用于治疗系统性红斑狼疮的16/6id抗体肽的制作方法

专利名称：用于治疗系统性红斑狼疮的16/6id抗体肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及合成肽，更具体地说，本发明涉及基于人单克隆抗DNA抗体互补决定区(CDR)的合成肽、包含所述合成肽的药用组合物以及它们在免疫调节系统性红斑狼疮(SLE)相关反应中的应用。
缩写16/6Id人16/6Id mAb；CDR互补决定区；CFA完全弗氏佐剂；hCDR肽基于人16/6Id mAb CDR区的肽；hCDR1SEQ ID NO6人类肽；hCDR3SEQ ID NO7的人类肽；人16/6IdmAb携带16/6Id的人致病性抗DNA mAb；ICD免疫复合物沉积；Id独特型；LNC淋巴结细胞；mAb单克隆抗体；MMP基质金属蛋白酶；mCDR1SEQ ID NO1小鼠肽；mCDR3SEQ ID NO3小鼠肽；PBL外周血淋巴细胞；PBS磷酸盐缓冲盐溶液；rev反向肽；SLE系统性红斑狼疮；SLEDAISLE疾病活动指数；TGF-β转化生长因子β；UT未处理。
背景技术：
系统性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫病，其特征在于出现一系列自身抗体，包括抗DNA抗体、抗核心抗原抗体和抗核糖核蛋白抗体。该疾病进行性发展伴有各种临床表现和免疫复合物沉积引起的组织和器官损害。与其它自身免疫病理状况相似，SLE病因学是遗传、环境、激素和免疫学多因素的。目前没有目的在于预防或治疗SLE的特效治疗。
名为16/6Id的人单克隆抗DNA抗体携带共有的独特型(Shoenfeld等，1983)。已经发现该独特型与SLE患者临床相关。因此，在54％患有活动性疾病的SLE患者体内(Isenberg等，1984)，以及在SLE患者的感染器官中(Isenberg和Collins，1985)，已经发现16/6Id在抗DNA抗体上表达。用所述人抗DNA 16/6 Id mAb免疫未发展任何自发性自身免疫病的近交株小鼠，所述小鼠发展出SLE在人体内以及在该疾病自发性鼠模型中的主要特点(Mendlovic等，1988)。因此，免疫后，所述小鼠产生特异性针对16/6Id的抗体、携带16/6Id的抗体以及靶向不同核心抗原(dsDNA、ssDNA、Sm、核糖核蛋白、Ro、La及其它)的抗体。所述血清学发现与白细胞减少、红细胞沉积率、蛋白尿、肾内免疫复合物增加以及肾小球硬化有关(Mendlovic等，1988)，这些表现是SLE的典型表现。
从实验性SLE小鼠获得的鼠抗16/6 Id mAb(Ab2)也能够在小鼠中引起实验性疾病(Mendlovic等，1989)，其引起的实验性疾病与16/6Id(Ab1)所引起的实验性疾病类似。此外，从实验性SLE小鼠制备得到表达16/6 Id的鼠抗DNA mAb。名为5G12的抗体Ab3与特异性针对16/6Id的抗体反应。用后一种抗体免疫引起实验性SLE，其表现与用人16/6Id(Ab1)和用鼠抗16/6Id(Ab2)mAb免疫后观察到的表现类似(Waisman等，1993)。这些结果显示16/6Id网络在小鼠体内对于SLE的诱导以及进行的重要性。
为了解与SLE有关的自身抗体出现的机制，本发明的发明人已经用实验性SLE的C3H.SW小鼠制备出多种单克隆抗体。通常能够引发携带16/6 Id或与之反应的抗体的单克隆自身抗体有致病性，并因此能够在小鼠中引起实验性SLE(Fricke等，1990；Sthoeger等，1993)。
然后测序从实验性SLE的C3H.SW小鼠分离的结合DNA或HeLa核提取物(NE)的九种自身抗体的可变(V)区(Waisman和Mozes，1993)。分析具有不同特异性的单克隆抗体，试图确定所述不同自身抗体之间的联系。三种mAb结合DNA，并且表现致病性抗DNA抗体的序列特征。这些mAb中名为2C4C2的一种mAb所使用的重(H)链V区基因(VH)与从其它易患狼疮的小鼠(即(NZB x NZW)Fi)分离的抗DNA mAb的VH相同。MAb 2C4C2的轻(L)链V区基因(VL)与从(NZB x NZW)F1小鼠分离的另一种抗DNA mAb的VL有98％同源性。名为5G12-4和5G12-6另外两种抗DNA mAb的VH序列与mAb 2C4C2的VH序列有93％同源性。根据对这些mAb的分析，看起来在实验性SLE小鼠体内发现的自身抗体所使用的遗传元件与从自发发展出狼疮的小鼠株分离的mAb所使用的遗传元件相似。
T细胞在实验性SLE的诱导和发展中起重要作用。因此，特异性针对16/6Id的T细胞系和克隆在同系接受者体内引起实验性SLE，其行为与16/6Id抗体类似。因此，当用所述细胞系的活化细胞接种小鼠后，所述小鼠出现SLE典型的血清学和肾损害(Fricke等，1991)。
如上文所述，从实验性SLE小鼠分离的能够结合DNA并且携带16/6Id的mAb 5G12能够在小鼠中引起实验性SLE(Waisman等，1993)。mAb特异性反应增殖的T细胞可能与携带来自它们互补决定区(CDR)序列的肽反应。很有可能所述T细胞识别上述抗体的V区，因为它们不与携带同样恒定区但有不同特异性的其它抗体反应。在所述可变区内，最有可能被识别的区是CDR，因为它们是在不同抗体间差别最大的区。上文提到的在小鼠中引起SLE的九种致病性鼠mAb的VH序列CDR区在Waizman和Mozes，1993的

图1中加框显示，其中显示所述九种mAb的可变重链(VH)完整核苷酸序列和推导的氨基酸序列。
本发明的申请人的国际PCT专利公开第WO 96/30057号描述基于从实验性SLE小鼠分离的致病性mAb CDR区的肽，尤其是分别基于鼠mAb 5G12VH链CDR1、CDR2和CDR3区的肽Ia到IIIa，以及分别基于鼠mAb 2C4C2VH链CDR1和CDR3区的肽IVa到Va。这些肽具有实质上如下面SEQ ID NO1到SEQ ID NO5所指出的序列TGYYMQWVKQSPEKSLEWIG(Ia)[SEQ ID NO1]EINPSTGGTTYNQKFKAKAT(IIa)[SEQ ID NO2]YYCARFLWEPYAMDYWGQGS(IIIa)[SEQ ID NO3]
GYNMNWVKQSHGKSLEWIG(IVa)[SEQ ID NO4]YYCARSGRYGNYWGQTL(Va)[SEQ ID NO5]本发明的发明人已经证明当通过PBS给予这些肽，尤其是本文中分别名为mCDR1[SEQ ID NO1]和mCDR3[SEQ ID NO3]的肽Ia和IIIa时，这些肽能够抑制T细胞受到合适mCDR肽或鼠来源或人类来源的全抗DNA 16/6Id mAb的激发(Waisman等，1997)。本发明的发明人进一步证明肽mCDRI和mCDR3治疗或预防由人抗DNA16/6Id mAb引起的SLE或者在易患SLE的小鼠(NZB x NZW)F1或MRL/lpr/lpr中自发发展出的已经建立的SLE(established SLE)(Eilat等，2000和2001)。
发明简述现在根据本发明，已经发现基于人单克隆抗DNA 16/6Id抗体CDR的肽能够免疫调节SLE相关反应。因此，测试基于人16/6Id CDR1和CDR3的肽，显示所述肽抑制用鼠肽mCDR1(SEQ ID NO1)和mCDR3(SEQ ID NO3)或用全人抗DNA 16/6Id mAb免疫的小鼠体内的淋巴结细胞增殖，抑制SLE患者外周血淋巴细胞(PBL)对人抗DNA16/6Id mAb的增殖性反应，并缓解患有自发性或实验性SLE的小鼠的疾病表现。
这些发现完全出乎意料，因为不是所有致病性自身抗体的CDR都同样被患者的T细胞识别。如以前在本发明人的实验室内证明的(Dayah等，2000)，SLE患者T细胞对抗DNA自身抗体2C4C2的CDR的识别比对基于抗DNA抗体5G12的CDR的识别要差。此外，已经证明基于上文提到的WO 96/30057中鼠自身抗体CDR的肽的许多类似物在抑制效应上并不有效，因此无法预测或提示在基于本发明人单克隆抗DNA抗体CDR的肽序列上的修饰是有效的。此外，对于人类应用，应当认为应用基于人类抗体的肽优于应用基于非人类抗体的肽。
因此，本发明在一方面涉及选自以下的合成肽
(a)一种至少12个氨基酸残基、至多30个氨基酸残基的肽或者所述肽的盐或化学衍生物，所述肽包含人单克隆抗DNA 16/6Id抗体重链或轻链的互补决定区(CDR)的序列或所述互补决定区内存在的序列(下文称为“hCDR序列”)，或者包含如下获得的序列(i)用不同氨基酸残基取代所述hCDR序列的一个或多个氨基酸残基；(ii)所述hCDR序列缺失一个或多个氨基酸残基；和/或(iii)在所述hCDR序列添加一个或多个氨基酸残基；(b)双合成肽，所述双合成肽包含两种不同的所述(a)肽，这两种肽相互之间直接共价连接或通过短连接链共价连接；(c)包含多个所述(a)肽序列的肽聚合物；和(d)附着到大分子载体上的(a)肽或(c)肽聚合物。
人单克隆抗DNA 16/6Id抗体在本文称为“人16/6Id mAb”，是能够在小鼠中引起SLE样疾病的致病性人单克隆抗DNA抗体。
根据本发明包含上文所定义的hCDR序列的肽在本文中称为“hCDR肽”。
在一个优选实施方案中，所述hCDR肽包括人16/6Id mAb重链的CDR序列，更优选是CDR1或CDR3，例如，包括但不限于本文称为hCDR1和hCDR3的肽，所述两种肽分别基本如SEQ ID NO6和SEQ ID NO7陈述的序列，如下所示GYYWSWIRQPPGKGEEWIG [SEQ ID NO6]YYCARGLLRGGWNDVDYYGMDV [SEQ IDNO7]另一方面，本发明提供药用组合物，所述药用组合物包含至少一种本发明的合成肽或肽聚合物以及药学上可接受的载体。所述药用组合物尤其通过调节SLE患者体内SLE相关反应，即负调节MMP-3和/或MMP-9的水平和/或IL-2和/或IFN-γ活性，或正调节TGF-β活性水平，从而尤其用于治疗SLE和缓解其疾病临床表现。
又一方面，本发明涉及用于治疗SLE的方法，所述方法包括给予SLE患者有效量本发明的肽或肽聚合物。本发明还涉及免疫调节SLE患者体内的SLE相关反应的方法，例如负调节SLE患者体内MMP-3和/或MMP-9的水平和/或IL-2和/或IFN-γ活性，或正调节TGF-β活性水平，所述方法包括给子SLE患者有效量本发明的肽或肽聚合物。
再一方面，本发明涉及评价药物在治疗SLE患者中的有效性的方法，所述方法包括在不同时间间隔测量从用所述药物治疗的所述患者获取的血液样品中的MMP-3和/或MMP-9水平，由此把MMP-3和/或MMP-9水平降低与药物疗效联系起来。
本发明又一方面涉及评价药物疗效的方法，该方法包括在不同时间间隔从用所述药物治疗的患者获取的血液样品中的IL-2和/或IFN-γ水平，由此把IL-2和/或IFN-γ水平降低与药物有效性联系起来。
另一方面，本发明涉及评价药物在治疗SLE患者中的有效性的方法，所述方法包括在不同时间间隔测量从用所述药物治疗的所述患者获取的血液样品中的TGF-β水平，由此把TGF-β水平升高与药物有效性联系起来。
可以根据上面任何一种方法评价有效性的药物可以是，例如但不限于，根据本发明的肽或上文提到的WO 96/30057中所述的鼠肽。
附图简述图1显示300μg hCDR1处理抑制用人16/6Id mAb免疫的小鼠的淋巴结细胞对不同浓度16/6Id mAb(0.1-10μg/孔)的增殖反应。
图2显示50μg hCDR1处理抑制用人16/6Id mAb免疫的小鼠的淋巴结细胞对不同浓度16/6Id mAb(0.1-10μg/孔)的增殖反应。
图3A-C显示用人16/6Id mAb免疫并用hCDR1或不相关肽p259-271处理的BALB/c小鼠中的细胞因子模式。图3A-IFN-γ模式；图3B-TGF-β模式；图3C-IL-10模式。
图4显示最佳化刺激SLE患者和健康对照的PBL所需的人抗DNA16/6Id mAb浓度。用不同浓度16/6Id mAb刺激PBL。产生最高刺激指标的浓度定义为最适于触发增殖反应。
图5显示在缺乏或存在hCDR1或hCDR3的情况下，来自一名用促分裂原植物凝集素(PHA)刺激的SLE患者的PBL增殖。
图6显示在缺乏或存在人肽hCDR1或hCDR3、或鼠肽mCDR3的情况下，来自一名用人16/6Id mAb刺激的SLE患者的PBL增殖。
图7显示在缺乏或存在hCDR1或hCDR3或鼠反向肽revmCDR1和revmCDR3的情况下，来自一名用人16/6Id mAb刺激的SLE患者的PBL增殖。
图8显示在缺乏或存在hCDR1或hCDR3的情况下，抑制用人16/6Id mAb触发的SLE患者的PBL的IL-2分泌。
图9显示在缺乏或存在hCDR1或hCDR3的情况下，正调节一名代表性的用人16/6Id mAb刺激的SLE患者的PBL的TGF-β分泌。
图10显示在未处理或用300μg hCDR1处理或用反向肽revhCDR1(用作对照)处理的(NZB x NZW)F1小鼠中的抗DNA自身抗体水平。
图11A-11D是照片，显示来自易患SLE的(NZB x NZW)F1小鼠的有代表性的肾切片，所述小鼠从5个半月龄开始接受PBS(11A，11B)或用100μg hCDR1(11C，11D)处理。所述切片是在9月龄处死的小鼠的切片。为检测Ig沉积，用缀合FITC的山羊抗鼠IgG(γ链特异性)温育所述切片(11A、11C x 100；11B、11D x 400)。
图12A-12F是照片，显示来自易患SLE的(NZB x NZW)F1小鼠的有代表性的肾切片，所述小鼠用PBS(12A，12B)或用300μg hCDR1(12C，12D)处理，或者用反向肽revhCDR1(12E，12F)处理。所述切片是在9月龄处死的小鼠的切片。为检测免疫复合物Ig沉积，用缀合FITC的山羊抗鼠IgG(γ链特异性)温育所述切片(12A、12C、12E x100；12B、12D、12F x 400)。
图13A-13C显示用ELISA测量得到的在易患SLE的(NZB xNZW)F1小鼠脾细胞的Con A刺激培养物上清中的细胞因子模式，所述小鼠未处理或用hCDR1处理或用反向肽revhCDR1处理。图13A-IFN-γ模式；图13B-IL-10模式；图13C-TGF-β模式。
图14A-14F是照片，显示患有16/6Id诱导的实验性SLE的BALB/c小鼠有代表性的肾切片，所述小鼠用PBS(14A，14B)处理或用200μghCDR1(14C，14D)处理，或者用反向肽revhCDR1(14E，14F)处理。所述切片是在9月龄处死的小鼠的切片。为检测免疫复合物Ig沉积，用缀合FITC的山羊抗鼠IgG (γ链特异性)温育所述切片(14A、14C、14E x 100；14B、14D、14F x 400)。
图15A-15E显示用ELISA测量得到的在16/6Id诱导的实验性SLE的BALB/c小鼠的16/6Id刺激的淋巴结培养物的上清中的细胞因子模式，所述小鼠未处理或用hCDR1处理(200或300μg)或用反向肽revhCDR1处理。在16/6Id触发的脾细胞的上清中测得图15A-IFN-γ模式；图15B-TNF-α模式；图15C-IL-10模式；图15D-TGF-β模式；图15E-TGF-β模式。
图16A-16F是照片，显示易患SLE的(NZB x NZW)F1小鼠有代表性的肾切片，所述小鼠未处理(16A，16B)或者接受来自用300μghCDR1(16C，16D)或反向肽revhCDR1(16E，16F)处理的小鼠的脾细胞。为检测免疫复合物Ig沉积，用缀合FITC的山羊抗鼠IgG(γ链特异性)温育所述切片(16A、16C、16E x 400；16B、16D、16F x 100)。
图17A-17B描述MMP-3、MMP-2和MMP-9在(NZB x NZW)F1小鼠血清内出现的动力学。在指定时间点从(NZB x NZW)F1小鼠(10只小鼠/组)采血。使用蛋白质印迹，测试从每组小鼠汇集的血清(4μl)中的MMP-3表达水平(图17A)，使用凝胶酶谱法测试MMP-9和MMP-2活性(图17B)。结果代表4个相似的实验。
图18A-18B描述MMP-3、MMP-2和MMP-9在BALB/c小鼠的血清内出现的动力学。在指定时间点从未免疫的BALB/c小鼠(10只小鼠/组)或者用PBS/CFA(10只小鼠/组)或16/6Id(在CFA中；10只小鼠/组)免疫的小鼠采血。使用蛋白质引迹，测试从每组小鼠汇集的血清(4μl)中的MMP-3表达水平(图18A)，使用凝胶酶谱法测试MMP-9和MMP-2活性(图18B)。结果代表3个相似的实验。
图19A-19C描述免疫后BALB/c小鼠的肾切片针对MMP-3和MMP-9进行的免疫染色。未免疫的BALB/c小鼠或用PBS/CFA或16/6Id(在CFA中)免疫的小鼠(3只小鼠/组)在接受16/6Id的加强后，于5.5个月处死。取出肾，将它们的5μm恒冷箱切片针对MMP-3(19A)和MMP-9(19B)进行免疫染色。进行对照染色以确认阻断的效率(19C)。(x200)。结果代表3个类似的实验。
图20A-20B描述在用mCDR1处理的(NZB x NZW)F1小鼠的血清中MMP-3和MMP-9的水平。在预防实验中，从小鼠2月龄开始，在10周内为小鼠(10/组)每周皮下注射给予mCDR1。结果代表处理结束后4个月所采的血清。在治疗实验中，从5月龄开始为小鼠(10/组)皮下注射PBS或250μg/小鼠mCDR1。结果代表处理结束后3周所采的血清。使用蛋白质印迹分析(20A)测试每个实验组汇集血清中的MMP-3水平，使用凝胶酶谱法(20B)测试MMP-9活性。UT-未处理。结果代表2个相似的实验。
图21A-21B描述用mCDR1处理的16/6Id免疫BALB/c小鼠中MMP-3和MMP-9的水平。在预防实验中，用mCDR1(100μg/小鼠)静脉内处理小鼠(8/组)。所显示的结果是使用处理结束后4.5个月所采血清获得的结果。在治疗实验中，用100μg/小鼠mCDR1皮下处理小鼠(8/组)。结果是使用处理结束时所采血清获得的结果。通过蛋白质印迹分析(21A)测试从每个实验组汇集的血清中的MMP-3，通过凝胶酶谱法测试MMP-9活性(21B)。UT-未处理。结果代表2个相似的实验。
图22A-22B描述16/6Id免疫的BALB/c小鼠的肾切片针对MMP-3和MMP-9进行的免疫染色，所述小鼠接受mCDR1以预防(22A)或治疗(22B)实验性SLE。引发疾病8个月后处死小鼠，取出它们的肾。制备恒冷箱切片(5μm)，针对MMP-3、MMP-9以及免疫复合物沉积的存在进行免疫染色(x 200)。(W/O)-控制染色达到阻断的效率，不使用第一抗体。结果代表2个相似的实验。
图23A-23B描述在用hCDR1处理的(NZB x NZW)F1小鼠血清中的MMP-3和MMP-9水平。在治疗实验中，从小鼠7月龄开始的十周内，每周一次用PBS或100μg或30μg/小鼠hCDR1皮下注射处理小鼠(10/组)。结果代表使用治疗中期采集血清获得的结果。通过蛋白质印迹分析(23A)测试从每个实验组汇集的血清中的MMP-3水平，通过凝胶酶谱法测试MMP-9活性(23B)。UT-未处理。结果代表2个相似的实验。
图24描述一块有代表性的凝胶，该凝胶显示在SLE患者和健康对照的血清中MMP-2和MMP-9活性。通过凝胶酶谱法分析40个SLE患者以及25个健康对照的血清(5μl)中的MMP-2或MMP-9活性。本图显示用这两个组的血清样品获得的代表性结果。
图25描述一张图，该图显示对SLE患者(黑柱)和健康对照(白柱)的血清中MMP-2和MMP-9活性的定量分析。使用比活测定试剂盒测定三十六份SLE患者血清样品以及15份健康对照血清样品的MMP-2或MMP-9活性。结果表示为平均值±s.e.m.。*P＝0.0302。
图26A-26B是显示SLE患者体内MMP-9活性水平和疾病活动指数(SLEDAI)的图。使用比活测定试剂盒测定来自8名男性(图26A)和27名女性(图26B)SLE患者总共三十五份SLE患者血清样品的MMP-9活性。给出根据患者SLEDAI的MMP-9活性分布。虚线表示健康对照体内的MMP-9活性。
图27A-27B是图，显示从两个SLE患者在4-6年病程中所采血清中MMP-2(白环)和MMP-9(黑环)活性的模式。使用比活测定试剂盒测定血清的MMP-2或MMP-9活性。所述测定一式两份进行。
发明详述在一方面，本发明涉及合成肽，所述合成肽包含在致病性人单克隆抗DNA 16/6Id抗体(本文中称为“人抗DNA 16/6Id mAb”或“人16/6Id mAb”)重链或轻链的CDR序列，或包含在所述CDR序列中存在的序列，其中所述抗体在小鼠中引起SLE样疾病。
本发明中源于人16/6Id mAb CDR的合成肽在本文中称为hCDR肽，所述肽最好基于在人16/6Id mAb重链CDR。
人16/6Id mAb的VH序列的CDR区在Waisman等，1995的图4A中加框显示。所述人16/6Id mAb的重链的CDR区具有实质上由SEQID NO8到SEQ ID NO10所描述的序列，如下所示CDR1FSGYYWS [SEQ ID NO8]CDR2EINHSGSTNYKTSLKS[SEQ ID NO9]CDR3GLLRGGWNDVDYYYGMDV [SEQ ID NO10]本发明的hCDR肽包含至少12个氨基酸残基、至多30个氨基酸残基，并且优选包含与选自SEQ ID NO8、9和10之一的序列相同的序列，或更优选在所述SEQ ID NO8、9或10中存在的序列，或包含如下获得的序列(i)用不同氨基酸残基取代SEQ ID NO8、9和10序列中的一个或多个残基；(ii)SEQ ID NO8、9和10序列缺失一个或多个氨基酸残基；或(iii)在SEQ ID NO8、9和10序列中添加一个或多个氨基酸残基。
本发明的hCDR肽除所述hCDR序列外，还包含其它氨基酸残基，最好是在所述hCDR序列侧翼的人16/6Id mAb序列的氨基酸残基，或者如下获得的序列的氨基酸残基用不同氨基酸残基取代所述hCDR侧翼序列的一个或多个氨基酸残基、缺失所述hCDR侧翼序列的一个或多个氨基酸残基或在所述hCDR侧翼序列中添加一个或多个氨基酸残基。
因此，在一个实施方案中，本发明提供合成肽，所述合成肽基于人16/6Id mAb重链的CDR1，所述CDR1区是实质上如SEQ ID NO8所描述的序列，所述肽选自以下(a)一种肽或该肽的盐或化学衍生物，所述肽包含SEQ ID NO8的序列或包含SEQ ID NO8中存在的序列，或者所述肽包含如下获得的序列(i)用不同氨基酸残基取代所述SEQ ID NO8的一个或多个氨基酸残基；(ii)从所述SEQ ID NO8缺失一个或多个氨基酸残基；和/或(iii)在所述SEQ ID NO8中添加一个或多个氨基酸残基。
(b)双合成肽，所述双合成肽包含两种不同的所述(a)肽，这两种肽相互之间直接共价连接或通过短连接链共价连接；(c)包含多个所述(a)肽序列的肽聚合物；和(d)附着到大分子载体上的(a)肽或(c)肽聚合物。
在本发明的一个优选实施方案中，基于人16/6Id mAb的重链的CDR1的肽是具有实质上如SEQ ID NO11所描述的序列的肽X1YYWSWIX2QX3PX4X5GX6EWIG[SEQ ID NO11]其中X1是G或TG；X2是R或K；X3是P或S；X4是G或E；X5是K或D；X6是E、L或S。
在更优选的实施方案中，SEQ ID NO11的肽是具有实质上如SEQID NO6所述的序列的在本文中名为“hCDR1肽”或简称为“hCDR1”的19体肽，SEQ ID NO6如下所述GYYWSWIRQPPGKGEEWIG[SEQ ID NO6]在hCDR1中，在SEQ ID NO8内的序列GYYWS之后是人16/6IdmAb重链的CDR1天然序列，只是在所述肽hCDR1位置15上谷氨酸残基(E)(粗体)取代mAb的天然亮氨酸(L)残基。
在另一实施方案中，SEQ ID NO11的肽是通过在hCDR1肽序列中取代和/或添加氨基酸残基而获得的hCDR1肽的类似物，其例子是具有实质上如SEQ ID NO12到SEQ ID NO18序列的肽(其中取代或添加的氨基酸用粗体表示)
GYYWSWIRQPPGKGLEWIG[SEQ ID NO12]GYYWSWIRQPPGKGSEWIG[SEQ ID NO13]GYYWSWIRQPPGDGEEWIG[SEQ ID NO14]GYYWSWIKQPPGKGEEWIG[SEQ ID NO15]GYYWSWIRQSPGKGEEWIG[SEQ ID NO16]GYYWSWIRQPPEKGEEWIG[SEQ ID NO17]TGYYWSWIRQPPGKGEEWIG[SEQ ID NO18]在又一实施方案中，本发明提供合成肽，所述合成肽基于人16/6IdmAb重链的CDR3，所述CDR3区是实质上如SEQ ID NO10所描述的序列，所述肽选自以下(a)一种肽或该肽的盐或化学衍生物，所述肽包含SEQ ID NO10的序列或包含SEQ ID NO10中存在的序列，或者所述肽包含如下获得的序列(i)用不同氨基酸残基取代所述SEQ ID NO10的一个或多个氨基酸残基；(ii)从所述SEQ ID NO10缺失一个或多个氨基酸残基；和/或(iii)在所述SEQ ID NO10中添加一个或多个氨基酸残基；(b)双合成肽，所述双合成肽包含两种不同的所述(a)肽，这两种肽相互之间直接或通过短连接链共价连接；(c)包含多个所述(a)肽序列的肽聚合物；和(d)附着到大分子载体上的(a)肽或(c)肽聚合物。
在本发明的一个优选实施方案中，基于人16/6Id mAb重链CDR3的肽是具有实质上如SEQ ID NO19所描述的序列的肽YYCARX1LLX2X3X4X5X6DVDYX7GX8DV[SEQ ID NO19]其中X1是G或F；X2是R或A；X3是G或A；X4是G或A；X5是W或A；X6是N或A；X7是Y或W；X8是M或Q。
在更优选的实施方案中，SEQ ID NO19的肽是SEQ ID NO7的在本文中名为“hCDR3肽”或简称为“hCDR3”的肽，SEQ ID NO7如下所述YYCARGLLRGGWNDVDYYGMDV[SEQ ID NO7]
在hCDR3中，人16/6Id mAb重链CDR3区的序列GLLRGGWNDVDYYYGMDV[SEQ ID NO10]的改变是缺失其中一个酪氨酸(Y)残基，在该序列之前是所述mAb的天然序列。
在另一实施方案中，SEQ ID NO19的肽是通过在hCDR3肽序列中取代和/或添加氨基酸残基而获得的hCDR3肽的类似物，其例子是具有SEQ ID NO20到SEQ ID NO27序列的肽(其中取代或添加的氨基酸用粗体表示)YYCARGLLRGGWADVDYYGMDV[SEQ ID NO20]YYCARGLLRGGANDVDYYGMDV[SEQ ID NO21]YYCARGLLRGAWNDVDYYGMDV[SEQ ID NO22]YYCARGLLRAGWNDVDYYGMDV[SEQ ID NO23]YYCARGLLAGGWNDVDYYGMDV[SEQ ID NO24]YYCARFLLRGGWNDVDYYGMDV[SEQ ID NO25]YYCARGLLRGGWNDVDYYGQDV[SEQ ID NO26]YYCARGLLRGGWNDVDYWGMDV[SEQ ID NO27]在再一实施方案中，本发明提供合成肽，所述合成肽基于人16/6IdmAb重链的CDR2，所述CDR2区是实质上如SEQ ID NO9所描述的序列，所述肽选自以下(a)一种肽或该肽的盐或化学衍生物，所述肽包含SEQ ID NO9的序列或包含SEQ ID NO9中存在的序列，或者所述肽包含如下获得的序列(i)用不同氨基酸残基取代所述SEQ ID NO9的一个或多个氨基酸残基；(ii)从所述SEQ ID NO9缺失一个或多个氨基酸残基；和/或(iii)在所述SEQ ID NO9中添加一个或多个氨基酸残基；(b)双合成肽，所述双合成肽包含两种不同的所述(a)肽，这两种肽相互之间直接或通过短连接链共价连接；(c)包含多个所述(a)肽序列的肽聚合物；和(d)附着到大分子载体上的(a)肽或(c)肽聚合物。
本发明的合成肽具有12-30个氨基酸残基、优选17-23个氨基酸残基、最优选19-22个氨基酸残基，可以通过化学合成或通过重组技术用本领域内众所周知的方法生产。
当制备通过取代氨基酸残基而获得的如上所述类似物时，重要的是所述取代不明显累积性改变未取代母肽的体积、疏水-亲水模式和对应部分的电荷。因此，可以用亲水性残基取代疏水性残基，或者相反，只要总效应不在实质上改变对应未取代母肽的体积、疏水-亲水模式和电荷。
本发明还包括本发明肽的化学衍生物。所述“化学衍生物”包含并不通常是所述肽的一部分的其它化学部分，只要所述衍生物保留所述肽的至少部分功能以允许它可用于预防或抑制T细胞增殖性反应和自身免疫病，所述衍生物包括在本发明范围内。例如，化学衍生物可能源于能够与所述肽的选定测链或末端残基反应的有机衍生剂的反应，并最好保留所述肽的至少部分功能，以特异性抑制对SLE引起的自身抗体有高反应性的小鼠T淋巴细胞的增殖反应和细胞因子分泌。在这些化学衍生物中，酰胺尤其受到关注，包括在C末端羧基的酰胺和在天冬氨酸残基或谷氨酸残基的游离羧基基团的酰胺。许多这样的化学衍生物和制造它们的方法是本领域内众所周知的。
本发明的范围内还包括本发明所述肽的盐和类似物。本文所用术语“盐”指羧基基团的盐以及所述肽分子的氨基基团的酸加成盐。羧基基团的盐可以通过本领域内已知的方法形成，包括无机酸盐和有机碱盐，无机酸盐例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐或锌盐等等，有机碱盐例如与胺形成的盐，所述胺例如三乙醇胺、精氨酸或赖氨酸、哌啶、普鲁卡因等等。酸加成盐包括，例如，与无机酸如盐酸或硫酸形成的盐，以及与有机酸如乙酸或草酸形成的盐。所述化学衍生物和盐最好用于修饰所述肽的药学特性，包括稳定性、溶解度等等。
可以如下选择依照本发明的hCDR肽使用对诱导SLE的自身抗体有高反应性的小鼠，测试所述hCDR肽抑制所述小鼠T淋巴细胞增殖反应的潜力。一旦产生依照本发明的肽，本领域内一般技术人员不必进行过度实验而使用如本文所述那些测试就可以容易地确定所述肽抑制小鼠(所述小鼠对诱导SLE的自身抗体有高反应性)T淋巴细胞增殖反应的能力。一个可以容易进行的测试是用于测试所述肽抑制某些特异性针对诱导SLE的自身抗体的T细胞系和集落体外增殖反应的能力。所述T细胞系和集落可以是，例如，采用以前描述的方法(Axelrod，O.和Mozes，E.Immunobiology，172，99(1986))从小鼠免疫淋巴结细胞建立的特异性针对16/6Id mAb的T细胞系和克隆(Fricke等，1991)。细胞每两周就暴露于在富集培养基中辐射过的同系脾细胞上呈递的刺激抗体。通过标准限制稀释技术克隆所述T细胞。使用例如在WO 96/30057中材料与方法部分(g)描述的方法测试这些T细胞系和集落的增殖反应。
为选择具有所需活性的类似物而可以进行的另一种测试是测试所述合成肽在母肽存在下抑制所述T细胞系和克隆帮助肽特异性B细胞的能力。也可以测试所述合成肽在生物素化后直接结合相关株抗原呈递细胞上II类MHC产物的能力。为此目的，在水溶液中过量生物素-N-羟基琥珀酰亚胺存在下，0℃下N末端生物素化所述相关肽(Mozes等，1989)。小鼠脾粘附细胞或PBL-粘附细胞(1×106/样品)在含0.1％牛血清白蛋白的PBS中(PBS/BSA)37℃下与生物素化肽温育20小时，然后与藻红蛋白-链霉抗生物素在4℃下温育30分钟。每次温育后，细胞都用上述溶液洗涤两次。此后，使用FACScan通过流式细胞术分析细胞。在每次分析中，最少检查5000个细胞(关于上述方法参见例如Mozes等，1989)。
可以进行的另一个测试是测试所述肽抑制细胞因子分泌的能力，所述细胞因子分泌是指来自对诱导SLE的自身抗体有高反应性的小鼠的T细胞系或T淋巴细胞或淋巴结细胞的细胞因子分泌。如下检测细胞因子通过ELISA评价IL-1活性，所述ELISA使用一对捕获和检测抗体(如下文针对IL-4、IL-6、IL-10所述)。使用依赖于IL-2的CTLL直接检测IL-2，或通过ELISA检测IL-2。通过ELISA测定上清液中IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α水平，所述ELISA根据厂家指导使用针对各种细胞因子的抗体(Pharmingen，San Diego，Ca.，USA)。此外，可以通过如本文在下面实施例所述的ELISA评价所述肽提高免疫抑制性细胞因子TGF-β分泌水平的能力。
在这些体外测试的一种或多种中显示阳性的肽预期将有体内活性。然而，不需要过度实验，也可以进行体内测试。因此，例如，可以在第-3天或第0天为成年小鼠注射候选肽。然后用引起疾病的自身抗体或所述肽免疫小鼠。十天以后，测试所述小鼠淋巴结细胞应答所述免疫原而增殖的能力，以发现所述候选肽的抑制能力。
另一个这样的体内动物试验包括直接测量针对小鼠模型体内上文所述SLE产生的治疗作用。可以注射所述肽入小鼠体内，其中通过不同途径、以不同剂量并采用不同时间表，诱导实验性SLE。此外，可以定期测试接受处理的小鼠，以测定所述肽对于所述小鼠体内由诱导SLE的自身抗体引发的自身抗体反应和疾病表现的效应。
另一种体内方法包括评价候选肽治疗自发产生SLE的小鼠(如(NZB x NZW)F1小鼠)的能力，如本文实施例所述。
因此，可以看到，除已经在本文实施例中证明可操作的优选实施方案外，本领域内的一般技术人员将能够根据本文陈述的方针确定也可操作的其它类似物，而不需要进行过度实验。
在另一优选实施方案中，本发明提供多表位单肽，如二肽。在一个实施方案中，所述二肽包括基于同一CDR的两种不同的肽，例如包括人16/6Id mAb重链CDR1序列(SEQ ID NO8)或CDR3序列(SEQ ID NO10)的两种不同的肽。
在又一更优选的实施方案中，所述二肽包括两种基于不同CDR的不同的肽，例如一种肽包括人16/6Id mAb重链CDR1的序列(SEQ IDNO8)，另一种肽包括人16/6Id mAb重链CDR3的序列(SEQ IDNO10)。
依照本发明的二肽最好包括两种不同的肽，一种是SEQ ID NO11的肽，另一种是SEQ ID NO19的肽，更优选一种肽选自SEQ ID NO6和SEQ ID NO12-18，另一种肽选自SEQ ID NO7和NO20-27，最优选一种肽是SEQ ID NO6的肽，另一种是SEQ ID NO7的肽，所述两种不同的肽相互之间或者直接共价连接，或者通过短连接链如一段丙氨酸共价连接，或通过推定的组织蛋白酶蛋白水解位点连接。关于这种位点，见例如美国专利5,126,249和欧洲专利495049。
在再一优选实施方案中，本发明提供多表位单肽，所述多表位单肽以肽聚合物的形式包括本发明的多个同种或不同的肽，通过用合适的聚合剂如0.1％戊二醛使所述肽聚合，得到所述肽聚合物(Audibert等，1981，Nature 289593)。所述聚合物最好包含5到20个肽残基，优选包含SEQ ID NO6、7和11-27的肽。也可以通过使所述肽交联或将多个肽附着到大分子载体上，形成所述肽聚合物。合适的大分子载体是，例如，蛋白质如破伤风类毒素，以及氨基酸的线性或分支共聚物，例如L-丙氨酸、L-谷氨酸和L-赖氨酸的线性共聚物和L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-丙氨酸和L-赖氨酸(T，G)-A-L-的分支共聚物或者多链聚-DL-丙氨酸(M.Sela等，1955，J.Am.Chem.Soc.776175)。如下获得所述缀合物例如，首先将所述肽与水溶性碳二亚胺(如1-乙基-3-(3′-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)偶联，然后与所述大分子载体偶联，如Muller，G.M.等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79569所述。进行氨基酸分析，与单独所述载体的组成相比较，确定每种缀合物内偶联的肽的含量。
根据本发明的又一实施方案，可以将一种或多种活性肽附着到合适的大分子载体上，或者在戊二醛存在下聚合。
将所述肽、它们的聚合物或它们与合适大分子载体的缀合物以保证它们的生物利用率、使它们适用于治疗的形式给予患者。假如发现本发明一种以上的肽有显著的抑制活性，就将这些肽以包含它们的混合物的制剂给予患者。
因此，本发明还涉及药用组合物，所述药用组合物包括至少一种依照本发明的合成肽或肽聚合物，可选还有药学上可接受的载体。
在一个优选实施方案中，所述药用组合物包括至少一种本发明的合成肽，更优选是选自以下的肽肽hCDRl[SEQ ID NO6]和hCDR3[SEQ ID NO7]以及通过在hCDR1和hCDR3序列中取代和/或添加氨基酸残基而获得的肽，尤其是选自以下的肽SEQ ID NO12到SEQ IDNO18以及SEQ ID NO20到SEQ ID NO27的肽。
本发明包括任何合适的给药途径，包括口服途径、静脉内途径、皮下途径、关节内途径、肌内途径、吸入途径、鼻内途径、鞘内途径、腹膜内途径、皮内途径、经皮途径或其它已知途径，包括肠途径。在优选实施方案中，通过口服途径、鼻内途径或皮下途径给予本发明的肽。
本发明组合物的给药剂量范围应当足以产生所需效应，例如，根据体外T细胞增殖测量，在实质上预防或抑制针对诱导SLE的自身抗体的免疫反应，并进而显著治疗所述疾病。所述剂量应当不足以引起副作用，例如不希望有的交叉反应、全身化免疫抑制、过敏反应等等。
本发明的肽用于治疗SLE的有效剂量在约1μg到1mg并高达100mg/kg体重的范围内。
本发明的合成人类肽目标在于抑制或阻抑SLE患者的特异性抗原反应，而不影响所有其它免疫反应。该方法非常重要，因为大多数确诊患者是年轻妇女，需要治疗许多年，而目前接受的SLE治疗涉及给予免疫抑制剂，如皮质甾类和/或细胞毒性药物，而这些免疫抑制剂缺乏特异性，并且有多种副作用。
本发明还涉及治疗系统性红斑狼疮(SLE)的方法，包括给予SLE患者有效量本发明的肽或肽聚合物。在一个优选实施方案中，所述方法包括给予SEQ ID NO6的肽。在另一个优选实施方案中，所述方法包括给予SEQ ID NO7的肽。
本发明还涉及免疫调节SLE患者体内SLE相关反应的方法，所述方法包括给予所述SLE患者有效量本发明的肽或肽聚合物。在一个实施方案中，所述方法包括负调节SLE患者体内基质金属蛋白酶(MMP)-3和/或MM-9活性的水平。在另一实施方案中，所述方法包括免疫调节SLE患者体内细胞因子活性的水平，尤其是负调节SLE患者体内IL-2和/或IFN-γ活性的水平和/或正调节TGF-β活性的水平。在一个优选实施方案中，所述方法包括给予SEQ ID NO6的肽。在另一个优选实施方案中，所述方法包括给予SEQ ID NO7的肽。
本发明还提供评价药物对于治疗SLE患者的有效性的方法，所述方法包括在不同时间间隔测量从用所述药物治疗的所述患者获得的血液样品中MMP-3、MMP-9、IL-2、IFN-γ和/或TGF-β的水平，因为MMP-3、MMP-9、IL-2和/或IFN-γ的水平降低或TGF-β的水平升高与所述药物的有效性相关。
本发明还涉及应用本发明的肽或肽聚合物制备药用组合物，尤其用于治疗SLE，更具体地说用于免疫调节SLE患者体内的SLE相关反应，例如负调节SLE患者体内的MMP-3和/或MMP-9和/或IL-2和/或IFN-γ水平，或正调节TGF-β的水平。
本发明将在下面非限制性的实施例和附图中更详细地说明。
实施例材料和方法小鼠。雌性(NZB x NZW)F1小鼠得自Jackson Laboratory(BarHarbor，ME)。6-8周龄BALB/c纯系雌性小鼠得自Experimental AnimalUnit，The Weizmann Institute of Science，Rehovot，Israel。
抗DNA单克隆抗体。以前已经特征鉴定携带16/6Id(IgGl/k)的人抗DNA mAb(Shoenfeld等，1982；Waisman等，1995)。所述mAb由在培养物中培养的杂交瘤细胞分泌，并使用蛋白G-Sepharose柱(Pharmacia，Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)纯化。
合成肽。如以前所述(WO 96/30057)，或使用自动化合成仪(Applied Biosystems 430A型，Germany)采取该公司用于t-butyloxycarbonyl(t-Boc)技术的方法，制备合成鼠肽mCDR1(SEQ IDNO1)和mCDR3(SEQ ID NO3)以及按mCDR1和mCDR3的反向顺序以及按人类肽hCDR1的反向顺序合成的反向肽，所述反向肽在本文中分别定义为revmCDR1[SEQ ID NO28]、revmCDR3[SEQ IDNO29]和revhCDR1[SEQ ID NO30]，用作对照。
所述反向肽具有如下序列GIWELSKEPSQKVWQMYYGTrevmCDR1[SEQ ID NO28]SGQGWYDMAYPEWLFRACYYrevmCDR3[SEQ ID NO29]GIWEEGKGPPQRIWSWYYG revhCDR1[SEQ ID NO30]诱导和治疗实验性SLE。为诱导实验性SLE，用1-2μg人mAb16/6Id免疫BALB/c小鼠，并在3周后加强。为预防实验性SLE，在免疫的同时静脉内(i.v.)或皮下给予小鼠hCDR1或hCDR3(mCDR1或revmCDR1在实施例12中用作对照)，此后5周每周对所述小鼠进行注射。在用16/6Id引起疾病三个半月后已经观察到临床表现时，开始对已经建立的疾病进行治疗。在实施例12中，每周以100μg/小鼠的剂量注射小鼠(静脉内或皮下)共10周。
用hCDR1或mCDR1肽预防和治疗(NZB x NZW)F1小鼠体内的SLE样疾病。为预防SLE，在观察到2月龄的小鼠出现疾病表现之前，每周为小鼠皮下注射hCDR1(或实施例12中的mCDR1，250μg/小鼠)共10周。为治疗已经建立的疾病，每周为5-7月龄的小鼠注射hCDR1(在实施例12中，皮下注射mCDR1，250μg/小鼠)共10周。
増殖性反应。通过Ficoll-Hypaque(Pharmacia)密度梯度离心从肝素化的静脉血分离PBL。所有测定都在平底微量滴定板(Falcon，BectonDickinson，Oxmard，CA，USA)上一式三份进行，其中如所述(Dayan等，2000)在富集的RPMI-1640中培养2×105PBL。使所述PBL暴露于不同浓度(0.1-40μg/孔)的人抗DNA 16/6Id mAb，同时添加或不添加浓度至少超过16/6Id浓度十倍的各种基于CDR的肽。在每个实验中使用植物凝集素(PHA；2μg/孔)作为培养条件的对照。所述培养物在37℃下7.5％CO2中温育6天。在收获细胞十八小时前，在所有培养物中加入[3H]-胸苷(5Ci/mmol的0.5μCi)(Nuclear Research Center，Negev，Israel)。结果表示为三份平行培养物平均胸苷掺入的每分钟计数(CPM)±SD，或表示为刺激指数(S.I.；人16/6Id最佳浓度下的平均CPM与仅存在培养基时平均CPM的比值)。S.I.≥2被认为是阳性反应(Dayan等，2000)。高于50％的抑制(存在16/6Id和各种基于CDR的肽的情况下平均CPM与存在16/6Id而不存在基于CDR的肽的情况下的平均CPM的比值)被认为是阳性。
诱导细胞因子生产。小鼠用人16/6Id mAb免疫，并用或不用基于CDR的肽处理，在用所述肽处理的不同时期或处理后处死小鼠。收获脾细胞和淋巴结细胞(LNC)，在16/6Id存在下温育(5×106/ml)。在48小时和72小时后收集上清液。
评价上清液中的细胞因子。开始培养后48小时，收集上清液，保存于-70℃。通过ELISA测量IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α，所述ELISA根据厂家指导使用相关标准以及捕获和检测Ab(Pharmingen)。通过ELISA测定TGF-β。简要地说，用重组人TGF-β1sRII/Fc嵌合物(R & D Systems Inc.，Minneapolis，MN，USA)包被板，使用的第二Ab是生物素化抗人TGF-β1抗体(R & D Systems Inc.)。所使用的底物溶液是TMB颜色试剂(Helix Diagnostics，WestSacramento，CA)，使用570-nm和630-nm滤片评价酶活性。
检测SLE相关的临床和病理学表现。使用Combistix试剂盒(AmesDivision，Bayer Diagnostics，Newbury，U.K.)半定量测量蛋白尿。在含1％乙酸(体积比)的蒸馏水中10倍稀释肝素化血液，然后计数白细胞(WBC，就白细胞减少而言)。为进行免疫组织学分析，固定冰冻的肾切片(6μm)，用FITC缀合的山羊抗鼠IgG抗体(γ-链特异性；Sigma)。
ELISA。为测量抗DNA抗体，用甲基化BSA或聚L-赖氨酸(Sigma)包被96孔Maxisorb微量滴定板(Nunc)。洗板，然后用10μg/ml变性的小牛胸腺DNA(Sigma)或λ-噬菌体双链DNA(Boehringer Mannheim，5μg/ml)包被板。在用不同稀释度的血清温育后，在板内加入缀合辣根过氧化物酶(Jackson ImmunoResearch)的山羊抗小鼠IgG(γ链特异性)，然后加入底物2，2′-连氮基-双(3-乙基苯基噻唑啉-6-磺酸)(Sigma)。使用ELISA读板仪读取结果。
测量MMP-2和MMP-9的活性。通过凝胶酶谱法测试MMP活性。通过1mg/ml明胶聚合的8％SDS-PAGE分离从不同实验组个体小鼠汇集的血清。电泳后，凝胶在2.5％Triton X-100中洗涤30分钟一次，除去SDS，然后在含50mM Tris-HCl，200mM NaCl，10mMCaCl2和0.02％(重量/体积)Brij 35的反应缓冲液(pH 7.5)中洗涤30分钟一次。更换新鲜的反应缓冲液，将所述凝胶在37℃温育24小时。通过用0.5％考马斯亮蓝染色凝胶，显示明胶水解活性。
血清中MMP-3的蛋白质印迹。在12％SDS/PAGE上加载5μl每种血清的样品，在还原条件下分离，然后转移到硝酸纤维素上。用抗MMP-3抗体(Oncogene Research Products，MA，USA)探测印迹(0.5μg/ml，1小时，室温)，并使用化学发光显影。
针对MMP-3或MMP-9进行肾切片免疫染色。为针对MMP-3或MMP-9进行免疫染色，用冷丙酮固定(室温下5分钟)肾切片(5μm)，在PBS中洗涤两次，在0.05％Triton X-100(在PBS中稀释)中渗透(室温下1分钟)，然后在PBS中洗涤两次。为获得FITC标记的山羊抗小鼠的特异性抗MMP染色和避免对免疫复合物沉积的染色，用未标记的山羊抗小鼠IgG+IgM(在1％BSA/PBS中以1∶1稀释；(Jackson ImmunoResearch Laboratories))封闭(室温下1小时)，然后用含0.05％Tween的PBS洗涤3次。加入用1％BSA/PBS稀释的单克隆抗MMP-9抗体(1∶100；Chemicon Intemational，Inc.)或抗MMP-3抗体(1∶50；Oncogene Research Products)，在室温下温育30分钟。对于所有的免疫染色程序，都使用在1％BSA/PBS中稀释的FITC标记的山羊抗小鼠IgG+IgM(Jackson ImmunoResearch Laboratories)(室温下30分钟)。
统计分析。结果表示为平均值±SD。使用卡方检验、Wilcoxon检验、Mann-Whitney检验和t-检验进行统计分析。P≤0.05被认为具有显著性。
实施例1合成人肽hCDR1和hCDR3如所述，使用本领域内众所周知的方法制备人hCDR1(SEQ IDNO1)和hCDR3(SEQ ID NO3)肽，例如使用自动化合成仪应用化学固相合成或液相合成，采用厂家用于叔丁氧基羰基(t-Boc)、芴甲氧羰基(Fmoc)或其它α-氨基保护基团程序的方法(见，例如，PeptidesSynthesis，Structure and Applications，B.Gutte编辑，Academic Press，1995；Peptide Synthesis Protocols，M.Pennington和B.Dunn编辑，Humana Press，1994；Schnolzer M.等，Boc-化学固相肽合成中的原位中和，困难序列的快速、高产量组装。Int.J.Pept.Protein Res.40180-193，1992)。
实施例2用mCDR1和mCDR3免疫并用hCDR1和hCDR3处理的小鼠体内淋巴结细胞(LNC)增殖的抑制为确定人类肽hCDR1和hCDR3的抑制效应，我们首先测试它们在体内抑制用鼠肽mCDR1和mCDR3引发小鼠的能力。
为此，分别用mCDR1和mCDR3免疫BALB/c小鼠和SJL小鼠。将溶于CFA的免疫用鼠肽注射(10μg/小鼠)入hind footpad的真皮内。在免疫的同时，为BALB/c小鼠的组皮下(s.c.)注射溶于PBS中的200μg hCDR1，相似地为SJL小鼠的组注射hCDR3。免疫后十天，处死小鼠，收获淋巴结，测试所述细胞在用免疫肽触发后增殖的能力。简要地说，在含有不同浓度(1-20μg/孔)鼠免疫肽并补充1％正常小鼠血清的富集RPMI-1640培养基中培养免疫后小鼠的LNC(0.5×106/孔，一式三份)。温育四天后，添加3H-胸苷，继续培养16小时。然后收获细胞，用β-计数器计数放射性。
表1A和1B中的结果表示分别用mCDR1和mCDR3免疫并用hCDR1和hCDR3处理的小鼠的LNC增殖的最大抑制％。所述抑制根据未用抑制肽hCDR1和hCDR3处理的小鼠LNC的增殖进行计算。可以看到hCDR1和hCDR3能够抑制对免疫用小鼠CDR肽的增殖反应。
表1AhCDR1抑制从BALB/c获得的LNC应答mCDR1的增殖
表1BhCDR3抑制从SJL获得的LNC应答mCDR3的增殖
实施例3用人抗DNA 16/6Id mAb免疫并用hCDR1和hCDR3处理的小鼠体内LNC增殖的抑制因为我们的目标是测试基于人16/6Id自身抗体的CDR的肽的抑制能力，所以重要的是了解肽hCDR1和hCDR3是否能够抑制人16/6IdmAb完整分子的引发作用。为此，用溶于CFA的人16/6Id mAb(2μg/小鼠)在hind footpad真皮下引发BALB/c和SJL小鼠。在引发的同时，为BALB/c小鼠的组皮下给予溶于PBS中的200μg/小鼠hCDR1，为SJL小鼠皮下给予溶于PBS中的200μg/小鼠hCDR3。免疫后十天，处死小鼠，体外测试它们的LNC应答不同浓度(0.1-10μg/孔)人抗DNA16/6Id mAb而增殖的能力。
这些实验有代表性的结果显示于表2A和表2B。结果表示为与用16/6Id mAb免疫但未用肽hCDR1和hCDR3处理的小鼠相比，来自用所述肽免疫和处理的小鼠的淋巴结细胞应答免疫用人16/6IdmAb而增殖的最大抑制％。如结果所示，肽hCDR1和hCDR3都能够有效抑制应答人16/6Id mAb的引发。
表2AhCDR1抑制来自BALB/c的LNC应答人16/6Id mAb的增殖
表2BhCDR3抑制来自SJL的LNC应答人16/6Id mAb的增殖
进一步的实验证明在用人16/6Id mAb免疫的同时，经鼻给予低至10甚至2μg/小鼠肽hCDR1或hCDR3抑制淋巴结细胞应答所述免疫用抗体的增殖反应达到100％。
在另一个实验中，用溶于CFA的1μg人16/6Id在hind footpad真皮下免疫BALB/c小鼠，然后或者皮下注射溶于PBS中的300μg/小鼠hCDR1，或者不进行进一步的处理。十天后，处死小鼠，测试它们的LNC在体外应答人16/6Id而增殖的能力。因此，在不同浓度(0.1-10μg/孔)人抗DNA 16/6Id mAb存在下温育腘LNC(0.5×106)。在4天温育期的结尾，在所述培养物中加入3H-胸苷，培养最后18小时。收获细胞，计数放射性。
图1显示所述实验的结果，证明hCDR1有效抑制受到处理的小鼠的淋巴结细胞的增殖反应。在不同浓度16/6Id mAb下增殖抑制％如下0.1μg/孔-47％；1μg/孔-66％；5μg/孔-76％；和10μg/孔-62％。
用溶于PBS中的50μg hCDR1/小鼠重复上面的同样实验。图2显示hCDR1非常有效地抑制用完整抗DNA 16/6Id大分子在小鼠体内进行的引发，甚至皮下注射少至50μg的hCDR1也显著抑制淋巴结细胞应答16/6Id自身抗体而增殖的能力。在不同16/6Id mAb浓度下增殖的抑制％如下0.1μg/孔-98％；1μg/孔-76％；5μg/孔-73％；和10μg/孔-64％。
实施例4肽hCDR1免疫调节细胞因子产生用人16/6Id mAb刺激来自用50μg实施例3的hCDR1处理的BALB/C小鼠的淋巴结细胞，以产生细胞因子，并通过ELISA测试细胞因子(IFN-γ、TGF-β和IL-10)的分泌。
图3显示有代表性的实验的结果。可以看到hCDR1负调节INF-γ的生产(图3A)，正调节TGF-β(图3B)和IL-10(图3C)的分泌。应当注意到用作对照的肽(p259-271，一种致肌无力的肽)并不显著影响INF-γ和IL-10的生产，并且对于正调节TGF-β并不那么有效。
实施例5肽hCDR1和hCDR3抑制SLE患者的PBI应答人16/6Id mAb的增殖反应六十二名SLE患者参加我们的研究，包括9名男性(14.5％)和53名女性(85.5％)。诊断时的平均年龄是32.95±12.92岁(范围12-61岁)，平均随访期是10.98±10.76年(范围1-32年)。所有患者满足至少四项美国风湿病学学院(American College of Rheumatology，ACR)修订的SLE诊断标准(Tan等，1982)。从三个以色列医疗中心(Kaplan，Rehovot；Ichilov，Tel Aviv；Asaf-Harofeh，Rishon Lezion)招募患者。根据SLEDAI狼疮活动性指数(Bombardier等，1992)确定疾病活动性。在研究SLE患者的同时，研究由36名性别和年龄相似的健康对照志愿者组成的对照组。该研究得到医疗中心伦理委员会的批准。
我们感兴趣的是研究基于人16/6Id mAb CDR1和CDR3的肽hCDR1和hCDR3是否能够抑制SLE患者PBL针对人16/6Id mAb的特异性增殖反应。为此，我们首先必须鉴定其体内PBL能够受到人16/6Id mAb的刺激而增殖的患者(应答者)。
因此，在人16/6Id存在下，顺序培养62名SLE患者的PBL，并确定它们的增殖反应以及分泌IL-2的能力。在总共62名接受测试的SLE患者中，有24名患者(39％)的PBL有增殖应答(SI≥2，范围2-5.6)，在总共55名接受测试的SLE患者中，有23名患者(42％)的PBL有IL-2分泌应答(SI≥2，范围2-60)。在SLE患者组中应答者的频率低于在作为对照测试的健康供体组中观察到的频率。因此，在总共36名健康供体中，有21名健康供体(58％)的PBL对16/6Id有增殖应答。应答16/6Id的SLE患者以及健康对照的增殖程度(SI水平)是相似的。然而，如图4所示，与SLE患者相比，在更高的浓度才观察到对照供体的PBL对16/6Id的增加应答。
在应答16/6Id的SLE患者和患者无应答者组之间，没有出现性别和年龄的差异。然而，其PBL应答16/6Id而增殖的患者患病时间较短(应答者的平均患病时间是9.78±8.36年，而无应答者的平均患病时间是11.73±12.06年；P≤0.036)。表3综述SLE患者中16/6Id应答者组以及无应答者组的临床特征。如我们可以从该表中看到的，两组在大多数SLE相关临床表现上是相似的。两组间SLE疾病活动性分数(SLEDAI)以及SLE诊断标准的数目也是相似的。尽管如此，与无应答者组相比，在患者的应答者组中观察到更高频率的神经受累(癫痫发作以及精神病)和血液学受累以及更低比率的肾损害。然而，可能由于相关亚组中的患者数目少，上述差异没有达到统计学显著性。此外，在研究时在那些用类固醇或细胞毒性剂治疗的患者之间，检测到相对更少的应答者患者。值得注意的是与无应答者组相比，显著更多的从未接受类固醇的患者对16/6Id有应答(应答者组是54％，而无应答者组是21％；P＝0.023)。
值得注意的是基于CDR的肽抑制健康供体PBL对16/6Id的增殖应答的功效远远低于其对SLE患者PBL的功效(未显示)。
表3.SLE患者的临床和实验室标准。
A诊断标准*
B疾病活动性
C当前治疗+
*根据ACR修订的标准定义临床损害程度。分别根据Hep2细胞以及Crithidia luciliae测定抗核抗体(ANA)以及抗dsDNA抗体。根据下面测试中一个或多个的反应性定义抗磷脂抗体(APLA)VDRL假阳性、狼疮抗凝血剂(LAC)或针对抗心磷脂抗体的ELISA。
+以200-400mg/天的剂量应用抗疟剂羟氯喹；类固醇治疗定义为以日剂量≥5mg使用泼尼松；使用的细胞毒性剂是环磷酰胺(0.75-1.0g/m2；每月)或硫唑嘌呤(100-150mg/天)。
++在应答组和无应答组SLE患者之间观察到差异趋势的参数。
为测试肽hCDR1和hCDR3抑制SLE患者PBL对人16/6Id mAb的应答的能力，用不同浓度(0.1-20μg/孔)人16/6Id mAb，在或不在肽hCDR1和hCDR3存在下(50或100μg/孔)，体外刺激SLE患者的PBL(2×105/孔)，一式三份。温育6天后，在每孔中加入3H-胸苷(0.5μCi在5Ci/mmol)，继续温育18小时。然后收获细胞，用β-计数器测量放射性。结果表示为三份平行培养物的平均每分钟计数(cpm)。然后计算刺激指数(最佳浓度16/6Id下cpm与不存在16/6Id时平均cpm的比值)。刺激指数(SI)≥2被认为是阳性。
在总共62名患者中，发现24名患者(39％)的PBL应答16/6Id mAb而增殖。对19名应答者SLE患者的PBL测试肽hCDR1和hCDR3抑制针对16/6Id自身抗体全分子的增殖反应的能力。
表4显示这些实验的结果。抑制超过50％的增殖能力被认为是阳性。该表显示每种肽最高的阳性抑制能力。可以看到，在测试的19名应答者中，人hCDR1和hCDR3分别抑制16/19(84.2％)以及15/19(78.9％)的PBL增殖。两种肽一起抑制19名受测试的应答者中18名患者(95％)的PBL增殖。还可以从表中看到，两种肽抑制的程度相似。因此，可以得出结论基于人16/6Id mAb CDR1和CDR3的肽是SLE患者的PBL应答人16/6Id mAb的增殖的有效抑制剂。
表4肽hCDR1和hCDR3抑制SLE患者的PBL增殖。
实施例6.
hCDR1和hCDR3抑制能力的特异性重要的是证明基于hCDR的肽的抑制效应特异性针对SLE相关反应。为此，在用促细胞分裂原植物凝集素(PHA，2μg/ml)刺激过的SLE患者PBL培养物中加入肽hCDR1或hCDR3。图5显示用一名SLE患者的PBL进行的所述实验的结果。肽hCDR1和hCDR3不能抑制PBL针对促细胞分裂原PHA的增殖反应(以cpm表示)，并且在存在或不存在(黑色柱)hCDR1或hCDR3的情况下，所述增殖反应相似地高。
在另一实验中，用人16/6Id mAb刺激SLE患者的PBL培养物，然后所述培养物与人类肽hCDR1或hCDR3温育，使用鼠肽mCDR3作为对照。图6显示用一名SLE患者PBL进行的所述实验的结果。如图6所示，虽然基于人自身抗体的肽hCDR1和hCDR3都有效抑制PBL针对人16/6Id mAb的增殖反应，但基于鼠抗体CDR3的肽mCDR3不抑制所述增殖。
在这些实验中使用另外对照肽，即按鼠mCDR1和mCDR3肽的反向顺序合成的肽(revmCDR1和revmCDR3)，结果显示于图7。可以看到，这两种反向肽不能显著抑制SLE患者PBL针对人16/6Id mAb的增殖反应，而肽hCDR1和hCDR3确实有效抑制所述增殖，这证明基于人hCDR的肽对增殖的抑制对于所述肽是特异性的，并且特异性针对SLE相关的T细胞反应。
实施例7.
在肽hCDR1和hCDR3存在下，SLE患者PBL的IL-2分泌受到负调节我们想知道hCDR肽是否能够抑制在用人16/6Id mAb刺激后SLE患者PBL的IL-2分泌。所述抑制也提示所述基于人CDR的肽至少部分通过负调节IL-2分泌而抑制针对16/6Id mAb的增殖反应。为此，在存在或不存在肽hCDR1或hCDR3的情况下，将SLE患者的PBL与人16/6Id mAb一起温育。温育48小时后，收集所述培养物的上清。使用IL-2依赖性CTLL细胞系进行测定，确定所述上清中的IL-2水平。简要的说，CTLL系的细胞(2×104/孔)在不同上清存在下温育24小时，然后加入3H-胸苷，继续温育18小时。然后收获细胞，用β计数器测量放射性。使用重组人IL-2作为标准，据此计算结果。测试所述肽抑制23名应答者PBL受到人16/6Id mAb刺激后的IL-2分泌的能力。结果综述于表5，显示hCDR1和hCDR3分别抑制21/23以及19/23名患者PBL的IL-2分泌。PBL增殖反应的抑制直接与所述基于CDR的肽的IL-2抑制相关。因此，在确定有抑制增殖的所有病例中，都观察到IL-2分泌的抑制。
图8显示用一名SLE患者的PBL获得的结果(IL-2的分泌以pg/ml表示)，结果显示hCDR1和hCDR3一起抑制100％由人16/6Id mAb触发的SLE患者PBL的IL-2分泌。
表5.hCDR1和hCDR3抑制IL-2分泌肽 抑制活性*％ 最大抑制％hCDR1 91(21/23) 84±31hCDR3 83(19/23) 78±34*认为仅存在16/6Id的情况下IL-2分泌是100％。认为50％或以上的抑制具有显著性。
实施例8.
基于CDR的肽正调节免疫抑制性细胞因子TGF-β的分泌为阐明所述基于人CDR的肽抑制针对人单克隆抗DNA 16/6Id抗体的增殖反应的机制，测定细胞培养物上清中免疫抑制性细胞因子TGF-β的水平。这些实验的基本原理基于我们以前的发现，即患SLE的小鼠的脾细胞培养物在用人抗DNA 16/6Id mAb诱导后TGF-β水平提高，或者在用基于鼠CDR的肽治疗后自发出现{(NZB x NZW)F1小鼠}TGF-β水平提高(Eilat等，2001)。TGF-β水平提高与受治疗小鼠的疾病表现缓解相关。
为此目的，各种SLE患者的PBL培养物与人16/6Id mAb在存在或不存在肽hCDR1或hCDR3的情况下温育48小时后，从培养物中取出上清。通过ELISA，根据厂商指导测定TGF-β。简要地说，用PBS稀释的重组人TGFβsRII/Fc嵌合物(R&D Systems)(100ng/ml)包被Maxisorb板(Nunc)。封闭后，加入细胞上清。温育18小时后，加入检测用生物素化的抗人TGF-β抗体(R&D Systems)。所使用的底物溶液是TMB染色试剂(Helix Diagnostics)，使用MRX ELISA读板仪，用570nm和630nm滤片评估酶活。结果综述于表6。
图9中的结果证明用致病性人16/6Id mAb刺激一名有代表性的SLE患者的PBL后，肽hCDR1和hCDR3触发所述PBL的TGF-β分泌(以pg/ml表示)显著正调节。
表6hCDR1和hCDR3肽正调节SLE患者PBL的16/6Id诱导刺激的TGF-β分泌。
肽 TGF-β的正调节％ 最大正调节％hCDR1100(19/19)305±221hCDR3100(19/19)338±242认为在16/6Id单独存在下TGF-β的分泌(平均值636±25pg/ml)是100％。结果表示为在单独存在16/6Id的情况以上的分泌百分率。
实施例9.
hCDR1免疫调节小鼠的SLE表现用hCDR1治疗(NZB x NZW)F1小鼠后疾病表现的缓解。
如上文所示，基于人抗DNA 16/6Id mAb CDR的肽能够以相似的效率抑制16/6Id mAb引发淋巴结细胞以及SLE患者PBL应答16/6IdmAb的增殖反应。因此，我们想查明这些肽是否能在动物模型中免疫调节SLE样疾病。
所述实验的目标在于查明所述人类肽治疗已经建立的SLE疾病的能力，首先用hCDR1肽进行所述实验。为此，设计一些实验，其中用hCDR1肽在易患SLE的(NZB NZW)F1小鼠5个半月龄、已经观察到SLE样疾病的表现(抗dsDNA、蛋白尿等)时进行治疗。每周皮下给予PBS中的hCDR1肽，共10周。测试不同剂量(50、100和200μg/小鼠)hCDR1肽的功效。对照组注射媒介物PBS。该治疗导致抗dsDNA自身抗体滴度中度降低。因此，在1∶1250血清稀释度，治疗结束时分别对PBS处理的小鼠、50μg/小鼠、100μg/小鼠和200μg/小鼠hCDR1治疗的小鼠的血清测得0.586±0.1、0.27±0.1、0.37±0.1和0.29±0.1的O.D.值。
我们进行另一个实验，其中每周为7月龄(NZB x NZW)F1小鼠皮下注射PBS中的300μg hCDR1，共10周。在用hCDR1治疗的小鼠的血清中能够观察到抗DNA抗体滴度轻度降低。然而，表7显示用hCDR1治疗导致蛋白尿降低以及受治疗小鼠肾内的免疫复合物沉积(ICD)显著减少。该表中的结果表示ICD的强度，其中0＝没有ICD；1＝中度ICD；2＝严重ICD而3＝严重并且极强烈的ICD。
表7用hCDR1在7月龄治疗的(NZB x NZW)F1小鼠的临床表现
p相对于未处理组小鼠计算。
然后我们进行另一个实验，该实验使用400μg/小鼠的hCDR1，查明是否能够通过增加所述肽的剂量获得更多的有益效果。用400μg/小鼠的hCDR1治疗对于抗DNA抗体滴度没有更多的效果，并且如表8所示，其对肾病的效果与用300μg剂量治疗后观察到的效果相似。
表8用hCDR1在7月龄治疗的(NZB x NZW)F1小鼠的临床表现
p相对于未处理组小鼠计算。
因此，我们进行另一个实验，其中用300μg hCDR1在7月龄治疗小鼠，并且使用对照肽，所述对照肽即反向hCDR1。该实验的目的是查明用hCDR1治疗除缓解临床表现外，是否免疫调节细胞因子产生。图10证明抗DNA自身抗体水平轻度降低。表9显示在不同时间点测量的蛋白尿。
表9用hCDR1在7月龄治疗的(NZB x NZW)F1小鼠的临床表现
在所有测量中可以看到用hCDR1治疗的效果。肾损害是(NZB xNZW)F1小鼠中SLE样疾病的主要表现之一。用hCDR1肽治疗十周显著减少肾损害。在治疗肾损害这一方面，50μg剂量不如100和200μg剂量有效。后两种剂量的有效性相似。
图11A-11D是图，显示用100μg剂量hCDR1治疗的小鼠有代表性的肾切片。因此，处死9月龄的小鼠，取出肾，立即在液氮中冰冻。5μm的冰冻恒冷箱切片风干，在丙酮中固定。为检测Ig沉积，用FITC缀合山羊抗小鼠IgG(γ链特异性)温育切片。图11A和11B显示PBS处理组小鼠(对照)的肾切片，而图11C和11D显示用100μghCDR1治疗的小鼠的肾切片。可以在图中看到，所述治疗减少免疫复合物的数目以及强度(11A、11C x 100；11B、11D x 400)。
各组(NZB x NZW)F1在小鼠7月龄、已经观察到充分发展的疾病时接受hCDR1治疗，获得相似结果。用100μg/小鼠或300μg/小鼠治疗小鼠10周。两种剂量的治疗都导致抗DNA自身抗体滴度中度降低，这与上述结果相似。还测量到蛋白尿相对于PBS处理组降低。用两种剂量治疗后肾病都得到缓解；然而，在用300μg剂量治疗的小鼠的组内测得更显著的效应。图12A-12F是每组有代表性的小鼠肾切片，其中A、B代表未治疗的小鼠；C、D代表用hCDR1治疗的小鼠的肾，而E、F代表用反向hCDR1治疗的小鼠的肾切片。A、C、E x 100而B、D x 400。
图13A-13C显示通过ELISA测得的治疗(每周皮下注射，共10周)结束时3组小鼠用Con A刺激的脾细胞培养物的上清内细胞因子(INF-γ、IL-10和TGF-β)模式。可以看到，INF-γ(图13A)和IL-10(图13B，程度更低)在接受治疗的小鼠体内受到负调节。在未刺激的细胞的上清中可以看到TGF-β分泌增加(图13C，左)。Con A并不触发所述细胞分泌更多的TGF-β(图13C，右)。
上面综述的结果指出用hCDR1长期治疗缓解疾病表现并且免疫调节细胞因子分泌。
实施例10.
在诱导实验性SLE后，用人hCDR1肽治疗BALB/c小鼠我们想查明hCDR1肽是否能够治疗小鼠体内用人抗DNA 16/6IdmAb诱导的实验性SLE。因此，用16/6Id致病性自身抗体免疫并加强BALB/c小鼠。加强注射三个半月后，当所述小鼠已经发展出疾病表现时，将它们分成三组。一组不接受治疗，第二组用100μg/小鼠hCDR1治疗，第三组用300μg/小鼠hCDR1肽治疗10周。跟踪小鼠的临床表现。
表10展示治疗结束时在接受测试的个体小鼠观察到的结果。对于治疗所用的两种剂量，都观察到所有测量的临床表现得到缓解[抗dsDNA自身抗体、白细胞计数(WBC)和尿蛋白]。实验结束时(加强注射后7个月)分析处死的小鼠的肾，显示在用16/6Id mAb免疫和未治疗的10只小鼠中有9只出现免疫复合物沉积。与此不同，在用16/6IdmAb免疫并分别用100μg/小鼠和300μg/小鼠hCDR1治疗的小鼠中，分别仅在3/10和2/9小鼠的肾中观察到免疫复合物沉积。因此，结果显示人类肽hCDR1能够治疗已经建立的实验性SLE。
表10用100μg或300μg hCDR1肽治疗患有实验性SLE的BALB/c小鼠的效果。
*＝与注射16/6Id组有显著差异(P＜0.05)。
在另一个实验中，用人16/6Id免疫和加强BALB/c小鼠，诱导实验性SLE。加强两个月后，将小鼠分组(每组8只小鼠)。用200、300或400μg/小鼠治疗所述小鼠10周。跟踪观察小鼠的抗体产生、白细胞减少、蛋白尿，并在治疗结束两个月后处死小鼠，分析它们肾内的免疫复合物沉积。结果综述于表11，显示治疗对于16/6Id特异性抗体反应没有效应。
表11用200μg、300μg或400μg hCDR1肽治疗患有实验性SLE的BALB/c小鼠的效应。
然而，治疗影响抗DNA抗体滴度、白细胞减少、蛋白尿水平，更重要的是，影响肾内的免疫复合物沉积。实验的对照组是同样年龄的完全未接受免疫或治疗的BALB/c小鼠。该实验提示hCDR1有效治疗实验性SLE，但没有观察到400μg剂量的好处。
因此，进行另外一个实验，其中用200和300μg/小鼠治疗小鼠。在该实验中使用对照肽反向hCDR1。该实验的目的除比较200和300μg治疗剂量外，是研究治疗对于接受治疗的小鼠体内细胞因子产生的影响。用16/6Id免疫和加强六十只BALB/c小鼠。加强三个月后，将小鼠分组(每组15只小鼠)，每组或者不进行进一步的治疗，或者每周接受200或300μghCDR1的治疗。另一组接受300μg反向hCDR1治疗。第五组(对照)不接受免疫并且不接受进一步治疗。跟踪观察小鼠的抗体产生和疾病表现。如表12所示，各组间小鼠血清内的抗16/6Id抗体水平(稀释度1∶10000)并没有差别。如该表所示，用200和300μg治疗降低抗DNA抗体水平(血清稀释度1∶1250)。表12也综述不同组小鼠间的临床表现。可以看到，虽然两种剂量都有效降低白细胞减少和蛋白尿，但在该实验中200μg剂量的效应没有达到显著性(实验结束一个月后处死小鼠)。
表12用200μg或300μg hCDR1或300μg revhCDR1治疗患有实验性SLE的BALB/c小鼠的效应
图14A-F显示每组的一个肾，其中A、B代表未治疗的小鼠；C、D代表用hCDR1治疗的小鼠，E、F代表用反向hCDR1治疗的小鼠的肾切片。图A、C、E x 100而B、D、F x 400。
图15A-E显示接受治疗的小鼠的用16/6Id刺激的淋巴结培养物上清内不同细胞因子的水平。后面的实验在治疗结束时进行(10次治疗注射后)。可以看到，用hCDR1治疗(两种剂量)负调节INF-γ(图15A)、IL-10(图15C)和TNF-α(图15B)。另一方面，hCDR1正调节TGF-β的水平。因为脾细胞通常比淋巴结细胞分泌更多的TGF-β(图15D)，所以也测量在用16/6Id触发的各组小鼠脾细胞上清内的TGF-β(图15E)。
因此，在患有诱导型实验性SLE的小鼠体内，hCDR1缓解疾病表现并免疫调节细胞因子分泌。
实施例11.
通过接受hCDR1治疗的小鼠的脾细胞转移对狼疮表现的有益效应重要的是研究受治疗小鼠的脾细胞是否能够传递hCDR1治疗的有益效应，即负调节疾病表现的效应。为此，我们进行一个实验，其中将8月龄大的已经患有完全发展的狼疮样疾病的(NZB x NZW)F1小鼠分为2个组。组1不接受治疗，向组2的小鼠转移20×106个3月龄(NZB x NZW)F1小鼠的脾细胞，所述(NZB x NZW)F1小鼠已经接受300μg/小鼠hCDR1注射3次(皮下，每隔两天)。所有脾细胞都胃肠外注射。测试小鼠的抗dsDNA自身抗体产生、疾病表现，并在转移细胞4周后处死小鼠。转移hCDR1治疗小鼠的细胞导致抗DNA抗体的水平轻度降低。
表13证明转移hCDR1治疗小鼠的脾细胞导致显著更低的蛋白尿，并且肾内的免疫复合物减少。
表13hCDR1治疗小鼠脾细胞的小鼠接受者中的临床狼疮表现
p值相对于未治疗小鼠的grl计算重复所述实验几次，使用revhCDR1作为对照。结果类似于第一个实验的结果，即转移受治疗小鼠的细胞轻微影响抗DNA滴度，显著影响蛋白尿和肾损害。表14显示一个有代表性的实验的临床表现。
表14hCDR1治疗小鼠脾细胞的小鼠接受者中的临床狼疮表现
p值相对于未治疗小鼠的grl计算可以看到受治疗小鼠的脾细胞能够传递用hCDR1治疗的负调节效应。
图16A-F显示组1(A、B-未治疗小鼠)、组2(用hCDR1治疗的2月龄小鼠的脾细胞的接受者)和组3(用revhCDR1治疗的2月龄小鼠的脾细胞的接受者)的小鼠的肾切片。A、C、E x 400；B、D、F x 100。
上面实验的结果指出以前用hCDR1治疗的健康小鼠的免疫细胞可以传递hCDR1对疾病表现的缓解效应。
实施例12.
鼠mCDR肽负调节MMP-3和MMP-9基质金属蛋白酶(MMP)(Shingleton等，1996；Goetzl等，1996；Massova等，1998)构成包含锌的内切蛋白酶的一个家族，该家族在正常组织中细胞外基质的重建中起重要作用，并且促进病理学进行。它们具有共同的结构域，但在底物特异性、细胞来源以及诱导性上不同。
MMP作为酶原样潜在前体合成，随后转化为活性形式。MMP-2和MMP-9都是明胶酶，能够降解IV型胶原蛋白、变性的胶原蛋白、V型、VII型、X型和XII型胶原蛋白、玻连蛋白、聚集蛋白聚糖、galectin-3以及弹性蛋白。MMP-2是最广泛表达的MMP。它由多种细胞产生，常常在恶性肿瘤转移时水平升高。
在蛋白质和域结构方面，MMP-9是目前鉴定的最大和最复杂的成员。MMP-9表达的特征在于在基因转录以及蛋白分泌(例如细胞因子、趋化因子、类二十烷酸)炎症介质水平受到严格控制的复杂调节，并且受到金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)作用的调节。此外，MMP-9活性受到pro-MMP-9的激活、血纤维蛋白溶酶原激活系统的成份或其它MMP的调节(Guedez等，1996)。
已经在各种自身免疫病如多发性硬化(Ozenci等，1999)及其动物模型实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)(Gijbels等，1994)、类风湿性关节炎(Keyszer等，1999)、急性热病性多神经炎(Creange等，1999)、实验性大疱性类天疱疮(Liu等，1998)和实验性自身免疫神经炎(Hughes等，1998)中，证明MMP涉及自身免疫病。据报道，狼疮神经炎患者体内MMP-3和TIMP-2的血清水平显著高于健康对照的血清水平，但没有注意到与疾病活动性的相关性(Zucker，1999；Keyszer等，1999)。
MMP抑制剂在几个自身免疫病动物模型中的抑制效应已经提示MMP的许多活性在炎症反应中的潜在重要性。在几种炎症和自身免疫病中，在体内对MMP的特异性抑制会抑制水肿、病理性组织增殖以及对专化组织结构的损伤(Gijbels等，1994；Wallace等，1999；Conway等，1995)。
根据本发明，我们显示MMP-3和MMP-9的水平在患有自发性SLE或诱导性实验性SLE的小鼠的血清和肾内提高。我们已经证明基于CDR的鼠肽缓解小鼠中的狼疮表现，用所述肽治疗患有SLE的小鼠降低MMP-3和MMP-9在受治疗小鼠的血清和肾内的水平，并且导致疾病表现缓解。预期本发明的人hCDR肽表现同样效应。
实施例12(i)MMP-3、MMP-2和MMP-9在(NZBxNZW)F1小鼠血清内出现的动力学。
我们首先调查(NZB x NZW)F1小鼠内自发性SLE的发展是否与MMP-3、MMP-2和MMP-9在它们血清中水平的改变有关。因此，我们从2月龄观察到疾病表现前开始，跟踪调查它们的水平，直到8月龄所述小鼠患有充分发展的疾病以后。结果显示于图17。如图17A所示，根据蛋白质印迹分析检测，MMP-3的34kd和40kd形式在2月龄小鼠血清中都非常低。所有形式的水平朝着8月龄(最后一个测试时间点)的方向逐渐提高。相似地，图17B显示根据凝胶酶谱法，MMP-9在小鼠血清中的活性在2月龄低，然后随着疾病进行逐渐提高直到8月龄。在图17B中也可以看到MMP-2的水平并不随着疾病进行显著改变。
实施例12(ii)MMP-3、MMP-2和MMP-9在用16/6Id免疫的BALB/c小鼠血清内出现的动力学以前我们实验室的结果已经显示用16/6Id免疫后可以在BALB/c小鼠中诱导SLE(Mendlovic等，1988；Waisman等，1993)。因此，我们想测试SLE的诱导模型在MMP-3和MMP-9变化方面是否类似于(NZB x NZW)F1模型。由此，我们观察该SLE实验模型中的MMP-3和MMP-9水平。图18显示的结果指出MMP-3的水平(所有同种型)在加强10天后(免疫后4.5周)升高，并且比同等年龄的对照未免疫或CFA免疫BALB/c小鼠体内的水平更高(图18A)。MMP-3的水平随着年龄的增长在所有组中提高，然而，其水平在16/6Id免疫小鼠中总是高于对照组。与此不同，在加强后2个月之前，都没有检查到MMP-9活性的诱导型变化(图18B)。在加强后约4个月可以观察到MMP-9在16/6Id免疫小鼠体内的活性比在未免疫小鼠体内的活性更高。
实施例12(iii)在用16/6Id免疫的BALB/c小鼠的肾切片中，MMP-3和MMP-9的特异性正调节。
由于用16/6Id免疫BALB/c小鼠导致SLE特征性的临床表现，其中包括肾损害(Mendlovic等，1988；Waisman等，1993)，并且因为(NZB x NZW)F1小鼠体内的肾损害据报道与MMP-3和MMP-9水平的提高相关(Nakamura等，1993)，所以我们观察这些酶在用16/6Id免疫的BALB/c小鼠肾内的表达。作为对照，我们使用CFA免疫的小鼠以及年龄匹配的未免疫小鼠。在加强时间点为这两个对照组注射PBS。用16/6Id加强后两个月和5个月，针对MMP-3或MMP-9免疫染色小鼠肾切片。图19显示加强后5个月取得的肾的免疫组织学。如在图中可以看到的，用CFA免疫小鼠正调节MMP-3(19A)、MMP-9(19B)在肾、肾小球和周围组织中的表达。然而，用在CFA中的16/6Id免疫进一步显著提高这两种MMP的表达水平。在用16/6Id加强后两个月已经观察到这种升高(数据未显示)。还显示所述染色的非特异性背景水平(19C)。
实施例12(iv)鼠肽mCDR1肽负调节(NZB x NZW)F1小鼠血清中MMP-3的水平和MMP-9的活性。
由于我们发现MMP-3和MMP-9的水平在SLE的两个实验模型中都升高，因此我们想检查在用mCDR1肽治疗后观察到的SLE临床症状缓解(Eilat等，2000；Eilat等，2001)是否伴随MMP-3和MMP-9水平的降低。因此，我们在小鼠2月龄(在观察到临床表现之前)处理自发发展出SLE样疾病的(NZB x NZW)F1小鼠每周为它们皮下注射PBS中的mCDR1(250μg/小鼠)共10周。该实验方案导致所有临床症状的缓解(Eilat等，2000)。如在图20中可以看到的，血清内MMP-3两条在下面的带减少(20A)，MMP-9活性降低(20B)。所述减少和降低与临床表现的减少相关(Eilat等，2000)。如在图20A中所看到的，MMP-3的45kd形式不受影响。
我们还想查明mCDR1肽是否能够负调节MMP-3已经升高的水平以及MM-9的活性。因此，我们观察(NZB x NZW)F1小鼠血清中MMP-3的水平和MMP-9的活性，所述小鼠在已经观察到疾病表现时接受mCDR1治疗。我们使用反向mCDR1作为对照肽。如图所示(图20，右边)，用mCDR1治疗病鼠特异性负调节血清中的MMP-3水平(20A)和MMP-9活性(20B)，而用revmCDR治疗则没有观察到这种效果。
实施例12(v)mCDR1肽负调节16/6Id免疫小鼠血清内的MMP-3水平和MMP-9活性。
如我们已经证明的，MMP-9活性在两个SLE实验模型[(NZB xNZW)F1和16/6Id诱导型]中升高。因为mCDR1肽在两个模型中都缓解疾病，并且负调节受治疗(NZB x NZW)F1小鼠血清内的MMP-3水平和MMP-9活性，我们进一步寻找治疗对16/6Id免疫BALB/c小鼠血清内这些酶的效应。图21显示一个预防实验和一个治疗实验的结果。该图显示mCDR1也能调节该实验模型中的MMP-3和MMP-9。在所述预防实验方案和所述治疗实验方案中都观察到MMP-3水平和MMP-9活性的负调节。因此，在诱导疾病阶段或在完全发展的疾病阶段，体内给予mCDR1能够降低MMP-3(21A)和MMP-9(21B)的水平。这种降低是特异性的，因为用反向mCDR1治疗并不影响MMP-3或MMP-9活性(未显示)。使用MMP-9活性测定系统(得自Amersham-Pharmacia Biotech UK Limited，England)得到的初步结果显示未免疫BALB/c小鼠的血清活性相当于7ng/ml纯的活性MMP-9。用16/6Id免疫提高所述活性到16ng/ml，而用mCDR1肽治疗负调节所述活性到几乎正常的水平(8.5ng/ml)。
实施例12(vi)mCDR1肽治疗对16/6Id免疫BALB/c小鼠肾切片中MMP-3和MMP-9水平的效应。
因为MMP-3和MMP-9在患有诱导型实验性SLE的小鼠的肾中提高，所有我们想观察mCDR1肽治疗对受治疗小鼠肾内后面MMP表达的效应。图22证明在预防实验(图22A)和治疗实验(图22B)中，mCDR1负调节受治疗小鼠肾内MMP-3和MMP-9的表达水平。在肾小球和间质都观察到MMP水平的降低。所观察到的MMP表达减少与使用抗Ig针对免疫复合物沉积的染色减少相关(图22B)。
因为MMP-3和MMP-9明显参与SLE的发病机理，所以我们测试人hCDR1肽是否能够在缓解疾病表现的同时，相关地负调节后者的水平。为此，每周一次皮下注射100μg或300μg/小鼠hCDR1，共10周，治疗各组(NZB x NZW)F1小鼠，然后在治疗期间的不同时期测试各组汇集的血清内的MMP水平。图23显示一个实验的结果，其中在小鼠7月龄观察到所有临床表现后开始对小鼠进行治疗。结果是在治疗中间、5次注射hCDR1后收集的血清的结果。图23的结果指出用300μg hCDR1治疗小鼠负调节MMP-3水平和MMP-9活性。这些结果与用hCDR1治疗后疾病表现的显著缓解一致。
讨论上面的结果显示MMP-3和MMP-9在SLE鼠模型的血清中和肾内都升高。鼠mCDR1肽能够负调节患有SLE的小鼠血清中和肾内的MMP-9和MMP-3水平。证明在SLE的自发模型中，血清中MMP-9和MMP-3的正调节都出现在头3.5个月内。在诱导模型中，血清中MMP-3水平提高出现非常早(用16/6Id加强后10天)，而MMP-9活性的升高在约3-4个月之后出现。16/6Id诱导模型允许我们跟踪疾病最早几个阶段的过程，根据该模型的结果，看起来MMP-3涉及诱导疾病，而MMP-9涉及疾病发展。
我们的结果显示在SLE的小鼠模型中MMP-3升高，该结果与下面的结果一致MMP-3在SLE患者血清中显著增加(Kotajima等，1998)，以及(NZB x NZW)F1小鼠体内MMP-3转录物随神经炎的进行显著增加(Nakamura等，1993)。总而言之，这些结果提示MMP-3可能促进狼疮神经炎中肾小球损伤的发展。
我们的结果显示在SLE的诱导模型和自发模型中，血清中的MMP-2活性水平并不随着疾病进行而显著升高。这些结果与以前报道的结果(Zucker，1999)相符，即MMP-2水平在SLE中不提高。因此，用基于CDR1的肽治疗并不调节该酶(数据未显示)。MMP-2的水平组成型分泌，在其它病理条件下(例如视神经炎和多发性硬化)也不改变，而MMP-9的水平相对于健康对照升高(Gijbels等，1992；Paemen等，1994)。
有趣的是，mCDR1肽特异性并直接影响SLE相关的T细胞反应，它可以负调节已经正调节(治疗方案)的MMP-3和MMP-9水平，以及防止它们升高(预防方案)。
还未报道过SLE患者体内或SLE动物模型中血清内的MMP-9活性。这是首次显示SLE和MMP-9之间的相关关系，并且首次证明MMP-9在患有SLE的小鼠的血清和肾中升高。虽然MMP-9在血清中的升高相对较晚(约加强后4个月)，但诱导疾病后在早期阶段(2个月)就观察到肾内MMP-9的升高(数据未显示)。本文还首次显示缓解小鼠SLE表现的肽(如上文所示的mCDR1和hCDR1)也负调节血清中和肾内的MMP-9。后面的数据还得到初步结果的支持，所述初步结果使用MMP-9活性测定系统，显示用16/6Id免疫升高MMP-9活性，而用基于CDR1的肽治疗负调节该活性到未免疫小鼠的活性水平。
本文还首次证明在自身免疫病的实验模型中，MMP-3和MMP-9的诱导动力学不同，所述实验模型如本文专门针对SLE所示。这可能指出上述MMP在所述疾病的发病机理中的不同作用。我们的结果证明免疫调节SLE相关T细胞反应并负调节疾病表现的肽能够控制那些MMP在血清和肾中的分泌(虽然不一定是由T细胞本身分泌)。这些结果指出MMP-3和MMP-9在SLE的发病机理中起作用，并且可能一方面作为疾病进行的替代标记，另一方面作为给定治疗缓解疾病的替代标记。
实施例13.
MMP-9活性(而不是MMP-2活性)在SLE患者的血清中升高在本实施例中，我们测定40名SLE患者血清中的MMP-9和MMP-2水平，我们证明SLE患者血清中MMP-9活性而不是MMP-2活性相对于健康对照显著上升。高MMP-9活性与盘形疹、雷诺现象、肺炎、粘膜溃疡以及抗磷脂抗体(ApLA)的存在相关。此外，MMP-9升高的水平与男性患者组内的SLE活动性相关。
材料和方法患者。四十名患者参加本研究，包括32名女性和8名男性。所有患者表现至少四项美国风湿病学学院(American College ofRheumatology，ACR)针对诊断SLE建立的修订诊断标准(Winchester，1996)。本研究中二十五名性别和年龄相匹配的健康志愿者作为对照组。患者在诊断时的平均年龄是29±9.7岁(范围从15-48岁)，平均随访期是11±10年(范围1-32年)。根据SLEDAI狼疮活动性指数(Bombardier等，1992)确定疾病活动性。该研究得到以色列Rehovot的Kaplan医疗中心伦理委员会的批准。
通过活性测定试剂盒测量MMP-2和MMP-9。通过特异性BiotrakMMP-2或MMP-9活性测定试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech UKLimited，UK)，根据厂家的操作指南测量MMP-2和MMP-9的活性。血清分别稀释1∶100倍和1∶32倍，以测定MMP-2和MMP-9活性。在每个测定中加入合适的标准。为测量MMP总含量，使用对氨基苯乙酸汞(APMA)激活MMP的原形式。
通过凝胶酶谱法测量MMP-2和MMP-9活性。通过明胶酶谱法测定MMP-2和MMP-9活性。通过1mg/ml明胶聚合的8％SDS-PAGE分离5μl血清样品。凝胶在2.5％Triton X-100中洗涤30分钟一次，除去SDS，然后在含50mM Tris-HCl，200mM NaCl，10mM CaCl2和0.02％(重量/体积)Brij 35的反应缓冲液(pH7.5)中洗涤30分钟一次。更换新鲜的反应缓冲液，将所述凝胶在37℃温育24小时。通过用0.5％考马斯亮蓝染色凝胶，显示明胶水解活性，然后通过光密度测定法进行定量。
统计分析。使用卡方检验或Fisher精确检验(Fisher exact test)、非配对t-检验和两尾P值评估数据。也使用Superman分析和多变量分析。
实施例13(i)MMP-9活性而不是MMP-2活性在SLE中升高如上文所述，MMP-9涉及几种自身免疫病以及SLE的动物模型。因此。我们感兴趣的是研究MMP-9是否也在SLE患者的血清中升高。为此目的，我们通过凝胶酶谱法检查40名SLE患者和25名健康对照的血清，其中可以看到MMP-9和MMP-2的活性。图24显示一块有代表性的凝胶。如在该图中可以看到的，MMP-9在SLE患者血清中的水平相对于健康对照提高。对40名SLE患者和25名健康对照的血清酶谱法的光密度测定法分析指出SLE患者的平均MMP-9活性是109±5.6光密度单位，健康对照的平均MMP-9活性是76.5±4.2光密度单位(p＝0.0001)。高于85光密度单位的活性值(健康对照平均值+2s.e.)被认为是高的。结果证明在68％的SLE患者体内出现高活性水平MMP-9。仅3％健康对照表现高MMP-9活性(p＝0.001)。对同样血清样品中MMP-2水平的光密度测定法分析揭示SLE患者和健康对照血清间MMP-2活性的差异不显著。因此，针对健康对照和SLE患者分别测得109±7和123±5(平均活性光密度单位±标准差)的值(p＝0.0531)。为进一步定量血清中的MMP-9和MMP-2活性水平，我们使用活性测定试剂盒。
图25显示MMP-9活性在SLE患者血清中相对于在健康对照血清中的水平提高到三倍，并且这种提高在统计学上显著(P＝0.0302)。与此不同，两组间MMP-2水平的差异不显著(P＝0.1254)。
由于我们以及其他人(Ebihara等，1998和1999)在患有非SLE慢性肾衰竭(如糖尿病、高血压)的患者血清中检测到可能由于MMP-9的保留而产生的高MMP-9水平，因此我们分析在所测试的SLE患者组内MMP-9水平与肾功能之间的相关性。在肌酸酐水平和MMP-9水平间没有观察到相关性(r2＝0.01)，这指出SLE患者体内MMP-9水平升高不是该酶由于肾损害而保留的结果。
实施例13(ii)MMP-9活性与临床和实验室参数之间的相关性SLE患者血清中MMP-9活性水平的升高促使我们寻找临床和实验室参数与血清MMP-9水平之间的可能相关性。进行统计学分析(卡方分析或Fisher精确检验)，研究每种临床表现具有高的和正常的MMP-9水平的患者数目(表15)，并且考虑具有或不具有某种临床症状的患者的实际平均MMP-9活性水平。两个分析的结果是相似的。值得注意的是，对于所有的临床症状，MMP-9水平升高的患者百分率远远高于健康对照组内的百分率。MMP-9水平与性别、患病时间或发病年龄不相关(Person，Spearman)。
图15显示根据患者MMP-9活性水平(低于或等于健康对照＝正常)排列的SLE患者的临床和实验室特征。高水平MMP-9与雷诺现象的存在显著相关(P＝0.0138)，并且与APLA显著相关(P＝0.041)。对于肺炎、盘状疹、神经学疾病和粘膜溃疡观察到强相关关系。然而，具有后面表现的患者数目太少，无法进行统计分析。多变量分析揭示雷诺现象和低补体(C3、C4)水平与高MMP-9水平呈正相关(P＝0.0001和0.0137)。与此不同，光敏感性、关节炎和血液学疾病与MMP-9活性水平呈负相关(P＝0.0381、0.0014和0.0065)。
表15根据患者MMP-9水平具有高的和正常的MMP-9活性的患者的临床特征。
根据ACR修订的标准(Winchester，1996)定义临床损害程度。分别使用Hep2细胞和Crithidia luciliae测定抗核抗体(ANA)和抗ds DNA抗体。根据下面测试中一个或多个的反应性定义抗磷脂抗体(APLA)假阳性VDR、狼疮抗凝血剂(LAC)或针对抗心磷脂抗体的ELISA。
我们还查找男性患者(图26A)和女性患者(图26B)在SLEDAI和MMP-9活性之间的可能相关性。有趣的是，相关系数在男性中显著并且是肯定的(r2＝0.6333)，但对于女性不显著并且是否定的(r2＝0.0571)。使用BILAG评分系统得到相似的结果。因此，男性的MMP-9活性和BILAG分数之间观察到肯定的相关系数(r2＝0.6442)，而女性的该相关系数不显著。
我们还想确定患者应用的各种治疗形式与MMP-9活性之间是否存在相关性。如在表16(A)中看到的，在患者的当前治疗与MMP-9活性之间没有显著的相关性。然而，当我们在他们病程内的任何时间观察患者时(表16(B))，高MMP-9水平与细胞毒性剂的应用相关(82％)。
表16根据患者MMP-9水平分类的SLE患者的治疗形式
以200-400mg/天的剂量应用抗疟剂羟氯喹。类固醇治疗定义为以日剂量≥5mg使用泼尼松；使用的细胞毒性剂是环磷酰胺(0.5-1g/m2，每月)或硫唑嘌呤(100-150mg/天)。
实施例13(iii)在不同时间点从各个SLE患者取得的血清样品中MMP-9活性的变化由于疾病活动性随时间变化，因此我们测量在4-6年随访期内取得的各个患者血清样品内MMP-9和MMP-2的活性水平。分析在不同时间点取得的九名患者的血清。MMP-2的水平在患者和健康对照间没有显著变化。在测试的9名患者中，对5名患者可以观察到各个患者血清样品中MMP-9活性随时间的变化。图27显示2名有代表性的SLE患者的结果。如可以看到的，MMP-9活性，而不是MMP-2活性，在同一患者体内随时间而变化。这些变化与根据SLEDAI或BILAG系统测定的疾病活动性指数不相关。在不同时间点从5名健康对照取样，在他们的血清中没有检测到MMP-9活性的变化(数据未显示)。在4名其他SLE患者中，没有观察到MMP-9或MMP-2活性随时间有实质性的变化，并且各个患者情况各不相同，MMP-9活性水平保持高或低的水平。
讨论本研究首次显示MMP-9涉及人SLE。我们显示MMP-9而不是MMP-2的活性在68％SLE患者血清中相对与健康对照显著升高。高MMP-9水平与雷诺现象、肺炎、神经性异常、盘状疹和APLA的存在相关。在同一名患者疾病不同时期的血清中观察到MMP-9活性的变化。女性患者中MMP-9活性水平并不与疾病活动性指数(SLEDAI、BILAG)相关，但男性患者中MMP-9活性水平与SLE活动性相关。
本研究显示MMP-2活性水平在SLE患者血清中并未显著升高。这些结果与以前的报道(Zucker，1999)一致，即MMP-2水平在SLE中不提高。在MMP-9水平相对于健康对照提高的其它病理状况中(例如视神经炎和多发性硬化)，MMP-2水平也是组成型并且未改变(Gijels等，1992；Paemen等，1994)。
SLE的发病机理中可能涉及另一种MMP，即MMP-3，因为MMP-3在SLE患者血清中显著升高(Kotajima等，1998)。本实施例中显示的具有升高的MMP-9活性的SLE患者的频率(68％)类似于SLE患者(76％)和RA患者(82％)中报道的高MMP-3水平的频率。此外，随着肾炎在(NZB x NZW)F1小鼠体内的进行，MMP-3转录物显著增加(Nakamura等，1993)。
SLE患者血清中增加的MMP的来源仍然未知。已经显示MMP-9由外周血细胞如T细胞、中性白细胞和巨噬细胞分泌(综述见Goetzl等，1996)。在MMP-9活性水平和患者体内外周血细胞数目之间没有相关性，这个事实提示MMP-9不是由外周血免疫细胞分泌，而是由SLE影响的器官如肾或肺/胸膜分泌。所有患肺炎的SLE患者都表现高MMP-9活性水平，这个观察提示病肺是高MMP-9水平的一种来源。此外，细胞毒性治疗(体现SLE相关器官损伤的严重性)与血清中高MMP-9水平之间的联系也支持这种意见，即患病器官是SLE患者体内MMP-9活性的来源。然而，仍然存在少数外周血淋巴细胞分泌更高MMP-9活性水平的可能性。
TNF-α和IL-1在人类疾病(Dean等，2000)和鼠模型(Segal等，1997；Theofilopoulos等，1999；Eilat等，2001)的SLE发病机理中都起重要作用。已经在几个系统中显示这些细胞因子诱导MMP-9产生(Guedez等，1996)，因此，有可能诱导MMP-9是这些细胞因子在SLE中的部分致病效应。已经报道由健康个体的外周血单核细胞自发分泌的MMP-9水平在暴露于TNF-α和IL-1β时受到正调节(Saren等，1996)。此外，T细胞和巨噬细胞的MMP通过切割膜结合形式而有利于TNF-α的分泌(Gearing等，1994)。因此，这些例子证明MMP对促炎细胞因子的相互调节效应，反之亦然。然而，在一些患者的血清中MMP-9活性水平在随访期内保持在正常范围内，而在大多数患者的血清中测量到高MMP-9活性水平，这个事实提示遗传因素参与MMP-9的调节。
本文的结果指出MMP-9可能在SLE的发病机理中起作用，并且在监测用干预MMP-9活性的药物治疗的患者时，测量这种金属蛋白酶的血浆/血清活性水平可能提供重要的信息。
参考文献Bombardier C，Gladman DD，Urowitz MB等。SLEDAI的推导。狼疮患者的疾病活动性指数。Arthritis Rheum 35630-40(1992).Conway，J.G.，J.A.Wakefield，R.H.Brown，B.E.Marron，L.Sekut，R.L.Clark，G.McGeechan和K.M.Connolly.通过基质技术蛋白酶抑制剂抑制辅助关节炎中的软骨和骨破坏。J.Exp.Med.182，449(1995).Creange，A.，Sharshar，T.，Planchenault，T.，Christov，C.，Poron，F.，Raphael，J-C.和Gherardi，R.K.，基质金属蛋白酶-9在急性热病性多神经炎中增加并切与疾病严重性相关。Neurology 531683-1691(1999).Dayan，M.，Segal，R.，Sthoeger，Z.，Waisman，A.，Brosh，N.，Elkayam，O.，Eilat，E.，Fridkin，M.和Mozes，E.SLE患者对基于致病性抗DNA单克隆抗体互补决定区的肽的免疫反应。J.Clin.Immunol.20，187(2000).Dean GS，Tyrrell-Price J，Crawley E等。细胞因子和系统性红斑狼疮。Ann Rheum Dis 59243-51(2000).Ebihara I，Nakamura T，Shimada N等。非胰岛素依赖性糖尿病mellitus中金属蛋白酶-9血浆浓度增加在微白蛋白尿发展之前。Am J KidneyDis 32544-50(1998).Ebihara I，Nakamura T，Ushiyama C等。在慢性肾衰竭中口服吸附剂AST-120对金属蛋白酶-9血浆浓度以及金属蛋白酶-1血清组织抑制剂浓度的效应。Nephron 83169(1999).Eilat，E.，Zinger，H.，Nyska，A.和Mozes，E.通过用基于致病性自身抗体CDR1和CDR3的肽处理预防(NZB x NZW)F1小鼠体内的系统性红斑狼疮样疾病。J.Clin.Immunol.20，268(2000).Eilat，E.，Dayan，M.，Zinger，H.和Mozes，E.基于致病性抗DNA自身抗体互补决定区1的肽缓解实验性SLE的机制。Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，98，1148(2001).Fricke，H.，Offen，D.，Mendlovic，S.，Shoenfeld，Y.，Bekimer，R.，Sperling，J.和Mozes，E.用单克隆抗La自身抗体免疫，在小鼠中诱导实验性系统性红斑狼疮。Int.Immunol.2，225(1990).Fricke，H.，Mendlovic，S.，Blank，M.，Shoenfeld，Y.，Ben-Bassat，M.和Mozes，E.个体基因型特异性T细胞系在小鼠中诱导实验性系统性红斑狼疮。Immunology.73，421(1991).Gearing AJH，Beckett P，Christodoulou M等。用金属蛋白酶处理肿瘤坏死因子α前体。Nature 370555-7(1994).Gijbels K，Masure S，Carton H等。多发性硬化患者和其它炎症神经学疾病患者脑脊髓液中的明胶酶。J Neuroimmunol 4129-34(1992).Gijbels，K.，R.E.Galardy和L.Steinman.用金属蛋白酶氧肟盐抑制剂逆转实验性自身免疫脑脊髓炎。J.Clin.Invest.942177-82(1994).Goetzl，E.J.，Banda，M.J.和Leppert，D.，免疫中的基质金属蛋白酶。J.Immunol.1561-4(1996).Guedez，L.，Lim，M.S.和Stetler-Stevenson，W.G.，金属蛋白酶和它们的抑制剂在血液学疾病中的作用。Crit.Rev.Oncogenesis 7205-225(1996).Hay EM，Bacon PA，Gordon C等。BILAG指数测量系统性红斑狼疮临床疾病活动性的可靠和有效手段。Q J Med 86447-58(1993).Hughes，P.M.，G.M.A.Wells，J.M.Clements，A.J.Gearing，E.J.Redford，M.Davies，K.J.Smith，R.A.Hughes，M.C.Brown和K.M.Miller.实验性神经炎期间基质金属蛋白酶的表达。Brain.121，481(1998).Isenberg，D.A.，Shoenfeld，Y.，Madaio，M.P.，Rauch，J.，Reichlin，M.，Stollar，B.D.和Schwartz，R.S.系统性红斑狼疮中的抗DNA抗体个体基因型。Lancet.2，417(1984).Isenberg，D.A.和Collins，C.检测来自狼疮患者的肾组织结合免疫球蛋白的交叉反应性抗DNA抗体个体基因型。J.Clin.Invest.76，287(1985).Keyszer，G.，1.Lambiri，R.Nagel，C.Keysser，M.Keysser，E.Gromnica-hle，J.Franz，G.R.Burmester和K.Jung.风湿性疾病中基质金属蛋白酶MMP-3和MMP-1、金属蛋白酶1的组织抑制剂(TIMP-1)以及MMP-1/TIMP-1复合物的循环水平。与其它替代标记相比与类风湿性关节炎临床活动性的相关性。J Rheumatol.26，251(1999).Kotajima，L.，Aotsuka，S.，Fujimani，M.，Okawa-Takatsuji，M.，Kinoshita，M.，Sumiya，M.和Obata，K.，在患有活动的狼疮神经炎的患者血清中基质金属蛋白酶水平提高。Clin.Exp.Rheum.16409-415(1998).Liu，Z.，Shipley，J.M.，Vu，T.H.，Zhou，X.，Diaz，L.A.，Werb，Z.和Senior，R.M.，明胶酶B缺陷型小鼠抵抗实验性大疱性类天疱疮。J.Exp.Med.188475-482(1998).Massova，I.，Kotra，L.P.，Fridman，R.和Mobashery，S.，基质金属蛋白酶结构、进化和多样化。Faseb.J.121075-1095(1998).Mendlovic，S.，Brocke，S.，Shoenfeld，Y.，Ben-Bassat，M.，Meshorer，A.，Bakimer，R.和Mozes，E.用通用人抗DNA个体基因型在小鼠中诱导系统性红斑狼疮样疾病。Proc.Natl.Acad.Sci.U.S A.85，2260(1988).Mendlovic，S.，Fricke，H.，Shoenfeld，Y.，和Mozes，E.抗个体基因型抗体对于在小鼠中诱导实验性系统性红斑狼疮的作用。Eur.J Immunol.19，729(1989).Mozes，E.，Dayan，M.，Zisman，E.，Brocke，S.，Licht，A.和Pecht，I.重症肌无力相关表位与生活的鼠抗原呈递细胞表面II类MHC分子的直接结合。EMBO J.8，4049(1989)Nakamura，T.，I.Ebihara，S.Osada，T.Takahashi，M.Yamamoto，Y.Tomino和H.Koide.金属蛋白酶和它们的抑制剂在New ZealandBlack/White F1小鼠肾组织中的基因表达。Clin.Sci.85295-301(1993).Ozenci，V.，L.Rinaldi，N.Teleshova，D.Matusevicius，p.Kivisak，M.Kouwenhoven和H.Link.多发性硬化中金属蛋白酶和它们的组织抑制剂。J.Autoimmun.12，297(1999).Paemen，L.，Olsson，T.，Soderstrom，M.，Van Damme，J.和Opdenakker，G.，评价视神经炎、多发性硬化和其它炎症神经学疾病患者的脑脊髓液中的明胶酶和IL-6.Eur.J.Neurol.155-63(1994).Saren P，Welgus HG，Kovanen PT.TNF-α和IL-1β选择性诱导人巨噬细胞表达92-kDa明胶酶。J Immunol 1574159-65(1996).Segal R，Bermas BL，Dayan M等。实验性系统性红斑狼疮中细胞因子产生的动力学T辅助细胞1/T辅助细胞2型细胞因子涉及疾病。JImmunol 1583009-16(1997).Shingleton，W.D.Hodges，D.J.，Brick，P.和Cawston，T.E.，胶原酶胶原蛋白周转中的关键酶。Biochem.Cell.Biol.74759-775(1996).Shoenfeld，Y.，Isenberg，D.A.，Rauch，J.，Madaio，M.P.，Stollar，B.D.和Schwartz，R.S.单克隆人狼疮抗体的个体基因型交叉反应。J.Exp.Med.158，718(1983).Shoenfeld，Y.，Hsu-Lin，S.C.，Gabriels，J.E.，Silberstein，L.E.，Furie，B.C.，Furie，B.，Stollar，B.D.和Schwartz，R.S.，人-人杂交瘤的自身抗体产生。J.Clin.Invest.70205-208(1982).Sthoeger，Z.M.，Tartakovsky，B.，Bentwitch，Z.和Mozes，E.来自患有实验性系统性红斑狼疮的小鼠的单克隆抗心磷脂抗体表征和诱导继发性抗心磷脂综合征。J.Clin.Immunol.13，127(1993).Tan EM，Cohen AS，F.FJ，Talal N，Winchester RJ.用于分类系统性红斑狼疮的1982年修订标准。Arthritis Rheum 251271-77(1982)Theofilopoulos AN，Lawson BR.鼠狼疮中的肿瘤坏死因子和其它细胞因子。Ann Rheum Dis 58增刊149-55(1999).Waisman，A.和Mozes，E.患有实验性系统性红斑狼疮的小鼠的自身抗体的可变区序列。Eur.J.Immunol.23，1566(1993).Waisman，A.，Mendlovic，S.，Ruiz，P.J.，Zinger，H.，Meshorer，A.和Mozes，E.16/6Id个体基因型网络在诱导和表现系统性红斑狼疮中的作用。Int.Immunol.5，1293(1993).Waisman，A.，Shoenfeld，Y.，Blank，M.，Ruiz，P.J.和Mozes，E.在小鼠中诱导实验性系统性红斑狼疮的致病性人单克隆抗DNA由VH4基因区段编码。Int.Immunol.7，689(1995).Waisman，A.，Ruiz，P.J.，Israeli，E，Eilat，E.Konin-Waisman，S.，Zinger，H.，Dayan，M.和Mozes，E.用基于致病性抗DNA单克隆抗体互补决定区的肽调节鼠系统性红斑狼疮。Proc.Satl.Acad.Sci.U.S.A.94，4620(1997).Wallace，G.R.，R.A.Whiston，M.R.Stanford，G.M.A.Wells，A.J.H.Gearing和J.M.Clements.基质金属蛋白酶抑制剂BB-1101预防实验性自身免疫uveoretinitis(EAU).Clin.Exp.Immunol.118，364 1999).Winchester RJ.系统性红斑狼疮发病机理。Koopman WJ编辑Birmingham.AlabamaWilliam和Wilkins，第1361-91页(1996)。Zucker，S.溶基质素血清水平在系统性红斑狼疮中增加缺乏与疾病活动性的相关性。J.Rheumatol.26，78(1999).
序列表<110>YEDA Research and Development Co.LtdMOZES，Edna<120>合成人肽以及用于治疗系统性红斑狼疮的含所述肽的药用组合物<130>TEVA-003 PCT<150>IL 141647<151>2001-02-26<160>30<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>20<212>PRT<213>鼠<400>1Thr Gly Tyr Tyr Met Gln Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Lys Ser Leu1 5 10 15Glu Trp Ile Gly20<210>2<211>20<212>PRT<213>鼠
<400>2Glu Ile Asn Pro Ser Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys1 5 10 15Ala Lys Ala Thr20<210>3<211>20<212>PRT<213>鼠<400>3Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Leu Trp Glu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp1 5 10 15Gly Gln Gly Ser20<210>4<211>19<212>PRT<213>鼠<400>4Gly Tyr Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu1 5 10 15Trp Ile Gly
<210>5<211>17<212>PRT<213>鼠<400>5Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Arg Tyr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Thr1 5 10 15Leu<210>6<211>19<212>PRT<213>人<400>6Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu1 5 10 15Trp Ile Gly<210>7<211>22<212>PRT<213>人<400>7
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Arg Gly Gly Trp Asn Asp Val Asp1 5 10 15Tyr Tyr Gly Met Asp Val20<210>8<211>7<212>PRT<213>人<400>8Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser1 5<210>9<211>16<212>PRT<213>人<400>9Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Lys Thr Ser Leu Lys Ser1 5 10 15<210>10<211>18<212>PRT<213>人<400>10
Gly Leu Leu Arg Gly Gly Trp Asn Asp Val Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met1 5 10 15Asp Val<210>11<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>基于人16/6Id mAb CDR1的肽。
<220>
<221>MISC FEATURE<222>(1)..(19)<223>位置1的Xaa是Gly或Thr Gly；位置8的Xaa是Arg或Lys；位置10的Xaa是Pro或Ser；位置12的Xaa是Gly或Glu；位置13的Xaa是Lys或Asp；位置15的Xaa是Glu、Leu或Ser.
<400>11Xaa Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Xaa Gln Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Glu1 5 10 15Trp Ile Gly<210>12<211>19<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>SEQ ID NO11的肽，其中其中Xaa(1)是Gly，Xaa(8)是Arg，Xaa(10)是Pro，Xaa(12)是Gly，Xaa(13)是Lys，而Xaa(15)是Leu。
<400>12Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu1 5 10 15Trp Ile Gly<210>13<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<224>SEQ ID NO11的肽，其中Xaa(1)是Gly，Xaa(8)是Arg，Xaa(10)是Pro，Xaa(12)是Gly，Xaa(13)是Lys，而Xaa(15)是Ser。
<400>13Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Ser Glu1 5 10 15Trp Ile Gly<210>14<211>19<212>PRT<213>人工序列
<220>
<225>SEQ ID NO11的肽，其中Xaa(1)是Gly，Xaa(8)是Arg，Xaa(10)是Pro，Xaa(12)是Gly，Xaa(13)是Asp，而Xaa(15)是Glu。
<400>14Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Asp Gly Glu Glu1 5 10 15Trp Ile Gly<210>15<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>SEQ ID NO11的肽，其中Xaa(1)是Gly，Xaa(8)是Lys，Xaa(10)是Pro，Xaa(12)是Gly，Xaa(13)是Lys，而Xaa(15)是Glu。
<400>15Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Lys Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu1 5 10 15Trp Ile Gly<210>16<211>19<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>SEQ ID NO11的肽，其中Xaa(1)是Gly，Xaa(8)是Arg，Xaa(10)是Ser，Xaa(12)是Gly，Xaa(13)是Lys，而Xaa(15)是Glu。
<400>16Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Glu Glul 5 10 15Trp Ile Gly<210>17<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>SEQ ID NO11的肽，其中Xaa(1)是Gly，Xaa(8)是Arg，Xaa(10)是Pro，Xaa(12)是Glu，Xaa(13)是Lys，而Xaa(15)是Glu。
<400>17Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Glu Lys Gly Glu Glu1 5 10 15Trp Ile Gly<210>18<211>20<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>SEQ ID NO11的肽，其中Xaa(1)是Thr Gly，Xaa(8)是Arg，Xaa(10)是Pro，Xaa(12)是Gly，Xaa(13)是Lys，而Xaa(15)是Glu。
<400>18Thr Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu1 5 10 15Glu Trp Ile Gly20<210>19<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>基于人16/6Id mAb CDR3的肽。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(22)<224>位置6的Xaa是Gly或Phe；位置9的Xaa是Arg或Ala；位置10的Xaa是Gly或Ala；位置11的Xaa是Gly或Ala；位置12的Xaa是Trp或Ala；位置13的Xaa是Asn或Ala；位置18的Xaa是Tyr或Trp；位置20的Xaa是Met或Gln。
<400>19Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Leu Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Val Asp1 5 10 15Tyr Xaa Gly Xaa Asp Val
20<210>20<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>SEQ ID NO19的肽，其中Xaa(6)是Gly，Xaa(9)是Arg，Xaa(10)是Gly，Xaa(11)是Gly，Xaa(12)是Trp，Xaa(13)是Ala，Xaa(18)是Tyr，而Xaa(20)是Met。
<400>20Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Arg Gly Gly Trp Ala Asp Val Asp1 5 10 15Tyr Tyr Gly Met Asp Val20<210>21<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>SEQ ID NO19的肽，其中Xaa(6)是Gly，Xaa(9)是Arg，Xaa(10)是Gly，Xaa(11)是Gly，Xaa(12)是Ala，Xaa(13)是Asn，Xaa(18)是Tyr，而Xaa(20)是Met。
<400>21Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Arg Gly Gly Ala Asn Asp Val Asp1 5 10 15Tyr Tyr Gly Met Asp Val
20<210>22<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>SEQ IDNO19的肽，其中Xaa(6)是Gly，Xaa(9)是Arg，Xaa(10)是Gly，Xaa(11)是Ala，Xaa(12)是Trp，Xaa(13)是Asn，Xaa(18)是Tyr，而Xaa(20)是Met。
<400>22Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Arg Gly Ala Trp Asn Asp Val Asp1 5 10 15Tyr Tyr Gly Met Asp Val20<210>23<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>SEQ ID NO19的肽，其中Xaa(6)是Gly，Xaa(9)是Arg，Xaa(10)是Ala，Xaa(11)是Gly，Xaa(12)是Trp，Xaa(13)是Asn，Xaa(18)是Tyr，而Xaa(20)是Met。
<400>23Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Arg Ala Gly Trp Asn Asp Val Asp1 5 10 15Tyr Tyr Gly Met Asp Val
20<210>24<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>SEQ ID NO19的肽，其中Xaa(6)是Gly，Xaa(9)是Ala，Xaa(10)是Gly，Xaa(11)是Gly，Xaa(12)是Trp，Xaa(13)是Asn，Xaa(18)是Tyr，而Xaa(20)是Met。
<400>24Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Ala Gly Gly Trp Asn Asp Val Asp1 5 10 15Tyr Tyr Gly Met Asp Val20<210>25<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>SEQ ID NO19的肽，其中Xaa(6)是Phe，Xaa(9)是Arg，Xaa(10)是Gly，Xaa(11)是Gly，Xaa(12)是Trp，Xaa(13)是Asn，Xaa(18)是Tyr，而Xaa(20)是Met。
<400>25Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Leu Leu Arg Gly Gly Trp Asn Asp Val Asp1 5 10 15Tyr Tyr Gly Met Asp Val
20<210>26<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>SEQ ID NO19的肽，其中Xaa(6)是Gly，Xaa(9)是Arg，Xaa(10)是Gly，Xaa(11)是Gly，Xaa(12)是Trp，Xaa(13)是Asn，Xaa(18)是Tyr，而Xaa(20)是Gln。
<400>26Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Arg Gly Gly Trp Asn Asp Val Asp1 5 10 15Tyr Tyr Gly Gln Asp Val20<210>27<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>SEQ ID NO19的肽，其中Xaa(6)是Gly，Xaa(9)是Arg，Xaa(10)是Gly，Xaa(11)是Gly，Xaa(12)是Trp，Xaa(13)是Asn，Xaa(18)是Trp，而Xaa(20)是Met。
<400>27Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Arg Gly Gly Trp Asn Asp Val Asp1 5 10 15Tyr Trp Gly Met Asp Val
20<210>28<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>以SEQ ID NO1反向顺序制备的合成肽。
<400>28Gly Ile Trp Glu Leu Ser Lys Glu Pro Ser Gln Lys Val Trp Gln Met1 5 10 15Tyr Tyr Gly Thr20<210>29<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>以SEQ ID NO3反向顺序制备的合成肽。
<400>29Ser Gly Gln Gly Trp Tyr Asp Met Ala Tyr Pro Glu Trp Leu Phe Arg1 5 10 15Ala Cys Tyr Tyr20
<210>30<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>以SEQ ID NO6反向顺序制备的合成肽。
<400>30Gly Ile Trp Glu Glu Gly Lys Gly Pro Pro Gln Arg Ile Trp Ser Trp1 5 10 15Tyr Tyr Gly
权利要求
1.一种合成肽，所述合成肽选自以下(a)一种至少12个氨基酸残基、至多30个氨基酸残基的肽，或者所述肽的盐或化学衍生物，所述肽包含由人单克隆抗DNA 16/6Id抗体重链或轻链互补决定区(CDR)组成的序列或所述互补决定区内存在的序列(下文称为“hCDR序列”)，或者所述肽包括如下获得的序列(i)用不同要基酸残基取代所述hCDR序列的一个或多个氨基酸残基；(ii)从所述hCDR序列缺失一个或多个氨基酸残基；和/或(iii)在所述hCDR序列中添加一个或多个氨基酸残基；(b)一种双合成肽，所述双合成肽包括相互之间直接共价连接或通过一个短连接链共价连接的两种不同的(a)所述肽；(c)一种肽聚合物，所述肽聚合物包括多个(a)所述肽序列；以及(d)连接到大分子载体的(a)所述肽或(c)所述肽聚合物。
2.依照权利要求1的合成肽，其中所述hCDR序列包括由人单克隆抗DNA 16/6Id抗体重链CDR组成的序列或所述CDR内存在的序列。
3.依照权利要求1或2的合成肽，所述合成肽包括其它的氨基酸残基。
4.依照权利要求3的合成肽，其中所述其它的氨基酸残基是下面序列的氨基酸残基在所述hCDR序列侧翼的人16/6Id mAb序列，或用不同氨基酸残基取代所述hCDR侧翼序列的一个或多个氨基酸残基、从所述hCDR侧翼序列缺失一个或多个氨基酸残基、和/或在所述hCDR侧翼序列添加一个或多个氨基酸残基而获得的序列。
5.依照权利要求2到4中任一项的合成肽，所述合成肽选自以下(a)一种肽或该肽的盐或化学衍生物，所述肽包含由SEQ ID NO8序列组成的序列或SEQ ID NO8内存在的序列，或者所述肽包含如下获得的序列(i)用不同氨基酸残基取代所述SEQ ID NO8中的一个或多个氨基酸残基；(ii)从所述SEQ ID NO8中缺失一个或多个氨基酸残基；和/或(iii)在所述SEQ ID NO8中添加一个或多个氨基酸残基；(b)一种双合成肽，所述双合成肽包括相互之间直接共价连接或通过一个短连接链共价连接的两种不同的(a)所述肽；(c)一种肽聚合物，所述肽聚合物包括多个(a)所述肽序列；以及(d)连接到大分子载体的(a)所述肽或(c)所述肽聚合物。
6.依照权利要求5的合成肽，所述合成肽包含由SEQ ID NO8序列组成的序列或SEQ ID NO8序列内存在的序列，或者所述合成肽包含如下获得的序列(i)用不同氨基酸残基取代所述SEQ ID NO8中的一个或多个氨基酸残基；(ii)从所述SEQ ID NO8中缺失一个或多个氨基酸残基；和/或(iii)在所述SEQ ID NO8中添加一个或多个氨基酸残基。
7.依照权利要求6的合成肽，所述合成肽选自SEQ ID NO11序列组成的肽。
8.依照权利要求7的合成肽，所述合成肽选自SEQ ID NO12到NO18的序列所组成的肽。
9.依照权利要求7的合成肽，所述合成肽由SEQ ID NO6序列组成。
10.一种肽，所述肽由SEQ ID NO6序列组成。
11.依照权利要求2到4中任一项的合成肽，所述合成肽选自以下(a)一种肽或该肽的盐或化学衍生物，所述肽包含由SEQ ID NO10序列组成的序列或SEQ ID NO10内存在的序列，或者所述肽包含如下获得的序列(i)用不同氨基酸残基取代所述SEQ ID NO10中的一个或多个氨基酸残基；(ii)从所述SEQ ID NO10中缺失一个或多个氨基酸残基；和/或(iii)在所述SEQ ID NO10中添加一个或多个氨基酸残基；(b)一种双合成肽，所述双合成肽包括相互之间直接共价连接或通过一个短连接链共价连接的两种不同的(a)所述肽；(c)一种肽聚合物，所述肽聚合物包括多个(a)所述肽序列；以及(d)连接到大分子载体的(a)所述肽或(c)所述肽聚合物。
12.依照权利要求11的合成肽，所述合成肽包含由SEQ ID NO10序列组成的序列或SEQ ID NO10序列内存在的序列，或者所述合成肽包含如下获得的序列(i)用不同氨基酸残基取代所述SEQ ID NO10中的一个或多个氨基酸残基；(ii)从所述SEQ ID NO10中缺失一个或多个氨基酸残基；和/或(iii)在所述SEQ ID NO10中添加一个或多个氨基酸残基。
13.依照权利要求12的合成肽，所述合成肽选自由SEQ ID NO19序列组成的肽。
14.依照权利要求13的合成肽，所述合成肽选自由SEQ ID NO20到NO27的序列组成的肽。
15.依照权利要求13的合成肽，所述合成肽为由SEQ ID NO7序列组成的肽。
16.一种肽，所述肽由SEQ ID NO7序列组成。
17.依照权利要求2到4中任一项的合成肽，所述合成肽选自以下(a)一种肽或该肽的盐或化学衍生物，所述肽包含由SEQ ID NO9组成的序列或SEQ ID NO9内存在的序列，或者所述肽包含如下获得的序列(i)用不同氨基酸残基取代所述SEQ ID NO9中的一个或多个氨基酸残基；(ii)从所述SEQ ID NO9中缺失一个或多个氨基酸残基；和/或(iii)在所述SEQ ID NO9中添加一个或多个氨基酸残基；(b)一种双合成肽，所述双合成肽包括相互之间直接共价连接或通过一个短连接链共价连接的两种不同的(a)所述肽；(c)一种肽聚合物，所述肽聚合物包括多个(a)所述肽序列；以及(d)连接到大分子载体的(a)所述肽或(c)所述肽聚合物。
18.依照权利要求17的合成肽，所述合成肽包含由SEQ ID NO9组成的序列或SEQ ID NO9序列内存在的序列，或者所述合成肽包含如下获得的序列(i)用不同氨基酸残基取代所述SEQ ID NO9中的一个或多个氨基酸残基；(ii)从所述SEQ ID NO9中缺失一个或多个氨基酸残基；和/或(iii)在所述SEQ ID NO9中添加一个或多个氨基酸残基。
19.依照权利要求2的双合成肽，其中两种不同的肽各自包含由不同的人16/6Id mAb重链CDR组成的序列或不同的人16/6Id mAb重链CDR内存在的序列，所述两种不同的肽相互之间或者直接共价连接，或者通过短的连接链共价连接。
20.依照权利要求19的双合成肽，其中一种权利要求6的肽共价连接一种权利要求12的肽。
21.依照权利要求20的双合成肽，其中一种SEQ ID NO11的肽共价连接一种SEQ ID NO19的肽。
22.一种双合成肽，其中SEQ ID NO6的肽共价连接SEQ ID NO7的肽。
23.依照权利要求1到4中任一项的肽聚合物，所述肽聚合物包含多个选自SEQ ID NO6、7和11-27的相同序列。
24.一种药用组合物，所述药用组合物包含至少一种依照权利要求1到23的合成肽或肽聚合物以及药学上可接受的载体。
25.一种药用组合物，所述药用组合物包含具有SEQ ID NO6的序列的肽以及药学上可接受的载体。
26.一种药用组合物，所述药用组合物包含具有SEQ ID NO7的序列的肽以及药学上可接受的载体。
27.依照权利要求24到26中任一项的药用组合物，所述药用组合物用于治疗系统性红斑狼疮。
28.依照权利要求24到27中任一项的药用组合物，所述药用组合物适用于口服给药、静脉内给药、皮下给药、关节内给药、肌肉内给药、吸入给药、鼻内给药、鞘内给药、腹膜内给药、皮内给药、经皮给药或肠内给药。
29.一种治疗系统性红斑狼疮(SLE)的方法，所述方法包括给予SLE患者有效量的依照权利要求1到23中任一项的肽或肽聚合物。
30.依照权利要求29的方法，所述方法包括给予所述SLE患者有效量SEQ ID NO6的肽。
31.依照权利要求29的方法，所述方法包括给予所述SLE患者有效量SEQ ID NO7的肽。
32.一种免疫调节系统性红斑狼疮(SLE)患者SLE相关反应的方法，所述方法包括给予所述SLE患者有效量依照权利要求1到23中任一项的肽或肽聚合物。
33.依照权利要求32的方法，所述方法包括负调节SLE患者体内基质金属蛋白酶(MMP)-3的水平和/或MMP-9活性。
34.依照权利要求32的方法，所述方法包括免疫调节SLE患者体内细胞因子活性水平。
35.依照权利要求34的方法，所述方法包括负调节SLE患者体内IL-2的水平和/或IFN-γ活性。
36.依照权利要求34的方法，所述方法包括负调节SLE患者体内TGF-β活性水平。
37.依照权利要求32到36中任一项的方法，所述方法包括给予所述SLE患者有效量SEQ ID NO6的肽。
38.依照权利要求32到36中任一项的方法，所述方法包括给予所述SLE患者有效量SEQ ID NO7的肽。
39.一种评价药物治疗SLE患者的有效性的方法，所述方法包括在不同时间间隔测量从用所述药物治疗的所述患者获取的血液样品中MMP-3和/或MMP-9的水平，由此把MMP-3和/或MMP-9的水平降低与所述药物的有效性联系起来。
40.一种评价药物治疗SLE患者的有效性的方法，所述方法包括在不同时间间隔测量从用所述药物治疗的所述患者获取的血液样品中IL-2和/或IFNγ-的水平，由此把IL-2和/或IFN-γ的水平降低与所述药物的有效性联系起来。
41.一种评价药物治疗SLE患者的有效性的方法，所述方法包括在不同时间间隔测量从用所述药物治疗的所述患者获取的血液样品中TGF-β的水平，由此把TGF-β的水平升高与所述药物的有效性联系起来。
全文摘要
至少12个氨基酸残基、至多30个氨基酸残基的合成肽，所述合成肽包含由人抗DNA 16/6Id单克隆抗体重链或轻链互补决定区(CDR)组成的序列或在所述互补决定区内发现的序列，或者所述合成肽包含通过在所述序列取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基而获得的序列，所述肽的盐、化学衍生物和聚合物可用于免疫调节系统性红斑狼疮相关反应。
文档编号A61P29/00GK1503806SQ02808712
公开日2004年6月9日 申请日期2002年2月26日 优先权日2001年2月26日
发明者E·莫泽斯, E 莫泽斯 申请人:耶达研究及发展有限公司