专利名称：用于治疗单纯疱疹和带状疱疹的诺卡软膏的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种以动物、植物或微生物的提出物为有效成份的药物配制品，特别是用于治疗单纯疱疹和带状疱疹的诺卡软膏。是单纯疱疹和带状疱疹患者的首选外用药。
使用的微生物用来生产本发明所述产品的是一种属于诺卡氏菌所属的菌株，红色诺卡放线菌(Nocardia rubra)Nr-8026(以下简称Nr-8026菌株)适于生产本发明所述的产品。该菌株经在甘油琼脂培养基上，33℃培养5天而得。并于2002年2月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.0712。
Nr-8026菌株的菌学特征1、菌落形态特征在甘油琼脂培养基上，33℃培养48小时，菌落隆起，呈桔红色，表面干燥皱起，外观呈砂粒状，略有光泽，接种环接触易碎。显微镜下观察菌体呈分枝状有横隔膜，形成纤细的菌丝体。整个菌丝分裂成规则的柱形短粗细胞，培养5天菌体成短杆状和球形。
2、染色性革兰氏染色阳性，抗酸染色阴性。
3、生化特性取甘油琼脂斜面培养基上经33℃，48小时培养的培养物接种于以下各种培养基内，经33℃，24小时后开始观察结果，连续观察8天，生化反应见下表红色诺卡放线菌生化反应结果 [注]“+”阳性产酸“-”阴性符合以上标准者可用于生产培养与提取方法通过常规的微生物生产方法，可以培养Nr__8026菌株，并经传代、扩增、超声波粉碎，提取获得该细胞壁骨架，酶纯化、有机溶剂除脂后，再加入适量的软膏基质制成。其培养方式既可为固体培养，也可为液体培养。
对培养基中的营养源并无特殊的规定，可使培养基中含有通常用于微生物培养的碳源、氮源及其它营养源。其中碳源可为淀粉、糊精、甘露醇、蔗糖、甘露糖、乳糖、山梨醇、麦牙糖、福寿草醇等。氮源可为肉膏、蛋白胨、铵盐、硝酸盐以及其它有机或无机含氮化合物。至于其它营养源则可适当添加一些无机盐类。例如食盐、磷酸盐类。
对温度、时间等培养条件并无严格的限制，以利于使用菌的生长为准，并以选择使其产量最高的条件为好。例如培养基的PH值以接近中性为好，培养温度宜在22-37℃，当然这些培养基的组分、氢离子浓度、培养温度等均应根据所使用的菌株不同及外部条件等进行适当的调节，以获得最好的效果。
通过常规培养微生物的方法，将Nr-8026菌株接种在甘油琼脂基上培养菌种，经检定合格的菌种增菌培养、菌体收集、细胞粉碎后经酶纯化、除脂后即为本发明产品的有效成分细胞壁骨架，添加药用微生物制剂所能接受的软膏基质，其组成与重量份数比如下十二烷基硫酸钠 1甘油 5单硬酸甘油酯 2十八醇 9白凡士林 10液体石蜡 3对羟基苯甲酸乙酯 0.1蒸馏水 69.9红色诺卡放线菌细胞壁骨架 0.0001-0.01本发明与现有技术相比，由于是利用微生物的细胞壁骨架做为有效成分，制成的生物制剂，该细胞壁骨架是一种免疫增强剂，它能增强机体抗肿瘤作用和对某些病毒和细菌感染具有保护作用，增强巨噬细胞的吞噬能力并被一系列的实验和药理药效实验所证明，对适应症取得了令人满意的疗效，见效快、疗程短、治愈率高，总有效率达100％，治愈后不易复发；并经皮肤急性毒性试验、皮肤刺激试验和皮肤过敏试验证明均未见毒性反应；多次给药对完整皮肤无刺激作用，对破损皮肤有轻度刺激作用；对皮肤产生弱致敏反应，患者无痛苦，愿意接受，同时由于有效成份含量低，使用成本低，使患者降低经济负担。
本发明所使用的红色诺卡放线菌Nr-8026，于2002年2月5日在北京中关村，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.0712。并经检测表明所寄存的菌株存活，无失活者。
例1，1)红色诺卡放线菌细胞壁骨架的制备以牛肉膏4.0g、蛋白胨8.0g、氯化钠4.0g、琼脂16.0g、甘油8.0ml、Na2HPO4·12H2O0.24g、蒸馏水800ml配制成甘油琼脂培养基，PH7.2-7.5灭菌后，将红色诺卡放线菌Nr-8026 CGMCCNo.0712接种于该培养基中，33℃培养5天；经检定合格的菌种增菌培养后接种于甘油培养基上，33℃培养5天。用无菌蒸馏水洗下菌苔后，经检定合格的菌液用3000rpm 20分钟离心分离，收集菌体洗五次合并菌体称湿重，置-20℃保存。经纯种试验无杂菌生长者使用，取1份重量的湿菌与3份重量的无菌蒸馏水混合经振荡后用超声波粉碎机进行粉碎，每粉碎10分钟，革兰氏染色镜检染色，显微镜下检查粉碎情况，每个视野有形菌不得超过6个，检查30个视野均达到此标准为合格。粉碎合格后用1400rpm离心20分钟去沉渣，上清液-20℃保存备用。配制磷酸盐PBS缓冲溶液PH7.2-7.4。配好的PBS缓冲溶液经灭菌后备用，然后对细胞壁骨架进行提取，取上清液400ml以14000rpm离心20分钟弃上清液，沉淀与400ml溶有其浓度为350μg/ml的DNA酶、RNA酶的PBS缓冲溶液混合后，22℃一小时后用14000rpm离心20分钟去上清，其沉淀用PBS缓冲溶液洗二次。并经RNA酶、DNA酶消化率检查，其沉淀用2％聚乙二醇辛基苯基醚稀释至400ml，22℃24小时后用14000rpm离心20分钟弃上清，沉淀用PBS缓冲溶液洗二次。所得沉淀用链酶蛋白酶(80μg/ml)与胰蛋白酶(3.0mg/ml)的溶液稀释至400m1，22℃12小时后，经14000rpm离心20分钟去上清，沉淀用PBS缓冲溶液洗二次。留样0.5ml检测蛋白残余量。有机溶剂除脂上步所得的沉淀用丙酮稀释至400ml，22℃24小时，14000rpm离心20分钟后，用PBS缓冲溶液洗二次，然后其所得沉淀用乙醚与乙醇的1∶1混合液至400ml，22℃24小时，用14000rpm离心20分钟后，用PBS缓冲溶液洗二次，并经检测余脂率合格，其所得沉淀即为细胞壁骨架，称湿重后按50mg/ml用无菌蒸馏水稀释，灭菌后置-20℃保存待用。
2)诺卡软膏成品的制备a)取白凡士林10份、十八醇9份、液体石蜡3份、单硬脂酸甘油酯0.1份，加热熔化后，调节温度至75℃保温；b)取十二烷基硫酸钠1份、甘油5份、对羟基苯甲酸酯0.1份，加入69.9份蒸馏水中，加热至80℃，使温度降至75℃；c)将a)液缓缓加入b)液中，并按同一方向随加随搅拌，继续搅拌至60℃±1℃时加入0.0001-0.01份红色诺卡放线菌细胞壁骨架，仍按同一方向随加随搅拌至乳化冷凝，即为成品，包装10g/管。
例21)以实施例1相同的条件，制备红色诺卡放线菌细胞壁骨架备用。2)诺卡软膏成品的制备.a)取15份十六醇、40份白凡士林加热熔化，温度调节至75℃保温；b)取5份甘油、1份十二烷基硫酸钠0.2份对羟基苯甲酸乙酯，加入38.8份蒸馏水中加热至80℃；c)将a)液缓慢加入b)液中，并按同一方向随加随搅拌，并连续搅拌至60℃，加入0.01份红色诺卡放线菌细胞壁骨架，仍按同一方向搅拌直到乳化冷凝，成检包装10g/管。
例3，1)以实施例1相同的条件，制备红色诺卡放线菌细胞壁骨架备用。2)制备诺卡软膏成品a)取22份硬酯醇、25份白凡士林加热熔化，温度调节至75℃保温；b)取1.5份十二烷基硫酸钠、0.25份羟苯甲酯、0.15份羟苯丙酯、12份丙二醇加入39.1份蒸馏水中加热至80℃；c)将a)液缓缓加入b)液中边加热边搅拌，持续搅拌至60℃，再加入0.0006份红色诺卡放线菌细胞壁骨架，仍按同一方向随加随搅拌直至冷凝，成检包装10g/管。
例4，1)以实施例1相同的条件，制备红色诺卡放线菌细胞壁骨架备用。2)诺卡软膏成品的制备a)取7.5份硬脂酸、1.75份单硬脂酸甘油酯、3.5份白凡士林加热熔化，调节温度至75℃保温；b)取15份甘油、0.5份三乙醇胺、0.1份对羟基苯甲酸乙酯、0.2份硼砂，加入71.45份蒸馏水中加热至80℃；c)将a)液缓缓加入b)液中，并按同一方向随加随搅拌，继续搅拌至60℃时加入0.0001份红色诺卡放线菌细胞壁骨架，仍按同一方向随加随搅拌，连续搅拌直至冷凝，成检包装10g/管。
例5，1)以实施例1相同的条件，制备红色诺卡放线菌细胞壁骨架备用。2)诺卡软膏成品的制备a)取18份液体石蜡、5份棕榈酸异丙酯、2份硬脂酸、5份单硬脂酸甘油酯、0.8份吐温-20和0.2份十六醇加热熔化后，调节温度至75℃保温；b)取0.2份卡尔波尔934、4份丙二醇、0.1份杰马A、1.8份三乙醇胺加入61.1份去离子水中加热至75℃；c)将a)液缓缓加入b)液中，并按同一方向随加随搅拌，继续搅拌至60℃，再加入0.0085份红色诺卡放线菌细胞壁骨架，仍按同一方向随加随搅拌，并连续搅拌直至冷凝，成检包装10g/管入库。
经检测其质量指标见下表
本发明的产品为白色脂质状软膏涂于病灶处外用药，每管10克，其每管含有效量红色诺卡放线菌细胞壁骨架不低于6.25mg/管。
权利要求
1.一种用于治疗单纯疱疹和带状疱疹的诺卡软膏，其特征是先培养红色诺卡放线菌CGMCCNo.0712，再经增菌培养、菌体收集、细胞粉碎、酶纯化除脂后即为本产品的有效成份细胞壁骨架，添加药用微生制剂所能接受的软膏基质，其组成与重量份数比如下十二烷基硫酸钠 1十八醇9甘油 5单硬脂酸甘油酯 2白凡士林 10液体石蜡 3对羟基苯甲酸乙酯 0.1蒸馏水69.9红色诺卡放线菌细胞壁骨架 0.0001-0.01。
2.根据权利要求1所述的诺卡软膏，其特征在于其组成与重量份数比如下甘油 5白凡士林 40十二烷基硫酸钠 1对羟基苯甲酸乙酯 0.2十六醇15蒸馏水38.8红色诺卡放线菌细胞壁骨架 0.01.
3.根据权利要求1所述的诺卡软膏，其特征在于其组成与重量份数比如下白凡士林 25硬脂醇22十二烷基硫酸钠1.5羟苯甲酯 0.25羟苯丙酯 0.15丙二醇12蒸馏水39.1红色诺卡放线菌细胞壁骨架 0.0006.
4.根据权利要求1所述的诺卡软膏，其特征在于其组成与重量份数比如下甘油15硬脂酸 7.5三乙醇胺0.5对羟基苯甲酸乙脂 0.1单硬脂酸甘油酯 1.75白凡士林3.5硼砂0.2蒸馏水 71.45红色诺卡放线菌细胞壁骨架 0.0001。
5.根据权利要求1所述的诺卡软膏，其特征在于其组成与重量份数比如下液体石蜡18棕榈酸异丙酯 5硬脂酸 2十六醇 0.2单硬脂酸甘油酯 5吐温-20 0.8卡尔波尔934 0.2丙二醇 4杰马A 0.1三乙醇胺1.8去离子水61.1红色诺卡放线菌细胞壁骨架 0.0085。
全文摘要
本发明涉及一种以动物、植物或微生物的提出物为有效成份的药物配制品，特别是用于治疗单纯疱疹和带状疱疹的诺卡软膏。它是通过先培养红色诺卡放线菌CGMCCNo.0712，再经增菌培养、菌体收集、细胞粉碎、酶纯化除脂后即为本产品的有效成份细胞壁骨架，再按配方的配比添加软膏基质十二烷基硫酸钠、十八醇、白凡士林、液体石蜡、对羟基苯甲酸乙酯、甘油、单硬脂酸甘油酯和蒸馏水经配制而成。本发明通过药理药效及皮肤急性毒性、皮肤刺激和皮肤过敏试验证明有对适应症见效快，疗程短，治愈率高，总有效率达100％，同时患者无痛苦、无毒副作用，对破损皮肤有轻度刺激作用，对皮肤产生弱致敏反应，患者容易接受。是适应症患者首选的外用药。
文档编号A61P31/00GK1465356SQ0213241
公开日2004年1月7日 申请日期2002年6月21日 优先权日2002年6月21日
发明者张策, 洪晓明, 王振波, 李军, 张 策 申请人:沈阳胜宝康生物制药有限公司