专利名称：树舌多糖，其制备方法和以该化合物为活性成分的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明公开一种树舌多糖，同时提供了其制备方法和以该化合物为活性成分的药物组合物，属于中药有效成分提取剂应用技术领域。
背景技术：
本发明所称的树舌异名老牛肝，为平盖灵芝(Gancdermaapplatum(Pers.)Pat.)的子实体。树舌多糖对肿瘤S-180具有明显的抑制作用。用树舌多糖制成的“肝必复”对乙肝患者有治疗作用。关于树舌多糖抗胃溃疡、治疗胃炎等方法的报道在本发明完成之前没有报道；树舌多糖是一种杂多糖混合物，具有抗溃疡、治疗胃炎作用的多糖组分，也是首次分离得到，且工艺方法简单、适用，提取的多糖部分活性强、纯度高(80％以上)，是一种适合于产业化生产的新方法。
发明内容
本发明提供一种具有药用价值的树舌多糖。
本发明还提供了从中药树舌中提取上述物质的制备方法，适用于工业化生产。
本发明进一步提供了以活性树舌多糖组分为主要药物或与其它药物组方用于预防和胃溃疡、急性胃炎、慢性胃炎、十二指肠球部溃疡的治疗以及镇痛、抗炎作用等。
树舌多糖是通过以下提取方法获得的方法1以中药树舌为原料，用水煎1～3次，每次时间为1～3小时，滤过，合并滤液，浓缩，浓缩液放冷，加乙醇至含醇量为20％，离心，弃去沉淀物，上清液加乙醇至含醇量为80％，静置24小时，抽滤，沉淀物以无水乙醇适量洗涤，干燥，粉碎成细粉，得树舌多糖。
方法2以中药树舌为原料，用20％乙醇回流提取3次，每次时间为3小时，合并提取液，减压浓缩，浓缩液加乙醇至含醇量为80％，静置24小时，抽滤，沉淀物以无水乙醇适量洗涤，干燥，粉碎成细粉，得树舌多糖。
本发明的上述方法可用于产业化大量制备具有抗溃疡等活性的多糖组分，通过化学分析证明该活性组分与以往分离的抗肿瘤和抗乙肝活性多糖都不相同，中性多糖含量约为52.0％，酸性多糖的含量约31.2％，多肽含量小于5％。其中的重金属含量小于5ppm，农药残留量(既“666、DDT、5-氯硝基苯”)低于10ppb，上述组成的活性多糖组分在本发明之前未见报道。
按药剂学方法，可以将本发明的树舌多糖制备成多种临床药物剂型作为胃溃疡、急性胃炎、慢性胃炎、十二指肠球部溃疡等疾病的治疗和镇痛抗炎的药物，所说的药剂是任何一种药剂学上所说的剂型。其中，口服制剂选自于片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂中的任何一种。
本发明的药物优选含有1％-99％的树舌多糖和99％-1％的赋形剂(包括其它配伍的药物)，优选含有30％-80％的树舌多糖和70％-20％的药用赋形剂(包括其它配伍用的药物)，最好含有60％-70％的树舌多糖和40％-30％的赋形剂(包括其它配伍用的药物)。
本发明的药物中的辅料是指常规的赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂、粘合剂等。本发明药物中的其它配伍用的药物，指的是以有效剂量的树舌多糖为一定的药物原料，再配伍其它可允许合用的中药或化学药品。
下述的药理实验证实了树舌多糖药物制剂具有治疗胃溃疡、急性胃炎、慢性胃炎、十二指肠球部溃疡等疾病治疗和镇痛等药理活性动物昆明种小鼠，体重18-22g，雌雄兼用，购自吉林省药品检验所，动物质量合格证编号为10-1008；Wistar大鼠，体重180-230g，购自长春高新医学动物实验研究中心，动物质量合格证编号10-5112。
药品树舌多糖胶囊由本院剂型室提供，为棕色粉末，批号20010328，规格0.35g/粒，40g生药/g粉。消炎痛由山西省临汾制药厂出品，批号010705，规格25mg/片；胃乐新冲剂由白求恩医科大学制药厂出品，批号011025；规格5g/袋，因其功能主治与树舌多糖胶囊相近，并且其有效成分也是多糖(小刺猴头菌生物发酵)，故被用作中药阳性对照药；西咪替丁(甲氰咪胍)由广州白云山制药总厂出品，批号0109053，规格0.2g/片，100片/瓶，在本试验中用作西药阳性对照药。阿司匹林由吉林省东方制药厂出品，批号000501，规格25mg/片；醋酸泼尼松(强的松)由天津太平洋制药有限公司出品，批号010303，规格5mg/片，分别作为阳性对照药；上述药物实验时用蒸馏水配成所需浓度。
试验材料1、菌株取胃粘膜组织，均匀涂抹于Skirrow培养基双碟上，置37℃微氧环境(使用德国biomeerieux Generbox)加入催化剂，使成微氧环境，5～8％CO2、5～8％O2、33.6％H2，孵育48h后，经观察菌落、菌体形态、生化反应及快速尿素酶试验，鉴定为幽门螺杆菌。
菌液制备从上述经鉴定的幽门螺杆菌斜面上取一白金铒加入5ml布氏肉汤中，培养环境同上，48小时后取出备用。
2、培养基布氏肉汤、Skirrow培养基按新编细菌检验用培养基手册配制。
3、样品制备取5g加入20ml灭菌水中，室温，浸泡24小时后，摇匀制成每m1相当于0.25g样品的浸泡液。
统计结果均经“t”检验，结果以X±SD表示。
实验方法与结果一、树舌多糖胶囊对幽门螺杆菌体外抑菌(MIC)、杀菌(MBC)的作用采用试管稀释法分别取无菌试管13支，每管加入布氏肉汤1ml，第一支试管加入上述制备药液1ml，摇匀，倍比稀释至第11支管，第12、13支试管不加药液，作对照试验。各管分别加入上述制备的幽门螺杆菌菌液0.1ml，约50-100个菌，混匀，置37‘C微氧环境中培养，48h后观察结果。液体混浊者为抗菌，清晰透明为敏感，同时每管取1ml，加入双碟内，注入Skirrow培养基中，摇匀，置37℃微氧培养48h后取出，观察是否有菌生长。无菌生长为有杀菌作用，反之无杀菌作用。试验结果表明树舌多糖胶囊对体外幽门螺杆菌无抑菌、杀菌作用。
二、树舌多糖胶囊对大鼠应激型溃疡的影响取雌雄各半大鼠60只分为6组，每组10只，第一组为对照组(蒸馏水，20ml/kg)，第二和三组分别灌胃甲氰咪胍1000mg/20ml/kg和胃乐新8000mg/20ml/kg，第四、五、六组分别按800、400和200mg/20ml/kg灌胃树舌多糖胶囊，每天给药二次，每次给药体积为10ml/kg，连续给药7天，于第6天给药后，立即禁食24小时，但供饮水。末次给药后2小时，用乙醚轻度麻醉大鼠后，将大鼠四肢绑在铁网上，头朝下垂直放置16小时后，断头处死。将贲门和幽门结扎后，取出全胃，向胃内注入生理盐水10ml，将其浸泡在1％福尔马林中固定5分钟，沿胃大弯剪开胃，用清水轻轻漂洗，将胃平展于玻璃板上，按下述方法计算溃疡等级完整的胃粘膜为0级；点状出血直径≤1mm，1～5点为1级；6～10点为2级；10点以上为3级；条状出血1～5条为4级；6～10条为5级；10条以上为6级。结果见表1。树舌多糖胶囊对大鼠应激型溃疡具有明显的抑制作用。
表1 树舌多糖胶囊对大鼠应激型溃疡的影响组别 剂量 动物数溃疡等级 抑制率mg/20ml/kg n％对照组- 10 5.0±0.471甲氰咪胍 1000 10 0.3±0.483***94胃乐新8000 10 3.3±0.744**34树舌多糖 800 10 1.8±1.398***64400 10 2.4±1.713***52200 10 3.8±1.033**24与对照组比较**P＜0.01，***P＜0.001三、树舌多糖胶囊对大鼠结扎幽门型胃溃疡的影响取大鼠60只，分组及给药剂量同实验一。每日给药二次，每次给药体积为10ml/kg，连续7天。于第5天给药后开始禁食不禁水48小时，然后，在乙醚麻醉下，剖腹结扎胃幽门，结扎术后继续禁食并停止供水，18小时后断头处死大鼠，开腹，结扎贲门，将胃取出，小心收集胃液，并记录胃液量，测定胃总酸，游离酸，胃蛋白酶活性。将胃沿大弯剪开，轻轻漂洗后，将胃平展于玻璃板上，检查溃疡等级，见照片，分级标准如下0级无病变；1级出血、糜烂或发生溃疡点(＜1mm)；2级1～5个小溃疡(1mm＜2级＜3mm)；3级6个以上小溃疡或1个大溃疡(＞3mm)；4级2个大溃疡(＞3mm)；5级穿孔性溃疡。以上结果见表2。树舌多糖胶囊对大鼠结扎幽门型胃溃疡具有明显的抑制作用，对胃游离酸和总酸以及胃蛋白酶活力亦具有明显的抑制作用，但对胃液容积却无明显影响。表2 树舌多糖胶囊对大鼠结扎幽门型胃溃疡的影响组别 剂量 胃溃疡溃疡等级游离酸 胃液总酸度 胃蛋白酶 胃液容积mg/kg 抑制率 mEq/L mEq/L U/L ml/100g％对照组- 4.8±0.44 40.0±19.9 71.8±16.3 198±55 5.66±1.366甲氰咪胍 100070.81.4±1.35***13.4±14.3**50.2±15.8**152±34*5.20±1.149胃乐新800029.23.4±0.73***17.9±21.3*52.6±20.0*136±40*5.36±1.084树舌多糖 100056.32.1±1.36***12.4±12.5**44.0±17.1**139±57*5.27±1.113500 25.03.6±0.84**15.6±19.3*51.9±21.9*136±57*5.22±1.212250 20.83.9±0.93*13.7±14.2**47.3±13.7**136±42*5.05±0.908与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001四、树舌多糖胶囊对大鼠醋酸型胃溃疡的治疗作用取大鼠70只，禁食不禁水48小时，在乙醚麻醉下进行手术，将胃轻拉至腹外，在胃体部与幽门窦交界处用微量注射器在大鼠胃浆膜下0.4～0.5mm处注入10％醋酸0.05ml，空白对照组注入生理盐水0.05ml。将胃轻轻送回大鼠体内，缝合腹壁。手术次日，将大鼠匀分7组，所有大鼠按表3所示剂量灌胃给药，每天二次，每次给药体积为10ml/kg，空白对照组和模型对照组灌胃同体积蒸馏水，连续给药14天。于末次给药后2小时，断头处死动物，剪开腹腔，结扎胃幽门和贲门，取胃浸泡于1％福尔马林溶液中10分钟，沿胃大弯剪开，将胃外翻，倒掉内容物，用细管冲掉食物残渣，在注射醋酸溶液相应部位的粘膜面观察溃疡形成程度，计算溃疡指数(溃疡最长径和最短径的均值)。结果见表3。溃疡呈圆形或椭圆型，中心凹陷，四周微微隆起，密布毛细血管；已愈合的溃疡，周围稍有隆起，表面红润，可见有放射状细纹。树舌多糖胶囊对大鼠醋酸型胃溃疡具有明显的抑制作用。表3 树舌多糖胶囊对大鼠醋酸型胃溃疡的影响组别 剂量 动物数溃疡指数 抑制率mg/20ml/kgnmm％对照组 - 90 -模型对照组 - 10 4.35±0.843甲氰咪胍 100010 1.15±1.680***73.6胃乐新 800093.36±1.993 22.8树舌多糖 100010 1.38±1.542***68.4500 92.31±1.948**47.0250 10 3.48±1.865 20.1与模型对照组比较**P＜0.01，***P＜0.001五、树舌多糖胶囊对药物诱发型胃溃疡的影响取大鼠70只，随机分为7组，按表4所示剂量每日2次灌胃给药，每次给药体积为10ml/kg，空白对照组和模型对照组灌胃同体积蒸馏水，共给7日。给药后第5天禁食48小时，不禁水。将消炎痛溶于5％NaHCO3溶液中(10mg/1ml)，再用蒸馏水稀释成2mg/1ml的混悬液，与第7日给药后半小时将上述消炎痛液按20mg/kg的剂量，向大鼠背部皮下一次注入。6小时后颈椎脱臼处死大鼠，剪开腹腔，结扎胃幽门和贲门，取胃，向胃内注入1％福尔马林10ml，再将整胃浸泡于1％福尔马林溶液中5-10分钟，以固定胃内外层，然后沿胃大弯剪开，用自来水冲洗干净，观察并记录胃粘膜损伤情况。以溃疡长度总和的毫米数作为溃疡指数，进行统计学处理，计算溃疡抑制百分率，评定药物作用。结果见表4。树舌多糖胶囊对药物诱发型胃溃疡具有明显的抑制作用。
表4、树舌多糖胶囊对药物诱发型胃溃疡的影响组别 剂量 动物数 溃疡指数抑制率mg/20ml/kg n mm％对照组 -10 0 -模型对照组 -10 58.7±14.51甲氰咪胍 1000 10 13.6±13.87***76.8胃乐新 8000 10 27.6±21.10**53.0树舌多糖 1000 10 20.4±13.53***65.2500 10 33.6±16.57**42.8250 10 54.1±20.43 7.8与模型对照组比较**P＜0.01，***P＜0.001六、树舌多糖胶囊对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的影响取大鼠40只，随机分为5组，按表5所示剂量每日二次灌胃给药，每次给药体积为10ml/kg，共给7日。于末次给药后1小时，在右后足跖下部注射1％角叉菜胶0.1ml/只，测定注入角叉菜胶后1、2、3、4、5、6、24小时足肿胀程度，观察药物到达高峰时间和消退时间，比较给药组和对照组的差异情况，结果见表5。树舌多糖胶囊对角叉菜胶所致大鼠足肿胀具有明显的抑制作用。
表5 树舌多糖胶囊对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的影响组别 剂量 足肿胀程度mmmg/kg 1h 2h3h4h5h 6h 24h对照组- 5.63±1.51 9.13±2.1012.13±2.47 10.75±2.43 9.75±1.98 6.50±2.67 2.13±1.55强的松20 4.75±2.12 8.25±2.0510.13±2.70 7.88±1.73*7.86±2.23 6.25±1.28 1.75±1.49树舌多糖 8004.00±1.51 7.63±1.928.75±1.93**7.25±2.05**6.25±2.49*4.50±2.07 1.13±0.994004.00±1.85 6.13±2.10*7.25±2.31**7.88±2.64*8.00±1.51 7.13±2.36 1.50±1.072004.38±1.30 6.13±1.46**8.25±2.12**9.13±1.96 8.25±2.60 5.88±1.96 1.75±1.28
与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01七、树舌多糖胶囊对角叉菜胶引起小鼠足肿胀的影响取小鼠50只，按体重随机分为5组，按表6所示剂量每日二次灌胃给药，每次给药体积为10ml/kg，共给7日。于末次给药后半小时，于小鼠右后足掌腱膜下注入1％角叉菜胶0.03ml/只，于致炎后6小时，剪下双侧后足，称量，计算足肿胀程度。结果见表6。树舌多糖胶囊对角叉菜胶引起小鼠足肿胀具有明显的抑制作用。
表6、树舌多糖胶囊对角叉菜胶引起小鼠足肿胀的影响组别剂量 动物数 溃疡面积mg/20ml/kg n mg对照组- 10 39.8±9.28强的松20 10 32.4±7.76树舌多糖 120010 28.8±7.55**600 10 32.3±5.58*300 10 37.4±8.88与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01八、树舌多糖胶囊对小鼠二甲苯性耳廓水肿的影响取小鼠50只，按体重随机分为5组，按表7所示剂量每日二次灌胃给药，每次给药体积为10ml/kg，共给7日。于末次给药后30分钟，将0.05ml二甲苯均匀滴于小鼠右耳内外侧，左耳为正常对照组。2小时后，将小鼠颈椎脱臼处死，沿耳廓基线剪下两耳，用直径9mm的打孔器分别在左、右耳同一部位打下圆耳片，称重，求左、右耳片重量之差，即为肿胀度，结果见表7。树舌多糖胶囊对小鼠二甲苯性耳廓水肿具有明显的抑制作用。
表7、树舌多糖胶囊对小鼠二甲苯性耳廓水肿的影响组别 剂量 动物数肿胀度mg/20ml/kg n mg对照组 - 10 21.8±6.26强的松 20 10 15.1±4.70*树舌多糖 1200 10 13.2±3.30**60010 15.1±2.81**30010 20.9±6.01与对照组比较*P＜0.05**P＜0.01九、树舌多糖胶囊对小鼠的镇痛作用(扭体法)取小鼠50只，雌性，按体重分为5组，对照组给水10mg/kg，其余各组按表8所示剂量灌胃给药一次，于给药后2小时，腹腔注射0.8％醋酸溶液0.1mg/10g，观察注射后10min内小鼠出现扭体反应次数以及出现扭体反应时间，结果见表7。树舌多糖胶囊对小鼠具有镇痛作用。
表8、树舌多糖胶囊对小鼠的镇痛作用(扭体法)组别 剂量 动物数出现扭体时间扭体次数mg/10ml/kg nS 次对照组- 10255±55 14.8±3.61阿斯匹林 200 10348±134 8.2±3.61***树舌多糖 120010352±107*10.2±5.14*600 10350±139 8.8±6.99*300 10294±69 13.8±3.46与对照组比较*P＜0.05，***P＜0.001十、树舌多糖胶囊对小鼠的镇痛作用(热板法)取雌性小鼠50只，按体重分为5组(分组前先筛选，以5-30秒内出现舔足者为合格)，按表9所示剂量给药一次，于给药后2小时，进行热板法实验，观察2小时小鼠的痛域值，结果见表9。树舌多糖胶囊对小鼠具有镇痛作用。
表9、树舌多糖胶囊对小鼠的镇痛作用(热板法)组别 剂量 动物数 出现反应时间舔足次数mg/10ml/kg n S 次对照组 -1020.3±4.00 8.5±2.27阿斯匹林 200 1027.5±7.55*6.0±3.46树舌多糖 1200 1024.6±4.09*6.1±2.42*600 1022.2±8.56 5.0±1.63**300 1020.0±4.57 7.4±2.41与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01结果与讨论药效学试验结果表明树舌多糖胶囊对大鼠应激型、结扎胃幽门型、醋酸型以及药物(消炎痛)诱发型胃溃疡皆有抑制作用，其抗溃疡作用随剂量增加而增强。对胃壁注射醋酸所形成的溃疡具有抑制其发展、促进其愈合的作用，高和中剂量组大鼠胃粘膜表面形成的溃疡长短径均值明显小于模型组，溃疡愈合百分率分别为68.4％和47.0％，当剂量为250mg/kg(溃疡愈合百分率作用为20.1％)时，对醋酸型胃溃疡的抑制强度与胃乐新8g/kg(溃疡愈合百分率作用为22.8％，无统计学差异)相当，即树舌多糖胶囊的作用强度为胃乐新32倍左右。对应激性溃疡，树舌多糖胶囊三个给药组动物的溃疡指数明显低于模型组，溃疡抑制百分率分别为64％和52％和24％，表明该药对机体在应激条件下诱发的溃疡具有一定的抑制作用，树舌多糖胶囊200mg/kg的作用强度与胃乐新8g/kg作用相近，即树舌多糖胶囊对应激型胃溃疡的抑制强度为胃乐新的40倍左右。对结扎幽门型胃溃疡，树舌多糖胶囊三个给药组动物的溃疡指数也明显低于模型组，溃疡抑制百分率分别为56.3％和25.0％和20.8％，树舌多糖胶囊500mg/kg的作用强度与胃乐新8g/kg(溃疡抑制百分率为29.2％)作用相近，即树舌多糖胶囊对结扎幽门型胃溃疡的抑制强度为胃乐新的16倍左右，树舌多糖胶囊对胃液容积无明显影响，但对胃酸和胃蛋白酶活性均有抑制作用，从而可减少攻击性因子对胃壁的侵蚀和伤害。且作用强度树舌多糖胶囊500mg/kg相当于胃乐新8g/kg，即是其作用的16倍左右。对药物(消炎痛)诱发型胃溃疡，高和中剂量给药组大鼠的胃溃疡指数均明显低于模型组，溃疡抑制百分率分别为65.2％和42.8％，树舌多糖胶囊1000mg/kg的作用强度与胃乐新8g/kg作用相近，即树舌多糖胶囊对药物(消炎痛)诱发型胃溃疡的抑制强度为胃乐新的8倍左右。成年胃病患者每天服用胃乐新的剂量为30g左右，而服用树舌多糖胶囊大概需1.4～5.6g左右的剂量即可达到治疗效果。此外，辅助药效学试验表明，树舌多糖胶囊还具有明显的抗炎和镇痛作用，这对胃炎和胃溃疡以及结肠炎等的恢复也是非常有利的。以上结果为树舌多糖胶囊在临床上应用奠定了一定的药理学基础。
权利要求
1.一种树舌多糖，可由下述两种方法当中的一种制备获得(1)以中药树舌为原料，用水煎1～3次，每次时间为1～3小时，滤过，合并滤液，浓缩，浓缩液放冷，加乙醇至含醇量为20％，离心，弃去沉淀物，上清液加乙醇至含醇量为80％，静置24小时，抽滤，沉淀物以无水乙醇适量洗涤，干燥，粉碎成细粉，得树舌多糖；(2)以中药树舌为原料，用20％乙醇回流提取3次，每次时间为3小时，合并提取液，减压浓缩，浓缩液加乙醇至含醇量为80％，静置24小时，抽滤，沉淀物以无水乙醇适量洗涤，干燥，粉碎成细粉，得树舌多糖。
2.树舌多糖在用于预防和治疗胃溃疡、急性胃炎、慢性胃炎和十二指肠球部溃疡或其它原因引起的胃痛、胃酸过多等疾病，并具有镇痛、抗炎作用的药物中的应用。
3.用于预防和治疗胃溃疡、急性胃炎、慢性胃炎和十二指肠球部溃疡等疾病，并具有镇痛、抗炎作用的药物组合物，其中含有治疗有效量的树舌多糖和药学上可接受的载体。
4.根据权利要求2、3所述的药物，其特征在于所说的药剂是任何一种药剂学上所说的剂型。
全文摘要
本发明公开一种树舌多糖，并提供了其制备方法，特点是得到的树舌多糖的含量高(80％以上)、重金属含量低(低于5ppm)，农药残留量低(低于10ppb)，其中中性多糖含量约为52.0％，酸性多糖的含量约31.2％，多肽含量小于5％。同时提供了以活性树舌多糖组分为主要药物或与其它药物组方，可用于预防和治疗胃溃疡、急性胃炎、慢性胃炎和十二指肠球部溃疡或其它原因引起的胃痛、胃酸过多等疾病，并具有镇痛、抗炎作用。
文档编号A61P1/00GK1412202SQ0214460
公开日2003年4月23日 申请日期2002年11月20日 优先权日2002年11月20日
发明者杨明, 赵全成, 焦连庆 申请人:吉林省中医中药研究院