专利名称：治疗Ⅰ型糖尿病的方法
相关申请的交叉引用—有关联邦资助研究或开发的声明—发明背景糖尿病糖尿病是一种异源疾病，它通常以患者的低血糖症为特征。在20世纪60年代末，已经知道了胰岛素依赖型糖尿病(I型)和非胰岛素依赖型糖尿病(II型)之间的区别。
已知I型糖尿病有自身免疫起因并且会受到遗传型素质和环境因素的影响(J.F.Bach，Endoc.Rev.18(4)516-542，1994)。I型糖尿病是遗传性疾病，有着相对较高的家族传递率。
环境因素看起来会影响I型糖尿病发病并且会改变该病的进程。例如，超过60％的同卵双生子对该病的易感性是不同的。此外，在各个国家之间该疾病的发病率变化很大，且一些非免疫学干涉似乎会升高或降低动物模型中该病的发病率。这些干涉包括特殊膳食和一些病毒感染。
I型糖尿病的动物模型非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠被用作人I型糖尿病的模型，这是因为在这两者中都可通过自身免疫反应破坏胰岛细胞。这种糖尿病的一个特征被称为“胰岛炎”，即淋巴细胞渗透进胰腺，这说明有免疫反应。
NOD小鼠中I型糖尿病的发展是T-细胞介导的，CD8+和CD4+细胞都参与了这一过程(L.S.Wicker等，Annu.Rev.Immunol.13179-200，1995)。两种决定性的胰岛细胞自身抗原是谷氨酸脱羧酶(GAD)和胰岛素。GAD催化神经递质γ-氨基丁酸的产生，在前糖尿病患者的血清中通常可发现GAD的抗体(S.Baekkeskov等，Nature347151-156，1990；W.A.Hagopian等，J.Clin.Invest.91368-374，1993)。
胰岛素的自身抗体在糖尿病的发病中也起到扮演了决定性的角色。在超过50％的新近发病的糖尿病患者中发现了这些抗体(L.Castano和G.S.Eisenbarth，Annu.Rev.Immunol.8647-680，1990)。I型糖尿病的特征包括高血糖症、极度口渴和多尿、血液胆固醇升高以及血液甘油三酯浓度升高。I型糖尿病通常与肥胖无关。
尽管NOD小鼠100％的遗传相似性，但只有70-80％用人造饲料喂养的(chow-fed)雌性NOD患上了糖尿病，同时只有20％用人造饲料喂养的雄性小鼠患上该病(S.Makino等，Exp.Anim.30137-140，1981)。类似地，在人类中，双胞胎都患有糖尿病只有50％的可能(A.H.Barnett等，Diabetologia 20404-409，1981)。因此，必需同时具备遗传和环境因素才会患上I型糖尿病。已知在NOD小鼠中，与主要组织相容性复合体(MHC)有关的基因涉及糖尿病的发展，但此基因不足以导致该病；因此，不止一种基因与NOD小鼠中糖尿病发病率的发展有关(L.S.Wicker等，同上，1995)(H.Acha-Orbea和H.O.McDevitt，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 842435-2439，1987；J.Todd等，Nature 329599-604，1987)。特别地，如连锁研究所确定的，可能有多达19个遗传区域与糖尿病的易感性有关(T.J.Vyse和J.A.Todd，Cell，1996)。已经确定这些区域中有一些与两种其它的自身免疫疾病有关，这两种疾病是系统性红斑狼疮和试验性自身免疫脑脊髓炎(T.J.Vyse和J.A.Todd，同上，1996)。从环境因素而言，糖尿病的发病存在南北差异，北欧的发病率最高，越往南或在赤道地区发病率越低(A.S.Krolewski，Diabetes37(8)1113-1119，1988；A.S.Krolewski等，New Eng.J.Med.3171390-1398，1987)。
发明概述在一个实施方案中，本发明是延迟糖尿病发病的方法，包括对人类患者口服施用有效量的维生素D化合物，这样可延迟或消除糖尿病的发病或糖尿病综合症。
在一个优选的实施方案中，所述维生素D化合物选自1α，25-二羟基维生素D3(1，25-(OH)2D3)、19-降-1，25-二羟基维生素D2(19-降-1，25-(OH)2D3)、24-高-22-去氢-22E-1α，25-二羟基维生素D3(24-高-22-去氢-22E-1，25-(OH)2D3)、1，25-二羟基-24(E)-去氢-24-高-维生素D3(1，25-(OH)2-24-高-D3)、19-降-1，25-二羟基-21-表-维生素D3(19-降-1，25-(OH)2-21-表-D3)、1α羟基维生素D3或1α羟基维生素D2。
在另一个优选的实施方案中，口服施用通过膳食进行的，剂量为每天每千克患者体重0.005μg-0.2μg。
在本发明另一个实施方案中是降低糖尿病综合症严重程度的方法，它包括对人类患者口服施用有效量的维生素D化合物，这样可消除糖尿病综合症。
附图的详细描述
图1是糖尿病的发病率，这是以每周抽血时血清葡萄糖含量超过300mg/dL的NOD小鼠占动物的百分比计算的。第一次在40天龄时抽取动物血样，然后每周抽取一次。
图2是血钙测量的结果，这是从第40天龄开始在图1的NOD小鼠中每周进行的。数据以mg/dL作为血钙单位。
图3是雌性NOD/LTJ小鼠第200天时糖尿病发病率的柱状图。
图4是雌性NOD/LTJ小鼠糖中尿病发病时的天数的柱状图。
发明详述在一个在先申请中，Mathieu等声称，对雌性NOD小鼠注射5μg/kg1，25(OH)2D3可使糖尿病的发病率从56％降至8％(C.Mathieu等，Diabetologia37552-558，1994)。该作者认为，1，25(OH)2D3可通过降低T-淋巴细胞增殖以及白细胞介素-2、干扰素γ和肿瘤坏死因子α分泌物纠正有缺陷的免疫抑制剂作用(C.Mathieu等，同上，1994)。Mathieu等用1，25(OH)2D3治疗NOD小鼠至100天龄并发现这些小鼠中总的糖尿病发病率在200天时约为35％，而对照小鼠为86％、用1，25(OH)2D3治疗至200天龄的小鼠为13％。从100至200天龄施用1，25(OH)2D3得到与对照组同样的糖尿病发病率，但糖尿病的发病似乎略有延迟。用1，25(OH)2D3治疗的小鼠骨钙含量会降低，但仍给予这些动物低钙膳食(0.2％)以防止高血钙(C.Mathieu等，“Vitamin D and Diabetes”收录在Vitamin D一书中，D.Feldman、F.H.Glorieux和J.W.Pike编，学术出版社，圣地亚哥，第70章，第1183-1196页，1997)。
相反，我们发现与缺乏维生素D的对照相反，在用口服1，25(OH)2D3治疗的雄性和雌性NOD小鼠中，糖尿病的发病率都有显著的降低。令人奇怪的是，在缺乏维生素D的NOD小鼠集落中，糖尿病的发病率与报道的NOD小鼠的发病率相比升高了。这说明当缺乏维生素D时，遗传因素对糖尿病发病率的贡献更大，而环境因素的贡献则较小。
接受1，25(OH)2D3的动物确会患上高血钙症。优选的治疗是施用1，25(OH)2D3的类似物，这种类似物是免疫反应性的但不会导致钙血症。
因此，在一个实施方案中，本发明是通过口服施用一定量维生素D化合物，优选1，25(OH)2D3或其类似物，以有效减轻糖尿病综合症，从而治疗人类I型糖尿病患者的方法。为了测量糖尿病综合症的减轻，我们通常测量或测量血糖。正常的空腹时的血糖范围为80-120mg％；高血糖症(慢性)是糖尿病的反映。
在另一个实施方案中，所述方法包括延迟I型糖尿病患者发病，它包括口服施用有效量的维生素D化合物，优选1，25(OH)2D3或其类似物。
这两种方法都包括选择I型糖尿病患者或预期患者，并对患者施用有效量的维生素D的类似物，从而可减轻、延迟或消除I型糖尿病症状。
在一个特别优选的有利治疗形式中，所施用的化合物是1α，25-二羟基维生素D3(1，25-(OH)2D3)、19-降-1，25-二羟基维生素D2(19-降-1，25-(OH)2D3)、24-高-22-去氢-22E-1α，25-二羟基维生素D3(24-高-22-去氢-22E-1，25-(OH)2D3)、1，25-二羟基-24(E)-去氢-24-高-维生素D3(1，25-(OH)2-24-高-D3)、19-降-1，25-二羟基-21-表-维生素D3(19-降-1，25-(OH)2-21-表-D3)、1α羟基维生素D3或1α羟基维生素D2。
在本发明另一种形式中，所述维生素D化合物有以下结构式 其中，X1和X2分别选自氢和酰基；其中Y1和Y2可以是H，或者其中之一可以是O-芳基、O-烷基、芳基、1-4个碳原子的烷基，或者这两者可合在一起形成具有以下结构的烯烃
其中，B1和B2可选自H、1-4个碳原子的烷基以及芳基，并且可有β或α构型；Z1＝Z2＝H，或者Z1和Z2一起＝CH2；同时，其中R是烷基、羟烷基或氟代烷基，或者R可代表以下侧链 其中(a)可有S或R构型，R1代表H、羟基/或O-酰基，R2和R3分别选自烷基、羟烷基和氟代烷基，或者它们合在一起表示-(CH2)m-，其中m是2-5的整数，R4选自氢、羟基、氟、O-酰基、烷基、羟烷基和氟代烷基，其中，如果R6是羟基或氟，则R4必须是氢或烷基，R5选自氢、羟基、氟、烷基、羟烷基和氟代烷基，或者R4和R5合在一起表示双键的氧，R6和R7合在一起形成碳-碳双键，R8可以是H或CH3，其中n是1-5的整数，且其中，侧链20、22或23位中任一位置上的碳可被O、S或N原子替代。
我们认为优选的口服剂型是胶囊、片剂或锭剂，它们可含在膳食中或者以缓释形式给予。根据所选的特定化合物，可使用的剂量为0.1μg-50μg/天。此剂量也可以透皮贴、栓剂或鼻喷雾剂的形式输递，并且可在多个时间点给药或者全天连续给药。
本发明还包括含有一定量维生素D化合物的药物组合物，所述剂量可有效减轻I型糖尿病综合症。优选地，维生素D化合物的剂量为0.1μg-50μg/天。所述药物组合物还可包含此领域已知的药学上可接受的载体。
实施例A.在非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠中口服使用1，25(OH)2D3及其类似物以预防I型糖尿病材料和方法非放射性1，25(OH)2D3购自Tetrionics公司(麦迪逊，威斯康星州)。
非肥胖型糖尿病(NOD.LtJ)小鼠购自The Jackson实验室(Bar Harbor，ME04609)。使小鼠保持高度纯化的缺乏维生素D的膳食，膳食中含有0.47％钙和0.3％磷并补充有维生素A、E和K。通过在粉末状的膳食中加入融化的琼脂使其固化。为使其后代缺乏维生素D，使怀孕的小鼠保持缺乏维生素D的膳食。然后，一旦其后代断奶，仍继续保持缺乏维生素D的膳食。在膳食中加入1，25(OH)2D3至一定水平，以使每只小鼠每天都可接受50μg。在断奶时开始用1，25(OH)2D3处理。在禁食4小时后于下午2点用玻璃移液管从眶外窦抽取动物血样，每周一次。
血清钙测定将血样立即离心以得到血清。将血清稀释在0.1％的氯化镧中，并用Perkin-Elmer 3110型原子吸收光谱分析仪通过原子吸收测量血清中的钙。
血清葡萄糖测定用购自Sigma(圣路易斯，密苏里州)的Trinder葡萄糖氧化酶酶测定试剂盒测定血清葡萄糖。将5μL NOD血清用作未知样品，并在505nm处与已知的葡萄糖标准物(Sigma，圣路易斯，密苏里州)对照进行分光光度分析。如果血清葡萄糖超过300mg/dL则认为此动物患有糖尿病。
结果图1显示了与用1，25(OH)2D3处理的NOD小鼠相比，缺乏维生素D的NOD小鼠集落的糖尿病发病率。在这一试验结束时，缺乏维生素D的雄性NOD小鼠的糖尿病发病率为80％。相反，当用50ng/小鼠/天的1，25(OH)2D3处理小鼠时，雌性NOD小鼠的糖尿病发病率迅速降至7.69％，同时雄性NOD小鼠的发病率降至7.14％。因此，用1，25(OH)2D3处理可防止NOD小鼠自身免疫性糖尿病的发生。
图2显示了在上述试验期间，这些小鼠的血清钙数据。在试验开始时，缺乏维生素D的小鼠血钙较低(雄性＝6.69±0.9mg/dL，雌性＝6.38±1.38mg/dL)。在试验期间它们的血钙水平逐渐升高，在试验结束时雄性和雌性小鼠的血清钙水平都达到约8mg/dL。在每天用50ng 1，25(OH)2D3处理的小鼠中，血清钙的值明显较高。在第40天时，进行这一处理的雄性小鼠的血清钙水平为9.22±0.93mg/dL，而雌性小鼠的血清钙水平为10.50±1.53mg/dL。在剩下的试验中血清钙水平还会升高。在150天龄时，雄性的血清钙水平为12.78±1.11mg/dL，而雌性的血清钙水平为13.10±1.01mg/dL。在此试验中雌性体比雄性体小些。因此，它们受到高血钙的影响较大。在150天龄时，7只用50ng 1，25(OH)2D3处理的雌性NOD小鼠已经死于高钙血症。这时决定在雄性和雌性小鼠中将膳食中1，25(OH)2D3的水平降至10ng/天。另一组NOD小鼠一开始就施用200ng 1，25(OH)2D3的剂量，但从100天龄开始就有雌性小鼠死于高钙血症，并从120天龄开始有雄性小鼠死于高钙血症。高钙血症的证据是特别高的血清钙水平(≥12mg/dL)和以肾脏中的白色斑点表明的肾钙化。同时，这些动物的血清葡萄糖水平在任何时候都没有超过300mg/dL。
讨论将缺乏维生素D的NOD小鼠的发病率与用1，25(OH)2D3处理的NOD小鼠的发病率比较。如图1所示，在膳食中施用50ng 1，25(OH)2D3在雄性和雌性NOD小鼠中都可预防糖尿病发生。这种糖尿病的预防是以高钙血症为代价的，如图2所示。这些数据是1，25(OH)2D3预防I型糖尿病的治疗潜能的证据。当然，1，25(OH)2D3的类似物将是优选使用的，它们具有免疫活性但不会造成这种高血清钙水平。
有图1中的数据可见的一个显著结果是，缺乏维生素D的NOD小鼠种群的发病率要明显高于文献中报道的用人造饲料喂养的动物的发病率。以前公布的数据是，有70-80％用人造饲料喂养的雌性NOD小鼠和20％用人造饲料喂养的雄性NOD小鼠会患上糖尿病(S.Makino等，同上，1981)。在这里，雌性小鼠该病的发病率为91.67％，而雄性的发病率为80％。因此，其它营养完全但缺少维生素D的膳食会提高糖尿病的发生。这说明，在NOD小鼠中至少一种对糖尿病发生有贡献的环境因素是维生素D的情况。
在治疗上，我们认为这种治疗可用于可能患有糖尿病的儿童。这些孩子可能带有β细胞抗原的自身免疫性抗体。有两种已知的β细胞抗原，它们是谷氨酸脱羧酶和胰岛素(S.Baekkeskov等，同上，1990；W.A.Hagopian等，同上，1993；L.Castano和G.S.Eisenbarth，同上，1990)。如果在前糖尿病的儿童中检测到了自身免疫性抗体，则可以早开始用1，25(OH)2D3治疗，这样就可以预防糖尿病。
B.注射和膳食研究的比较我们将注射和口服施用1，25(OH)2D3进行了比较以确定膳食施用和腹膜内(i.p.)注射1，25(OH)2D3哪一个对于预防雌性NOD/LtJ小鼠发生糖尿病更加有效。
用对照膳食(如Suda等在J.Nutr.1001049-1052，1970中描述的纯化的膳食11，含有0.47％的钙+维生素A、D、E和K)或实验膳食(对照+10、25或50ng 1，25D3/小鼠/天)饲养NOD/LtJ小鼠。
用50μL无菌花生油注射对照(媒介)动物，而每两天用溶于无菌花生油的5μg/kg 1，25D3/小鼠注射试验动物。
在第21天将小鼠断奶并用合适的膳食替代。每48小时注射一次或施用试验膳食。对照膳食每周给三次。从第30天开始到第170天，每10天将小鼠称重并抽取血样以测量血清钙水平。从第70天开始，每周三次检测小鼠的糖尿情况。如果测得小鼠为阳性，则将其禁食4小时并抽取血样以测量血清葡萄糖水平。如果禁食后的血清葡萄糖水平超过300mg％，则该小鼠被确定患有糖尿病。在第200天处死所有的小鼠。
结果表1和图3，描绘第200天时雌性NOD/LtJ小鼠糖尿病发病率的柱状图，描述了这些结果。注射1，25(OH)2D3的小鼠的糖尿病发病率超过了70％。经注射的媒介小鼠和未添加维生素D化合物的小鼠的糖尿病发病率分别为40％和50％。相反，用添加有1，25(OH)2D3的膳食饲养(口服处理)的小鼠的糖尿病发病率为10-25％。较低的1，25(OH)2D3剂量似乎更加接近预防糖尿病的最佳剂量。较高剂量显然会造成高钙血症，但仍然降低糖尿病发病率。更重要的是，从我们这里看来，每天注射50μg会增加而不是降低糖尿病的发病率。
可能较低的1，25(OH)2D3口服剂量是有效的，且不会造成高钙血症。但此数据仍足以得出口服而非注射的1-羟基化的维生素D剂量可预防I型糖尿病发病这一结论。
表1
图4描绘了雌性NOD/LtJ小鼠糖尿病发病的天数。
权利要求
1.在人类患者中延迟糖尿病发病的方法，其特征在于，所述方法包括对患者口服施用有效量的维生素D化合物，这样可延迟糖尿病或糖尿病综合症的发生。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述化合物选自1α，25-二羟基维生素D3(1，25-(OH)2D3)、19-降-1，25-二羟基维生素D2(19-降-1，25-(OH)2D3)、24-高-22-去氢-22E-1α，25-二羟基维生素D3(24-高-22-去氢-22E-1，25-(OH)2D3)、1，25-二羟基-24(E)-去氢-24-高-维生素D3(1，25-(OH)2-24-高-D3)、19-降-1，25-二羟基-21-表-维生素D3(19-降-1，25-(OH)2-21-表-D3)、1α羟基维生素D3或1α羟基维生素D2。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述维生素D化合物选自具有以下结构式的维生素D化合物 其中，X1和X2分别选自氢和酰基；其中Y1和Y2可以是H，或者其中之一可以是O-芳基、O-烷基、芳基、1-4个碳原子的烷基，或者这两者可合在一起形成具有以下结构的烯烃 其中，B1和B2可选自H、1-4个碳原子的烷基以及芳基，并且可有β或α构型；Z1＝Z2＝H，或者Z1和Z2一起＝CH2；同时，其中R是烷基、羟烷基或氟代烷基，或者R可代表以下侧链 其中(a)可有S或R构型，R1代表H、羟基/或O-酰基，R2和R3分别选自烷基、羟烷基和氟代烷基，或者它们合在一起表示-(CH2)m-，其中m是2-5的整数，R4选自氢、羟基、氟、O-酰基、烷基、羟烷基和氟代烷基，其中，如果R6是羟基或氟，则R4必须是氢或烷基，R5选自氢、羟基、氟、烷基、羟烷基和氟代烷基，或者R4和R5合在一起表示双键的氧，R6和R7合在一起形成碳-碳双键，R8可以是H或CH3，其中n是1-5的整数，且其中，侧链20、22或23位中任一位置上的碳可被O、S或N原子替代。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述口服施用是通过膳食进行的。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述口服施用以每天每千克患者体重0.005-0.2μg的浓度进行。
6.降低糖尿病症状严重程度的方法，其特征在于，所述方法包括向人类糖尿病患者施用有效量的维生素D化合物，这样可减轻糖尿病症状。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述化合物选自1α，25-二羟基维生素D3(1，25-(OH)2D3)、19-降-1，25-二羟基维生素D2(19-降-1，25-(OH)2D3)、24-高-22-去氢-22E-1α，25-二羟基维生素D3(24-高-22-去氢-22E-1，25-(OH)2D3)、1，25-二羟基-24(E)-去氢-24-高-维生素D3(1，25-(OH)2-24-高-D3)、19-降-1，25-二羟基-21-表-维生素D3(19-降-1，25-(OH)2-21-表-D3)、1α羟基维生素D3或1α羟基维生素D2。
8.如权利要求6所述的方法，其中，所述维生素D化合物选自具有以下结构式的维生素D化合物 其中，X1和X2分别选自氢和酰基；其中Y1和Y2可以是H，或者其中之一可以是O-芳基、O-烷基、芳基、1-4个碳原子的烷基，或者这两者可合在一起形成具有以下结构的烯烃 其中，B1和B2可选自H、1-4个碳原子的烷基以及芳基，并且可有β或α构型；Z1＝Z2＝H，或者Z1和Z2一起＝CH2；同时，其中R是烷基、羟烷基或氟代烷基，或者R可代表以下侧链 其中(a)可有S或R构型，R1代表H、羟基/或O-酰基，R2和R3分别选自烷基、羟烷基和氟代烷基，或者它们合在一起表示-(CH2)m-，其中m是2-5的整数，R4选自氢、羟基、氟、O-酰基、烷基、羟烷基和氟代烷基，其中，如果R6是羟基或氟，则R4必须是氢或烷基，R5选自氢、羟基、氟、烷基、羟烷基和氟代烷基，或者R4和R5合在一起表示双键的氧，R6和R7合在一起形成碳-碳双键，R8可以是H或CH3，其中n是1-5的整数，且其中，侧链20、22或23位中任一位置上的碳可被O、S或N原子替代。
9.如权利要求6所述的方法，其中，所述口服施用是通过膳食进行的。
10.如权利要求6所述的方法，其中，所述口服施用以每天每千克患者体重0.005-0.2μg的浓度进行。
全文摘要
揭示了延迟糖尿病发病或降低其在人类患者中的严重程度的方法。在一个实施方案中，本发明包括对人类患者口服施用有效量的维生素D化合物，这样可延迟糖尿病或糖尿病综合症的发生。
文档编号A61K31/593GK1551776SQ01822264
公开日2004年12月1日 申请日期2001年12月27日 优先权日2001年1月25日
发明者H·F·德卢科, L·麦克凯里, J·B·泽勒, H F 德卢科, 丝, 泽勒 申请人:威斯康星校友研究基金会