专利名称：衍生自乳的骨保健组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及得自乳酸性蛋白组分的骨保健组合物，特别是得自乳清酸性蛋白组分的骨保健组合物，涉及生产所述骨保健组合物的方法，涉及包括所述骨保健组合物的治疗方法，及涉及所述骨保健组合物的医药用途。
尽管在30岁后逐步开始出现骨质丢失，但其非常缓慢以至于在患者开始察觉之前需要许多年。女性一般比男性具有更高的患骨质疏松的危险。只是因为在绝经期后，由于雌激素水平降低使女性经历迅速的骨骼中骨质丢失。
直至人40岁左右，分别由破骨细胞和成骨细胞破坏(再吸收)和形成(重新形成)骨的过程是接近完美的偶联系统，彼此相互刺激。骨包括胞外蛋白质基质(主要是胶原纤维)，其散布在骨的细胞(骨细胞)之间，其间沉积的矿物成分由钙盐和其它矿物质组成，包括钠，镁和氟化物。破骨细胞在特殊部位再吸收骨，然后经历程序化细胞死亡。成骨细胞取代蛋白质基质(类骨质)并介导其再矿物质化。在再矿物质化期间，成骨细胞包在钙化的物质中，并成为骨细胞，有助于保持骨的结构。由破骨细胞和成骨细胞介导的骨更新出现在整个生命过程，并将其称为“重塑(remodeling)”。确认雌激素缺乏可延迟破骨细胞的程序化细胞死亡或细胞凋亡，因此导致净骨质丢失。
随着年龄增长，重塑系统破坏而且所述两个过程(再吸收和再形成)变得不再同步。原因还不清楚。一些个体具有非常高的骨更新速度，一些具有非常渐进的更新，但骨破坏最后还是超过形成。因为再形成和再吸收的模式在患者之间通常不同，专家确信有许多不同的因素与这个问题有关。在整个过程中包含重要的激素如雌激素、甲状旁腺素、维生素D、和影响细胞生长的血液因子。任何这些因子水平的变化在骨质疏松症的发生中均起作用。
绝经期后的女性通常进行激素替代治疗(HRT)，以补偿降低的天然雌激素水平。HRT在患者非常接近骨质丢失临界极限之前通常不采用，所述临界极限可以导致骨质疏松性骨折。
由于钙是骨的基本成分，因此确信必需通过饮食或补充具有足够的钙摄取量。没有维生素D，所述钙不能掺入骨中，因此特别需要摄取足够量的维生素D。乳和乳蛋白作为良好的蛋白质来源，乳通常是钙和维生素D的主要饮食来源。针对乳蛋白及其对骨疾病的作用已经进行了大量研究。乳中发现的蛋白质包括免疫球蛋白、生长因子、牛血清白蛋白(BSA)、α-乳白蛋白、β-乳清蛋白和大量酪蛋白，所有这些均是磷蛋白质。这些蛋白质除了酪蛋白之外，也均存在于乳清中。已知乳中含有多种促有丝分裂蛋白质和也许直接参与骨重塑的蛋白质。
酪蛋白糖大肽(caseinoglycomacropeptide，CGMP)是在干酪制造过程的粗制凝乳酶介导的酪蛋白凝结步骤(通过凝乳酶的作用)期间，从κ酪蛋白中释放的一种肽，并在乳清组分中发现，所述乳清被称为是甜乳清或干酪乳清。CGMP有时简单称为GMP(糖大肽)。干酪乳清蛋白由15％-20％CGMP组成。CGMP早期已经被提出作为乳中的骨保健促进成分之一，如WO00/49885所述(见下文所述)。
乳酸乳清用乳酸菌通过发酵生产，或者在酪蛋白酸盐或乡村干酪(cottage cheeses)和意大利乳清干酪的生产期间直接加入乳酸生产。无机酸乳清通过在酪蛋白酸盐生产期间加入无机酸生产。乳酸乳清和无机酸乳清不含有CGMP。这两个过程的基础是将pH降低至大约4.6，以使酪蛋白沉淀，这与使用凝乳酶导致沉淀相反。
因此未暴露于凝乳酶的任何乳制品均不含有CGMP。
生长因子(IGF-类胰岛素生长因子、TGF-转化生长因子等)、免疫球蛋白、BSA和一些β-乳球蛋白通过阳离子交换层析回收自乳或乳清。一些生长因子以中性蛋白回收。CGMP是可通过阴离子交换层析回收的酸性蛋白。
骨桥蛋白(OPN)是一种高度磷酸化和糖基化的蛋白质，发现于所有体液(包括乳)和矿物化组织的胞外基质中。作为骨中一种更丰富的非胶原蛋白，OPN位于矿物化组织的细胞—基质和基质—基质界面，在此其由于破骨细胞的作用而沉积。OPN可以保护暴露的骨表面或引发随后的细胞—基质之间的相互作用。已经提议OPN作为调理素，促进巨噬细胞吸附及微粒矿化组织碎片的吞噬作用。OPN可以通过转谷氨酰胺酶交联，而且其可以结合各种胞外分子包括I型胶原、纤连蛋白和骨钙蛋白。这可以期望增加胞外基质的物理强度。OPN表现为促进骨细胞吸附于骨基质。OPN以相对高的浓度存在于脊椎动物血清中，及因此也分泌入哺乳动物乳汁中(Denhardt，D.T.和Noda，M.，骨桥蛋白表达及功能在骨重塑中的作用，细胞生物化学杂志增刊30/3192-102(1998))。
新西兰专利说明书503608阐述了从乳或加热的乳清中，通过阳离子交换层析制备骨抗再吸收制剂。半胱氨酸蛋白酶抑制剂或半胱氨酸蛋白酶抑制剂的酶水解产物据揭示在抑制骨再吸收中有效用。骨、骨关节及牙周疾病可以通过摄取存在半胱氨酸蛋白酶抑制剂或其水解产物的饮料、食物或饲料预防(或治疗)。
新西兰专利说明书282898揭示了牛IGF-1样生长因子，其通过阳离子交换层析从乳、脱脂乳、干酪乳清、再生乳清、WPC、WPI、乳粉、乳清粉或初乳中纯化。这些材料优选在阳离子交换层析步骤之前加热。使用限定的蛋白质与阳离子交换剂比率，在温度为4-40℃之间完成结合。所述制品的生长促进作用在培养的类成骨细胞(MC3T3-E1细胞)中证实。所述组合物要求用于预防或治疗骨和关节疾病，尤其骨质疏松症。如果在人的生长阶段施用，可以提高其最高骨质含量。作为原料成分，所述材料用于掺入饮料、食物、内服药和动物饮食中。
欧洲专利说明书EP0787499(相当于日本专利摘要8045566)阐述了在牛血浆和乳中发现的激肽原，促进骨形成及抑制骨再吸收。整体激肽原，激肽原的1.2kb片段和激肽原的酶降解产物(分子量范围0.1-70kDa(千道尔顿)均要求是活性的。该专利涵盖了此产物家族在饮料、食物、内服药和饲料中的应用。
新西兰专利说明书314286揭示了作为骨生长促进剂和骨再吸收抑制剂的高迁移性基团(HMG)蛋白和兼性蛋白或其降解产物的N末端序列。具有活性的上述降解产物分子量为0.1-20kDa。所述制品可以用作食物、饮料、内服药或饲料成分，其中包含钙。回收自其它体液的HNG蛋白和两性霉素也具有相似作用。在提供的实施例中，乳的HMG蛋白通过阳离子交换层析及随后在S-琼脂糖和Mono-Q柱上纯化而分离。
新西兰专利说明书246211阐述了得自乳清的成骨细胞生长因子/骨增强因子，其通过用乙醇沉淀酸化的乳清而获得，分子量在5-28kDa之间。所述活性制剂作为乙醇沉淀级分的水提取物而回收。或者，当通过30kDa膜超滤加热的乳清时，在滤过物中回收该因子。所述制品的等电位点在4-9之间。不使用阴离子交换层析。
新西兰专利说明书314097揭示了乳衍生蛋白，分子量为2-24kDa，等电位点在7.5-11.0之间，具有成骨细胞增殖作用、骨加固作用和骨再吸收抑制作用。所述活性蛋白通过阳离子交换层析回收，并用0.1M-1.0M盐洗脱。也要求保护含有这种制品的食物、饮料、内服药和饲料。
新西兰专利说明书301362(相当于日本专利摘要JP207508)阐述了一种破骨细胞抑制蛋白、编码其的DNA及表达所述DNA的方法。所述蛋白质在还原条件下是60kDa，在非还原条件下是60-120kDa。所述蛋白质可以通过阳离子交换或通过结合肝素柱而纯化。所述蛋白质的生物活性通过在56℃加热10分钟而降低。
欧洲专利说明书EP704218揭示了基于乳的碱性蛋白级分和基于乳的碱性肽级分的制备。这些通过对乳和乳清进行阳离子交换层析而产生。这两种产物及其水解物当口服施用时，促进骨生长及抑制破骨细胞的再吸收。可以存在于食物或饮料中。所述组合物要求用于治疗或预防各种骨疾病如骨质疏松症。
PCT专利说明书WO00/49885揭示了一种预防或治疗骨或牙齿疾病的组合物，其包含一种乳蛋白水解物。在优选的实施方案中，所述乳蛋白水解物是一种酪蛋白水解物，特别是酪蛋白糖大肽(CGMP)，或其生物可利用形式的模拟物、同系物或片段，其保留了CGMP的抑制骨再吸收或骨质丢失的能力；或利于钙吸收保持或钙化；或上述作用的组合。所述组合物通过浓缩和弱阴离子层析从甜乳清中生产。
Bayless等(乳骨桥蛋白的分离和生物学性质，蛋白质表达和纯化9(3)309-314(1997))揭示了在未加工的脱脂乳中纯化骨桥蛋白的方法，使用DEAE-Sephacel(天然乳，pH of 6.6)在4℃混合过夜。除去未结合部分，并用0.25M NaCl冲洗除去其它结合的蛋白质。含有骨桥蛋白的级分通过0.3M洗脱除去。集合含有骨桥蛋白的级分，在盐中制成4M，然后在苯基琼脂糖柱上通过疏水相互作用层析(两次)纯化。从未加工的脱脂乳中分离在商业上不可取，这种目的是高纯化的样品而不是丰富的产品。
Takada等(乳乳清蛋白在卵巢切除的大鼠中增强骨破坏力，营养学研究17，1709-1720(1997))的早期研究示出骨加固成分存在于乳清中。所述活性成分是热稳定的并存在于低分子量乳清的30％-70％乙醇可沉淀部分中。未进行乳清分馏。
Yun S.S.等(从干酪乳清蛋白浓缩物中分离促有丝分裂糖磷酸肽，生物科学生物技术学和生物化学60(3)429-433(1996))研究了干酪乳清蛋白浓缩物(CWPC)的免疫学功能，使用小鼠脾细胞中促有丝分裂活性作为指数。通过对CWPC进行凝胶过滤和阴离子交换层析分离的级分示出高度促有丝分裂活性。该研究结果表明干酪乳清含有具有强促有丝分裂活性的糖磷酸肽(GPP)。
Sorensen E.S.等(分离自乳 蛋白胨级分的三种蛋白质的纯化和定性，乳制品研究杂志60(2)189-197(1993))从乳 蛋白胨中分离了三种主要蛋白质。这些蛋白质通过Sephadex G-75凝胶层析，Q-Sepharose离子交换及在存在尿素的情况下额外的Sephadex G-75凝胶层析纯化。从其在梯度SDS-PAGE中的迁移率中，发现所述蛋白质分子量为17、28和60kDa。发现所述17kDa蛋白质的N末端氨基酸序列与骆驼乳清蛋白同源。这个蛋白质先前在乳中未加以阐述。从SDS-PAGE结果中，断定所述28kDa蛋白质是 蛋白胨的主要蛋白，大约占总量的25％。N末端氨基酸序列示出与任何已知蛋白质序列均不同源，但氨基酸成分表明28kDa蛋白质与来自乳或其部分的 蛋白胨级分的PP3成分相同。发现所述60kDa蛋白质是牛骨桥蛋白，一种非常高度磷酸化的蛋白质，具有介导细胞吸附的Arg-Gly-Asp序列。
科学和专利文献出版物未示出乳(或乳清)的酸性成分能提供一种(潜在的)骨抗再吸收因子的来源。
发明目的因此本发明不同方面的一个目的是提供得自乳酸性成分特别是得自乳清的酸性蛋白级分的骨保健组合物；生产这种组合物的方法；包含所述组合物的治疗方法；所述组合物的医药用途；和/或至少为公众提供了一种有益选择。
根据本发明的第二方面，提供了一种骨保健组合物，其包含得自乳成分的一种酸性蛋白级分、得自乳成分的一种酸性蛋白级分的水解物或其组合，其中所述组合物不含有酪蛋白糖大肽(CGMP)。
根据本发明的第三方面，提供了一种骨保健组合物，其包含乳清的一种酸性蛋白级分、乳清的一种酸性蛋白级分的水解物或其组合，其中所述组合物不含有酪蛋白糖大肽(CGMP)。
优选地，本发明组合物使用阴离子交换层析生产，及更优选使用强阴离子交换层析生产。
优选地，本发明组合物包含70％重或更多，80％重或更多，及优选90％重或更多的蛋白质，包括骨桥蛋白和 蛋白胨。优选地所述 蛋白胨包含通过纤溶酶作用从酪蛋白中产生的肽，及包括选自 蛋白胨5(PP5)、慢 蛋白胨8(慢PP8)、快 蛋白胨8(快PP8)、以及非酪蛋白 蛋白胨3(PP3)的一或多种蛋白质。
优选地，本发明组合物中的蛋白质具有3,000-65,000的分子量，这是通过SDS-PAGE测定的。
优选地，本发明组合物的唾液酸含量在0.8％-6.5％范围。优选地，本发明组合物的磷酸盐含量在0.5％-3％。
优选地，本发明组合物得自选自调配的或新鲜全乳、调配的或新鲜脱脂乳、复水的全乳粉或脱脂乳粉、初乳、乳蛋白浓缩物(MPC)、乳蛋白分离物(MPI)、乳清蛋白分离物(WPI)、乳清蛋白分浓缩物(WPC)、乳清、复水的乳清粉末中任一项的或多种原料，或得自任何乳加工产品，或得自通过超滤和/或微滤任一或多种这些原料获得的滤物。优选地，所述原料得自牛和其它乳制品(例如山羊或绵羊或其它产乳哺乳动物)或其组合。适当的加工产品例如是在乳白蛋白TM或TMPTM(总乳蛋白)分离物的生产期间生产的那些产品。甚至更优选地，本发明组合物得自乳酸乳清或无机酸乳清。适于商业生产乳清的方法见于JG Zadow(编辑)“乳清和乳糖加工”(Elsevier应用科学，伦敦和纽约，1992)及T Sienkiewicz和C Riedel(编辑)“乳清和乳清利用”(Verlag，德国1990)所述。
优选地，本发明组合物还包含生理可接受数量的钙、镁、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K2和/或锌。
根据本发明的第四方面，提供了一种生产骨保健组合物的方法，包括以下步骤(a)提供一种水溶液，其不包含CGMP而且其得自任一种或多种选自以下的原料调配的或新鲜全乳、调配的或新鲜脱脂乳、复水的全乳粉或脱脂乳粉、初乳、乳蛋白浓缩物(MPC)、乳蛋白分离物(MPI)、乳清蛋白分离物(WPI)、乳清蛋白分浓缩物(WPC)、乳清、复水的乳清粉末中任一项的或多种原料，或得自任何乳加工产品，或得自通过超滤和/或微滤任一或多种这些原料获得的滤物；(b)将所述水溶液进行阴离子交换层析，pH在大约3-4.9之间；(c)冲洗所述阴离子交换介质；(d)从阴离子交换培养基中洗脱一种乳清酸性蛋白质级分。
优选地，所述原料得自乳和其它乳制品(例如山羊或绵羊或其它产乳哺乳动物)或其组合。
优选地，(a)步骤中提供的水溶液是酸性乳清或无机酸乳清。优选地，(a)步骤中提供的水溶液得自酸性乳清或无机酸乳清。优选地，(a)步骤中提供的水溶液包含乳清酸性蛋白级分的水解物。
优选地，所述阴离子交换层析是强阴离子交换层析。优选地(b)步骤在pH4-4.7之间进行，或者更优选在pH4.5进行。可以使用的阴离子交换器典型例如基于大孔亲水性琼脂糖的阴离子交换器，例如Q-琼脂糖、Q-琼脂糖、快速流动、Q-琼脂糖大珠和Q-交联葡聚糖。或者，可以使用基于纤维素的大孔Gibcocel QA阴离子交换器和Whatman QA纤维素。也可以使用的其它阴离子交换器包括基于聚苯乙烯的Macropep-Q和Diaion阴离子交换器。
优选地，(c)步骤包括使用去离子水冲洗所述介质。
优选地，(d)步骤使用NaCl或KCl或其混合物进行。优选地，(d)步骤使用1M的NaCl进行。优选地，(d)步骤使用一种酸进行。优选地(d)步骤使用具有不同pH的两或多种洗脱溶液进行。优选地，(d)步骤使用在5.0-9.0之间的pH和至多为1.0M的盐浓度进行。
在一个优选的方式中，本发明方法在(a)步骤之前还包括一或多个步骤，其中所述步骤包括选自以下的步骤加热、巴氏消毒、离心除去脂肪、超滤和/或微滤以浓缩所述水溶液、或反向渗透、电渗析、或离子交换层析以使所述制品去离子化。
通过本发明第四方面的方法生产的组合物还可以包含钙、镁、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K2、和/或锌。
在本发明优选的实施方案中，本发明的骨保健组合物及通过本发明方法生产的那些组合物，可以掺入饮食补充物、食物或饮料中、或作为饮食补充物、食品添加剂或饮料添加剂而提供。
本发明其它优选的实施方案包括包含本发明骨保健组合物和通过本发明方法生产的那些组合物的饮食补充物、营养药、食品添加剂或饮料添加剂。
本发明其它优选的实施方案包括含有乳、乳粉和基于乳粉配方的矿物质补充物、强化维生素果蔬汁产品、谷类或糖果条、及利用这些原料的产品、UHT和巴氏灭菌乳、酸乳、发酵乳和直接酸化的乳，包括本发明的骨保健组合物，和通过本发明方法生产的那些乳。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，本发明的骨保健组合物和通过本发明方法生产的组合物，包含选自以下的一或多种成分骨桥蛋白，骨涎蛋白、 蛋白胨3、 蛋白胨5、 蛋白胨8、唾液酸化和磷酸化蛋白及得自其中的肽，及α-sl-酪蛋白磷酸肽。
优选地，本发明组合物或通过本发明方法生产的组合物包含任何肽或肽成分，其中所述蛋白质成分呈现有助于骨健康的性质。
根据本发明的第五方面，提供了一种保持或改善骨健康的方法，包括为患者施用本发明组合物或通过本发明方法生产的组合物。
根据本发明的第六方面，提供了一种治疗或预防净骨质丢失的方法，包括为患者施用本发明组合物或通过本发明方法生产的组合物。
根据本发明的第七方面，提供了本发明组合物或通过本发明方法生产的组合物在生产保持或改善骨健康的配方中的用途。
根据本发明的第八方面，提供了本发明组合物或通过本发明方法生产的组合物在生产治疗或预防净骨质丢失的配方中的用途。
本发明还可宽泛地解释为包括申请书的说明书中所述的个别或全部的部分、原理和特点，及所述任两个或多个部分、原理或特点的组合，而且其中在此提及了与本发明相关的本领域已知等价物的特殊完整部分，这种已知的等价物在此并入单独阐述。
本发明包括前文所述内容，也包括以下实施例的内容。
图2示出实施例2中得自乳酸乳清的酸性乳清蛋白级分的HPLCMono Q分析。
图3示出实施例3中酸性乳清蛋白成分对培养的小鼠颅骨(头果顶部)细胞的抗再吸收作用。
图4示出实施例4中体内饲养实验中，不同组群大鼠的股骨和椎骨的骨矿物质密度对比。
发明详述本申请书中揭示了一种乳的酸性蛋白级分，这是乳尤其乳清的一种成分，可以降低或预防净骨质丢失。
术语“酸性蛋白级分”是指乳蛋白的一种级分，其包含等电位点为4.9或更低的蛋白质。
本发明的酸性蛋白级分已经示出含有许多较小的酸性乳清蛋白。这些包括骨桥蛋白、 蛋白胨3、 蛋白胨5(PP5)，也称为ss-酪蛋白-5P(fl-105)或p-酪蛋白-5P(fl-107)、慢 蛋白胨8(慢PP8)，也称为ss-酪蛋白-1P(f29-105)或ss-酪蛋白-1P(f29-107)、唾液酸化的和磷酸化的蛋白质、α-sl-酪蛋白磷酸肽、及通过天然蛋白酶解得自这些蛋白质肽混合物。也存在非常少量的乳酸化α和β-乳球蛋白。
所述酸性蛋白级分示出含有得自通过水解天然发生的乳蛋白酶纤溶酶而产生的这些蛋白质的肽。在酸性蛋白级分回收自乳酸乳清的特殊情况中，通过乳酸菌蛋白酶以及纤溶酶的作用天然产生更广范围的肽。
使用动物模型(卵巢切除的大鼠—OVX大鼠)模拟绝经期对骨的作用，发现本发明的酸性蛋白级分抑制骨再吸收，所述骨再吸收一般见于绝经期后，最后导致如骨质疏松等疾病。本发明的酸性蛋白级分因此用于治疗或预防如骨质疏松和骨关节疾病。
本发明的酸性蛋白级分的总唾液酸含量范围是0.8％-6.5％，及磷酸盐含量在0.5-3％之间。
所述酸性蛋白级分含有分子量为3000Daltons(水解产物)至大约65,000Daltons( 蛋白胨集合物)范围的蛋白质和肽。
商业回收本发明酸性蛋白级分的潜在原料包括调配的或新鲜乳、调配的或新鲜脱脂乳、复水的全乳粉或脱脂乳粉、初乳、乳蛋白浓缩物(MPC)、乳蛋白分离物(MPI)、乳清蛋白分离物(WPI)、乳清蛋白分浓缩物(WPC)、乳清、复水的乳清粉末、或得自任何乳加工产品，或得自通过超滤和/或微滤任一或多种这些原料获得的滤物。任何这些潜在原料均可得自一或多种乳和其它乳制品原料(例如山羊或绵羊或其它产乳哺乳动物)。或者，潜在的原料可得自任何乳加工制品，如在乳白蛋白或TMPTM(总乳蛋白)分离物生产期间生产的那些制品。适于商业生产乳清的方法见于JG Zadow(编辑)“乳清和乳糖加工”(Elsevier应用科学，伦敦和纽约，1992)及T Sienkiewicz和CRiedel(编辑)“乳清和乳清利用”(Verlag，德国，1990)所述。
本发明的酸性蛋白级分使用阴离子交换层析生产，优选强阴离子交换层析。优选地，所述阴离子交换层析在pH3.0-pH4.9之间，更优选在pH4.0-pH4.7之间，及最优选在pH4.5进行。这些pH条件是通过阴离子交换层析回收酸性蛋白的最佳条件，因为在此范围所述活性成分与柱结合，而且不需要的蛋白质几乎完全排除在未结合成分中。这些包括主要的乳清蛋白如α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、和牛血清白蛋白，其只作为测定活性的稀释剂。工业应用本发明的组合物及通过本发明方法生产的组合物可以通过掺入食物或饮料中用于生产功能性食物，及用于治疗、控制和/或预防骨缺陷(所有年龄组)包括骨关节炎、骨质疏松症和牙病。
本发明的组合物在日常饮食中作为营养药或饮食补充物摄取，以延迟或预防骨退化疾病的发生。
将从所述柱洗脱的酸性蛋白质级分使用Amicon 3K NMCO螺旋超滤单位(得自Millipore，美国)浓缩大约6.25倍。浓缩的蛋白质存留物用水透析，然后冻干。
干燥的产物(回收的56g产物)具有79％的蛋白质，少于0.5％的钙，大约1.0％的磷和6.0％唾液酸。洗脱的蛋白质级分的氨基酸成分示于表1。
表1得自无机酸乳清的酸性蛋白级分的氨基酸分布图氨基酸 含量(％w/w)天冬氨酸8.19丝氨酸 6.22谷氨酸 17.7甘氨酸 1.34组氨酸 2.22精氨酸 3.69苏氨酸 4.83丙氨酸 2.59脯氨酸 6.15酪氨酸 1.88缬氨酸 4.18赖氨酸 6.64异亮氨酸5.70亮氨酸 6.72苯丙氨酸2.86根据Elgar等(层析学杂志A，878(2000)，pp183-196)所述方法，通过反相HPLC分析所述酸性蛋白级分的乳清蛋白和 蛋白胨。使用分析阴离子交换Mono Q柱HR5/5(得自Amersham-Pharmacia Biotech，澳大利亚)，测定所述酸性蛋白级分的蛋白质成分。这样检测到存在骨桥蛋白、α-sl-酪蛋白磷酸肽、 蛋白胨3、 蛋白胨5和β-乳球蛋白。慢 蛋白胨8与PP5一起洗脱，因此不出现单独的峰。对通过天然蛋白酶解得自这些蛋白质的肽也进行检测，示出每种成分均具有明显的峰，而且在主要的峰周围存在小峰。
将回收自阴离子交换器的冻干酸性级分溶解于20mM Tris/HCl缓冲液中，pH8.0，并加样于Mono Q柱上。使用三阶段线性梯度至1M氯化钠(pH6.0)产生进行分析的分离物。在214nm测定蛋白质吸附和洗脱。使用在我们自己的实验室中制备的标准来分辨蛋白质峰值相同性。标准是针对PP5、PP3和骨桥蛋白制备的。每个标准的相同性通过氨基酸测序(如N末端测序)证实，其纯度通过SDS-PAGE和HPLC分析证实。其它成分通过对从HPLC收集的峰值的氨基酸序列分析鉴别，如
图1所示。
这些分析的结果(图1)示出得自这些蛋白质的骨桥蛋白、α-sl-酪蛋白片段、唾液酸化的和/或磷酸化的较小的蛋白质、 蛋白胨5和3、及得自这些蛋白质的肽存在于回收自无机酸乳清的酸性蛋白质中。实施例2得自乳酸乳清的酸性蛋白级分将20L无机酸乳清蛋白浓缩物溶液(Alacen 312-得自NZMP，Wellington，新西兰)在10％固体物和pH4.5经过一个2L的Q-Sepharose BB柱(Amrad Pharmacia，澳大利亚)，流速为110ml/min。将该柱用5L去离子水冲洗，并用1.0M氯化钠溶液(pH6.0)洗脱。通过测定在280nm的吸光度监测蛋白质吸附和洗脱。
将从所述柱洗脱的蛋白质使用Amicon 3K NMCO螺旋超滤单位(得自Millipore，美国)浓缩大约6.25倍。浓缩的蛋白质存留物用水透析，然后冻干。
根据Elgar等(层析学杂志A，878(2000)，pp183-196)所述方法，通过反相HPLC分析所述酸性蛋白级分的乳清蛋白和 蛋白胨。使用分析阴离子交换Mono Q柱HR5/5(得自Amersham-Pharmacia Biotech，澳大利亚)，测定骨桥蛋白、α-sl-酪蛋白磷酸肽、 蛋白胨3、 蛋白胨5的存在情况。如实施例1所述对得自这些蛋白质的肽的存在情况也进行观测。
将回收自阴离子交换器的冻干酸性级分溶解于20mM Tris/HCl缓冲液中，pH8.0，并加样于Mono Q柱上。使用三阶段线性梯度至1M氯化钠(pH6.0)产生进行分析的分离物。在214nm测定蛋白质吸附和洗脱。使用已知标准或通过对收集的峰来进行N末端测序以分辨蛋白质峰的相同性。
这些分析的结果(图2)示出得自这些蛋白质的骨桥蛋白、α-sl-酪蛋白片段、唾液酸化的和/或磷酸化的较小的蛋白质、 蛋白胨5和3、及得自这些蛋白质的肽存在于回收自乳酸乳清的酸性蛋白质中。实施例3效力的体外分析如Lowe等(骨和矿物质研究杂志(美国)，6(12)1277-1283(1991))所述，将实施例1产物在骨器官培养模型中测试。图3示出所述酸性蛋白级分在低如10ug/ml的剂量，对骨器官培养物细胞也具有抗再吸收作用。与对照物相比较低的钙释放和较低的胸苷掺入表明了这种抗再吸收作用。实施例4效力的体内分析对得自实施例1的酸性蛋白级分在卵巢切除(OVX)的大鼠中，降低由于雌激素缺乏所致的骨质丢失的能力进行为期16周以上的研究。卵巢切除的大鼠模型是研究在绝经期后发生的骨质丢失的普遍认同的模型。
30个6月龄雌性Sprague-Dawley大鼠中，l0个是假手术动物(sham-operated animal)，20个是在5.5月龄OVX动物。将假手术的动物麻醉并作切口，但卵巢完整保留。在OVX动物中，切除卵巢。将动物分成3组(每组10个)。这些组群示于表2。
表2对3组大鼠应用的处理对照饮食 添加0.3％(w/w)的酸性乳清蛋白级分的饮食A组是否(假手术)B组是否(OVX对照)C组否是(OVX试验)将动物分别圈养在鞋盒中，并保持在22℃的温度及控制光照(12小时白天/黑夜循环)的房间中。动物随意饮用去离子水。为动物提供均衡的半合成饮食，由15％酪蛋白酸盐、5％纤维素、5％玉米油、0.5％钙、62％淀粉组成及加入所需的维生素和无机物。当加入0.3％(w/w)的酸性乳清蛋白级分(实施例1产生的样品)时，调整所述酪蛋白。假手术对照组(A组)和OVX对照组(B组)均接受不加入酸性蛋白级分的基本饮食。C组(OVX大鼠)接受含有得自实施例1的0.3％(w/w)酸性蛋白级分的饮食。测定动物的每日摄取量，并每周根据SHAM组体重调整摄取量，以防止OVX组体重增长。实验进行4个月，每个月均进行测定。
针对骨矿物质密度(BMD)测定，将大鼠每4周在麻醉下扫描。将大鼠称重并用适当剂量麻醉，即0.05ml/100g体重。麻醉剂是0.2ml乙酰普马嗪(Acepromazine，ACP)+0.5ml氯胺酮(Ketamine)+0.1ml甲苯噻嗪+0.2ml无菌H2O的混合物，通过用25G×5/8″针头和1ml注射器经腹膜内注射施用。注射大约5-10分钟后大鼠达到适当的麻醉水平，并在麻醉下保持2小时。
使用Hologic QDR4000骨显像密度计，用笔形波束单位(Bedford，美国)进行骨矿物质测定。每日进行质量控制(QC)扫描以保证精确。这要求符合变化系数。使用0.06英寸(0.1524cm)直径的瞄准仪进行局域高分辨扫描，所述瞄准仪具有0.0127英寸(3.23×10-2cm)点分辨率和0.0254英寸(6.45×10-2cm)谱线间距(line spacing)。将大鼠置于均一厚度1.5英寸(3.81cm)的丙烯酸平台上。每只大鼠进行3次椎骨及左侧和右侧局域高分辨扫描。将大鼠置于仰卧位，椎骨和股骨，股骨和胫骨之间处于正确角度。
图4示出在用所述级分饲养16周后，右侧股骨和椎骨的BMD。在两种情况中，对照OVX组(B组)的BMD有统计学意义地低于假手术A组(有统计学意义结果用*标示)，而用酸性乳清蛋白级分饲养组(C组)的BMD与假手术组没有明显不同(p＜0.05)。
这个实验示出用对照饮食(B组)饲养的OVX大鼠与假手术对照大鼠(A组)相比丧失明显数量的骨质，而令人惊奇地，用酸性蛋白级分饲养的大鼠(C组)与假手术大鼠相比不丢失明显数量的骨质。这表明本发明的酸性蛋白级分可降低或预防由于雌激素缺乏引起的骨质丢失。
以上阐述了本发明的一些优选实施方案，并表明一些可能的修改，但本领域技术人员应意识到在不偏离本发明范围的前提下，可以对本发明进行其它修改。
权利要求
1.一种骨保健组合物，其包含乳的酸性蛋白级分、乳酸性蛋白级分的水解物或其组合，其中所述组合物不包含酪蛋白糖大肽(CGMP)。
2.一种骨保健组合物，其包含得自乳成分的酸性蛋白级分、得自乳成分的酸性蛋白级分的水解物或其组合，其中所述组合物不包含酪蛋白糖大肽(CGMP)。
3.一种骨保健组合物，其包含乳清酸性蛋白级分、乳清酸性蛋白级分的水解物或其组合，其中所述组合物不包含酪蛋白糖大肽(CGMP)。
4.权利要求1-3中任一项的骨保健组合物，其中所述酸性蛋白级分包含70％重或更多的蛋白质，所述蛋白质的80％重或更多包含骨桥蛋白和 蛋白胨。
5.权利要求1-3中任一项的骨保健组合物，其中所述酸性蛋白级分包含70％重或更多的蛋白质，所述蛋白质的90％重或更多包含骨桥蛋白和 蛋白胨。
6.权利要求1-5中任一项的骨保健组合物，其中所述级分中蛋白质的分子量的分布范围通过SDS-PAGE测定为3,000-65,000。
7.权利要求4或5的骨保健组合物，其中所述 蛋白胨包含通过纤溶酶的作用从酪蛋白中产生的肽，并包括选自 蛋白胨5(PP5)、慢 蛋白胨8(慢PP8)、快 蛋白胨8(快PP8)、以及非酪蛋白 蛋白胨3(PP3)的一或多种蛋白质。
8.权利要求1-7中任一项的骨保健组合物，其中所述级分的唾液酸含量在0.8％-6.5％范围。
9.权利要求1-8中任一项的骨保健组合物，其中所述级分的磷酸盐含量在0.5％-3％范围。
10.权利要求1-9中任一项的骨保健组合物，其中所述组合物使用阴离子交换层析生产。
11.权利要求1-10中任一项的骨保健组合物，其中所述组合物使用强阴离子交换层析生产。
12.权利要求1-11中任一项的骨保健组合物，其得自选自调配的或新鲜全乳、调配的或新鲜脱脂乳、复水的全乳粉或脱脂乳粉、初乳、乳蛋白浓缩物(MPC)、乳蛋白分离物(MPI)、乳清蛋白分离物(WPI)、乳清蛋白浓缩物(WPC)、乳清、复水的乳清粉末的任一或多种原料，或得自任何乳加工产品，或得自通过超滤和/或微滤任一或多种这些原料所获得的滤物。
13.权利要求1-12中任一项的骨保健组合物，其得自乳酸乳清或无机酸乳清。
14.一种生产骨保健组合物的方法，其包含以下步骤(a)提供一种水溶液，其不含CGMP而且其得自选自调配的或新鲜全乳、调配的或新鲜脱脂乳、复水的全乳粉或脱脂乳粉、初乳、乳蛋白浓缩物(MPC)、乳蛋白分离物(MPI)、乳清蛋白分离物(WPI)、乳清蛋白浓缩物(WPC)、乳清、复水的乳清粉末的任一或多种原料，或得自任何乳加工产品，或得自通过超滤和/或微滤任一或多种这些原料所获得的滤物；(b)将所述水溶液进行阴离子交换层析，pH在大约3-4.9之间；(c)冲洗所述阴离子交换介质；(d)从阴离子交换介质中洗脱一种乳清酸性蛋白质级分。
15.权利要求14的方法，其中(a)步骤中提供的水溶液是乳酸乳清或无机酸乳清。
16.权利要求14的方法，其中(a)步骤中提供的水溶液得自乳酸乳清或无机酸乳清。
17.权利要求14的方法，其中(a)步骤中提供的水溶液包含乳清酸性蛋白级分的水解物。
18.权利要求14-17中任一项的方法，其中所述阴离子交换层析是强阴离子交换层析。
19.权利要求14-18中任一项的方法，其中(b)步骤在大约pH4-4.7之间进行。
20.权利要求14-18中任一项的方法，其中(b)步骤在pH4.5进行。
21.权利要求14-20中任一项的方法，其中(c)步骤包含使用去离子水冲洗所述介质。
22.权利要求14-21中任一项的方法，其中(d)步骤使用NaCl或KCl或其混合物进行。
23.权利要求14-21中任一项的方法，其中(d)步骤使用1MNaCl进行。
24.权利要求14-21中任一项的方法，其中(d)步骤使用一种酸进行。
25.权利要求14-21中任一项的方法，其中(d)步骤使用具有不同pH的两种或多种洗脱溶液进行。
26.权利要求14-21中任一项的方法，其中(d)步骤使用pH在5.0-9.0的洗脱溶液和浓度至多为1.0M的盐进行。
27.权利要求14-26中任一项的方法，其在(a)步骤之前还包括一或多个步骤，所述步骤选自加热、巴氏消毒、离心、超滤、微滤、反向渗透、电渗析、或离子交换层析。
28.通过权利要求14-27中任一项的方法生产的组合物。
29.权利要求1-13和28中任一项的组合物，其还包含生理可接受量的钙、镁、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K2、和/或锌。
30.权利要求1-13，28和29中任一项的组合物，其中所述组合物得自乳或其它乳制品原料或其组合，包括山羊或绵羊或其它产乳哺乳动物。
31.权利要求1-13和28-32中任一项的组合物，其包含选自骨桥蛋白、骨涎蛋白、 蛋白胨3、 蛋白胨5、 蛋白胨8、从中获得的唾液酸化的和磷酸化的蛋白质和肽、及α-sl-酪蛋白磷酸肽的一种或多种组合物。
32.权利要求1-13和28-32中任一项的组合物或其成分，其呈现对骨健康有益的性质。
33.一种饮食补充物，其包含权利要求1-13和28-32中任一项的组合物。
34.一种食品添加剂，其包含权利要求1-13和28-32中任一项的组合物。
35.一种饮料添加剂，其包含权利要求1-13和28-32中任一项的组合物。
36.一种营养药，其包含权利要求1-13和28-32中任一项的组合物。
37.一种药物，其包含权利要求1-13和28-32中任一项的组合物。
38.一种保持或改善骨健康的方法，其包括为患者施用权利要求1-13和28-32中任一项的组合物。
39.一种治疗或预防净骨质丢失的方法，其包括为患者施用权利要求1-13和28-32中任一项的组合物。
40.权利要求1-13和28-32中任一项的组合物在生产保持或改善骨健康的配方中的应用。
41.权利要求1-13和28-32中任一项的组合物在生产治疗或预防净骨质丢失的配方中的应用。
全文摘要
本发明涉及包含乳的酸性蛋白级分的骨保健组合物，涉及生产所述骨保健组合物的方法，涉及包括所述骨保健组合物的治疗方法，及涉及所述骨保健组合物的医药应用。本发明的一个主要方面提供了一种骨保健组合物，所述组合物包含的酸性蛋白级分衍生自乳、乳成分、乳清、其水解物、或其组合，其中所述组合物不包含酪蛋白糖大肽(CGMP)。本发明另一方面提供了使用阴离子交换层析生产本发明组合物的方法。
文档编号A61P3/00GK1468108SQ01816898
公开日2004年1月14日 申请日期2001年9月27日 优先权日2000年10月5日
发明者伊恩·雷金纳德·里德, 吉尔·科尼什, 尼尔·沃德·哈格蒂, 凯特·帕尔马诺, 伊恩 雷金纳德 里德, 帕尔马诺, 沃德 哈格蒂, 科尼什 申请人:纽西兰乳品局