专利名称：应用差示文库制备肿瘤疫苗及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术发明领域，是针对癌症和感染性疾病的细胞治疗。具体涉及利用自体树突状细胞进行呈递疾病组织(包括肿瘤和感染性疾病)的特异性抗原所构成的抗原库(此抗原库即为本发明所指的差示文库)，利用此抗原库以诱导机体或自体T细胞的针对这些差异抗原的细胞免疫反应，从而达到治疗疾病的目的，其中包括治疗肿瘤类疾病的目的，发明涉及疾病组织(包括肿瘤和感染性疾病)的特异性抗原差示文库的构建及其治疗的实施过程和用途。
本发明的技术背景本发明主要涉及利用自体树突状细胞呈递疾病组织特异的抗原，诱导机体或自体T细胞的针对这些差异抗原的细胞免疫反应，从而达到治疗疾病的目的。
对于肿瘤，传统的化疗、放疗、手术等治疗方法的疗效并不理想。近年来应用转导了抗原的树突状细胞刺激抗原特异的杀伤T淋巴细胞(CTL)取得了一定的疗效，另外，对于某些难治性胞内病原体的感染，如病毒、胞内菌等的感染也可以应用这种方法治疗。在正常的情况下，机体的抗原呈递细胞可以识别由于恶变或感染而使表型发生变化的细胞，并将其表达的特异抗原在胞内降解为抗原表位，由MHC分子将这些抗原表位呈递至细胞表面，从而被能与这种抗原分子结合的T细胞受体识别，识别后的T细胞克隆就会大量扩增，成为特异性的杀伤表达该抗原的细胞的CTL(cytotoxic lymphocyte)，从而清除病变组织。然而由于肿瘤和病原体经常存在某些机制，从而抑制机体的这种免疫反应，使得病变发展。随着体外大量培养树突状细胞这种专职抗原呈递细胞技术的出现，使得体外致敏抗原呈递细胞，激发并扩大针对特异抗原的免疫反应的治疗方法成为可能。
目前这种治疗方法依其致敏抗原的不同可分为两类其一、克隆肿瘤特异抗原，体外将其转导自体树突状细胞，树突状细胞作为一种抗原呈递细胞可以将这种肿瘤特异抗原呈递给T淋巴细胞，诱导肿瘤特异的T淋巴细胞的增殖、活化，产生针对该肿瘤特异抗原的CTL，从而特异性的杀伤肿瘤细胞，此方法在动物实验和一些临床试验中取得了一定的疗效。但遗憾的是，目前发现的肿瘤抗原种类很少，而且在肿瘤中的阳性率也不高，限制了其应用范围。其二、可以将肿瘤细胞与树突状细胞在体外融合或将肿瘤组织的总mRNA转导致肿瘤细胞中，也就是说通过树突状细胞将整个肿瘤抗原库呈递给T淋巴细胞，这样可以免去克隆筛选肿瘤抗原的繁琐，而且动物实验和临床试验也证实其确有一定疗效。但这种方法却带来了一些新的问题首先，在肿瘤总抗原中，绝大多数是正常组织也具有的，只有极少数是肿瘤特异的，而树突状细胞不能识别，将其一并呈递给T淋巴细胞，这样就大大浪费了树突状细胞的呈递资源，降低了呈递效率；其次，虽然理论上讲，针对自身抗原的T淋巴细胞在出生前后就经胸腺的阴性选择去除了，因此不会产生针对自身抗原的自身免疫反应，但很难排除这种情况会在某些敏感个体发生，导致自身免疫性疾病。
本发明的内容本发明的内容是将肿瘤组织与正常组织的差示文库转导抗原呈递细胞，主要是树突状细胞，诱导针对多个肿瘤特异抗原的CTL，从而治疗肿瘤的方法，类似的方法也可以用于难治性胞内病原体感染。应用差示文库来致敏抗原呈递细胞，虽然操作步骤增加了，但可以有效提高抗原呈递细胞的呈递效率，最大限度避免针对自身抗原的产生，又几乎可以应用于所有肿瘤患者，而不受有限肿瘤抗原的限制。
文库一般是由病变组织和周围正常组织比较得来，对于难以获得病变组织或正常组织的情况下，也可以应用有代表性的细胞株(或感染细胞株)来替代，例如恶性胶质细胞瘤的细胞株。
在本发明的例子中采用将病变组织与正常组织的cDNA文库杂交后，用链亲和素标记的磁珠去除正常组织中含有的基因，从而得到差示文库的方法(具体见实施例1)，也可以应用差异显示PCR法，消减杂交法及它们的改良方法。
差示文库可以直接克隆在真核表达载体内，导入抗原呈递细胞，导入的方法可以采用脂质体、阳离子聚合物等非病毒载体，也可将差示文库克隆至病毒载体中，如腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等，在各种载体中均可加入引导分子(如甘露糖等)以增加转染效率。另外，还可以将差示文库载体外转录合成RNA转染树突状细胞，或翻译成肽链刺激树突状细胞。
一般而言，用于刺激产生CTL的抗原呈递细胞常采用专职抗原呈递细胞，如树突状细胞，此外也可应用巨噬细胞、上皮细胞及人造抗原呈递细胞(如导入MHC和共刺激信号的细胞)等。
转导差示文库的树突状细胞可直接注入体内(包括静脉和皮下注射等途径)，也可在体外刺激肿瘤特异的CTL的增殖、活化，再将生成的CTL回输体内来攻击肿瘤细胞，类似的方法也可用于治疗胞内病原体的感染。
本发明的关键是采用表达的差示文库致敏抗原呈递细胞，差示文库的来源是病变组织和正常组织的表达的mRNA的差异，在不能得到病变组织或正常对照组织时，可用表型最为相近的细胞株来代替，或用病原体感染的细胞株来代替感染组织，提取两种组织的总RNA或mRNA，体外反转录成cDNA后，通过PCR扩增后，在利用杂交等方法去除正常组织的基因，即可得到差示文库。产生可表达的差示文库的方法有很多种，经典的方法有差异显示PCR法，消减杂交法及改良后的抑制性消减杂交法。这些构建差示文库的方法一般用于寻找差异表达的基因，如肿瘤抗原基因，一般要求这些方法1)敏感性高，对于一些低丰度的基因也能检测到；2)特异性强，避免过多的假阳性；3)文库中3’非编码区克隆的数量低；4)操作简单，所需mRNA的量少；5)得到的文库能够保持原来的开放读码框架(ORF)，最好是全长cDNA文库。遗憾的是，目前还没有一种方法能同时满足以上这些要求。所幸应用于致敏抗原呈递细胞的差示文库并不需要达到很高的质量要求，只要能得到数个肿瘤特异基因的克隆，而且绝大部分正常基因能被取除掉，就可以满足要求，当然，文库的质量越高，治疗的效果会越理想。在下文所介绍的例子中采用的文库构建方法是，首先采用SMART技术得到病变组织的全长cDNA库，再与掺入了生物素的对照组织的cDNA杂交，用带有链亲和素的磁珠去除被杂交的cDNA，剩余的就是肿瘤特异的全长cDNA，(Zhao Z，Huang X，et al.J Biotechnol 73(1)35-41)，将这些全长cDNA克隆在表达载体中，获得肿瘤差异抗原基因表达文库。
在应用抗原呈递细胞体外致敏治疗肿瘤和感染性疾病的过程中，抗原呈递细胞的转染效率低一直是影响这种方法的治疗效果的关键因素。蛋白质、肽链和抗原表位可以直接致敏抗原呈递细胞，但由于蛋白成分与抗原呈递细胞的结合时间很短，缩短了其刺激CTL的时间，降低治疗效果，同时蛋白质和肽链不能进入细胞，从而无法在细胞内分解成为可被T细胞受体识别的抗原表位，而使其刺激效果降低。RNA和抗原基因可以由载体携带进入细胞内并表达一段时间，不断表达出的蛋白质可以在细胞内降解为抗原表位，被MHC分子呈递至细胞表面，而进一步被T细胞受体识别，这种方法可以延长抗原呈递细胞刺激CTL的时间，也更符合生理情况。在各种转基因载体中，腺病毒的转染效率最高，可以达到90％左右(Dietz AB，Blood 91(2)392-8)，其缺点是腺病毒载体的外壳有一定的细胞毒性，在感染滴度过高时会导致抗原呈递细胞的死亡，更重要的是，腺病毒载体的外壳本身具有很强的抗原性，可以被抗原呈递细胞呈递，导致其刺激的CTL中的大部分是针对腺病毒载体的，而非针对病变抗原。腺相关病毒载体的转染效率，在病毒滴度较高，纯度较好时，可达50～60％，而且，重组腺相关病毒载体的抗原性很弱，在直接注入体内时也不会产生针对其的特异性CTL(Chiriva-Internati M，Liu Y，et al.Eur J Immunol 32(1)30-8)，其主要的缺点是该载体用常规制备方法制备时的包装效率和产量均低，不易得到高滴度和高纯度的重组腺相关病毒载体。鼠逆转录病毒对于分裂并不旺盛的抗原呈递细胞的感染效率很低，而慢病毒的感染效率虽有应用价值，但由于其来源于HIV，安全性方面的顾虑使其难以在近期应用于临床。非病毒载体，如；脂质体、聚乙烯亚胺、多聚左旋赖氨酸、壳聚糖等，可以转染质粒和RNA，操作简单，效率在10～20％之间，可以诱导明确的抗原特异性CTL，另外如电转法、基因枪等方法的转染效率比前者略高，但需要特殊的设备，而且转染条件的细微变化对转染效率影响很大，使转染效率不稳定。在下文的实施例中采用的方法是将差异cDNA文库克隆于重组腺相关病毒载体的构建质粒pSNAV-Sfi I中，该质粒同时是一种真核表达载体质粒，这样既可直接采用非病毒载体导入抗原呈递细胞中进行表达，也可以在病毒包装细胞中包装成腺相关病毒载体，转染抗原呈递细胞，增加转染效率。
抗原呈递细胞有多种，一般采用专职抗原呈递细胞----树突状细胞，它不仅呈递效率高，而且可以刺激原始T细胞(naive T cell)的活化、增殖，启动特异性免疫反应，应用十分广泛。体外大量培养树突状细胞的方法主要有二种，其一来源于外周血单核细胞(PBMC)，具体是将分离得到的PBMC在体外附壁培养3小时后，洗去不能附壁的淋巴细胞，余下的即为树突状细胞，在有GM-CSF、IL-4等细胞因子的培养条件下，5～8天逐渐成熟，期间给予抗原致敏，成为成熟的树突状细胞。其二来源于骨髓CD34+细胞，在GM-CSF、TNF-a、SCF等细胞因子的培养条件下，诱导分化成成熟的树突状细胞。这两种方法得到的成熟树突状细胞均可用MHC、CD83等表面分子来鉴定。另外也可用人工构建的方法得到人造抗原呈递细胞，例如人工导入MHC分子和共刺激分子等方法。
应用上述方法得到的致敏的抗原呈递细胞可用于治疗和预防肿瘤和感染性疾病，在疾病发生前、进行中、及好转后均可使用，并不干扰原有的治疗方案，可以与传统的手术、化疗、放疗协同作用，但不建议与明显的免疫抑制剂合用。抗原呈递细胞可来源于患者自体或配型相符的供体。致敏的抗原呈递细胞可以直接注入体内(包括，静脉注射、淋巴管内注射、皮下注射等)，引起机体的CTL反应，输入的剂量依患者的体重、免疫状态和病变程度而变化，推荐的剂量为105～108/kg，但并不限于此。另外也可以在体外刺激T淋巴细胞，然后回输扩增活化的CTL，T淋巴细胞可来源于患者自体或配型相符的供者。在刺激CTL的过程中，可应用丝裂原、IL-2、IL-12、OKT3(抗CD3抗体)、抗CD21抗体、GM-CSF、灭活的PBMC、EB病毒感染的纤维细胞等刺激特异的CTL的增殖，扩大回输体内的CTL的数量，以增加治疗效果。回输的CTL的剂量依患者的体重、免疫状态和病变程度而定，推荐的剂量为109～1010/kg，但并不限于此。
致敏的树突状细胞的刺激活性可以通过体外刺激T淋巴细胞的增殖效率来测定，可以使用3H掺入法来测算T淋巴细胞的增殖率。致敏的树突状细胞刺激的CTL的杀伤效率可以通过与靶细胞共孵育的方法来检测其杀伤靶细胞的效来确定，靶细胞的死亡率可以通过51Cr测定来计算杀伤率。
综上所述，本发明的核心是采用表达的差示文库致敏抗原呈递细胞，其中，表达的差示文库可以是肿瘤组织的特异性抗原差示文库也可以是感染性疾病组织的特异性抗原差示文库。被表达的差示文库致敏了的抗原呈递细胞是通过诱导产生针对多个肿瘤特异抗原的CTL，达到治疗肿瘤的目的。当然，被表达的差示文库致敏了的抗原呈递细胞也可以是通过诱导产生针对多个胞内病原体特异抗原的CTL，达到治疗感染性疾病的目的。即转导差示文库的抗原呈递细胞可在体外刺激肿瘤特异的CTL的增殖、活化，再将生成的CTL回输体内来攻击肿瘤细胞，也可以转导差示文库的抗原呈递细胞可在体外刺激胞内病原体特异的CTL的增殖、活化，再将生成的CTL回输体内来治疗胞内病原体的感染。因此，肿瘤组织的抗原差示文库可做为肿瘤疫苗。肿瘤组织的抗原差示文库可用于治疗肿瘤类疾病。感染性疾病组织的抗原差示文库可做为感染性疾病疫苗。感染性疾病组织的抗原差示文库可用于治疗感染性疾病。在表达的差示文库的构建过程中，表达的差示文库的意思是指将疾病组织的特异性抗原差示文库插入真核表达载体质粒pSNAV-Sfi-I的Sfi-I克隆位点，成为pSNAV-Sfi-I/cDNA抗原差示文库。另外，表达的差示文库可以插入到除pSNAV-Sfi-I以外的其它真核表达载体质粒中。转导差示文库的抗原呈递细胞可直接注入体内，包括静脉注射途径和皮下注射等途径。
实施例以下实施例对本发明的实施的过程、方法和应用作了详细说明，但不意味着限制本发明的内容。
实施例1肿瘤树突状细胞疫苗的制备1.肿瘤组织和癌旁正常组织(对照组织)的RNA的获得手术获得的肿瘤组织及瘤旁正常组织立即置于液氮中，尽早制备匀浆，按照RNA操作的注意事项和总RNA或polyA mRNA提取试剂盒的说明书提供的方法提取总RNA或polyA mRNA，-70℃保存，避免反复冻融。
2.获得肿瘤组织和对照组织的cDNA。
对照以Oligo-dT(15-18)为引物将癌旁正常组织的mRNA反转录成cDNA总RNA(1～2ug)与Oligo-dT(10uM)2ul混合后，补水(无RNase水)至5ul，72℃，2min，冰浴2min，依次加入5×RT Buffer 4ul，dNTP(10mM)2ul，AMV反转录酶1～2ul，补水(无RNase水)至20ul，42℃，60min。然后用PCR的方法掺入生物素，反应混合物1ul反转录产物，20uM biotin-21-dUTP，200uM dNTP，2ulOligo-dT，定容至50ul，反应条件是95℃ 20sec，40℃ 5min，72℃ 3min，40个循环。
肿瘤组织采用SMART cDNA合成试剂盒反转录得到肿瘤组织的全部全长cDNA，其中两条引物的序列分别为下游引物为5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3’上游引物为5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3’两条引物的序列中均带有Sfi I酶切位点，反转录反应条件与对照组织的cDNA的获得相同，体系为10ul。
3.消减杂交和PCR扩增取5ul肿瘤组织的反转录产物，加入10ul对照组织的PCR产物中，98℃退火5min，在0.5％SDS和6×SSC杂交液中，65℃杂交12小时，取20ul杂交产物通过S-400层析柱，去除盐和小分子物质，将过滤后的杂交产物加入0.2ml包被有链亲和素的磁珠(NEB)，室温孵育2min，65℃孵育5min，12000转离心取上清40ul为模板进行PCR扩增，所用引物与上述肿瘤组织反转录cDNA所用引物相同，扩增体系50ul，条件为95℃ 15sec，68℃ 5min，15-25个循环。以上所述为两种组织的cDNA杂交消减、PCR扩增的过程。
再次取上述PCR产物40ul，与10ul对照PCR产物混合，同上述步骤再次进行杂交，消减，PCR，如此反复3-4次，总PCR循环数不超过60。
4.构建可表达的差示文库将得到的最终消减扩增产物150ul，纯化后，用Sfi I酶50℃酶切2小时，与同样经Sfi I酶切的真核表达载体质粒pSNAV-Sfi I连接，转化，铺板后扩增，得到肿瘤差异cDNA表达质粒文库pSNAV-Sfi I/cDNA。该文库的载体为重组腺相关病毒载体的构建质粒pSNAV-1经在多克隆位点插入Sfi I酶切位点改构而成，其图谱见说明书附图中图1所示，在真核表达框的两端有腺相关病毒载体的末端反向重复序列(ITR)，在真核表达框的多克隆位点处为填充序列相隔的两个Sfi I酶切位点，可以定向插入cDNA。图1中所示为插入差示文库的质粒载体pSNAV-Sfi-I的图谱，其中多克隆位点中含有Sfi I(A)和Sfi I(B)位点，中间为250bp的填充序列。
5.检测提取肿瘤差异cDNA表达文库的质粒，以260nm和280nm吸光度来检测所提取的文库质粒的浓度和纯度。用于检测的文库质粒的浓度和纯度应较高。
PCR以GAPDH基因特异序列为引物，以文库为模板扩增，如为阴性，说明绝大多数正常基因已被去除，文库中主要为肿瘤特异的基因克隆。
更为精确的检测方法可采用斑点杂交法(适用于差示文库)体外反转录肿瘤组织和对照组织的cDNA探针，同时掺入生物素，分别与尼龙膜上的不同量的文库质粒的斑点进行杂交，以链亲和素-HRP与底物反应来显色，如果对照探针的结果为阴性，实验探针的结果为阳性，则说明文库中致含有肿瘤特异的基因，而不含有正常组织的基因。
最精确的方法是将文库中的基因克隆逐个或随机选取多个进行测序，并与Genbank中公布的序列比较，对于不能明确为肿瘤基因的克隆，或新序列，可以通过Northern的方法来验证该基因是否为实验肿瘤组织的特有基因，而非其临近正常组织的基因。
6.树突状细胞的培养和成熟取患者外周血，以肝素或EDTA抗凝后，缓慢加入装有淋巴细胞分离液的离心管中，形成分层(分离液∶血液＝1∶2或2∶3)，2000转离心，20分钟，弃去上清，吸取中间的白色细胞层，以5倍体积的PBS或Hank’s液清洗细胞1000转/10分钟×3次，弃上清。以含有10％FCS的RPMI1640重悬细胞，稀释至2×106个细胞/ml，加入六孔板中，每孔3ml，37℃孵育3小时。
吸取非贴壁细胞，加入10％DMSO冻存备用，以培养基洗涤一次贴壁的细胞，加入含15％FCS的RPMI1640(含青链霉素)培养，并在培养基中加入GM-CSF800u/ml，IL-4 500u/ml。培养第4天换液，第7天，树突状细胞浮起，收集细胞。
DC免疫表性的检测取少量树突状细胞为样本进行检测，以PBS洗涤后，重悬至106个细胞/ml，以100ul/管，加入FCM专用管，再分别加入标记液(PBS+1％BSA+0.02％叠氮钠)稀释的鼠抗人一抗(CD14，40，54，83，86，HLA-DR)，单标浓度为5ug/ml，4℃标记30min。PBS洗涤一次，一抗不带有荧光的再加入PE或FITC标记的二抗，避光4℃标记30min。PBS洗两次，然后通过流式细胞仪检测，得到各表型的百分比。树突状细胞表面分子阳性细胞的数量应占总细胞数的90％左右。成熟的树突状细胞可直接致敏，也可冻存，待需要时复苏。
7.脂质体介导差示文库转染树突状细胞成熟的树突状细胞重悬于Opti-MEM培养液中，浓度为2-5×106个细胞/ml。以250～750ul的Opti-MEM培养液分别稀释文库质粒(用量为1～5ug/106树突状细胞)和脂质体(用量为5～20ulDOTMADOPE/106树突状细胞)，将两者等体积混合后，室温反应20～45min，将此混合物加入树突状细胞中，37℃孵育2～6小时，然后加入含15％血清的培养液，37℃孵育，24小时后，清洗细胞，作为致敏的抗原呈递细胞。此致敏抗原呈递细胞可直接用于体外刺激CTL、活性测定，或体内应用，也可冻存待用。
8.树突状细胞刺激CTL的活性及检测复苏冻存的自体淋巴细胞，重悬至2×106个细胞/ml；致敏的树突状细胞收集后，重悬至1×105个细胞/ml；两者等体积混合(效应细胞∶刺激细胞为20∶1)，加入96孔板中，100ul/孔，37℃孵育。3天后换液一次，加入IL-2至终浓度为25u/ml，以诱导抗原特异性CTL的活化和扩增。
将靶细胞(肿瘤组织和对照组织)5×106个分别加入到200uCi的Na251CrO4溶液中，37℃标记1小时，然后用10％FCS培养基洗净，再将上述诱导的CTL和靶细胞按10∶1，20∶1，40∶1，80∶1的比例混合，加入96孔板，400g离心1分钟后，37℃培养4～6小时，吸取上清100ul，以盖革计测定51Cr的量。以下列公式计算杀伤率杀伤率(％)＝[(测定值-对照值)/(最大释放值-对照值)]×100％其中，最大释放值为靶细胞中加入Triton X-100时的51Cr释放量。
实施例2肺癌肿瘤疫苗体外刺激CTL攻击自体肿瘤细胞1.肺癌树突状细胞肿瘤疫苗的制备手术切除肺癌及癌旁组织，取部分肺癌细胞进行原代培养，冻存后待用。余下部分肺癌组织和癌旁组织分别提取总RNA，如实施例1中所述制备成该肺癌组织的差异全长cDNA表达文库。经脂质体转染树突状细胞，成为树突状细胞瘤苗。
2.肺癌肿瘤疫苗体外刺激CTL攻击自体肿瘤细胞将肺癌树突状细胞瘤苗在体外刺激自体淋巴细胞(如实施例1所述)，成为针对该肺癌组织的CTL。复苏冻存的原代肺癌细胞，将5×106个细胞分别加入到200uCi的Na251CrO4溶液中，37℃标记1小时，然后用10％FCS培养基洗净，再将上述诱导的CTL和肺癌细胞按10∶1，20∶1，40∶1，80∶1的比例混合，分别加入96孔板，以不加CTL的肺癌细胞为对照。400g离心1分钟后，37℃培养4～6小时，吸取上清100ul，以盖革计测定51Cr的量。以下列公式计算杀伤率杀伤率(％)＝[(测定值-对照值)/(最大释放值-对照值)]×100％其中，最大释放值为靶细胞中加入Triton X-100时的51Cr释放量。
实施例3A375(人黑色素瘤)细胞系的树突状细胞瘤苗治疗裸鼠转移癌动物模型1.树突状细胞肿瘤疫苗的制备体外培养A375细胞和BHK细胞，分别提取其总RNA，如实施例1中所述制备成A375细胞的差异全长cDNA表达文库。经脂质体转染人树突状细胞，成为树突状细胞瘤苗。
2.裸鼠转移癌动物模型的制备6周雌性裸鼠，每只经鼠尾静脉注射2×105个肿瘤细胞(悬于0.1ml HBSS溶液)。并设对照组。
3.树突状细胞瘤苗体外刺激CTL治疗转移癌动物模型将A375的树突状细胞瘤苗在体外刺激自体淋巴细胞(如实施例1所述)，成为针对A375细胞的CTL。肿瘤接种3天后，每天给予107个CTL细胞/只，连续3天，计算裸鼠的死亡率，肿瘤接种40天后，处死所有裸鼠，测量肺总重及肺内转移灶的个数。
图1所示为插入差异文库的质粒载体pSNAV-Sfi-I的图谱，其中多克隆位点中含有Sfi I(A)和Sfi I(B)位点，中间为250bp的填充序列。
权利要求
1.采用表达的差示文库致敏抗原呈递细胞。
2.根据权利要求1，表达的差示文库是肿瘤组织的特异性抗原差示文库。
3.根据权利要求1，表达的差示文库是感染性疾病组织的特异性抗原差示文库。
4.根据权利要求1，被表达的差示文库致敏了的抗原呈递细胞是通过诱导产生针对多个肿瘤特异抗原的CTL，达到治疗肿瘤的目的。
5.根据权利要求1，抗原呈递细胞为树突状细胞。
6.根据权利要求1，表达的差示文库是将疾病组织的特异性抗原差示文库插入真核表达载体质粒pSNAV-Sfi-I的Sfi-I克隆位点，成为pSNAV-Sfi-I/cDNA抗原差示文库。
7.根据权利要求1，表达的差示文库可以插入到除pSNAV-Sfi-I以外的其它真核表达载体质粒中。
8.根据权利要求1，转导并表达了差示文库的抗原呈递细胞可直接注入体内，包括静脉注射途径和皮下注射途径。
9.根据权利要求2，转导差示文库的抗原呈递细胞可在体外刺激肿瘤特异的CTL的增殖、活化，再将生成的CTL回输体内来攻击肿瘤细胞。
10.根据权利要求2，肿瘤组织的抗原差示文库做为肿瘤疫苗。
全文摘要
本发明涉及所有利用差异文库来致敏抗原呈递细胞制备疫苗的方法，用于(原发或转移)肿瘤或感染性疾病的治疗。发明中所指的差异文库是指利用各种方法得到的病变组织(肿瘤或感染组织)与正常组织的差异cDNA文库(全长或部分)。利用真核基因表达载体将此文库转染抗原呈递细胞，或在体外合成RNA、肽链来致敏抗原呈递细胞。这种致敏的抗原呈递细胞可以直接输入体内，刺激针对病变的免疫反应，或在体外刺激产生CTL，再将此CTL回输以清除病变。
文档编号A61K48/00GK1572327SQ0212429
公开日2005年2月2日 申请日期2002年7月16日 优先权日2002年7月16日
发明者康禹, 吴小兵 申请人:本元正阳基因技术股份有限公司