专利名称：东亚钳蝎毒素BmK AS在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体的说，本发明涉及了一种天然活性多肽——东亚钳蝎毒素BmK AS(以下简称BmK AS)在制药领域中的用途。
炎症通常和组织或神经损伤有关，并常伴有红、肿、热、痛和初级痛觉过敏等现象。在损伤部位反应阈值的降低或对阈下刺激的反应加剧都被认为是初级的痛觉过敏。同时，初级痛觉过敏可导致初级伤害性感受器在炎症部位易被机械和温度刺激激活，初级传入神经纤维的活动增强，从而在大脑皮层产生痛觉。炎症过程中机体不断释放，生成的炎症因子趋向于炎症部位，从而使炎症组织得以修复。
蝎属于节肢动物门蛛型纲蝎目。共包括约800种蝎，下分6科，其中钳蝎科约占40％。已报道的对人有危害的，即具有医学意义的几乎都属于钳蝎科。在我国分布约15种蝎，尚无蛰伤致死的病例，它们给人的危害是强烈的局部疼痛。分布最广的东亚钳蝎，主要分布在河南，山东和辽宁一带。
蝎蛰伤症状可分为全身和局部两种。局部症状主要是疼痛，全身症状以神经症状为主，表现为焦虑、多涎、呕吐、呼吸困难、肌肉紧张、抽筋和痉挛到惊厥，严重者可导致休克乃至死亡。从半致死剂量看，东亚钳蝎的毒性较弱，比毒性强的蝎毒约低了一个数量级，但是被蜇之后仍会有剧烈的疼痛。蝎毒中含有多种生物活性成分，其中神经毒蛋白是蝎毒中引起死亡和麻痹效应的主要活性物质。由于这些蝎神经毒素选择性地作用于神经元膜上离子通道，因此关于蝎神经毒素以及应用该毒素的研究引起了神经生物学者的普遍关注。直到今天，蝎子仍被作为一种传统中药根据‘以毒攻毒’的理论治疗中风或半瘫痪等神经疾病。
BmK AS是一种β类型长链蝎神经毒素(Ji YH，Xu K，Kawano S，etal(1997)A new scorpion polypeptide enhance the binding of radiolabeled-ryanodine on rayanodine-receptor on sarcoplasmic reticulum of rabbit skeletal-muscle.Chin Sci Bull 2147-150)；(Ji YH，Li YJ，Zhang JW，et al(1999)Covalentstructure of BmK AS and BmK AS-1，two novel bioactive polypeptides，purifiedfrom chinese Buthus martensi Karsch.Toxicon 37519-536)，是一个由66个氨基酸残基组成的新型活性多肽。以往的实验结果表明，BmK AS可以通过改变钠通道的通透性诱导大鼠海马脑薄片上去甲肾上腺素的释放，可以间接刺激兔骨骼肌上ryanodine受体和ryanodine结合，并不可逆地部分阻断NG108-15细胞上Na+电流(Ji YH，Xu K，Kawano S，et al(1997)A new scorpionpolypeptide enhance the binding of radiolabeled-ryanodine on rayanodine-receptor on sarcoplasmic reticulum of rabbit skeletal-muscle.Chin Sci Bull 2147-150)。此外，BmK AS-1(Ji YH，Li YJ，Zhang JW，et al(1999)Covalent structure ofBmK AS and BmK AS-1，two novel bioactive polypeptides，purified from chineseButhus martensi Karsch.Toxicon 37519-536)和BmK AS一级序列同源性非常高，达86％，并被认为生理特性比较相似，具有和BmK AS类似的外周镇痛作用，足底注射可以降低大鼠足底辐射热缩腿潜伏期，鞘内施加BmK AS-1能够强烈抑制大鼠后肢半膜半腱肌曲肌反射肌电C反应，BmK AS-1可以显著性地抑制大鼠小直径背根节神经元胞体的TTX-S和TTX-R两类钠电流，但对TTX-R钠电流的抑制作用显著的高。
背根节神经元是初级感觉传入神经元，介导各种躯体感觉换能后的电信号传入脊髓后角相关区域。其中，小直径DRG神经元被认为与伤害性初级感觉传入密切相关。电压门控钠通道被认为是电信号产生和传播的重要基础。因此，小直径DRG神经元上的电压门控钠通道与伤害性感觉的产生和初级传入密切相关。BmK AS对大鼠背根神经节远端游离神经末梢上TTX-R型钠通道抑制作用强于对TTX-S型钠通道的作用，为BmK AS对角叉菜胶致炎大鼠足底辐射热缩腿潜伏期降低的抑制作用显著性地强于它对正常大鼠反应的调制作用提供了理论依据。
本发明在外周足底皮下注射东亚钳蝎β-型哺乳动物选择性神经毒素BmK AS，能够降低正常和角叉菜胶致炎大鼠对足底辐射热足收缩延迟的阈值，表现出抗伤害性和抗痛觉过敏现象；这些结果提示，类β型抗哺乳动物神经毒素，在外周小剂量施加时具有抗伤害性和抗痛觉过敏效应。
本发明的另一目的是提供东亚钳蝎毒素BmK AS在制备抗痛觉过敏药中的应用。
本发明的活性多肽——β型长链蝎神经毒素BmK AS可以通过分子凝胶过滤、离子交换层析和高效液相色谱等方法，从东亚钳蝎粗毒中分离提纯(Ji YH，Li YJ，Zhang JW，et al(1999)Covalent structure of BmK AS and BmK AS-l，two novel bioactive polypeptides，purified from chinese Buthus martensi Karsch.Toxicon 37519-536)。
我们发现，BmK AS通过调节位于外周DRG神经元游离末梢的TTX-S和TTX-R钠通道的电压门控机制，使得伤害性传入末梢处电信号的产生和传播受到抑制，从而在行为学上表现出对大鼠外周伤害性传入的抑制作用。
本发明观察了大鼠足底注射BmK AS——类β型长链蝎毒素后产生的生理效应。小剂量的BmK AS不仅不引起大鼠的伤害性和炎症反应，并有外周镇痛作用。于是我们进一步考察了BmK AS对正常大鼠的抗伤害性反应和对角叉菜胶炎症模型的大鼠痛觉过敏的调制作用。我们发现BmK AS很容易作用于伤害性感受器，可以运用于制备抗外周伤害药物和抗痛觉过敏药物中。
图2显示了BmK AS对正常大鼠的抗伤害性作用。
图3为BmK AS的抗伤害性反应及抗痛觉过敏的剂量—反应曲线。
实施例1 BmK AS对炎症大鼠热痛觉过敏的调制作用首先，选用240±10克的成年雄性SD品系大鼠(上海实验动物中心，中国)。每笼5只动物，充足的水和食物供应，自由取食。室温保持21-23℃，12小时昼夜循环。每次只测试一只大鼠，并且每只大鼠只用一次。
根据Hargreaves(Hargreaves，K.M.，Dubner，R.，Brown，F.，Flores，C.，Joris，J.(1988a).A new and sensitive method for measuring thermal nociception incutaneous hyperalgesia.Pain 32，77-88。)等的方法，动物的热痛觉过敏是通过测定其对辐射热的缩腿反应时间得出的。室温条件下(25℃)，实验在透明塑料盒子中进行(底板是玻璃的)。实验前大鼠被预适应30分钟。大鼠的后足足底接受辐射光束(RTY-1型热痛测试仪，第四军医大学生理教研室，西安，中国)的照射，直至其抬足。间隔5分钟分别测试动物的两只后足。缩腿潜伏期(PWL)精确到0.1秒。为了避免辐射热对动物的损伤，事先剔除了PWL＞20.0秒和PWL＜3.0秒的热迟钝或热过敏动物。
在诱导大鼠的单侧后足炎症模型前，先测定了大鼠对辐射热的缩腿潜伏期的基线。大鼠被乙醚麻醉后足底皮下注射2毫克角叉菜胶(Carrageenantyep 1，Sigma，C-1013溶于0.1毫升生理盐水)，大鼠在1-2分钟内清醒。这个模型是通过在大鼠后肢跖部皮下注射角叉菜胶造成局部炎症，从而引起伤害性反应。局部炎症引起痛觉过敏，可以为热刺激炎症区来检测。这个模型操作简单，并以对侧肢体的反应作为对照，因此被广泛使用于疼痛研究中。注射角叉菜胶后，大鼠的被注射足可以观察到明显的红肿现象，并可持续4小时以上，且对热刺激的缩腿潜伏期显著减小，另一侧足没有或极少出现此类现象。这表明大鼠出现了局部的皮肤痛觉过敏。角叉菜胶引起的作用主要局限在注射侧后足，大鼠对辐射热的缩腿潜伏期从基线的10.7±0.3秒降低到3.2±0.2秒，另一侧后足没有类似现象，其对辐射热的缩腿潜伏期仍维持在10.5±0.7秒。
3小时后，在三组角叉菜胶诱导的炎症大鼠足底皮下注射10微升BmKAS(溶于生理盐水)，浓度分别为0.001，0.01和0.1毫克/毫升。对照组的炎症大鼠注射等量生理盐水。注射10微升BmK AS后大鼠对辐射热的缩腿潜伏期在5分钟内迅速上升，15-20分钟时达到峰值，然后逐渐降低，40分钟左右恢复正常。对照组大鼠炎症后足足底注射等量生理盐水不能增加缩腿反射时间。注射BmK AS后20min时，大鼠炎症足对辐射热的缩腿潜伏期和对照组相比分别提高了150±28％，203±34％和250±17％，表明BmK AS对角叉菜胶引起的炎症有剂量依赖性的抑制作用，并且仅局限于被注射侧的后足，不影响对侧足对辐射热的缩腿潜伏期。
实施例2 BmK AS对正常大鼠的外周抗伤害性作用另三组正常的大鼠被用来观察BmK AS的抗伤害性效应，每组大鼠足底皮下注射10微升BmK AS，剂量分别是0.001，0.01和0.1毫克/毫升，对照组大鼠注射等量生理盐水。取没有加BmK AS的对照组大鼠最大反应值的时间点(注射蝎毒后20分钟时)观察药效。对正常大鼠注射BmK AS后，注射侧后足对辐射热的缩腿潜伏期由基线的10.7±0.3秒迅速上升，在15-20分钟时达到峰值，然后逐步下降。在20分钟时，大鼠注射BmK AS的热缩腿潜伏期分别增加了126±4％，132±4％和140±6％。对侧后足则没有明显变化。对照组的15只大鼠注射了等量生理盐水，对其缩腿潜伏期无明显作用。
实施例3 BmK AS的抗伤害性反应及抗痛觉过敏的剂量-反应曲线在正常大鼠和角叉菜胶诱导的炎症大鼠足底皮下分别注射10微升浓度分别为0.001，0.01和0.1毫克/毫升的BmK AS。
从上述实施例可知，小剂量的BmK AS不仅不引起大鼠的伤害性和炎症反应，并有外周镇痛作用。并且，BmK AS对正常大鼠的抗伤害性反应和对角叉菜胶炎症模型的大鼠痛觉过敏有调制作用。BmK AS很容易作用于伤害性感受器，可以运用于制备抗外周伤害药物和抗痛觉过敏药物中。
权利要求
1.东亚钳蝎毒素BmK AS在制备抗外周伤害药中的应用。
2.东亚钳蝎毒素BmK AS在制备抗痛觉过敏药中的应用。
全文摘要
本发明涉及东亚钳蝎毒素BmK AS制药领域中的用途。具体的说，东亚钳蝎毒素BmK AS在制备抗外周伤害药中的应用，以及东亚钳蝎毒素BmK AS在制备抗痛觉过敏药中的应用。
文档编号A61P37/00GK1390603SQ0211222
公开日2003年1月15日 申请日期2002年6月25日 优先权日2002年6月25日
发明者吉永华, 陈冰 申请人:吉永华