重程度，以及缺血期间心肌坏死范围是否有减小的效果，并评估动物存活率是否增加。
此外，通过对大鼠及天竺鼠的电生理学作用比较THP与现有的抗心律不齐药物，以评估THP或其衍生物的自由基清除作用，并测定动物血液中乳酸脱氢酶(LDH)的浓度变化。LDH的浓度的增加可以用作心肌损伤程度的指标。另外，本发明还评估了THP或其衍生物对缺血及缺血再灌流的动物血液中的NO产量的影响。
根据本发明的一个方面，包含THP或其衍生物或其酯类或可药用的盐类的药物组合物，可以口服或注射的方式给药于待治的患者。此外，该药物组合物也可以包含可药用的载体或赋形剂以便通过口服或注射的方式给药于待治的患者。这类药物组合物的配制是本领域普通技术人员公知的。
本文所用的可药用的盐类包括无机酸的盐类，例如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸的盐类；有机酸的盐类，例如醋酸、顺丁烯二酸、酒石酸、甲磺酸的盐类；氨基酸的盐类，如精胺酸、天冬氨酸和谷氨酸的盐类。适当的剂型包括灭菌水溶液或分散液、灭菌粉末、片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等。此外，这些THP或其衍生物也可并入持续释放的制剂或组合物中。可药用的载体包括任何和所有的溶剂、分解剂、粘结剂、润滑剂、吸收延迟剂等。由于本发明的化合物可以以酯的形式存在，当然这些酯也包含在本发明的范围内。
以下将举出本发明的具体实施例对本发明作更详细的说明，但这些实施例仅为本发明的举例说明，而并非用以限定本发明的范围。
实施例1沙立朴吩(THP)的制备1.原海罂粟碱(Norglaucine)的制备用2％的乙酸提取台湾雅楠(Phoebe Formosana(Hayata))的茎部(60℃，三次)，得到富含(+)-新木姜子碱(laurolitsine)的提取物，将此(+)-新木姜子碱粗制品(50克)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF；250毫升)以及甲酸乙酯(40毫升)置于500毫升反应瓶中，在90℃下搅拌混合物60小时，再以甲醇再结晶，得到7.5克的N-甲酰基新木姜子碱(N-fomyllaurolitsine)。物理数据如下熔点275-277℃；1H NMR(CD3OD，400MHz)δ8.61，8.44(1H，s，N-CHO)，8.45，8.40(1H，s，H-11)，7.21，7.16(1H，s，H-8)，6.61(1H，s，H-3)，3.89(3H，s，10-OMe)，3.58(3H，s，1-OMe)；EIMS(70eV)m/z(rel.int.％)341(90)，296(40)，283(100)，240(30)，58(70)。
将N-甲酰基新木姜子碱(10.3克，29.4毫摩尔)、甲醇(100)毫升)、碳酸钾(12.3克)以及碘化甲烷(13毫升)置于反应瓶中，减压脱气2分钟后再密闭反应瓶，于60℃下搅拌混合物24小时，减压浓缩后，用氯仿(300毫升)及水(150毫升×2)分配。有机层经碳酸钠干燥、减压下过滤并浓缩。用甲醇将残留物再结晶，得到针状物形状的N-甲酰基原海罂粟碱(N-formylnorglaucine)(9.5克，87％)。物理数据如下熔点151-152℃；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ8.37，8.23(1H，s，N-CHO)，8.12，8.11(1H，s，H-11)，6.78，6.74(1H，s，H-8)，6.63，6.60(1H，s，H-3)，4.46(dd，J＝14.4，4.3Hz)，4.89(1H，dd，J＝13.9，4.2Hz，H-6a)，3.90(9H，s，3x OMe)，3.65(3H，s，1-OMe)；EIMS(70eV)m/z(rel.int.％)[M]+365(5)，355(100)，340(40)。
将N-甲酰基原海罂粟碱(2.00克，5.42毫摩尔)、氢氧化钾(2.30克，41.5毫摩尔)以及乙醇(50毫升)置于反应瓶(100毫升)中。将混合物加热回流3小时(Chastanet J，等人，Heterocycles，1992，341565-1572)，减压浓缩，所得残留物用水(100毫升)及氯仿(300毫升×3)分配。有机层经碳酸钠干燥、减压下过滤并浓缩，得到固体，将所得固体通过柱色谱法纯化(硅胶，用0.2％甲醇/氯仿作为洗脱液)，得到(+)-原海罂粟碱(1.75克，95％)。物理数据如下无定形固体；[α]D24+77.1°(c＝0.35，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.09(1H，s，H-11)，6.73(1H，s，H-8)，6.58(1H，s，H-3)，3.90(3H，s，9-OMe)，3.88(3H，s，10-OMe)，3.86(3H，s，2-OMe)，3.65(3H，s，1-OMe)，3.81(1H，dd，J＝13.9，4.2Hz，H-6a)；HR LC/MS m/z[M+H]+342.1682(C20H24NO4的计算值为342.1705)。
2.(+)-沙立朴吩(THP)的制备将原海罂粟碱(1.90克，5.2毫摩尔)、甲醇(50毫升)以及35.5％甲醛(6.0毫升)，依次置于250毫升的反应瓶中。于室温搅拌下分批加入NaBH4(共2.0克，52毫摩尔)，将混合物反应6小时，减压浓缩，所得残留物在水(150毫升)及氯仿(150毫升×3)之间分配。将有机相用饱和食盐水洗涤后，用硫酸钠干燥，减压下过滤并浓缩，得到固体，将所得固体通过柱色谱法纯化(硅胶，用氯仿作为洗脱液)，得到固体产物海罂粟碱(glaucine)(1.78克，90％)。物理数据如下熔点112-114℃(二乙醚)；[α]D24+120.0°(c＝0.30，甲醇)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.06(1H，s，H-11)，6.75(1H，s，H-8)，6.56(1H，s，H-3)，3.91(3H，s，9-OMe)，3.88(3H，s，10-OMe)，3.86(3H，s，2-OMe)，3.64(3H，s，1-OMe)，2.54(3H，s，N-Me)。
将海罂粟碱(3.02克，8.45毫摩尔)置于反应瓶(100毫升)中，于冰浴下加入6.0毫升的90％硫酸(Castedo L，等人，Heterocycles，1980，141135-1138)，减压下将混合物脱气2分钟，再密闭反应瓶。于室温避光下搅拌13天后，将反应混合物倒入含100毫升冰水的烧瓶内并搅拌。用氨水(25％)将pH调至8.0，再用氯仿提取(80毫升×3)。将有机相在硫酸钠上干燥，减压下过滤并浓缩，得到残留物3.48克，通过柱色谱法纯化(硅胶，用1-3％甲醇/氯仿作为洗脱液)，得到沙立朴吩(THP)(1.82克，产率62％)。物理数据如下熔点185-187℃(甲醇)；[α]D24+66.7°(c＝0.31，甲醇)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.03(1H，s，H-11)，6.76(1H，s，H-8)，6.52(1H，s，H-3)，3.90(6H，s，2-OMe和9-OMe)，3.88(3H，s，10-OMe)，2.53(3H，s，N-Me)；EIMS(70eV)m/z(rel.int.％)[M]+341(100)，326(34)，298(24)，267(28)。
实施例2(+)-N-丙基原沙立朴吩(propylnorthaliporphine)的制备1.(+)-N-丙基原海罂粟碱(propylnorglaucine)制备根据实施例1中所述的制备N-甲酰基新木姜子碱的方法，将新木姜子碱粗制品(30.0克)溶于二甲基甲酰胺(75毫升)及丙酸酐(6毫升)中，于室温下将混合物反应24小时，用甲醇再结晶，得到8.02克的N-丙酰基新木姜子碱(N-propionyllaurolitsine)。物理数据如下熔点185-189℃；1H NMR(CD3OD，400MHz)δ8.06(1H，s，H-11)，3.71(1H，s，H-8)，6.61(1H，s，H-3)，3.88(3H，s，10-OMe)，3.59(3H，s，1-OMe)，2.52(2H，q，J＝7.2Hz，NCOCH2CH3)，1.16(3H，t，J＝7.2Hz，NCOCH2CH3)；EIMS(70eV)m/z(rel.int.％)[M]+369(100)，296(87)，283(85)，269(44)，240(16)，57(34)。
向N-丙酰基新木姜子碱(2.50克，6.78毫摩尔)、甲醇(25毫升)以及碳酸钾(2.60克)的混合物中，加入碘化甲烷(3.5毫升，56.2毫摩尔)。在类似于实施例1的反应条件和处理下，得到产物N-丙酰基原海罂粟碱(N-propionylnorglaucine)(2.21克，82.4％)。物理数据如下熔点150-152℃(甲醇)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.13(1H，s，H-11)，6.76(1H，s，H-8)，6.60(1H，s，H-3)，3.89(3H，s，9-OMe)，3.87(6H，s，2-OMe或10-OMe)，3.59(3H，s，1-OMe)，2.45(2H，q，J＝7.2Hz，NCOCH2CH3)，1.18(3H，t，J＝7.2Hz，NCOCH2CH3)；EIMS(70eV)m/z(rel.int.％)[M]+397(79)，324(58)，311(100)，265(16)，57(20)。
将无水四氢呋喃(THF；15毫升)先置于干燥的反应瓶中，再加入LiAlH4(380毫克，10毫摩尔)，将混合物搅拌10分钟。向悬浮的混合物中滴加入溶于无水四氢呋喃(5毫升)中的N-丙酰基原海罂粟碱(4.01克，10.1毫摩尔)。将混合物力热回流2小时。冰浴下向混合物中力入Na2SO4·10H2O，以破坏过量的LiAlH4。用硅藻土垫过滤混合物，并以氯仿清洗残留物。浓缩合并的滤液和洗涤物后再以乙醚再结晶，得到N-丙基海罂粟碱(N-propylnorglaucine)(3.36克，86％)。物理数据如下熔点95-97℃；[α]D24+106.7°(c＝0.33，甲醇)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.03(1H，s，H-11)，6.75(1H，s，H-8)，6.54(1H，s，H-3)，3.86(3H，s，9-OMe)，3.83(6H，s，2-OMe或10-OMe)，3.60(3H，s，1-OMe)，2.88和2.43(2H，m，N-CH2C2H5)，1.50(2H，m，N-CH2CH2CH3)，0.93(3H，t，J＝7.2Hz，N-C2H4CH3)；EIMS(70eV)m/z(rel.int.％)[M]+383(100)，368(82)，354(45)，352(36)，281(19)。
2.(+)-丙基原沙立朴吩(THP)的制备依实施例1中所述的制备(+)-沙立朴吩的方法，将N-丙基海罂粟碱(1.20克，10.3毫摩尔)与90％硫酸(3毫升)反应，得到N-丙基原沙立朴吩(346毫克，产率30％)。物理数据如下熔点66-70℃(甲醇)；[α]D24+60.2°(c＝0.33，甲醇)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.00(1H，s，H-11)，6.75(1H，s，H-8)，6.51(1H，s，H-3)，3.90(6H，s，2-OMe或9-OMe)，3.89(3H，s，10-OMe)，2.60(1H，m)和2.43(1H，m)(N-CH2CH3)，1.57(2H，m，N-CH2CH2CH3)，0.95(3H，t，J＝7.2Hz，N-C2H4CH3)；EIMS(70eV)m/z(rel.int.％)[M]+369(100)，354(22)，340(36)，298(20)。
实施例3沙立朴吩对大鼠及天竺鼠的电生理作用心电图记录该研究根据US National Institutes of Health(NIH出版号85-23，1996年改编)出版的实验室动物护理和使用指南(Guide for the Care and Use ofLaboratory Animals)进行。在肝切除(hepariniation)并用尿烷(1.25g/kg i.p.)麻醉后，杀死成年大鼠与天竺鼠。将其心脏分离之后，以兰氏灌流(Langendorff perfusion)的方法，用10μM奎尼定和THP分别灌流主动脉。将一对以接有银线的双极电极(bipolar electrode)置于科氏三角(Triangle ofKoch)的尖端，以记录喜氏束(His bundle)的心电图。此外，用另一对接有银线的双极电极置于右心室的表面上以记录T波。靠近上腔静脉(superiorvena cava)的右心房以300ms的起搏周期长度(pacing cycle length)以恒定速率进行起搏。心电图分别量测QT间隔(QT interval)、穿过窦房(sinoatrial)、房室结(atrioventricular node)及喜氏系统(His-purkinje system)的传导时间，分别是SA、AH及HV间隔。同时也记录喜氏系统的回复曲线(即H2V2与V1H2的关系图)，另外亦以相同的方式记录心房、心室以及房室结的反应期(refractory period)。结果显示于图1及图2。
实施例4沙立朴吩或其衍生物的抗氧化作用及自由基清除作用将人类低密度脂蛋白(LDL；100微克/毫升)与0.1％二甲基亚砜(DMSO)(基底组及对照组)，或各种浓度的沙立朴吩(1～100μM)，在37℃中预先培养10分钟，然后加入5μM的硫酸铜，除了基底组之外，其余各组再培养12小时，以测试沙立朴吩对脂质过氧化作用的影响。结果如图3所示。
将各种浓度的沙立朴吩(1～100μM)与100μM的1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼(DPPH)，在室温(25℃)中培养30分钟后，测量DPPH在517nm吸光度的降低，以测定沙立朴吩对于清除DPPH自由基的剂量反应曲线。结果如图4所示。
实施例5沙立朴吩或其衍生物的抗心律不齐作用1.对结扎再灌流诱发的大鼠心律不齐的作用通过在左主冠状动脉周围的丝结扎(silk ligature)的暂时拉紧(temporarytightening)而将离体的大鼠心脏结扎，以诱发心肌缺血。通过释放施用于结扎的张力而实现再灌流以诱发产生心律不齐。然后给予10μM的沙立朴吩，记录其心室及心房的心电图。结果如图5所示。
2.对整体性缺血后再灌流诱发的天竺鼠心律不齐的作用将离体的天竺鼠心脏进行整体性缺血而结扎。通过释放施用于结扎的张力而实现再灌流以诱发产生心律不齐。然后给予不同浓度的沙立朴吩，记录心室纤维性颤动(VF)的情形，结果如表1所示表1THP对经受整体性缺血的离体的天竺鼠心脏中再灌流诱发的心室纤维性颤动的影响

an表示实验的心脏个数；*与载体的值具有统计上的显著不同(p＜0.05)。
3.对哇巴因诱发的离体天竺鼠心脏的心律不齐的作用将天竺鼠心室给予0.6～0.8μM的哇巴因(Ouabain)之后，观察到其心收缩力逐渐增加。在诱发心律不齐5～10分钟之后，给予10～20μM的沙立朴吩或其相关衍生物以将哇巴因诱发的心律不齐恢复正常。结果如图6及图7所示。
4.沙立朴吩对大鼠的临床疗效评估通过在左主冠状动脉周围的丝结扎(silk ligature)的暂时拉紧(temporarytightening)而诱发心肌缺血。通过释放施用于结扎的张力而实现再灌流(手术组)。假手术的动物经过所有外科手术过程，除了通过左主冠状动脉周围的丝不系紧外(假手术组)。在冠状动脉阻塞前15分钟，从颈静脉向动物灌注THP(3.5×10-7，3.5×10-6，3.5×10-5g/kg)，L-NAME(N-硝基-L-精氨酸甲酯；1×10-3g/kg)或载体(二甲基亚砜/NaCl0.9％，1∶103体积/体积)。冠状动脉阻塞30分钟或5分钟，随后经过30分钟的再灌流，然后将动物随机分成下列几组(1)假手术+载体；(2)假手术+THP(3.5×10-4g/kg)；(3)手术+载体组；(4)手术+THP(3.5×10-7g/kg)；(5)手术+THP(3.5×10-6g/kg)；(6)手术+THP(3.5×10-5g/kg)；(7)手术+L-NAME(1×10-3g/kg)+THP(3.5×10-5g/kg)。在缺血之前和期间及再灌流之前和期间，记录心率(HR)、血压(BP)和ECG的变化。根据Lambeth Convention推行的诊断标准评估心室异位活性。测定存活的动物中心室心动过速的发生率和持续时间，包括心室心动过速(VT)和心室纤维性颤动(VF)。使用Mann-Whitney rank-sum试验来分析载体组和药物治疗组之间在VT和VF持续时间上的区别。采用ANOVA(方差分析法)来分析心律不齐研究中载体组和药物治疗组的大鼠之间BP和HR的变化，随后进行Bonfeeroni’s测试。用Chi-square测试来分析VT、VF和死亡率的百分发生率的不同。结果示于表2-3中。
表2在活体内沙立朴吩对麻醉的大鼠因缺血诱发的心律不齐的作用

aVT及VF的持续时间值是以10-14个大鼠的平均值±SE表示；b载体是0.01％DMSO溶于生理食盐水中；*p＜0.05的统计上的差异；n＝10～12。
表3在活体内沙立朴吩对麻醉的大鼠因再灌流诱发的心律不齐的作用


aVT及VF的持续时间是以7-16个大鼠的平均值±SE表示；b载体是0.01％DMSO溶于生理食盐水中；*p＜0.05的统计上的差异。
n＝7。
通过三苯基四唑鎓氯化物-Evan’s蓝染色技术测定梗塞的尺寸。在大鼠的左下行冠状动脉阻塞4小时后杀死大鼠。梗塞组织的重量表达为总心室重量或受阻区域的百分数。使用未配对的Student’s t-试验对梗塞尺寸的不同进行统计学分析。结果如表4所示。表4载体和THP治疗的大鼠经受4小时冠状结扎后的危险区域和梗塞尺寸

a数据以平均值±SE表示；n，动物数目。
b载体是0.01％DMSO溶于生理食盐水中。
*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，与载体相比较。
L-NAME表示N-ω-硝基-L-精胺酸甲酯；THP表示沙立朴吩。
通过测量血浆LDH来评估细胞损害。在肝素化(heparinized)的管中收集的缺血或缺血-再灌流端部处的颈动脉导管中抽取动脉血液样本。将血液保持在4℃下直到它在2000×g下离心15分钟。回收血浆并用得自Sigma的市售试剂盒测定等份试样的LDH活性。将去蛋白的血浆样本冷冻并保持直到用于分析。根据Yanu F.等人(1997)Clin.Chem.43657-662中描述的NO/臭氧化学发光技术来测定NO。使用未配对的Student’s t-测试来对血浆NO和LDH的差异进行统计学分析。结果如表5及表6所示。
表5沙立朴吩对乳酸脱氢(U/L)释放的作用

a数据以平均值±SE表示，n＝6；b载体是0.01％DMSO溶于生理食盐水中；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，与载体相比较。
表6沙立朴吩对一氧化氮(μmol/L)释放的作用

a数据以平均值±SE表示，n＝6；b载体是0.01％DMSO溶于生理食盐水中；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，与载体相比较。
在图1中，在奎尼定治疗的心脏中SA、AH、HV间隔及T波均延长。相较于奎尼定，沙立朴吩处理的心室的S-A间隔不受影响，HV间隔略微有所延长，显示奎尼定具有较差的选择性。此外，沙立朴吩在3、10及30μM时，能使心房不反应期(AERP)由60毫秒分别延长为90、100及120毫秒；心室不反应期(VERP)则由160毫秒分别变为160、170及190毫秒；房室结(AVnode)的不反应期(AVNERP)则由170毫秒分别变为170、200及240毫秒。当与相同方式的THP比较时，3、10及30μM的奎尼定使心房不反应期由40毫秒延长为60、80及130毫秒；心室不反应期则由180毫秒变为170、180及190毫秒；房室结的不反应期则由130毫秒变为150、200及245毫秒。对于心脏下垂周期长度(Wenckbach Cycle Length；WCL)，则3、10及30μM的沙立朴吩可使其由200毫秒变为210、230及280毫秒，而3、10及30μM的奎尼定则使WCL由150毫秒变为170、210及300毫秒。虽然沙立朴吩及奎尼定均会使心房、心室及房室结的不反应期延长，但仅奎尼定会抑制房室结的传导速率(使AH间隔延长)；相比较而言，即使在沙立朴吩的浓度增加到10μM时，对房室结的传导仍不会有抑制作用。
此外，沙立朴吩在3～10μM的浓度下，使大鼠及天竺鼠的心房或心室细胞的作用电位持续时间延长(数据未显示)。此外，沙立朴吩对大鼠的瞬间外流钾电流(Ito)及天竺鼠的迟延外流钾电流(Ik)均有明显的抑制作用。另外，亦发现沙立朴吩对内流钠电流有抑制作用，但对内流钙电流则有增强作用(Su MJ，等人，Eur.J.Pharmacol.，1994，254141-150)。沙立朴吩具有延长作用电位、增强心收缩并减慢心率的作用。
通过评估THP对低密度脂蛋白(LDL)的TBARS(对硫代巴比妥酸具有活性的物质)的形成的影响来进一步评估其对类脂过氧化的影响。将LDL暴露于硫酸铜12小时导致LDL的过氧化，这由TBARS的含量增加来表示(图3)。加入THP以浓度依赖性的方式抑制了硫酸铜诱发的TBARS的形成(IC50为15.7μM)。除了防止LDL的氧化作用外，THP可以浓度依赖性的方式清除黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统产生的超氧化物阴离子(superoxide anion)，其EC50为12.6μM。
在1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼(DPPH)分析系统中，将沙立朴吩的自由基清除活性表达为IC0.200。在捕集DPPH的未配对电子后监测加入THP后在517纳米处吸光度的降低。参见图4，THP以浓度依赖性的方式清除DPPH，其IC0.200为12.4μM。
沙立朴吩在浓度为3～30μM时，能有效地使离体大鼠心脏经过30分钟结扎后再灌流所引起的心律不齐恢复正常，其IC50为15.7μM(参考图5)。相似地，沙立朴吩在浓度为10μM时，能有效抑制离体天竺鼠心脏整体性缺血后再灌流诱发的心律不齐的发生(表1)。虽然大鼠及天竺鼠两者冠状动脉的结构不甚相同，但沙立朴吩对于两种动物的离体心脏经受缺血-再灌流所引发的心律不齐均有有效的抑制作用。
参考图6及图7，将天竺鼠心室标本给予0.6～0.8μM的乌巴因(Ouabain)之后，观察到其心收缩力增加。再经5～10分钟之后就会引起心律不齐。在给予10～20μM的沙立朴吩或其衍生物之后，心律逐渐恢复正常；但此浓度的奎尼定并无此功效(数据未显示)。
静脉注射给药沙立朴吩对经受心肌缺血的大鼠的舒张压、收缩压和心率(HR)无改变作用。在载体和药物组(3.5×10-6或3.5×10-5克/千克THP)之间没有显著的差异。
在缺血状况下，在冠状动脉阻塞6-7分钟后载体组开始出现严重的心室心律不齐，在8-12分钟后达到高峰，通常在从开始约15分钟后消失。VF的持续时间计算为32.1±8.9秒，VT的持续时间是36.8±8.8秒。在载体组的14个大鼠中，57％呈现出VF，而100％呈现出VT。给药3.5×10-5克/千克THP导致VT和VF的发生率分别降低到10％和0％(p＜0.05)。VT和VF的持续时间显著降低为0.3±0.3秒和0.0±0.0秒(p＜0.05)。特别重要的发现是在3.5×10-7克/千克THP的很低的剂量下死亡率的很有效的降低。而且，在L-NAME+THP组，VT或VF的发生率和持续时间和死亡率不能与对照组(手术-载体)中所测定的值相区分，表明L-NAME(1×10-3克/千克)完全消除了THP的抗心律不齐的活性和降低死亡率的功效(表2)。
再灌流诱发的心律不齐的严重程度严格地依赖于缺血前期的持续时间。因此，选择5分钟的缺血期随后30分钟的再灌流期的方案来产生心律紊乱的最高发生率。表3示出了在载体组中，约88％的动物在再灌流期呈现出VF，75％的动物死亡，主要是由于VF引起的。相比而言，用THP(3.5×10-6克/千克和3.5×10-5克/千克)预处理的动物经历了VF的发生率从88％显著下降到29％和13％(p＜0.05)，VF的持续时间从92.4±20.5秒显著下降到9.2±8.3秒和1.2±1.2秒(p＜0.05)。给药3.5×10-6克/千克的THP死亡率也从75％下降到0％(p＜0.05)。但是，共同给药L-NAME仅部分拮抗THP的抗心律不齐作用和阻止死亡率的作用(3.5×10-5克/千克)。
评估在缺血4小时后通过染色技术显示的缺血区域和梗塞尺寸的不同。每个试验组之间的危险区域没有显示出明显的不同(表4)，表明类似量的组织受到每个组中左冠状动脉阻塞的影响。在载体组中，坏死区域表达为危险区域的百分比(45.2±1.0％)或总心室的百分比(19.8±2.2％)，表明危险的心脏组织的量将要坏死。给药THP以剂量依赖性方式降低了心肌缺血的延伸。该降低以坏死区域/危险区域(相对于3.5×10-7、3.5×10-6、3.5×10-5克/千克THP分别为38.1±5.0％、29.0±2.5％和10.7±1.8％)，或坏死区域/总心室(相对于3.5×10-7、3.5×10-6、3.5×10-5克/千克THP分别为17.9±2.3％、13.4±1.2％和5.0±0.9％)来表示。但是，在L-NAME+THP组中，梗塞尺寸并非与对照组(手术-载体)中观察到的不同，表明L-NAME(1毫克/千克)完全消除了THP(3.5×10-5克/千克)的梗塞消除(infarct-sparing)效果。
在缺血和缺血-再灌流期间测定细胞损害的生化指标(LDH释放)。在阻塞前可以看到对照组的低LDH活性(123.6±20.6U/L)。在阻塞或阻塞-再灌流后，在手术-载体组的大鼠的血浆中发现酶的显著增加(分别为500.5±81.4U/L和273.7±29.2U/L)。但是，给药THP以剂量依赖性的方式加重了缺血和缺血-再灌流期间LDH的释放(表5)。
根据30分钟缺血或30分钟再灌流后5分钟的动物血浆中亚硝酸盐(NO2-)和硝酸盐(NO3-)的存在来测定氧化氮(NO)的释放。在假性动物中，在有或没有THP预处理下测定的NO分别为9.6±2.3和7.6±0.9μM。在手术的动物中，THP使血浆NO显著升高；在3.5×10-6克/千克剂量下，相比于未处理的(载体)缺血或缺血-再灌流的动物分别增加了2倍和3.5倍。
总之，本发明的沙立朴吩及其相关衍生物，不仅抑制了缺血或缺血-再灌流诱发的心室心律不齐的严重程度，而且降低了延长的冠状动脉阻塞后的梗塞尺寸的大小。沙立朴吩及其相关衍生物同时增加了经受局部缺血或再灌流的大鼠血液中的NO，并降低了LDH浓度。如上文所述，许多传统的抗心律不齐的药物在再灌流诱发的心律不齐方面具有负作用以及低功效。本发明的沙立朴吩及其相关衍生物提供了用作有效的抗心律不齐和心脏保护药物的机会。
虽然已经参考了本发明的优选实施方案对本发明进行了描述，但本发明普通技术人员在不偏离本发明的精神和实质下，可以对本发明的形式和细节上进行多种改变。因此，本发明的保护范围由权利要求书界定。
权利要求
1.一种用于在哺乳动物中治疗和/或预防心脏疾病的药物组合物，包括(i)有效量的式I化合物 或其酯类衍生物，其中，R是氢、乙酰基、丙酰基、丁酰基或叔丁氧羰基，或者其药学上可接受的盐类；以及(ii)可药用的载体或赋形剂。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述心脏疾病包括心律不齐、心肌缺血或心肌梗塞，以及心律不齐或急性心肌梗塞所引起的猝死。
3.式I表示的化合物 或其酯类衍生物或可药用的盐类，其中，R是丙酰基、丁酰基或叔丁氧羰基。
4.式II表示的化合物 或其酯类衍生物或可药用的盐类，其中R1是氢、乙酰基、丙酰基、丁酰基或叔丁氧羰基；和R2是乙基、烯丙基、丙基、丁基、异丁基或环丙基甲基。
5.一种用于在哺乳动物中治疗和/或预防心脏疾病的药物组合物，包括(i)有效量的式II化合物 或其酯类衍生物，其中，R1是氢、乙酰基、丙酰基、丁酰基或叔丁氧羰基；和R2是乙基、烯丙基、丙基、丁基、异丁基或环丙基甲基；或者其可药用的盐类；以及(ii)可药用的载体或赋形剂。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其中所述心脏疾病包括心律不齐、心肌缺血或心肌梗塞，以及心律不齐或急性心肌梗塞所引起的猝死。
7.式III所表示的化合物 或其酯类或可药用的盐类，其中，R是氢、乙酰基、丙酰基、丁酰基或叔丁氧羰基。
8.一种用于在哺乳动物中治疗和/或预防心脏疾病的药物组合物，包括(i)有效量的式III化合物 或其酯类衍生物，其中R是氢、乙酰基、丙酰基、丁酰基或叔丁氧羰基；或其可药用的盐类；和(ii)可药用的载体或赋形剂。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述心脏疾病包括心律不齐、心肌缺血或心肌梗塞，以及心律不齐或急性心肌梗塞所引起的猝死。
10.如权利要求1、5及8中任一项所述的药物组合物，其是所述药物组合物是以注射或口服的方式给予所需的患者。
11.一种用于在哺乳动物中治疗和/或预防心脏疾病的方法，包括给予哺乳动物有效量的式I的化合物 或其酯类衍生物，其中，R是氢、乙酰基、丙酰基、丁酰基或叔丁氧羰基，或者其可药用的盐类。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述心脏疾病包括心律不齐、心肌缺血或心肌梗塞，以及心律不齐或急性心肌梗塞所引起的猝死。
13.一种用于在哺乳动物中治疗和/或预防心脏疾病的方法，包括给予哺乳动物有效量的式II的化合物 或其酯类衍生物或可药用的盐类，其中R1是氢、乙酰基、丙酰基、丁酰基或叔丁氧羰基；和R2是乙基、烯丙基、丙基、丁基、异丁基或环丙基甲基。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述心脏疾病包括心律不齐、心肌缺血或心肌梗塞，以及心律不齐或急性心肌梗塞所引起的猝死。
15.一种用于在哺乳动物中治疗和/或预防心脏疾病的方法，包括给哺乳动物给药有效量的式III的化合物 或其酯类衍生物，其中R是氢、乙酰基、丙酰基、丁酰基或叔丁氧羰基；或其可药用的盐类。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述心脏疾病包括心律不齐、心肌缺血或心肌梗塞，以及心律不齐或急性心肌梗塞所引起的猝死。
全文摘要
本发明揭露沙立朴吩(thaliporphine)及其相关衍生物用于心脏疾病的治疗及预防，包括心律不齐、心肌缺血或心肌梗塞所引起的心脏疾病，以及心律不齐或急性心肌梗塞所引起的猝死。
文档编号A61P9/06GK1429212SQ01809682
公开日2003年7月9日 申请日期2001年2月28日 优先权日2000年8月23日
发明者苏铭嘉, 李水盛 申请人:美时化学制药股份有限公司