专利名称：新型金葡菌素制剂及其制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗金色葡萄球菌感染的新型金葡菌素免疫制剂。
背景技术：
在一般的外科范围内，急性化脓性感染之病原菌中，以葡萄球菌感染率为第一位，占检出的总病菌数的88.9％以上，较青霉素、链霉素等抗菌素应用前的1945年上升了约50％。这是由于这些年来，青霉素等抗菌素的大量应用，使许多的结核菌、化脓菌得到控制，但是，由于葡萄球菌能比较快的产生抗药性，使得葡萄球菌有增无减，目前现存的自然的葡萄球菌80-85％是耐药菌株，而从医院取得并分离出来葡萄球菌中95％以上对青霉素、链霉素、四环素以及先锋系列是多重耐药的，使目前的抗炎药物无法控制病情，目前尚缺乏有效的控制药品。及时开发出能够抵抗葡萄球菌感染、并能根据其耐药性及时进行调整、使金葡球菌不能产生抗耐药性的免疫制剂，已经成为世界性的重大课题。
根据这些现状，美国近年批准了一种新的抗菌药物ZYVOX，它是35年来全世界推出的最有意义的新型抗菌药，但是，为了避免病原菌特别是葡萄球菌接触后产生出新的耐药菌株，美国规定，只有对其他抗菌药无效的情况下，经过批准才可以使用。近年来，我国从败血病人的血清中分离并培植了S155金色葡萄球菌，并研制了其无毒的类毒素，但是随着此类抗原的不断变异，需要不断开发新的异变菌种。并且，原有的金葡菌素是注射剂，其中有少量的患者在注射部位有红肿、热痛等不良反应，需要诱导、分离并纯化新的抗菌疫苗。这种剂型如果遇到大范围的感染，注射器械不及时，将难以使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的金色葡萄球菌抗菌疫苗，及其该疫苗的制作方法。
本发明解决上述技术问题的方案是新型金葡菌素制剂，所述的制剂中包括金黄色葡萄球菌staphlococcusaureus cgmcc No.0671的菌体蛋白及其类毒素的生物制剂，其中所述的菌体蛋白(毫克)与类毒素(溶血单位)比例为(0.5-30)∶(5-30)。
上述的新型金葡菌素制剂，所述的制剂是10-20单位/毫升的注射液、喷雾剂或者外用皮肤擦剂。
上述的新型金葡菌素制剂的制作方法，其过程包括，将cgmcc 0671菌株作为进行种子培养和纯化保存于血斜面中培养、将该培养物清洗后破碎制取菌体蛋白、用该培养物在碱性环境下用甲醛解毒制成类毒素，将取得的菌体蛋白和类毒素按比例混合，制成相应的制剂。
本发明与已有的技术相比的有益效果是1.经临床检验，本产品对现有的葡萄球菌的感染的疗效占90％以上，由于本产品是免疫制剂，不会产生耐药性的问题，是国际领先的抗菌消炎新药，在外科感染中，金色葡萄球菌的感染引起的死亡占外科死亡的42％，本产品可以大幅度的降低外科手术的皮肤创面的葡萄球菌感染，降低外科感染率90％以上。本产品的发明将会象当年青霉素、链霉素的发明一样，为人类抵御外科感染提供强而有力的帮助。
2.传统的金葡菌素只能注射给药，一但发生大范围的外伤，如地震、战争等，根本无法实现及时控制疫情，所以国际上都在花大力气研究无创伤给药的疫苗。本产品帅先实现了粘膜或者皮肤给药的方式，无毒副作用，方便有效，可以应付突发性群体外伤的治疗局面。避免注射等有伤给药带来的交叉感染机会。
3.本方法的提纯工艺，大幅度提高产品的纯度，基本消除了已有的产品用药后产生的红肿、发热等问题。
4.本产品可以明显刺激肌体产生金黄色葡萄球菌的抗毒物质，充分利用金黄色葡萄球菌顽强而迅速的抵御外来侵害的能力，并以此抵抗现有的葡萄球菌的毒性，及时有效的刺激肌体产生抗杀白血球素，能有效的中和葡萄球菌感染产生的毒素，保护白血球，增加白血球的数量，增强吞噬功能。
5.疗效广泛，根据不同的病种可不同的病情，可以配制不同配比的疫苗，可治疗主要由金黄色葡萄球菌感染的疾病如外伤感染，外科手术感染，金葡球菌败血病、青草痤疮、臃、疖、骨髓炎、乳腺炎、中耳炎等各种化脓性感染。
6.类毒素的精制工艺使本产品的性能有了显著的提高，由于毒素中包括金黄色葡萄球菌菌体蛋白，在一定的培养条件下，可以产生大量的外毒素及其肠毒素，杀血球毒素，经过本提纯无毒化处理工艺后，获得精制的没有毒性的类毒素。经临床试验证明，该类毒素与菌体蛋白混合后治疗有多重抗药性的金色葡萄球菌的感染，已经取得了明显的疗效，使肌体的免疫功能显著加强。
7.药效高，用量少。采用免疫递增打法使用本产品0.2ml(含金葡菌素1-4单位，菌体蛋白50-150mg)以后每日递增0.1ml，达到0.5ml为一个疗程。经临床检验，无不良反应。
8.经检验，可以认定，本产品的抗原蛋白包括蛋白A(ProteinA)，壁酸(Teichaic acid)、粘多肽、Jonsen抗原A、vewey部分B、细胞壁、表面抗原以及菌体蛋白，在这5种抗原成份中，我们已经准确的确认其中的三种蛋白包括壁酸、Jensen抗原和Vewey部分B的混合物是在肌体内的对人体淋巴细胞产生刺激作用的有效物质，通过本方法得到的本产品中的这些物质的配合比例促使了肌体抗原的形成。
9.经检验，本产品使免疫动物的外围周血中性白细胞不仅数量增加，而且褪噬活性明显增高，并且，单独的传统形成的金黄色葡萄球菌素只产生抗毒素，而使用了本产品的免疫动物同时产生抗两种抗体，增加了抗体的种类和滴度，对于本产品的两种有效成份的及本品分别进行检验的效果见下表下面举例进行说明实施例1新型金葡菌素制剂，所述的制剂中包括金黄色葡萄球菌staphlococcusaureus cgmcc No.0671的菌体蛋白及其类毒素的生物制剂，根据病种及感染的严重程度选配，其中菌体蛋白(毫克)与类毒素(溶血单位)比例为(0.5、1、2、4、7、10、15、20、25、30)∶(5、7、10、15、20、25、30)。
其菌体特性为球菌，直径为0.8-1.0μm，细胞单个，成对和多于一个平面分裂成不规则的堆团，菌落光滑、奶油状，并且有完整的边缘。
菌学特性甘露醇好氧产酸+ 麦芽糖+厌氧产酸+ D-甘露醇 +γ酵素 +凝固醇(兔血浆) +
胞内核酸酶抗热+ 溶血+生长需要生物素- 溶菌酶 -细胞壁核糖醇+甘 油-A蛋白 +对新生素敏感 s其中+为大多数(90％以上)菌株阳性-为大多数(90％以上)菌株阴性s为最低抑制浓度小于0.6μg/ml上述的新型金葡菌素制剂，所述的制剂是10-20单位/毫升的注射液、喷雾剂或者外用皮肤擦剂。
实施例2上述的新型金葡菌素制剂的制作方法，其中与传统的金葡菌素制造过程中不同的部分包括将cgmcc 0671菌株作为进行种子培养和纯化保存于血斜面中培养、将该培养物清洗后破碎在pH4.5时制取菌体蛋白并提纯、用该培养物在碱性环境下用甲醛解毒制成类毒素并提纯，将取得的菌体蛋白和类毒素按上述的比例混合，制成相应的制剂。
实施例3实施例2中所述的新型金葡菌素制剂的制作方法中，所述的种子培养纯化过程包括1.一种可以采用的生产菌体蛋白的培养基蛋白胨1.0％ 氯化钠0.5％ 牛肉汁100毫升 琼脂20％2.制作方法取蛋白胨100克，NaCl 50克，加入牛肉汁中，加热溶化，加牛肉汁至10000ml，煮沸10分钟，用NaOH调至pH7.6，过滤后分装成7份，在15磅灭菌30分钟备用。
菌株活力恢复将cpmcc 0671菌用无菌肉汤从培养基中洗出，在37℃下培养24小时。
取培养物于血平板上划线分离，在37度培养24小时，取溶血环大的菌落，接种到普通肉汤中37℃，培养10-30小时。
将培养物0.5ml注入小白鼠腹腔，濒死时取其心血，作血平板划线分离，在37℃培养20小时，取溶血环较大的血平面，在37℃培养20小时。
3.上述的操作条件是可以放宽的，具体叙述如下将由败血症患者血样中分离的cgmcc 0671菌株用无菌肉汤培养基将其洗入肉汤管中，在36-38℃培养12-24-36小时，用其在血平板上划线分离，在36-38℃培养12-24-36小时，取溶血环较大的单个菌落，接种到肉汤中，在36-38℃培养下10-20-30小时，取肉汤培养物注入到小白鼠体中，至其濒死时取其心血，作血平板划线分离，在36-38℃培养10-20-30小时，取溶血环较大的菌落移入血斜面，在36-38℃培养10-20-30小时。
实施例4实施例2或3中所述的新型金葡菌素制剂的制作方法中，制取菌体蛋白的过程可以是这样的取血斜面培养物-接种环，种于固体的培养液之中，在36或37或38℃培养10-30小时，一般为20小时，洗涤2-5次，取掉异蛋白和外毒素，装入均浆杯，加盐水至满杯，取鲜菌体及玻璃珠加入，放入冰箱预冷到3-7℃比如5℃后。
放入均浆机中以每分钟2000次低速振动，通入CO2气体之后，开到二档，以每分钟4000次振动12分钟，每2分钟停一下，涂片，革氏染色为阴性，检测到破碎率到95％以上停止。
用无菌水从均浆杯中将破碎的菌体洗出，在4℃，以每分钟4000转离心40分钟，离心去沉淀，留上清液。
在10℃以下，边搅拌边滴盐酸等酸类调整pH4.5，需要反复几次，稳定。
在每分钟10000/r冷冻离心20-50分钟，例如40分钟，弃上清，沉淀即为菌体蛋白。
菌体蛋白的精制此时将得到的菌体蛋白经重复沉淀后，得到的免疫性是最强的，具体方法是用强碱调制pH8.5左右，以溶解沉淀，透析60-70-80-90小时，例如72小时，每日换水3-6次，用电风扇等进行蒸发浓缩、将透析袋中菌体用无菌蒸馏水洗出，放入蒸发皿中速冻，然后减压干燥，可以加1％的硫柳贡使成1/5000在4℃冰箱中保存备用。
实施例5
上述的新型金葡菌素制剂的制作方法中所述的类毒素的制取过程可以是这样的1.培养基牛肉浸液取牛肉1000克加水2000ml，在2-8℃浸泡20-24小时，在搅拌下煮费45分钟，加酸到pH4.5，过滤后，补液至2000ml，在120℃灭菌30分钟，在4℃避光保存。
牛肉消化液取牛肉渣500克，加水至2500ml，置于带塞玻璃瓶中，加入碳酸钠1.5克，胰酶10克，氯仿30ml，塞好，置于37℃中消化，开始时2-3小时摇动一次，并用40％NaOH调pH至8.0，消化36小时，用HCI调至pH4.5，加热到80-90℃，过滤，滤液加氯仿至2％，在4℃避光保存。
培养基配方牛肉浸液70ml，牛肉消化液30ml，MgSO4.7H2O 0.03g，KCI 0.02g，K2HPO4.3H2O 0.03g，葡萄糖0.2g，酵母透析液 10ml，10％胱氨酸0.2ml KCI 0.02g。
全部溶解后，调pH为7.6，煮沸过滤，加活性炭0.2g，混均后装培养瓶。每瓶60ml，在115℃灭菌30分钟。
用实施例3培养的菌种制毒素将血平面培养物一白金耳，接种于上述的培养基中，在36-38℃的摇床中在170-200rpm状态下，向室内通入20％CO2，培养10-20-30小时，选未染杂菌溶血效价1024以上的，将培养液在3-10℃(例如4℃)，3000rpm情况下离心30分钟，取上清液类毒素置备将上款得到的上清滤液以NaOH等强碱调至pH8.0，加甲醛至浓度达0.4％，在36-38℃解毒3-7天，至不溶血即完全解毒，得到类毒素。
类毒素的精制取上款类毒素，可以加三氯乙酸至pH4.0，弃上清，于在3-8℃例如4℃，在3000rpm状态下离心20-30分钟，将沉淀用蒸馏水洗涤，再离心，将沉淀溶于原类毒素体积1/15-1/25的pH8.0的磷酸缓冲液中，在3-8℃例如4℃，3000rpm情况下离心20-30-40分钟，取上清液加硫铝汞使浓度在0.001-0.03％，在冰箱中低温保存。
权利要求
1.一种新型金葡菌素制剂，其特征是所述的制剂中包括金黄色葡萄球菌staphlococcus aureus cgmcc No.0671的菌体蛋白及其类毒素的生物制剂，其中菌体蛋白(毫克)与类毒素(溶血单位)比例为(0.5-30)∶(5-30)。
2.根据权利要求1所述的新型金葡菌素制剂，其特征是所述的制剂是10-20单位/毫升的注射液、喷雾剂或者外用皮肤擦剂。
3.一种权利要求1或2所述的新型金葡菌素制剂的制作方法，其特征是将saureus 0671菌株作为进行种子培养和纯化保存于血斜面中培养、将该培养物清洗后破碎制取菌体蛋白、用菌体液在碱性环境下用甲醛解毒制成类毒素，将取得的菌体蛋白和类毒素按比例混合，制成相应的制剂。
4.根据权利要求3所述的新型金葡菌素制剂的制作方法，其特征是所述的种子培养纯化过程包括将由败血症患者血样中分离的saureus 155菌株用无菌肉汤培养基将其洗入肉汤管中，在36-38℃培养12-24-36小时，用其在血平板上划线分离，在36-38℃培养12-24-36小时，取溶血环较大的单个菌落，接种到肉汤中，在36-38℃温度下培养10-20-30小时，取肉汤培养物注入到小白鼠体中，至其频死时取其心血，作血平板划线分离，在36-38℃培养10-20-30小时，取溶血环较大的菌落移入血斜面，在36-38℃培养10-20-30小时。
5.根据权利要求3或4所述的新型金葡菌素制剂的制作方法，其特征是所述的制取菌体蛋白的过程包括取血斜面培养物-接种环，种于含100ml肉汤容器中，在在36-38℃培养10-20-30小时，低温洗涤2-5次，离心去掉异蛋白和外毒素，取鲜菌体及玻璃珠取共同装入均浆杯，预冷至3-7℃，放入均浆机进行均浆破碎，当破碎率到95％以上，用无菌水从均浆杯中将破碎的菌体洗出，离心去沉淀，用盐酸等酸类调整pH4.5稳定，离心20-30-50分钟，沉淀即为菌体蛋白，为增强免疫性能，可以用强碱调制pH8.5左右，以溶解沉淀，透析60-70-80-90小时，每日换水3-6次，浓缩、冻干。
6.根据权利要求5所述的新型金葡菌素制剂的制作方法，其特征是所述的类毒素的制取过程包括将血平面培养物接中于液体培养基中，在36-38℃的摇床中培养10-20-30小时，将培养液在3-10℃离心20-40分钟，取滤液以强碱调至pH8.0，加甲醛至浓度达0.1-0.6％，在36-38℃解毒3-7天，至不溶血即得到类毒素，加三氯乙酸至pH3-5，在3-8℃离心20-30分钟，将沉淀洗涤，再离心，将沉淀溶于原类毒素体积1/10-1/25的pH6.5-8.5的磷酸缓冲液中，在3-8℃离心20-30-40分钟，取上清液加硫柳汞使浓度在0.001-0.03％，以保存备用。
7.根据权利要求3或4所述的新型金葡菌素制剂的制作方法，其特征是所述的类毒素的制取过程包括将血平面培养物接中于培养基中，在36-38℃的摇床中培养10-20-30小时，将培养液在3-10℃离心30分钟，取滤液以强碱调至pH8.0，加甲醛至浓度达0.4％，在36-38℃解毒3-7天，至不溶血即得到类毒素，此后，可以加三氯乙酸至pH3-5，在3-8℃离心20-30分钟，将沉淀洗涤，再离心，将沉淀溶于原类毒素体积1/20的pH8.0的磷酸缓冲液中，在3-8℃离心20-30-40分钟，取上清液加硫柳汞使浓度在0.001-0.03％，以保存备用。
全文摘要
新型金葡菌素制剂及其制作方法，一种治疗金色葡萄球菌感染的新型金葡菌素免疫制剂。外科急性化脓性感染之病原菌中，以葡萄球菌感染率为第一位，占检出的总病菌数的88.9％以上，由于葡萄球菌能比较快的产生抗药性，使得葡萄球菌有增无减，目前现存的自然的葡萄球菌80－85％是耐药菌株。没有有效的药品可以控制病情。本制剂中包括金黄色葡萄球菌staphlococcus aureus cgmccNo.0671的菌体蛋白及其类毒素的生物制剂，其中菌体蛋白(毫克)与类毒素(溶血单位)比例为(0.5－30)∶(5－30)，该制剂可以是注射液也可以是喷雾剂或者外用皮肤擦剂。用于治疗外伤感染，外科手术感染，金葡球菌败血病、青春痤疮、臃、疖、骨髓炎、乳腺炎、中耳炎等各种化脓性感染。
文档编号A61P31/04GK1451437SQ0210951
公开日2003年10月29日 申请日期2002年4月18日 优先权日2002年4月18日
发明者孙建华, 沙长青, 曲月英, 夏海华, 曲晓军, 李新玉 申请人:黑龙江省科学院应用微生物研究所