钩虫疫苗的制作方法

专利名称：钩虫疫苗的制作方法
背景技术：
发明领域本发明大体上涉及钩虫的疫苗。尤其是，本发明提供了基于寄生虫来源的抗原的疫苗。
背景技术：
钩虫感染是世界范围内发展中国家的一个重要的公共卫生问题，其引起肠炎，肠道内失血，贫血，发育迟缓以及营养不良。据估计世界范围内具有多于十亿的人类钩虫感染病例，单单在中国就有一亿九千四百万的病例(Hotez等人，1997年)。在中国的某些地区，诸如在南海的海南省，多于60％的人群携带钩虫(Gandhi等人，2001年)。
大多数由钩虫引起的病理学症状产生于人类肠道内成熟阶段的寄生虫。成熟钩口线虫属(Ancylostoma)钩虫对脊椎动物小肠的粘膜和粘膜下层的吸附是所有寄生虫学中一种最详细定义寄主-寄生虫之间关系的例子。在寄生虫的口鞘中包括几个立方毫米的寄主粘膜和粘膜下层组织，可以在验尸或者尸体检查的过程中真正触及寄主-寄生虫的关联(Kalkofen，1970年；Kalkofen，1974年)。
犬钩口线虫(Ancylostoma caninum)是包括北美亚热带地区的世界各地的犬类发病和死亡的主要原因。引起严重贫血甚至死亡的与钩虫相关的缺血可以发生在狗单次最初感染后2和3周之间(Soulsby，1982年；Jones和Hotez，2002年)。值得注意的是，犬钩口线虫(A.canium)最近已被鉴定为一种重要的人类病原体。感染有成熟犬钩口线虫寄生虫的人畜共患病可以引起嗜酸性肠炎综合征，即一种肠道响应于寄生虫攻击的炎症状态(Prociv和Croese，1990年)。犬钩口线虫(Ancylostoma canium)感染的发病机理与肠道内缺血相关，所述缺血可以发生在成熟寄生虫在哺乳动物小肠中吸附和摄取食物的阶段(Kalkofen，1970年；Kalkofen，1974年)。
目前对钩虫蔓延的治疗和控制的努力集中在用驱虫药从病人体内周期性去除成熟钩虫。这种方法具有几种局限性，包括治疗后的快速重复感染，需要多次就诊，以及在多年大量使用驱虫药治疗后最终发展出钩虫的抗驱虫药株(Savioli等人，1997年；Geerts和Gryseels，2000年)。因此，如果具有治疗和预防哺乳动物钩虫感染的可用的其它方法将是十分有益的。例如，如果具有治疗或预防钩虫感染的有用疫苗将是非常有益的。
发明概述本发明提供了引发针对钩虫的免疫应答的制剂。所述制剂含有多种钩虫抗原，这些抗原已被证实可用于引发免疫应答。这些制剂可被用作疫苗抗哺乳动物，例如人类体内的钩虫。施用制剂后，免疫接种的哺乳动物可以发展抗钩虫的免疫应答，产生对寄生虫感染的免疫性，或者可以显示较少的虫载量，缺血的缓解，或者寄生的钩虫大小的降低。为此，本发明提供了含有来自钩虫的重组或者合成的抗原或者其片段以及一种可可药用载体的组合物。重组的或者合成的抗原可以显示与诸如如下所述的抗原有至少80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API或者Ay-TTR。在一个优选的实施方案中，抗原为Ac-TMP，Ac-MEP-1或者Ac-MTP-1。抗原可以来源于诸如美洲板口线虫(Nector americanus)，犬钩口线虫(Ancylostoma canium)，锡兰钩口线虫(Ancylostoma ceylancium)，和十二指肠钩口线虫(Ancylostoma duodenale)种类的钩虫。
本发明也提供了引发哺乳动物对钩虫免疫应答的方法。所述方法包括给哺乳动物施用有效量的组合物的步骤，所述组合物包括来源于钩虫的重组或者合成的抗原(或者抗原的片段)和可药用载体。重组或者合成的抗原与诸如如下所述的抗原表现出至少大约80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API和Ay-TTR。在优选的实施方案中，抗原为Ac-TMP，Ac-MEP-1或者Ac-MTP-1。抗原可以来源于诸如美洲板口线虫，犬钩口线虫，锡兰钩口线虫，和十二指肠钩口线虫种类的钩虫。
本发明进一步提供了免疫接种哺乳动物抗钩虫的方法。所述方法包括给哺乳动物施用有效量的组合物的步骤，所述组合物包括来源于钩虫的重组或者合成的抗原(或者抗原的片段)和可药用载体。重组或者合成的抗原表现出与诸如如下所述的抗原有至少大约80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API和Ay-TTR。在优选的实施方案中，抗原为Ac-TMP，Ac-MEP-1或者Ac-MTP-1。抗原可以来源于诸如美洲板口线虫，犬钩口线虫，锡兰钩口线虫，和十二指肠钩口线虫种类的钩虫。
本发明进一步提供了一种组合物，其包括来源于钩虫的重组或者合成的抗原(或者抗原的片段)。重组或者合成的抗原表现出与诸如如下所述的抗原有至少大约80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API和Ay-TTR。组合物进一步包括一种可药用载体。在优选的实施方案中，抗原为Ac-TMP，Ac-MEP-1或者Ac-MTP-1。抗原可以来源于诸如美洲板口线虫，犬钩口线虫，锡兰钩口线虫，和十二指肠钩口线虫种类的钩虫。
本发明进一步提供了一种疫苗，其包括来源于钩虫的重组或者合成的抗原(或者抗原的片段)。重组或者合成的抗原表现出与诸如如下所述的抗原有至少大约80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API和Ay-TTR。所述疫苗进一步包括一种可药用载体。在优选的实施方案中，抗原为Ac-TMP，Ac-MEP-1或者Ac-MTP-1。抗原可以来源于诸如美洲板口线虫，犬钩口线虫，锡兰钩口线虫，和十二指肠钩口线虫种类的钩虫。
本发明进一步提供了一种引发免疫应答的组合物，所述组合物包括来源于钩虫的重组或者合成的抗原(或者抗原的片段)。重组或者合成的抗原表现出与诸如如下所述的抗原有至少大约80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API和Ay-TTR。所述疫苗进一步包括一种可药用载体。在优选的实施方案中，抗原为Ac-TMP，Ac-MEP-1或者Ac-MTP-1。抗原可以来源于诸如美洲板口线虫，犬钩口线虫，锡兰钩口线虫，和十二指肠钩口线虫种类的钩虫。
本发明进一步提供了能够给病人接种疫苗抗传染性疾病的方法。所述方法包括如下步骤治疗钩虫感染到足以提高淋巴细胞增殖的水平，并且免疫接种病人抗诸如HIV，结核病，疟疾，麻疹，破伤风，白喉，百日咳或者脊髓灰质炎(polio)的传染性疾病。
本发明也提供了能够接种免疫钩虫的方法。所述方法包括如下步骤化学治疗钩虫感染的病人以缓解钩虫感染，并且在缓解钩虫感染后给病人接种来源于钩虫的重组或者合成的抗原(或者其抗原片段)。在所述方法中，通过治疗钩虫感染可被完全根除或者可降低到钩虫免疫接种有效的程度。重组或者合成的抗原可能显示与诸如如下抗原有至少大约80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API和Ay-TTR。
本发明还提供了减少感染有钩虫的病人缺血的方法。所述方法包括给病人施用一种组合物的步骤，所述组合物包括一种来源于钩虫的重组或者合成抗原(或者其抗原的片段)以及一种可药用载体。
本发明还提供了降低感染有钩虫的病人体内钩虫大小的方法。所述方法包括给病人施用一种组合物的步骤，所述组合物包括一种来源于钩虫的重组或者合成抗原(或者其抗原的片段)以及一种可药用载体。
本发明进一步提供了一种降低感染有钩虫的病人体内钩虫数量的方法。所述方法包括给病人施用一种组合物的步骤，所述组合物包括一种来源于钩虫的重组或者合成抗原(或者其抗原的片段)以及一种可药用载体。
本发明也提供了下列的核酸和氨基酸序列SEQ ID NO.11，SEQID NO.12，SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15，SEQ IDNO.16，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11，SEQ ID NO.12，SEQID NO.21，SEQ ID NO.22，SEQ ID NO.23，SEQ ID NO.24，SEQ IDNO.25，SEQ ID NO.26，SEQ ID NO.27，SEQ ID NO.28，SEQ ID NO.29，SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.31，SEQ ID NO.32，SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.34，SEQ ID NO.35，SEQ ID NO.36，SEQ ID NO.37，SEQID NO.38，SEQ ID NO.39，SEQ ID NO.40，SEQ ID NO.41，SEQ IDNO.42，SEQ ID NO.43，SEQ ID NO.44，SEQ ID NO.47，SEQ ID NO.48，SEQ ID NO.49，SEQ ID NO.50，SEQ ID NO.51，SEQ ID NO.52，SEQ ID NO.55，SEQ ID NO.56，SEQ ID NO.57，SEQ ID NO.58，SEQID NO.59，SEQ ID NO.60，SEQ ID NO.61，SEQ ID NO.62，SEQ IDNO.63和SEQ ID NO.64。


图1A和B.Na-ASP-1A，cDNA(SEQ ID NO.1)和B，推导的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)。GeneBank登录号AF079521。
图2A和B.Na-ACEA，cDNA(SEQ ID NO.3)和B，推导的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)。GeneBank登录号AF536813。
图3A和B.Na-CTLA，cDNA(SEQ ID NO.5)和B，推导的氨基酸序列(SEQ ID NO.6)。
图4A和B.Na-APR-1A，cDNA(SEQ ID NO.7)和B，推导的氨基酸序列(SEQ ID NO.8)。
图5A和B.Na-APR-2A，cDNA(SEQ ID NO.9)和B，推导的氨基酸序列(SEQ ID NO.10)。
图6A和B.Ac-TMPA，cDNA(SEQ ID NO.11)和B，推导的氨基酸序列(SEQ ID NO.12)。
图7A和B.Ac-MEP-1A，cDNA(SEQ ID NO.13)和B，推导的氨基酸序列(SEQ ID NO.14)。GeneBank登录号AF273084。
图8A和B.Ac-MTP-1A，cDNA(SEQ ID NO.15)和B，推导的氨基酸序列(SEQ ID NO.16)。GeneBank登录号AY036056。
图9A和B.Ac-ASP-1A，cDNA(SEQ ID NO.17)和B，推导的氨基酸序列(SEQ ID NO.18)。GeneBank登录号AF132291。
图10A和B.Ac-ASP-2A，cDNA(SEQ ID NO.19)和B，推导的氨基酸序列(SEQ ID NO.20)。GeneBank登录号AF089728。
图11A和B.Ac-ASP-3A，cDNA(SEQ ID NO.21)和B，推导的氨基酸序列(SEQ ID NO.22)。
图12A和B.Ac-ASP-4A，cDNA(SEQ ID NO.23)和B，推导的氨基酸序列(SEQ ID NO.24)。
图13A和B.Ac-ASP-5A，cDNA(SEQ ID NO.25)和B，推导的氨基酸序列(SEQ ID NO.26)。
图14A和B.Ac-ASP-6A，cDNA(SEQ ID NO.27)和B，推导的氨基酸序列(SEQ ID NO.28)。
图15 A和B.Ac-TTRA，cDNA(SEQ ID NO.29)和B，自核苷酸25-531推导的氨基酸序列(SEQ ID NO.30)。
图16A和B.Ac-103A，cDNA(SEQ ID NO.31)和B，氨基酸序列(SEQ ID NO.32)。
图17A和B.Ac-VWFA，cDNA(SEQ ID NO.33)和B，氨基酸序列(SEQ ID NO.34)。
图18A和B.Ac-CTLA，cDNA(SEQ ID NO.35)和B，氨基酸序列(SEQ ID NO.36)。
图19A和B.Ac-API-1A，cDNA(SEQ ID NO.37)和B，自核苷酸23-706推导的氨基酸序列(SEQ ID NO.38)。
图20A和B.Ac-MTP-1A，cDNA(SEQ ID NO.39)和B，氨基酸序列(SEQ ID NO.40)。
图21A和B.Ac-MTP-2A，cDNA(SEQ ID NO.41)和B，氨基酸序列(SEQ ID NO.42)。
图22A和B.Ac-MTP-3A，cDNA(SEQ ID NO.43)和B，氨基酸序列(SEQ ID NO.44)。
图23A和B.Ac-FAR-1A，cDNA(SEQ ID NO.45)和B，氨基酸序列(SEQ ID NO.46)。GeneBank登录号AF529181。
图24A-C.Ac-KPI-1A和B，cDNA(SEQ ID NO.47)和C，自核苷酸12-2291推导的氨基酸序列(SEQ ID NO.48)。
图25A和B.Ac-APR-1A，cDNA(SEQ ID NO.49)和B，氨基酸序列(SEQ ID NO.50)。
图26A和B.Ac-APR-2A，部分cDNA序列(SEQ ID NO.51)和B，部分氨基酸序列(SEQ ID NO.52)。
图27A和B.Ac-APA，cDNA(SEQ ID NO.53)和B，氨基酸序列(SEQ ID NO.54)。
图28A和B.Ay-ASP-1A，cDNA(SEQ ID NO.55)和B，氨基酸序列(SEQ ID NO.56)。
图29A和B.Ay-ASP-2A，cDNA(SEQ ID NO.57)和B，氨基酸序列(SEQ ID NO.58)。
图30A和B.Ay-MTP-1A，cDNA(SEQ ID NO.59)和B，氨基酸序列(SEQ ID NO.60)。
图31A和B.Ay-API-1A，cDNA(SEQ ID NO.61)和B，自核苷酸23-703推导的氨基酸序列(SEQ ID NO.62)。
图32A和B.Ay-TTRA，部分cDNA(SEQ ID NO.63)和B，部分氨基酸序列(SEQ ID NO.64)。
图33A和B.钩虫数量和抗-MTP-1抗体滴度之间的皮尔曼(Spearman)等级相关。A)总虫数；B)中值EPG。
图34A-C.免疫接种有犬钩口线虫重组融合蛋白的犬体内抗原-特异性几何平均数IgG1抗体滴度作为时间的函数。几何平均数计算为每组6只狗，除了Ac-AP组，其中只有一只狗发展了抗原-特异性抗体应答。箭头显示时控的免疫接种。(A)抗-Ac-APR-1应答(n＝6)。(B)抗-Ac-TMP应答(n＝6)。(C)抗Anti-Ac-AP应答(n＝1)。
图35.从免疫接种或者注射明矾的狗的结肠回收的雄性和雌性成熟犬钩口线虫钩虫。
图36A和B.钩虫数量和抗-MTP-1抗体滴度之间的皮尔曼等级相关。
图37A和B.A)抗-TTR IgE抗体和钩虫数量减少之间的关联；B)抗-TTR IgG1抗体和钩虫数量减少之间的关联。
图38A和B.在L3攻击后，HV-4犬血红蛋白(B)和血细胞比容(A)的改变。
图39.相比于佐剂对照组，TTR免疫接种的小组中钩虫大小(在1和2mm之间)在统计上显著减小。
图40.来自用钩口线虫(Ancylostoma)L3抗原刺激后的钩虫感染(虫卵阳性)个体的CD4+淋巴细胞。
图41.来自用表达重组Na-ASP-1的毕赤酵母(Pichia)刺激后的钩虫感染(虫卵阳性)个体的CD4+淋巴细胞。
本发明优选实施方案的详细描述本发明提供了用于引发哺乳动物针对钩虫的免疫应答的组合物。这种组合物可被用作疫苗用于治疗和/或预防钩虫感染。所述疫苗包括纯化的抗原制剂和可药用载体，所述抗原来源于钩虫。术语“来源于”是指抗原起源于(即，分离自)钩虫的生物分子。例如，抗原可以是蛋白，多肽或者蛋白或者多肽的抗原片段，所述蛋白或者多肽组成了钩虫生物体的一部分。通常，这种抗原是分离自并且至少部分纯化自钩虫，分离和纯化方法对于本领域技术人员是公知的(例如参见下述实施例部分)。当制造用于引发免疫应答或者作为疫苗时，这种抗原可以是“合成的”，即合成获得(例如，在多肽和蛋白片段的情况下通过肽合成制成)，或者是“重组的”，即通过遗传工程技术获得(例如，通过在含载体的宿主细胞中产生，所述载体具有编码抗原的DNA)。本领域技术人员将认识到多种这样的合适表达系统都可以采用，包括但不限于那些使用大肠杆菌，酵母(例如，毕赤酵母)，杆状病毒/昆虫细胞，植物细胞和哺乳动物细胞的表达系统。在本发明的优选实施方案中，抗原表达在酵母或者杆状病毒/昆虫细胞表达系统中。
这里给出了特异性抗原，其氨基酸一级序列以及编码它们的核酸序列的例子。为了参考的方便，表I列举了一些示范性抗原和它们相应的SEQ ID NOS。然而，本领域技术人员应该认识到这里列举的序列可以存在或者构建多种变体，这些变体在实施本发明的过程中也可作为抗原。例如，根据氨基酸序列，可以存在或者构建变体，所述变体表现保守氨基酸取代；非保守氨基酸取代；例如通过在氨基末端或者羧基末端或者在分子内部缺失氨基酸进行截短；或者通过在氨基末端或者羧基末端或者在分子内部添加氨基酸(例如，添加有助于蛋白分离的组氨酸标记)，取代残基以改变溶解特性，替换包括蛋白酶剪切位点的残基以消除剪切位点并提高稳定性，添加或者去除糖基化位点等或者为了其它任意原因)。这种变体可以是自然发生的(例如，作为在种之间或者个体之间自然变异的结果)；或者可以是有目的的导入(例如，利用遗传工程技术的试验装置)。如果抗原变体显示与描述的序列有充分的同一性，则这里公开的序列的所有变体都应该包括在本发明的教导中。优选的，与公开的序列的同一性在大约50到100％的范围内，更优选在大约75到100％的范围内，而最优选在80到100％的范围内。同一性是参考相应于原始抗原序列的氨基酸序列部分，即不包括可被添加的其它元件，诸如下列描述的嵌合抗原。
表I.钩虫抗原，描述，和相应的SEQ ID NOS。

本发明也包括嵌合抗原，例如由这里描述的氨基酸序列加上其它序列组成的抗原，所述其它序列当分离时与公开的序列不必须相连，但是添加这些氨基酸赋予了一些其它的优点。例如，这些优点可被用于分离和纯化蛋白(例如，组氨酸标记，GST，麦芽糖结合蛋白)；指引蛋白到特定的细胞内位置(例如酵母分泌蛋白)；提高蛋白的抗原性(例如，KHL，半抗原)。所有的这些嵌合构建体都应该包括在本发明的范围内，只要基于此处公开的序列的部分构建体的存在至少显示同源性的水平。
本领域技术人员将认识到为了引发对抗原所起源的寄生虫有足够的抗原应答，无须使用蛋白和或者多肽的全部一级序列。在一些情况下，蛋白的片段足以赋予免疫性。因此，本发明也包括此处公开的序列的抗原片段，及其在疫苗制剂中的应用。通常，这种片段的长度至少大约10-13氨基酸。本领域技术人员应该认识到合适的序列通常是亲水的并且常常是表面可接近的。
同样，根据这里公开的核酸序列，本领域技术人员应该认识到序列可以存在或构建多种变体，这种变体仍然能够提供编码的抗原或者其需要的部分。例如，由于遗传密码的冗余，一种以上密码子可被用于编码一种氨基酸。此外，如上所述，可希望对抗原一级序列进行改变，而且这对于编码核酸序列的改变是必须的。此外，本领域技术人员应该认识到核酸序列的多种变体可得以构建用于涉及克隆策略的目的(例如，为了便于操作序列插入载体，诸如导入限制酶剪切位点等)，用于修饰转录的目的(例如，导入启动子或者增强子序列等)，或者用于其它任意合适目的。这里公开的核酸序列的所有这样的变体都应该包括在本发明的范围内，只要序列表现出与原始序列大约50到100％的同一性，并且优选，显示大约75到100％的同一性，而最优选，大约80到100％的同一性。同一性参照相应原始序列的部分核酸序列，并且不应该包括其它元件，诸如，启动子，载体来源的序列，来源于其它来源的限制酶切位点等。
本发明的抗原可以来自于任何种类的钩虫，例子包括但不限于美洲板口线虫，犬钩口线虫，锡兰钩口线虫和十二指肠钩口线虫。
合适的钩虫抗原的例子包括但不限于Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API，和Ay-TTR。
在本发明的一些实施方案中，抗原实体是与激活相关的分泌蛋白，这些蛋白的例子包括但不限于Na-ASP-1，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ay-ASP-1，和Ay-ASP-2。
在本发明的其它实施方案中，抗原部分是蛋白酶，这些蛋白酶的例子包括但不限于金属蛋白酶(例如，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3；半胱氨酸蛋白酶；天冬氨酸蛋白酶(例如，Ac-APR-1和Ac-APR-2)；以及丝氨酸蛋白酶。
在本发明的其它实施方案中，抗原可以是凝集素(例如，Na-CTL，Ac-CTL)。
在本发明的其它实施方案中，抗原可以是蛋白酶抑制剂(例如，Ac-API-1，Ay-API-1，Ac-AP，Ac-KPI-1)。
在优选的实施方案中，在实施本发明中使用的抗原为Ac-TMP，其DNA编码序列列在图6A(SEQ ID NO.11)中，并且其氨基酸序列列在图6B(SEQ ID NO.12)中。
在另一个优选的实施方案中，在实施本发明中使用的抗原为Ac-MEP-1，其DNA编码序列列在图7A(SEQ ID NO.13)中，并且其氨基酸序列列在图7B(SEQ ID NO.14)中。
在另一个优选的实施方案中，在实施本发明中使用的抗原为Ac-MTP-1，其DNA编码序列列在图8A(SEQ ID NO.15)中，并且其氨基酸序列列在图8B(SEQ ID NO.16)中。
其它的优选抗原包括但不限于Na-CTL(SEQ ID NOS.5-6)；Na-APR-1(SEQ ID NOS.7-8)；Na-APR-2(SEQ ID NOS.9-10)；Ac-TMP(SEQID NOS.11-12)；Ac-ASP-3(SEQ ID NOS.21-22)；Ac-ASP-4(SEQ IDNOS.23-24)；Ac-ASP-5(SEQ ID NOS.25-26)；Ac-ASP-6(SEQ ID NOS.27-28)；Ac-TTR(SEQ ID NOS.29-30)；Ac-103(SEQ ID NOS.31-32)；Ac-VWF(SEQ ID NOS.33-34)；Ac-CTL(SEQ ID NOS.35-36)；Ac-API-1(SEQ ID NOS.37-38)；Ac-MTP-1(SEQ ID NOS.39-40)；Ac-MTP-2(SEQID NOS.41-42)；Ac-MTP-3(SEQ ID NOS.43-44)；Ac-KPI-1(SEQ IDNOS.47-48)；Ac-APR-1(49-50)；Ac-APR-2(SEQ ID NOS.51-52)；Ay-ASP-1(SEQ ID NOS.55-56)；Ay-ASP-2(SEQ ID NOS.57-58)；Ay-MTP-1(SEQ ID NOS.59-60)；Ay-API-1(SEQ ID NOS.61-62)；Ay-TTR(SEQ ID NOS.63-64)。
本发明提供了用于引发免疫应答的组合物，所述组合物可被用作疫苗抗钩虫。术语“引发免疫应答”是指一种抗原刺激特异性抗体的合成，滴度为大约＞1到大约1×106或者更大。优选的，滴度为从大约10,000到大约1×106或者更大，而最优选的，滴度大于1×106，例如通过3H胸腺嘧啶的掺入进行测定。术语“疫苗”是指一种引发免疫应答的抗原，与未免疫接种(例如只有佐剂)的对照组生物体相比引起生物体内钩虫数量至少降低大约30％。优选的，下降水平为大约50％，更优选的大约60到大约70％或者更高。
本发明提供了用于引发免疫应答的组合物，可被用作疫苗抗钩虫。所述组合物包括这里所述的基本上纯化的钩虫抗原或者其变体，以及可药用载体。用作疫苗的这种组合物的制备是本领域技术人员公知的。通常，这种组合物可被制备成液体溶液或者悬浮液，然而诸如，片剂，丸剂，粉末等的固体形式也在考虑的范围内。在给药前适合溶解于或者悬浮于液体中的固体形式也可被制备。制剂也可以是乳化的形式。活性组分可以与可药用的并与活性组分相容的赋形剂混合在一起。合适的赋形剂为，例如，水，盐水，葡萄糖，甘油，乙醇等等，或者其组合物。此外，组合物可以含有少量的辅助物质，诸如润湿剂或者乳化剂，pH缓冲剂等。另外，组合物可含有其它佐剂。如果需要施用口服形式的组合物，可以添加各种增稠剂，调味剂，稀释剂，乳化剂，分散助剂或者粘合剂等。本发明的组合物可以含有任意的这种添加成分从而提供适合给药形式的组合物。制剂中钩虫抗原的最终量可以变化。但是，通常，制剂中的量大约从1％到99％。
本发明的疫苗制剂可以进一步包括佐剂，合适的例子包括但不限于Seppic，Quil A，Alhydrogel等。
本发明的制剂可以含有一种单一的钩虫抗原。或者，一种以上钩虫抗原可被用于制剂中，即，制剂可含有“鸡尾酒”抗原。
本发明也提供了引发针对钩虫的免疫应答的方法以及免疫接种哺乳动物抗钩虫的方法。术语引发免疫应答是指施用抗原引起特异性抗体(滴度范围为1到1×106，优选1×103，更优选1×103到大约1×106，而最优选大于1×106)的合成和/或细胞增殖，例如通过3H胸腺嘧啶的掺入进行测定。所述方法包括给哺乳动物施用在可药用载体中含有钩虫抗原的组合物。本发明的疫苗制剂可通过任意的多种合适的方式进行给药，所述方式对于本领域技术人员是公知的，包括但不限于注射，口服，鼻内，通过摄取含有抗原的食品等等。在优选的实施方案中，给药方式为皮下或者肌内。
本发明提供了引发针对钩虫的免疫应答的方法以及免疫接种哺乳动物抗钩虫的方法。在一个实施方案中，哺乳动物为人类。但是，本领域技术人员应该认识到其它哺乳动物也存在，因为对此接种免疫抗钩虫也是有益的，即制剂也用于兽用目的。所述例子包括但不限于伴侣“宠物”，诸如狗，猫等；食物来源，工作和娱乐动物，诸如牲畜，马，牛，绵羊，猪，山羊等等。
本领域技术人员应该认识到，通常为了免疫接种(或者引发免疫应答)目的物种(例如，人)抗钩虫，使用的抗原应该来源于寄生于目的物种的钩虫种。例如，通常来源于美洲板口线虫的抗原对于免疫人类是优选的，并且来源于犬钩口线虫的抗原对于免疫犬类是优选的。但是并非总是这种情况。例如，犬钩口线虫已知寄生人类及其原始的犬类宿主。此外，交叉物种的钩虫抗原有时可能对于引发非宿主动物，即通常不作为抗原所来源的寄生虫的宿主的免疫应答高度有效。甚至，抗原适合用于免疫刺激或者疫苗制剂的测定依赖于其赋予的防止寄生虫攻击和寄生的能力，如通过例如钩虫数量的降低或者抑制与钩虫相关的缺血所表明(例如，通过血球比容积和/或血红蛋白的浓度进行测定)所显示。例如，为了用于疫苗制剂，给药后抗原引起钩虫数量降低至少大约30％，优选至少大约50％，而最优选至少大约60％到大约70％。
在本发明的一个实施方案中，提供了能够免疫接种病人抗传染病的方法。所述方法包括治疗钩虫感染到足以增加淋巴细胞增殖的水平，然后通过免疫接种病人抗所述传染病。所述方法基于实施例10中提供的事实，所述实施例显示钩虫滋生引起细胞对钩虫和可能的其它抗原刺激无免疫反应性。因此，通过在免疫接种抗钩虫或任意传染剂前化学处理钩虫感染病人，对于免疫接种的应答会得以提高。免疫接种抗所述传染病的结果得以改善的传染病的例子包括但不限于HIV，结核病，疟疾和常规儿童免疫接种(例如，麻疹，破伤风，白喉，百日咳，脊髓灰质炎等等)。
可通过其进行化学处理的钩虫药剂的例子包括但不限于丙硫咪唑(albendazole)和其它的驱虫药。
这里描述的特定抗原也可用于治疗其它肿瘤，自身免疫和心血管疾病，以及治疗促炎状态。其它钩虫抗原的这种应用已被描述在，例如，授权给Capello等人的美国专利5,427,937和授权给Hawdon的美国专利5,753,787中。
本发明也提供了下列核酸和氨基酸序列SEQ ID NO.11，SEQ IDNO.12，SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15，SEQ ID NO.16，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQID NO.9，SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11，SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.21，SEQ ID NO.22，SEQ ID NO.23，SEQ ID NO.24，SEQ ID NO.25，SEQ ID NO.26，SEQ ID NO.27，SEQ ID NO.28，SEQ ID NO.29，SEQID NO.30，SEQ ID NO.31，SEQ ID NO.32，SEQ ID NO.33，SEQ IDNO.34，SEQ ID NO.35，SEQ ID NO.36，SEQ ID NO.37，SEQ ID NO.38，SEQ ID NO.39，SEQ ID NO.40，SEQ ID NO.41，SEQ ID NO.42，SEQ ID NO.43，SEQ ID NO.44，SEQ ID NO.47，SEQ ID NO.48，SEQID NO.49，SEQ ID NO.50，SEQ ID NO.51，SEQ ID NO.52，SEQ IDNO.55，SEQ ID NO.56，SEQ ID NO.57，SEQ ID NO.58，SEQ ID NO.59，SEQ ID NO.60，SEQ ID NO.61，SEQ ID NO.62，SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64。所述序列代表cDNA序列以及其编码的氨基酸序列(开放阅读框架)。虽然序列本身已经被要求保护，但是其它与那些描述的序列相比具有高水平同一性的序列也被考虑在内，例如与给出的序列具有至少65％到100％同一性，或者优选大约75％到100％同一性，或者最优选至少大约80％到100％同一性的序列。
尤其是，Ac-APR-2(SEQ ID NOS.51和52)以及Ay-TTR(SEQ IDNOS.63和64)是代表大部分抗原序列的部分序列。因此，本发明包括完整的Ac-APR-2抗原和完整的Ay-TTR抗原。
另外，本领域技术人员应该认识到在本申请中提供的Ay-TTR抗原代表在很多物种线虫中存在的Ay-TTR族的抗原。同样，来自任意线虫的Ay-TTR抗原应该包括在本发明的范围内。尤其是，来自于包括但不限于美洲板口线虫，犬钩口线虫，锡兰钩口线虫，和十二指肠钩口线虫的种类钩虫的任意Ay-TTR也包括在本发明的范围之内。
实施例实施例1.Ac-TMP的分子克隆和纯化材料和方法成熟犬钩口线虫文库的免疫筛选制备抗-犬钩口线虫分泌性产物抗体。如上所述(Hotez和Cerami，1983)，从尸检(感染后6周)感染狗的肠道内回收一百只活的成熟阶段的犬钩口线虫(Ancylostomacaninum)钩虫。成熟钩虫在无菌PBS中冲洗3次，然后在37℃(5％CO2)保存在15ml含有25mM的HEPES，100单位/ml的氨苄青霉素和100μg/ml的链霉素的RPM 1640中24小时。收集上清液，用PEG6000浓缩，并用1L的磷酸盐缓冲液((pH 7.2)在4℃透析过夜。透析后，析出的产物在10,000xg离心10分钟，并回收上清液。
通过皮下注射用完全弗氏佐剂乳化的钩虫分泌的蛋白(400μg)免疫兔子。随后，用相同量的弗氏不完全佐剂乳化的钩虫分泌的蛋白以2周的时间间隔免疫兔子，总共进行三次免疫。最终免疫后10天获得终血，并且从全血分离血清并保存在-20℃。
cDNA表达ZapII(Stratagene，La Jolla CA)文库的构建以前曾经报道过(Capello等人，1996)。根据厂商的说明书用兔子抗-犬钩口线虫成熟分泌产物抗体筛选到据估计5×105的噬斑。简而言之，5×104的噬斑涂铺在LB琼脂培养板中。通过用10mM IPTG浸润的硝酸纤维膜覆盖噬斑诱导犬钩口线虫抗原的表达。在37℃培养4小时后，提起膜，用5％脱脂奶的PBS进行封闭，然后与兔抗体(1∶500稀释)在24℃培养1小时。膜用含有0.1％Tween-20的PBS(PBS-Tween)清洗三次并用辣根过氧化物酶偶联的山羊抗-兔IgG(Sigma)以1∶1000的稀释比在24℃继续温育1小时。用PBS-Tween再次清洗膜三次，然后用3，3′-二氨基联苯胺(DAB)底物和过氧化氢显色。对可能的阳性克隆打分并分离用于第二次筛选。
根据厂商的说明书(Stratagene)将免疫阳性克隆切除到pBluscript噬菌体中，利用碱性裂解的方法(Qiagen)提取噬粒DNA，并利用侧翼载体引物(T3和T7)进行双链测序。通过BLAST搜索将核苷酸和推导的氨基酸序列与GenBank中的现有序列进行比较。利用ESEE 3.1软件进行序列分析。
反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增RT-PCR被用于鉴定Ac-tmp mRNA转录的发育阶段特异性。犬钩口线虫(A.Caninum)卵，L1和L2幼虫阶段，和L3传染幼虫阶段如上所述获得(Hawdon等人，1999)。利用TRIzol试剂(GIBCO BRL)从每个生活史阶段分离总RNA。利用寡d(T)引物和MMLV-RT(GIBCOBRL)合成单链cDNA。基于从60bp到440bp的Ac-tmp序列的特异性引物(TIMP3′-1HR和TIMP5′-2ER)用于扩增Ac-tmp cDNA。PCR反应参数为94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸2分钟。总共进行30个循环。
纯化Ac-TMP天然产物用于犬钩口线虫成熟分泌产物分级分离的半制备性反相色谱分析条件的优化在510HPLC系统(Waters)上进行，所述系统安装了带有一个半制备性流动池的490 E多波长检测器，波长设定在214，280，260和254mm，以及一根250mm×4.6I.D.YMC-Pack Protein-RP，200，5μm C4柱(Waters)。15个小时以后从1260只成熟钩虫收集作为起始材料的成熟犬钩口线虫分泌产物到37℃的含有25mM HEPES，100单位/ml的氨苄青霉素，100μg/ml的链霉素和100μg/ml的庆大霉素的15ml RPMI 1640中。在7,500xg离心1小时之前，上清液通过超滤在Centricon-3的微型浓缩装置(Amicon)中浓缩到0.3倍体积。将大约0.6mg的寄生虫分泌蛋白进行层析分析。洗脱液A为0.01％三氟乙酸(TFA)的水，而洗脱液B为0.01％TFA的乙腈。以1ml/分钟的流速从0到80％B的线性梯度洗脱40-分钟。收集0.5分钟的级分并进行冷冻干燥，然后用于进一步的纯化和通过SDS-PAGE(Laemmli，1970)进行分析。为了进行SDS-PAGE，2μl的分泌产物以及10μl的HPLC分离级分编号51与相同体积的2XSDS-PAGE样品缓冲液(4％SDS，2.5％2-巯基乙醇，15％甘油)混合，并煮5分钟。样品以100V在4-20％梯度的SDS-PAGE凝胶上电泳2小时。根据厂商的说明书(BIO-RAD)对凝胶进行银染。
级分51在安装了如上所述的使用250mm.×3.0 I.D.YMC蛋白RP，200A，5μm C4柱的510 HPLC系统上进行RP-HPLC，所述级分含有从半制备分离的大多数的犬钩口线虫分泌蛋白。洗脱液A为0.01％TFA的水，而B为0.01％TFA的乙腈。从0到60％B的线性梯度以1ml/分钟的流速洗脱30分钟。收集0.5分钟的级分并进行冷冻干燥。从这种分离中收集的主蛋白峰部分进行氨基酸序列分析和SDS-PAGE(Laemmli，1970)。基于蛋白Edman降解的氨基酸序列分析在安装了785A可编程检测器和140C泵系统(由ProSeq，Inc.(Boxford MA)提供)的精确494型蛋白测序仪(Applied Biosystems)上进行。利用标准精确610A软件鉴定测序产物。
为了证实相应于Ac-TMP的N-末端序列，在相应于51号级分的部分N-末端肽序列的两个方向合成简并寡核苷酸引物。成对的侧翼简并载体引物被用于从构建在ZapII内的成熟cDNA文库获得的DNA中扩增产物。“热起始”PCR条件是含有50mM KCl的10mMTris-HCl(pH 8.5)，2.0mM的MgCl2，0.2mM的每种dNTP，以及1μl的cDNA文库，共20μl反应物。反应物在94℃加热5分钟，而后降低到85℃，历时5分钟，然后加入1单位的Taq DNA聚合酶(GIBCO BRL)。随后进行三十个如下循环在94℃变性1分钟，在55℃退火1分钟，并在72℃延伸2分钟。PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳并用溴化乙锭进行染色。用QIAEX II的凝胶提取试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)对PCR产物进行凝胶纯化，并进行测序。
实施例1的结果Ac-TMP cDNA.从成熟钩虫cDNA文库通过免疫筛选用针对所有犬钩口线虫(Ancylostoma canium)成熟分泌产物的兔抗体克隆Ac-TMP cDNA。分离到两个阳性的相同克隆。全长cDNA为559 bp(SEQ IDNO.11)，其编码140个氨基酸(SEQ ID NO.12)的开放阅读框架(ORF)和3′末端的聚腺苷酸尾。预测的ORF计算得到的分子量为16,100道尔顿并且理论pI为7.55。疏水信号肽序列带有一个信号肽酶酶切位点，酶切位点位于氨基酸16和17之间。紧接着信号肽之后，Ac-TMP具有一个识别标志N末端Cys-X-Cys序列。推导的N连接的糖基化位点(N-X-T)存在于氨基酸119和122之间(图6B)。
GenBank数据库搜索显示，这个分子的预测的氨基酸序列与人类金属蛋白酶2的组织抑制剂(TIMP-2)的N-末端结构域具有33％的同一性和50％的相似性。来自自生线虫美丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)的Ac-TMP和推测的TIMP含有一个单结构域并且缺乏第二个脊椎动物TIMP的特征性C-末端结构域(数据未显示)。
RT-PCR扩增.为了鉴定生活史阶段特异性表达的Ac-TMP，从不同发育阶段的犬钩口线虫(Ancylostoma canium)提取mRNAs，并用Ac-TMP特异性引物反转录为cDNA。RT-PCR产生一个380bp的特异性条带，所述条带只从成熟的cDNA中扩增而来。没有从卵，Li-L2和L3生活史阶段的cDNA中观察到扩增结果。犬钩口线虫(A.caninum)基因组DNA的扩增显示两条带，表明有可能的内含子或者存在第二个相关Ac-TMP基因(数据未显示)。
在犬钩口线虫成虫的分泌产物中鉴定Ac-TMP.为了证实Ac-TMP是由成熟犬钩口线虫钩虫释放的，通过RP-HPLC将蛋白鉴定在寄生虫分泌产物中并从寄生虫分泌产物中纯化。每个主峰都进行氨基酸序列分析作为较大犬钩口线虫蛋白组学研究的一部分(数据未显示)。选择相应于“级分51”的蛋白峰进行进一步的研究并且重新进行层析分析。银染后级分51包括一条突出的条带，迁移表观分子量分子量Mr＝16,000。这个级分的N-末端肽序列(20个氨基酸)与预测的信号肽酶切位点后的Ac-TMP的ORF序列完全匹配。基于相对于全部分泌产物谱总面积的HPLC峰51的曲线以下的计算面积，Ac-TMP被确定为包括大约6.3％的总犬钩口线虫(A.caninum)分泌产物。这就将这种分子鉴定为一种由成熟犬钩口线虫(A.caninum)释放的最多的蛋白。通过在SDS-PAGE上目测证实在钩虫分泌产物中Ac-TMP的丰度。基于头七个氨基酸的序列的成对简并引物被用于从成熟钩虫cDNA文库构建PCR产物。PCR产物的DNA序列证实了与Ac-TMP cDNA的同一性(数据未显示)。
这个实施例显示TMP是钩虫分泌最多的蛋白，并且所述蛋白已被克隆和表达并且重组蛋白被分离。
实施例2.Ac-mep-1的分子克隆和鉴定。
材料和方法寄生虫如上所述犬钩口线虫寄生虫生长在小猎犬体内(Schad1982)。从木炭粪培养物中分离第三阶段的感染幼虫(L3)并保存在BU缓冲液中(Hawdon等人，1995)。成熟犬钩口线虫(A.caninum)钩虫从尸检后感染的狗体内收集。这些钩虫在PBS中清洗三次，在液氮中急速冷冻，并保存在-80℃。
核酸通过常规方法(Ausubel等人，1993)从成熟犬钩口线虫分离基因组DNA。在存在Trizol试剂(Gibco BRL)的条件下根据厂商的操作流程通过研磨事先冷冻(-80℃)的成熟钩虫分离犬钩口线虫RNA。根据厂商的说明书，通过ProSTAR第一条链RTPCR试剂盒(Stratagene)从RNA制备cDNA。
犬钩口线虫基因组和cDNA文库根据如下操作构建犬钩口线虫(A.caninum)基因组DNA文库在100μl体积的推荐缓冲液中，30μg的犬钩口线虫(A.caninum)基因组DNA由8单位的Sau3A限制酶(NEB)部分降解(37℃5分钟)。然后将降解的DNA进行乙醇沉淀并通过标准方法收集沉淀。将产生的沉淀干燥，溶解在水中，并且根据厂商的说明书将其连接到λ-FIXII载体(Stratagene)中。然后用Gigapack Gold包装提取物(Stratagene)将连接反应物包装并进行扩增。犬钩口线虫成熟体的cDNA文库从前(Capello等人，1996年)构建在λZAPII(Stratagene)载体中。
金属蛋白酶克隆Ac-mep-1 cDNA的克隆开始于利用简并引物和寡-dT在成熟钩虫文库cDNA上进行的PCR。简并引物被设计为与含有锌结合基元的保守序列相反，所述锌结合基元观察在来自美丽隐杆线虫(C.elegan)的两个假定的锌金属蛋白酶基因的BLAST比对中(GenBankTM，登录号T22668和Q22523)。反应条件如下85ng的模板DNA，1X嗜热DNA缓冲液(Promega)，2.5mM的MgCl2，0.2mM的dNTP，2μM的每种引物，1U的taq DNA聚合酶(Promega)，20μl的总体积。反应进行如下的35个循环94℃1分钟，55℃1分钟，和72℃1分钟。这个PCR产生一个片段，当其克隆(pGEM-T，Promega)和测序时代表458bp(包括聚腺苷酸尾的21个残基)的3′Ac-mep-1cDNA(克隆MP-1)。利用MP-1作为特异性引物设计的基础，通过PCR用T3(载体)和MEP-R1基因特异性引物在文库DNA上鉴定到其它的Ac-mep-1(克隆MP-2)序列。在系列稀释的文库DNA上进行反应，一直扩增到独特的产物并进行克隆。反应条件如上所述。
在类似的克隆中，用T3和MEP-R2引物扩增MP-3。使用来自GibcoBRL的5′-RACE试剂盒鉴定Ac-mep-1的5′末端。简而言之，第一条cDNA链用Ac-mep-1特异性引物RACE-R1在新近制备的RNA上产生在反转录反应物中。然后利用末端脱氧转移酶给这个cDNA在3′末端加聚胞嘧啶尾并且用作含有锚定引物AAP(GibcoBRL)和基因特异性反向引物MEP-R2的PCR反应中的模板。产生的产物进行稀释，并用作含有锚定引物UAP(GibcoBRL)和基因特异性引物MEP-R3的半巢式PCR反应的模板。克隆产生的PCR产物并命名为MP-4。
从Ac-mep-1类似序列的基因组DNA克隆(G-MEP)鉴定更多的5’序列。对多个克隆进行测序以证实Ac-mep-1 cDNA和Ac-mep-1的全长编码区在上述条件下作为使用合适引物的单独片段进行PCR扩增(克隆FL-1)。
序列分析利用DNASTAR公司的MEGALIGN软件(3.7.1版本)对部分Ac-mep-1克隆进行比对。用于简并引物设计的最初的序列和预测的Ac-mep-1开放阅读框架(ORF)的BLAST分析利用美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的BLAST应用程序进行。利用Curatools序列分析应用程序(CuragenCorp.，New Haven，CT).进行Ac-mep-1的序列分析。带有分析美丽隐杆线虫DNA设置的FGENESH基因查询程序(finder utility)(CGG网络服务器(genomic.sanger.ac.uk))被用于从基因组DNA克隆G-MEP进行基因预测。GMEP中可能外显子序列的鉴定用Wise2序列分析应用程序(sanger.ac.uk/Software Wise2/)完成。
Northern印迹在从十只成熟钩虫的Trizol(GibcoBRL)分离的总RNA上进行Northern印迹分析。在1.2％甲醛凝胶上分级分离RNA，并且通过标准方法印迹在Hybond-N膜(Amersham)上。用32P随机最初标记的DNA片段探测印迹，所述DNA片段代表Ac-mep-1 cDNA的碱基对780到2688。
发育阶段的RT-PCRRT-PCR用来研究犬钩口线虫各个生活史阶段的Ac-mep-1的转录。对于这些反应，来自虫卵，L1，未激活的和活化的L3以及成熟钩虫的cDNA用Acmep-1特异性引物MEP-F1和MEP-R1进行试验。如果这些cDNA的质量在利用引物PKA-F和PKA-R的分离反应中得以验证，那么这些cDNA对于犬钩口线虫(A.caninum)蛋白激酶A将是特异性的(Hawdon等人，1995)。这些反应条件与在2.4部分定义的条件一致。
抗-Ac-mep-1抗体代表来自Ac-MEP-1C末端部分的610个氨基酸的cDNA片段从成熟犬钩口线虫的cDNAλ文库中利用合适的引物通过PCR进行扩增。这个片段被T/A克隆进入到pGEM(Promega)中，通过标准方法(Sambrook和Russell，2001)将其克隆进入pET28c表达载体(Novagen)的HindIII位点。通过添加1mM的IPTG到用tAc-MEP-1/pET28c构建体转化的BL21(DE3)PlysS(Stratagene)细胞的培养物中诱导截短的Ac-MEP-1(tAc-MEP-1)的细菌蛋白表达。
表达的蛋白是不溶的。为了纯化tAc-mep-1，冷冻(冷冻后，BL21(DE3)PlysS细胞裂解)诱导的细胞沉淀，再悬浮在十分之一体积的50mM的tris pH 8.0，2μM的EDTA中，超声波破碎直到没有粘性，然后在12,000xg离心15分钟(Sorvall RC5B，GSA转头)。产生的沉淀再悬浮在15ml的1％SDS，0.5％的B-巯基乙醇中，超声波破碎，煮5分钟，然后在室温下培养2小时。通过反复离心作用除去不溶解的碎片。上清液彻底地对磷酸盐缓冲液(pH 7.4)进行透析以除去BME。根据厂商的操作流程不用变性剂在HisBind(Novagen)镍树脂亲和性柱上纯化蛋白。5只雄性Balb/c小鼠(6-周龄)组用20μg的明矾-沉淀的tAc-MEP-1或者只有明矾作为对照进行腹膜内免疫。随后以2-周的间隔加强免疫小鼠两次。第三次和最终的免疫后一周，收集血清，混合血清并用作蛋白印迹和免疫染色分析的初级抗体。
蛋白印迹法通过10％的SDS-PAGE分离的蛋白在转移缓冲液(39mM的甘氨酸，48mM的tris碱，0.037％SDS，pH 8.3)中在30V转移18个小时到甲醇带电荷的Immobilon-P PVDF膜(Millipore)上。用5％脱脂乳的PBS(封闭缓冲液)随着温和的振荡在室温下(RT)对膜进行封闭1小时并和大肠杆菌吸收的初级小鼠抗tAc-MEP-1抗体(1∶1500)在室温下培养1小时，所述小鼠抗tAc-MEP-1抗体稀释在封闭缓冲液中。然后在封闭缓冲液中冲洗三次膜(每次10分钟)，并在RT下伴随振荡与辣根过氧化酶-结合的山羊抗小鼠IgG次级抗体(1∶5000)的封闭缓冲液一起培养1小时。最终，在PBS中冲洗膜15分钟并用Renaissance(NEN Life Science产品)化学发光剂显色。
免疫定位成熟犬钩口线虫钩虫通过标准方法进行石蜡包埋和切片。通过将脱石蜡的钩虫切片RT下温育在1∶100稀释度(以PBS稀释，pH 7.4)的小鼠抗tAc-MEP或对照血清(同上)中1小时完成Ac-MEP-1的原位免疫定位。切片在PBS中冲洗三次并在25℃温育在1∶200稀释度的山羊抗小鼠IgG中1小时，继之以在PBS中冲洗(三次)。然后用Olympus IX-50倒置荧光显微镜(U-MWIG滤光器)观察切片并拍照。
实施例2的结果Ac-mep-1的cDNA结构用于获得完全的Ac-mep-1编码序列的克隆策略如下通过测序简并PCR克隆MP-1，PCR来源的克隆MP-2，MP-3和5′RACE克隆MP-4鉴定大约2.6kb的Ac-mep-1转录本。虽然接近于RACE产物5’末端有一个甲硫氨酸密码子，但是这个密码子之前为不包含终止子的58个符合读框的氨基酸，显示MP-4不代表实际的Ac-mep-1的5′末端。此外，我们不能获得包括剪接前导序列的cDNA克隆(通过PCR)。因此，Ac-mep-1类似序列(98.7％的外显子同一性)的基因组DNA克隆G-MEP的检查利用美丽隐杆线虫DNA的基因预测程序以及除通过5′RACE鉴定到的以外不同的潜在转录起始位点。这个预测延伸超过5′RACE序列158个bp并且增加推导的编码区91个氨基酸。运用这种预测，Ac-mep-1的整个编码区被扩增作为2.7kb的单一产物并且通过其两端的部分测序验证了所述克隆。Ac-mep-1转录本的总长度通过Northern印迹(5′和3′末端的非编码区在全长PCR中没有被扩增)证实为大约2.8kb。这种转录本推导的氨基酸顺序编码了870个氨基酸的单一ORF，这些氨基酸具有四个可能的N-连接的糖基化位点(预测pI＝5.5，m.w.＝98.7kDa)。Ac-MEP-1的氨基末端氨基酸包含一个疏水的信号肽测序，在残基22后具有一个预测酶切位点(参见具有AC-MEP-1序列的图)。鉴定到表征金属蛋白酶的内肽酶24.11族的两个识别标记锌结合基元。
Ac-mep-1与相关毛圆线虫血液给食的线虫捻转血矛线虫(H.Contortus)的一种金属蛋白酶(Hc-MEP 2b)存在66％的类似性和48％的同一性。它也同样类似于来自非寄生的线虫美丽隐杆线虫(C.elegans)的金属蛋白酶(T25B6.2)(Gen-BankTMT28906)。十四个半胱氨酸残基在这些三个分子之间高度保守。其他两个半胱氨酸(仅仅一个是保守的)存在于Ac-MEP-1和Hc-MEP1b中。
Ac-mep-1表达的Northern印迹和显色分析Northern印迹分析显示成熟钩虫mRNA中有一个大约2.8kb的单一mRNA转录本(未显示)。采用RT-PCR研究Ac-mep-1转录的发育特异性。在试验的cDNA中有可能鉴定寄生虫仅仅成熟期而非钩虫卵，L1或者活化和未活化的L3幼虫的转录。相反，用特异于犬钩口线虫(Ancylostoma canium)蛋白激酶A的引物在相同cDNA上实施的阳性对照PCR显示从所有模板cDNA的扩增。因此，Ac-mep-1好象是专门地表达在成熟钩虫体内。
成熟钩虫切片内Ac-mep-1的蛋白印迹分析和免疫定位通过蛋白印迹法，小鼠抗MEP-1抗血清显著地识别到大约90和100kDa的成熟犬钩口线虫(Ancylostoma canium)蛋白。成熟钩虫切片的免疫组化分析将Ac-MEP-1定位到钩虫内脏的微绒毛的表面。与用对照血清温育的切片相比，抗血清与成熟钩虫切片的内脏微绒毛激烈地反应。也偶而记录到成熟钩虫皮肤中的微弱染色。虽然Ac-MEP-1的功能是未知的，沿着寄生虫内脏微绒毛表面的位置将显示所述酶与干血直接接触，并且可能因此具有营养物消化的作用。
这个实施例显示MEP-1是一种重要的酶，其使钩虫消化血液，因此是一个有吸引力的疫苗靶。重组MEP-1蛋白已被克隆和表达。
实施例3.AC-MTP抗原研究传染性第三阶段的钩口属钩虫幼虫(L3)释放一种锌-依赖的金属蛋白酶，其迁移的表观分子量为50kDa(Hawdon等1995a)。所述酶响应于L3阶段诱导给食和发育的刺激特异性的释放(Hawdon等，1995b)，并且可能在寄生虫皮肤和组织入侵或者蜕皮中发挥作用(Hotez等，1990)。因为其在寄生虫-来源的组织入侵和脱皮中的作用，直接针对Ac-MTP-1的抗酶抗体反应可能阻断幼虫移行以及寄生虫进入肠内。Ac-MTP-1是阶段特异性的，并且由在类似宿主的环境下激活的钩虫L3释放以重新开始在体外给食。在激活期间Ac-MTP-I的释放使得这个分子成为有吸引力的疫苗靶。
实施例3A.从编码虾红素家族的锌-金属蛋白酶(Ac-mtp-1)的犬钩口线虫(A.caninum)L3表达文库分离cDNA。
材料和方法抗血清经过IRB-同意的人研究协议，从中国安徽省的Nanlin县的5位居民收集用于免疫筛选犬钩口线虫(A.caninum)L3表达文库的血清。十二指肠钩口线虫是这个地区的主要钩虫，根据从感染病人的幼虫和成熟钩虫的回收率，十二指肠钩口线虫与美洲板口线虫的比率大于20∶1(Yong等人.1999)。如其他文献(Xue等人，2000)所述，从具有高滴度的针对犬钩口线虫L3所有裂解抗原的循环抗体的安徽居民获得血清。两个居民为钩虫卵阴性，而剩余的3个人每克粪便带有低于400个虫卵的定量粪便虫卵。因为他们较高的抗体滴度以及较低的感染强度，这些个体被看作假设有抗性并且混合他们的血清用于免疫筛选。从上海的大学生体内收集阴性对照血清。
表达文库的筛选根据厂商的说明书利用混合的抗血清筛选构建在X ZapIl中的犬钩口线虫(A.caninum)(Baltimore株)L3的cDNA文库(Stratagene，La Jolla，CA)(Hawdon等人1995)。简而言之，通过将硝酸纤维膜在37℃浸入10mM的IPTG中4小时诱导5×104的噬斑表达蛋白。温育后，将膜温育在5％的脱脂奶粉的PBS中1小时。在22℃用1∶100稀释度的混合人血清将封闭的膜温育在PBS中1小时，在22℃用PBS清洗三次共10分钟，并与1∶1000稀释度的辣根过氧化物酶结合的抗-人IgG(Sigma，St.Louis MO)共培养。用底物3，3′-二氨基联苯胺(DAB)和0.015％的过氧化氢对膜进行显色。通过再次涂铺平板和再次筛选对阳性噬斑进行多轮噬斑纯化。通过体内切除拯救质粒(Short和Sorge，1992)，并且利用互补于侧接载体序列的引物对两条链进行测序。核苷酸和推测的氨基酸序列通过BLAST搜索(Altschul等人，1997)在GeneBank数据库中与现有序列进行比较。
全长Ac-MTP cDNA的克隆所有分离的阳性克隆在5′进行截短。为了获得5′末端，利用基因特异性引物PI和相应于保守线虫剪接前导序列的引物的PCR被用来从犬钩口线虫(A.caninum)L3的第一条cDNA链扩增5′末端。20μl的含有100ng的每种引物，1U的Taq聚合酶(Promega，Madison WI)和1μl的cDNA的反应物在95℃变性2分钟，然后进行30个如下循环在94℃1分钟，在55℃1分钟，以及在72℃2分钟。扩增子进行凝胶纯化并通过常规方法克隆到pGEM Easy-T载体(Promega，Madison，WI)中。
阶段特异性通过RT-PCR确定mtp-1转录的阶段特异性(Hawdon等人，1995)。通过蔗糖浮选法从感染犬的粪便中分离犬钩口线虫虫卵(Nolan等人，1994)，通过用NaOCl进行无菌化(axenize)处理，并涂铺在线虫生长培养基琼脂平板中(Sulston等人，1988)。随后在26℃温育24-30小时，用BU缓冲液(Hawdon和Schad，1991)从平板清洗温育物(混合的L1/L2)并在干冰/乙醇浴中进行快速冷冻。未孵化的虫卵也进行快速冷冻以制造cDNA。在尸检过程中从感染犬的小肠收集犬钩口线虫(A.caninum)成熟钩虫。在犬钩口线虫虫卵，混合的L1/L2血清-刺激的和未刺激的L3(如下所述)，以及成熟犬钩口线虫样品上如下进行RT-PCR。在预先冷冻(液N2)的研钵中将样品研磨成粉末，并根据厂商的说明书利用TRIzol试剂(Life Technologies，Gaithersburg，MD)分离总RNA。用10单位的DNAse 1(不含RNase，BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)处理RNA，并用TRIzol再次提取。在存在TRIzol的条件下利用BeadBeater机器(BioSpec，Bartlesville，OK)用玻璃珠机械破碎分离总的虫卵RNA，如上所述进行DNAse处理和再次提取。从含有如下组分的50μL反应物内的每种样品中在37℃合成第一条cDNA链共1小时50mM的Tris HCl，pH 8.3，75mM的KCl，3mM的MgCl2，10mM的DTT，500ng的寡(dT)引物，1μg的总RNA，以及200U的Moloney鼠白血病毒反转录酶(LifeTechnologies)。反应物在94℃温育5分钟，并用dH2O补充到100μL。1μL的第一条cDNA链被用于PCR中，引物为MTP5′-I(5′-CTTCTCATGATCAACAAACACTACG)SEQ ID NO.65和MTP3′-1(5′-AATCTAACTCCAACATCTTCTGGTG)SEQ ID NO.66。反应物进行30个如下循环在94℃1分钟，在55℃1分钟，以及在72℃2分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分离扩增子并用溴化乙锭进行染色观察。
重组蛋白的表达和纯化利用常规技术将全长Ac-mtp-1 cDNA以符合读框的方式克隆到表达载体pET28(Novagen)中并转化到感受态BL-21大肠杆菌(E.coli)细胞中。在含有编码5′末端的6个载体编码的组氨酸残基(His-标记)重组蛋白的表达通过加入1mM IPTG在37℃进行诱导3小时。1ml表达rMTP-1的细胞通过在5000xg离心5分钟进行沉淀，丢弃上清液，将细胞在100ml的TE(pH 8.0)中进行裂解，所述100ml的TE含有100μg/ml的溶解酶和0.1％的Triton X-100。在30℃温育20分钟后，在冰上将样品用超声波处理(功率水平2-3，20-30％的占空因素)，每个样品进行5秒钟10次的破碎，直到样品不再发粘。在还原条件下通过12％SDS-PAGE的电泳分离可溶性和不溶性细胞部分，用考马斯亮兰染色观察溶解的蛋白。为了纯化rMTP-1，来自2升诱导的细菌培养物的细胞沉淀悬浮在60ml的1.0％SDS，0.5％2-巯基乙醇中，煮5分钟，并冷却到室温。提取物在2升0.1％SDS的PBS透析48小时，更换两次缓冲液，并施加到10ml的HisBind镍树脂柱(Novagen)中。根据厂商的说明书进行层析，除了向所有缓冲液中添加0.1％的SDS。
在努力提高溶解性和研究MTP-1的结构域结构的过程中，3个缺乏氨基His标记序列的构建体通过PCR进行制备。全长Ac-MTPcDNA(1-1642bp)，没有5′-前肽(408-1642bp)的cDNA，以及推测的催化结构域(408-1101bp)以符合读框的方式被克隆到pET28中Nco I位点上游，从而从载体中将His标记编码序列去除。在如上所述的相同条件下表达重组蛋白。抗血清生产通过用纯化的rMTP免疫BABL/C小鼠获得抗-rMTP多克隆抗血清。20μg的柱纯化的rMTP用明矾(Ghosh等人，1996)以及皮下注射进行共沉淀。其它加强剂与明矾沉淀的rMTP(每种20μg)一起在第3，6和9周时进行给药。
吸附针对大肠杆菌BL21株的细菌裂解物的小鼠血清以去除与细菌蛋白反应的抗体。25ml的诱导细胞进行离心，溶解在25ml的2X样品缓冲液中(100mM Tris，pH6.8，2％的SDS，2.5％的2-巯基乙醇)，并在12,000xg离心10分钟。将硝酸纤维素膜(4cm×8cm)浸入上清液中20分钟，然后温育在转移缓冲液中(48mM的Tris，39mM的甘氨酸(glyine)，0.037％的SDS，20％的甲醇)共30分钟。在含有0.1％Tween-2的PBS中清洗膜3次，并在22℃温育与1∶100稀释度的小鼠抗血清一起温育1小时。用新鲜的膜重复温育两次。为了证实抗体的特异性，第二次吸附针对表达全长rMTP-1的BL21(DE3)细胞裂解物的等份的吸附的小鼠抗血清。吸附的抗血清用于蛋白印迹。
体外激活L3并收集ES产物在类似于宿主体内的条件下如上所述(Hawdon等人1999)活化犬钩口线虫(A.caninum)L3。简而言之，在22℃从粪培养物收集的L3用1％HCl的BU缓冲液(Hawdon和Schad，1991)净化30分钟。大约5000个L3在37℃，5％CO2培养在24孔组织培养平板单个孔的0.5ml RPM1640组织培养基中24小时，所述培养基添加了25mM的HEPES pH 7.0以及抗生素(Hawdon等人1999)。通过包括15％(v/v)的＜10kD超滤犬血清和25mM的S-甲基-谷胱苷肽(Hawdon等人1995)活化L3从而重新开始给食。未活化的L3在没有刺激的情况下温育在RPMI中。如上所述确定给食的幼虫的百分比(Hawdon等人1996)。
含有活化的和未活化的L3的培养基转移到分离微离心管中并在14,000rpm离心5分钟。从相同处理组而来的上清液进行混合，通过0.45μm的注射用过滤器进行过滤从而去除任意的L3和脱落表皮，并保存在-20℃。在电泳之前，通过利用Centricon 10滤芯(Amicon，Beverley，MA)的超滤将上清液浓缩。浓缩的ES用1ml的BU进行清洗，超滤并冷冻干燥。
为了收集成熟ES，1260只成熟钩虫在37℃，10％CO2培养在RPMI1640组织培养基(Hawdon等人1999)中15小时。通过在Centricon 3旋转柱中超滤将上清液浓缩3倍。
蛋白印迹表达rMTP-1融合蛋白的细菌细胞的裂解物和冷冻干燥的ES产物重新悬浮在2x SDS-PAGE的样品缓冲液中(4％SDS，5％2-巯基乙醇，15％的甘油)并在4-20％的梯度SDS-PAG(Invitrogen，Carlsbad，CA)上进行分离。分离的蛋白通过在25V电印迹1小时而转移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore，Bedford，MA)上(Towbin等人，1979)。在22℃，膜用5％脱脂干奶粉的冲洗缓冲液(PBS，pH7.4，0.1％的Tween 20)中封闭1小时。封闭的膜在22℃与1∶5000稀释度的小鼠rMTP抗血清一起温育1小时，所述小鼠rMTP抗血清针对表达全长rMTP的细菌裂解物，已被预吸。在24℃用冲洗缓冲液冲洗膜三次共10分钟，随后在22℃下与1∶5000稀释度的辣根过氧化酶-结合的山羊抗小鼠IgG(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)一起培养1小时。利用化学发光检测试剂(ECL+，Amersham.Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)观察条带。
实施例3A的结果犬钩口线虫(A.caninum)MTP cDNA的克隆利用从中国内地病人收集的具有高抗-钩虫L3滴度的混和血清筛选犬钩口线虫(A.caninum)L3 cDNA表达文库。鉴定到12个阳性克隆，其中6个通过DNA测序被确定为是相同的。每个克隆含有一个3′聚腺苷酸尾，但是在5′末端是截短的。利用来自线虫剪接前导序列的引物连同基因特异性引物P1通过PCR从犬钩口线虫(A.caninum)L3cDNA分离到5’末端(Hawdon等人1995；Bektech等人，1988)。
不带聚腺苷酸尾的全长cDNA为1703bp(参见图8A，SEQ ID NO.15)并且编码547个氨基酸的开放阅读框架(参见图8B，SEQ ID NO.16)计算分子量为61,730，以及pI为8.72。ATG起始密码子开始于剪接前导序列末端下游的两个核苷酸处，在Ac-mtp-1 cDNA的5′末端产生总共23个未翻译的核苷酸。一个TAA终止子位于核苷酸1666到1668，接着一个含有AATAAA聚腺苷化信号的35bp 3′UTR(Blumenthal和Steward，1997)，其在聚腺苷酸尾上游的12bp处(碱基1687-1692)。推导的蛋白序列的氨基酸1到16被预测代表一个疏水信号肽，可能的剪切位点位于第6位的Ala和第7位的Gly之间(Nielson等人，1995)。推测的序列在Asn39和Asn159含有2个可能的N-连接的糖基化位点(N-X-S/T)。
利用Ac-MTP-1预测的氨基酸序列通过BLAST搜索(Altschul等人，1997)GenBank显示与称作虾红素的锌金属蛋白酶的家族成员有显著的同源性(Bond和Benyon，1995)，虾红素的锌金属蛋白酶由小龙虾螯虾(Astacus astacu)的消化蛋白酶虾红素命名而来。用Ac-MTP-1推导的氨基酸序列搜索蛋白结构数据库(Apweiler等人，2000)显示存在特征性虾红素指纹图谱，包括延伸的锌结合结构域以及保守的Met转角，所述转角位于下游37个氨基酸处。含有锌结合位点的催化结构域接着一个同源于表皮生长因子(EGF)的结构域，从氨基酸334到368。从氨基酸374到484是与CUB结构域有较差同源的结构域，该命名是因为其在补体亚组分C1r/C1s，胚胎海胆蛋白Uegf和BMP-1中的存在。EGF和CUB结构域在虾红素金属蛋白酶中是一样的，并且相信会参与蛋白-蛋白的互作(Bond和Benyon，1995)。
N-信号肽后为一段119个氨基酸富含螺旋的前-肽结构域。前肽结构域的C-末端含有一个从第132位氨基酸到第135位氨基酸的4个碱性氨基酸(R-E-K-R)，其是弗林蛋白酶或者其它类似胰蛋白酶加工酶的可能的识别位点(Bond和Benyon，1995)。在这个位点的蛋白水解将活化Ac-MTP-I成为一种推测的412个氨基酸加工后的形式，计算的MW为46419，并且pI为8.04。
阶段特异性的RT-PCR分析Ac-mtp-1表达的阶段特异性通过来自不同发育阶段的犬钩口线虫的cDNA的定性RT-PCR进行研究。Ac-mtp-1特异性引物被设计成扩增相应于完全序列的核苷酸985到1419的Ac-mtp-1 cDNA的434bp部分。预测大小的产物从未活化的和活化的L3cDNA扩增而来，而非从犬钩口线虫虫卵或者L1/L2混合阶段的cDNA扩增。在成熟的cDNA中观察到一条强度较小的条带。较长的片段自基因组DNA扩增而来，显示所述引物跨越一个内含子，并且证实来自cDNA的扩增子来源于cDNA的扩增而非污染的基因组DNA。对照引物扩增部分组成型表达的犬钩口线虫蛋白激酶A催化亚基(Hawdon等人，1995年)，其从所有的DNA样品中成功的扩增出产物，显示存在可扩增的模板。
重组MTP的表达和免疫印迹重组MTP-1产生于大肠杆菌中，并通过Ni柱层析纯化，用于免疫BALB/c小鼠产生特异性抗血清。吸附针对大肠杆菌的裂解物的抗血清并且用于确定Ac-MTP-1是否是由犬钩口线虫(A.caninum)L3体外分泌的。从10,000只未活化的(未给食)和活化的(给食)L3获得的ES产物利用rMTP-1抗血清通过蛋白印迹进行分析。抗血清识别大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达的全长和加工(即，没有前肽结构域)形式的rMTP-1，但是不能识别只含有载体的诱导细胞裂解物中的任意条带。
rMTP抗血清识别10,000只犬钩口线虫(A.caninum)L3的ES产物中MW为47.5和44.5的条带，所述犬钩口线虫(A.caninum)L3已被活化从而体外重新开始给食。抗血清不能识别只在培养基中10,000只未活化的L3的ES中或者成熟犬钩口线虫(Ancylostoma canium)ES产物或者钩虫裂解物(未显示)中的任意条带。在活化的ES中迁移较慢的条带与加工形式的rMTP具有类似的MW(47.5对46.5)，这显示在体外活化期间犬钩口线虫(A.caninum)L3释放加工的MTP-1。较低的MW条带也被免疫前小鼠血清(未显示)识别，显示抗血清识别与Ac-MTP-1不相关的蛋白。为了证实这种识别是非特异性的，吸附针对表达全长MTP-1的BL21(DE3)细胞的小鼠抗血清并用于探测蛋白印迹。吸附的抗血清没能识别任意的rMTP-1，但是识别活化的ES产物中MWr＝44.5的条带，显示由抗血清识别低分子量的条带是非特异性的。
虽然重组MTP-1由用于筛选文库的混合血清识别，但是生活在非传染区(上海)的个体的血清不能识别rMTP-1(未显示)。
实施例3B.MTP-1 cDNA的分离和鉴定中国感染钩虫的病人的血清用作探针从而对来自犬钩口线虫(A.caninum)L3表达文库的cDNA进行分离和鉴定，所述表达文库编码一个虾红素家族的锌金属蛋白酶(Ac-mtp-1)。根据厂商的说明书利用来自中国安徽省的病人的混合抗血清筛选构建在1 ZapII(Stratagene，La Jolla，CA)的犬钩口线虫(A.caninum)(Baltimore strain)L3 cDNA表达文库(Hawdon等人，1995年)，在中国安微省十二指肠钩口线虫(A.Duodenale)为主要的钩虫物种。使用具有低粪便虫卵数的和对于犬钩口线虫(A.caninum)L3全裂解物抗原的高滴度的循环抗体的病人的血清，这种情况显示这些病人可能抗钩虫的感染。在噬斑纯化后回收六个相同的截短的克隆。利用线虫剪接前导序列连同两种基因特异性引物通过巢式PCR从犬钩口线虫(A.caninum)L3 cDNA分离5′末端(Hawdon等人，1995年)，并测序两个独立的5′末端克隆。
实施例3B的结果扩增的序列被认为是代表转录本的全部5′末端，因为预测的ATG起始密码子之后是剪接前导序列的第一个甲硫氨酸，前16个推测的氨基酸编码分泌蛋白的特征性信号肽(Nielson等人，1997年)，并且与类似金属蛋白酶的比对显示这是完整的氨基酸序列。不带聚腺苷酸尾的全长cDNA为1703bp并且编码一段547个氨基酸的开放阅读框架，计算的分子量为61,730，pI为8.72。推导的蛋白序列中的第1个到第16个氨基酸被预测代表一种疏水信号肽，可能的剪切位点位于Ala16和Gly17之间(Nielson等人1997)。所述蛋白序列在Asn39和Asn159含有两个可能的N-连接的糖基化位点(NX-S/T)。利用Ac-MTP-1预测的氨基酸序列通过BLAST搜索(Altschul等人，1997年)GenBank显示与称作虾红素(Bond和Beynon，1995年)的锌金属蛋白酶家族的成员具有显著的同源性，所述虾红素命名为小龙虾Astacus astacus的降解蛋白酶。这个家族成员的特征在于一段将其靶向用于分泌的短-末端信号肽，接着一个前肽，以及一个含有特征性锌结合区和“甲硫氨酸转角”的催化结构域。不象虾红素，大多数的其它家族成员含有C-末端结构域，包括不同数目的EGF和CUB结构域(Bond和Beynon，1995)。用Ac-MTP-1推导的氨基酸序列搜索蛋白结构数据库(Apweiler等人，2000年)显示特征性虾红素指纹的存在，包括一个延伸的锌结合区，和一个位于37个氨基酸下游的保守的甲硫氨酸转角。含有锌结合位点的催化结构域之后是一个同源于表皮生长因子(EGF)的结构域，从第334位到第368位氨基酸。从第374位到第484位氨基酸是一个与CUB结构域具有较低同源性的结构域，该命名是因为其在补体亚组分中C1r/C1s，胚胎海胆蛋白Uegf和BMP-1中的存在(Bork和Beckman，1993年)。
虾红素金属蛋白酶被合成为失活的前酶。通过加工酶去除前肽激活了所述酶(Bond和Beynon，1995年)。Ac-MTP-1含有一段119个氨基酸的N-末端结构域，其预测的用于胰蛋白酶-或者弗林蛋白加工酶的4个氨基酸识别位点(R132E133K134R135)位于其C-末端(Bond和Benyon，1995)。在这个位点的蛋白水解将活化Ac-MTP-1成为一种推测的412个氨基酸加工后的形式，计算的MW为46419，并且pI为8.04。前肽也被预测含有四个两性分子的α-螺旋，由一个短的连接区(从第23位氨基酸到第86位氨基酸)分隔开来(Kelley等人，2000)。
通过将来自犬钩口线虫(A.caninum)多个发育阶段的cDNA进行定性RT-PCR来研究Ac-mtp-1的阶段特异性表达。特异性引物被设计用于扩增相应于全序列核苷酸985-1419的434bp的部分Ac-mtp-1cDNA。推测大小的产物从非活化和活化的L3 cDNA中扩增得到，但是没有从犬钩口线虫(A.caninum)虫卵或者L1/L2混合阶段的cDNA扩增得到，显示Ac-mtp-1主要表达在L3阶段。较弱强度的条带观察在成熟cDNA中。虽然这个条带是微弱的，但是不可能得出关于基因表达量的结论，因为RT-PCR只用于定性分析。然而利用小鼠抗-rMTP血清对成熟裂解物进行的蛋白印迹没能识别成熟ES或者裂解物中的任意蛋白(未显示)。这就显示Ac-MTP-1的表达限于L3阶段，而且存在于成熟阶段的信使没有被翻译或者可能部分被降解了。
重组MTP-1产生于大肠杆菌中，并通过Ni柱层析进行纯化，且用于免疫BALB/c小鼠产生特异性抗血清。吸附针对大肠杆菌裂解物的抗血清并被用于确定Ac-MTP-1是否是由犬钩口线虫(A.caninum)L3在体外分泌的。从10,000只未活化的(未给食的)和活化的(给食)的L3收集的ES产物(Hawdon和Schad，1993)利用rMTP-1抗血清通过蛋白印迹进行分析。抗血清识别在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达的全长和加工(即，没有前肽结构域)形式的rMTP-1，但是不能识别只含有载体的诱导的细胞裂解物中的任意条带。一条较小分子量的条带被观察到并且大小类似于加工的rMTP(即缺少前序列)，显示在大肠杆菌中表达的一些rMTP在前肽的C-末端接受过体外剪切。这可能是自身催化的剪切，虽然由细菌蛋白酶进行的非特异性剪切也是可能的。自身催化也可能代表了Ac-MTP-1的体内生理活化机制。
rMTP抗血清识别已被活化以在体外重新给食的10,000只犬钩口线虫(Ancylostoma canium)L3的ES产物中Mr为47.5和44.5的条带。抗血清不能识别来自未活化L3的ES中，只在培养基中，或在成熟犬钩口线虫(A.aninum)ES产物或钩虫裂解产物(未显示)中的任意特异性条带。在活化ES中一条慢慢迁移的条带具有与rMTP的加工形式类似的分子量(47.5对46.5)，表明了犬钩口线虫(Ancylostoma canium)L3在体外激活过程中释放已加工的MTP-1。此外，MTP-1仅仅响应于活化L3重新开始给食的刺激而进行释放，因此，最可能在传染过程的某些阶段起作用(Hawdon等，1996)。先前描述的金属蛋白水解活性在激活期间也被特异性的释放，且具有类似的分子大小(Hawdon等，1995)，表明Ac-MTP-1可能对至少部分的这种活性负责。
活化ES产物中的一条较低分子量的条带(分子量为44.5kDa)也通过免疫前的小鼠血清识别(未显示)，表明抗血清识别一种与Ac-MTP-1无关的蛋白。为了证实此种识别是非特异性的，吸附针对表达全长MTP-1的大肠杆菌细胞的小鼠抗血清且用于探测蛋白印迹。被吸附的抗血清不能识别任意的rMTP-1，但识别活化的ES产物中分子量为44.5的条带，表明抗血清对低分子量条带的识别是非特异性的。重组体MTP-1被用于筛选文库的混合血清识别，但来自生活在非发病区域(上海)的个体的血清不能识别rMTP-1(未显示)。
虽然Ac-MTP-1的确切功能是未知的，表达的阶段特异性以及激活期间的特异性释放表明了在传染性过程中的决定性作用。因此，对Ac-MTP-1体内功能的干预提供了一种开发控制钩虫病的疫苗的有用策略。
这个实施例证明了MTP-1是一种由钩虫寄生虫入侵所用的重要酶，且所述蛋白是免疫显性抗原，因为其被来自尽管反复暴露于钩虫但带有低钩虫数量的患者的血清所识别。因此MTP是一种用于疫苗抗原的引人注目的候选物。
实施例3C.用Ac-MTP-1抗原进行的犬疫苗试验为试验Ac-MTP-1是否是一种有效的疫苗，两组8+1周龄的5只目的性-育种的雄性小猎犬用重组(从大肠杆菌中表达和分离)融合蛋白与AS02A佐剂的制剂，或仅仅佐剂来免疫接种。AS02A的组合物其已被成功地用于几种疟疾疫苗临床研究，描述在别处(Lalvani等，1999；Bojang等，2001；Kester等，2001)。具体的动物管理和饲养条件先前已被报道(Hotez等，2002a)。含有多聚组氨酸标记的重组融合蛋白纯化自溶于6M HCl胍的10mM Tris HCl，pH8.0中的已洗涤的E.coli包涵体。溶解的包涵体通过凝胶过滤色谱法(在含有0.1NaH2PO4，10mMTris-HCl和6M胍的缓冲液中预平衡过的SaphacrylS-300，26/60凝胶过滤柱[AmershamPharmacia])在室温下(2ml/分钟的流速)以5-10ml批量加工。根据Singh等的方法(2001)将所选择的含有Ac-MTP-1(如通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳[SDS-PAGE]上分析测定)的级分混合，再折叠，然后上样到5ml的Hi-Trap IMAC柱(Amersham Pharmacia)上，所述Hi-TrapIMAC柱用ZnCl2带电荷并平衡在50mM的磷酸钠(pH7.2)，1M的尿素，和0.5M的NaCl中。随后用15倍柱体积的平衡缓冲液冲洗柱，且用50mM的磷酸钠(pH7.2)，1M的尿素，0.5M的NaCl，以及50mM的乙二胺四乙酸(EDTA)洗脱结合的蛋白。洗脱的含有蛋白的样品进行混合且用10mM的Tris-HCl(pH8.0)，5％的甘油，1mM的二硫苏糖醇，以及2mM的EDTA进行透析。纯化的重组Ac-MTP-1没有显示出酶活性(数据未显示)。
重组Ac-MTP-1融合蛋白与SBAS2佐剂混合并在第1，4，43，和50天进行4次肌内注射施用于5只狗中的每一个。每只狗接受每剂量大约140μg的重组融合蛋白和0.5ml的ASO2A。根据相同的给药流程给5只狗肌内注射AS02A。免疫之后，每周通过静脉穿刺收集血液并分离血清冷藏在-20℃。抗原-特异性犬IgG2和IgE抗体通过如先前所描述(Hotez等，2002a)的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)进行测定。来自未活化的L3和在宿主刺激条件下活化的L3的分泌产物的免疫印迹法如前所述(Zhan等，2002)利用从Ac-MTP-1-免疫接种的狗获得的混合血清进行。每个研究用的狗在最后一次免疫后14天用500只犬钩口线虫(Ancylostoma canium)L3皮下感染。用于研究的钩虫株的来源描述在别处(Hotez等，2002c)。用于研究的钩虫种类的确认通过聚合酶链式反应继之以限制性片段长度多态性(Hawdon，1996)得以证实。感染后，通过静脉穿刺每周对狗取血来获得全部血球数(CBC)。在接种疫苗流程的最后和尸体解剖之前也获得了血清的化学特性。每只狗的定量钩虫卵计数(McMaster技术)在感染后(PI)第12天开始每周3天获得。感染后第5周，通过静脉注射巴比妥酸盐处死狗，并在验尸过程中回收成熟钩虫并计数来自小肠和大肠的成熟钩虫(Hotez等，2002c)。成熟钩虫数量之间的统计显著性差异利用方差分析实验(Anovatest)来确定，正如血液学参数和定量的钩虫卵数量的差异。钩虫数量以及卵数量与抗体滴度的比较利用皮尔曼等级(非参数的)相关来测定。
Ac-MTP-1重组融合蛋白的SDS-PAGE分析之后用考马斯蓝染色，显示迁移的蛋白具有酶原预测的61kDa的表观分子量。同样显示了与具有低表观分子量一起迁移的三个一组的条带，可能对应于部分被加工的Ac-MTP-1。免疫之后，每个接受疫苗的狗显现了介于1∶40,500和1∶364,500的范围之间的高滴度的IgG2抗-Ac-MTP-1-特异性抗体；介于1∶500和1∶1,500范围之间的抗Ac-MTP-1-特异性IgE抗体应答。来自接种疫苗的狗的血清识别三个一组的紧密迁移的蛋白，其具有酶原和在宿主活化L3的分泌产物中加工形成的Ac-MTP-1的预测分子量，而在非未活化的L3分泌产物中则没有。其它条带可能也对应于其它由犬钩口线虫(Ancylostoma canium)L3分泌的相关金属蛋白酶；至少3个来自犬钩口线虫(Ancylostoma canium)L3的密切相关表达的序列标记被发现在dbEST数据库中(ncbi.nim.nih.gov/dbEST/index.html)。
总的来说，从接种疫苗的狗回收的成熟钩虫数目(154+34只钩虫)(平均数+标准偏差)与从对照狗回收的成熟钩虫数目(143+30只钩虫)相比没有统计学上的显著差异。然而，如图33A所示，回收自接种疫苗的具有高度抗犬钩口线虫IgG2抗体滴度的狗肠道内的成熟钩虫数目有统计学上的显著减少。抗体滴度和成熟钩虫数量之间的皮尔曼相关系数是-0.89(P＝0.04)。回收自具有最高抗体滴度的狗钩虫数目(98只钩虫)与回收自具有最低抗体滴度的狗的成熟钩虫数目(189只钩虫)相比相当于50％肠虫数的减少。相同的关系被表示在IgG2抗体滴度和中值卵计数之间(图33B)。
这些研究表明Ac-MTP-1可提供作为一种抗钩虫疫苗抗原的下游预示。
实施例4.用Ac-TMP，Ac-AP，以及Ac-APR-1抗原进行的犬疫苗试验为了评价直接针对寄生虫酶和酶抑制剂的抗体是否对钩虫病具有的治疗效果，进行犬类免疫接种试验，所述试验使用编码成熟犬钩口线虫(A.caninum)蛋白酶或蛋白酶抑制剂的重组融合蛋白。因为从活钩虫只能获得少量蛋白，实验这些作为候选疫苗的分子需要在原核或真核宿主系统中的重组载体的表达，然后用纯化的重组融合蛋白对犬进行免疫。
用于实施例4的材料和方法。
狗和畜牧业的研究在方案由乔治华盛顿大学设立的动物保护和使用委员会(IACUC)的批准后，购买了特定给食的，寄生虫幼稚的8±1周龄的雄性小猎犬，通过耳刺纹进行标识，并饲养在乔治华盛顿大学动物研究机构授权的AALAC(实验动物保护的评估和鉴定协会)。在70+4°F的室温下，狗被圈养在一个房间内用于研究，每小时换气10-15次，由100％新鲜空气组成，且12小时的照明周期与12小时的暗周期反复交替。每天监控气流和计时器功能。用Teklad认证的狗食#8727的食谱饲养狗，倘若厌食则补充以罐装软食。饮用水是输自过滤水厂并通过自动供水系统传递；水质分析由U.S.Army Corps ofEngineers进行。来自设施自动系统的水每年对其中的细菌和真菌进行培养。围圈被天天冲洗并每两周进行一次消毒。给定研究组中的狗在钩虫幼虫攻击之前被允许在一起生活和活动，但感染后被分开圈养。所有的狗在开始进行疫苗试验之前被隔离检疫大约一周。在接种疫苗之前，获得全部血球数(CBC)，血清化学特性，以及接种疫苗之前的血清样品。
疫苗研究方案以及样品数量疫苗试验被设计来试验三种不同的抗原，每种与明矾配制，以及明矾佐剂对照。总共24只狗被随机分配为四个组，每组包括6只狗。犬样本的数量基于检测所述免疫接种组小肠内的成熟钩虫数目相对于对照狗减少40-50％的能力进行选择，以80％的统计功率(α＝0.05，双-尾)。所述数据来自先前回收自用400只犬钩口线虫(Ancylostoma canium)L3感染的年龄-匹配的狗的成熟钩虫的平均数和标准偏差(Hotez等，2002)。
重组抗原每一组的6只狗用重组钩虫蛋白免疫接种，其中的重组钩虫蛋白作为融合蛋白被表达在带有杆状病毒的大肠杆菌或昆虫细胞系中。Ac-AP(Cappello等，1995；1996)和Ac-TMP被表达在大肠杆菌中作为含有多聚组氨酸标记的pET 28(Novagen)融合蛋白(Cappello等，1996)。Ac-APR-1(Harrop等，1996)表达在杆状病毒pBacPAK6载体(Clontech)中，所述载体被修饰含有一种多聚组氨酸-编码序列和其它的限制性内切酶位点(Brindley等，2001)。然后通过镍亲和色谱法纯化重组Ac-AP和Ac-TMP融合蛋白，随后进行第二步纯化。在Ac-AP的情况下(Cappello等，1995；1996)，重组蛋白通过mono-S(Amersham-Pharmacia)离子交换色谱法纯化，而Ac-TMP(Zhan等，2002)通过superdex 75(Amersham-Pharmacia)凝胶过滤色谱法纯化。Ac-APR-1(Harrop等，1996)通过底物亲和色谱法利用胃酶抑制剂琼脂糖纯化(Brindley等，2001)。抗原原液蛋白浓度通过Pierce Micro BCA分析(Pierce Chemicals)或通过样品在289nm处的吸光率利用消光系数进行测定，所述消光系数由推导的所述融合蛋白的氨基酸组成计算得到。每一剂量抗原中明矾吸附的蛋白量通过Pierce Micro BCA分析利用牛血清清蛋白标准进行测定。每一抗原相对于污染大肠杆菌或昆虫细胞蛋白的相对纯度通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的分析进行测定。
佐剂制剂重组Ac-TMP和Ac-APR融合蛋白如前面描述(Ghosh等，1996)用硫酸铝钾十二水合物和碳酸氢钠的混合物进行明矾沉淀。所述方法需要将蛋白的水溶液用铝盐在碱性条件下沉淀，然后离心和洗涤(Ghosh和Hotez，1999)。利用这种方法，重组Ac-AP融合蛋白没有在明矾沉淀物中检测到。因此，开始两剂量的Ac-AP的给药没有佐剂。然而，最后两次剂量的Ac-AP被吸附到无定形的非结晶磷酸钙凝胶上。
犬免疫选择4-剂量免疫程序(表II)。每只狗通过22号针在肩的两个位点通过皮下免疫进行接种。注射的体积介于0.5和1.0ml之间。每种抗原的四剂量在38-天的时间内给药。开始的两次注射(初级免疫)在第1天和第4天施用，而最后的两次免疫接种(加强)在第34天和第38天施用。对照组的狗注射相同量的明矾。
表II.用于每只犬免疫接种的抗原量和佐剂。

犬抗体测定通过静脉穿刺每周收集血液并分离血清和冷藏于-20℃。抗原-特异性犬IgG1抗体通过间接的酶联免疫吸附试验(ELISA)测定。由于未获得合适的高品质的犬-特异性试剂，其它的IgG亚类没有被测定。样品血清和酶-联检测抗体的最佳浓度通过测试板滴定法测定。最佳的抗原浓度利用饱和技术来测定。NUNC Maxisorp F96认证平板(Rosklide，丹麦；批号045638)用每孔0.1ml抗原的0.05M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)进行包被。密封的平板在4℃过夜(ON)培养，然后通过DYNEX OpsysTM平板洗涤机(Chantilly，VA)用PBS(pH 7.2)洗涤3次。该平板用每孔0.25ml的含有0.5％Tween 20的0.15MPBS(PBS-Tween 20)(pH7.2)在室温(RT)下处理1.5个小时，倾析，并用纸巾吸干。各种连续稀释度的测试血清制备在0.1ml的PBS-Tween 20中并在4℃过夜培养。洗涤后，0.1ml偶联于碱性磷酸酶(Bethyl实验室，Montgomery，TX)的抗犬IgG1以1∶1000的稀释度被加到每个孔中。室温下1.5小时后，平板在用0.1ml 2.5mM对-硝基苯磷酸酯(Sigma.St.Louis，MO)的10mM二乙醇胺(Sigma，St Louis，MO)和0.5mM氯化镁(Sigma，St.Louis，MO)(pH9.5)的溶液加到每个孔中之前用PBS-Tween20洗涤10次。平板在暗中培养30分钟并通过带有SOFTmax Pro软件(Molecular Devices，Sunnyvale，Ca)的SpectraMax 240PC读数仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在405nm波长处读数。对照犬血清的平均光密度用作基准。最后大于上述基准3倍的血清稀释度被看作滴定终点。这些终点的几何平均值按照来自每一组的六只犬来计算。
犬钩虫传染和寄生虫回收在最后免疫14天后，所研究的每只狗用包含在胶囊中的400只犬钩口线虫(Ancylostoma canium)L3进行口服感染。被用来研究的钩虫株的来源描述在别处(Hotez等，2002)。用于研究的钩虫种的确认通过聚合酶链式反应继之以限制性片段长度多态性(Hawdon，1996)进行证实。感染后，狗通过静脉穿刺每周取血以获得全部血球数(CBC)。血清化学特性也在接种疫苗结束和在尸体检验之前获得。每一只狗定量的钩虫卵计数(McMaster技术)在感染12天后开始以每周三天获得。感染五周后，狗通过静脉内注射巴比妥酸盐被处死，在尸体解剖时从小肠和大肠回收成熟的钩虫并计数(Hotez等，2002)。每只成熟钩虫的性别通过肉眼观察来确定。当每天实施安乐死8只狗(两只狗来自四个组中的每一组)时，尸体解剖在三天时间内进行。分离大约1-2cm的小肠并置于福尔马林中用于将来的组织病理分析。
统计方法在免疫接种的组中成熟钩虫数量相对于对照组减少或增加的百分比通过下式来表示 成熟钩虫数量差异的统计显著性利用非参量检验法；Kruskal-Wallis与Dunn法，以及Mann-Whitney U试验测定。组之间的血液学参数以及定量的钩虫卵计数的差异通过ANOVA试验来评价。当超过两个试验通过相同的变量来计算时，显著性的水平应根据试验的数目进行调整。回收的成熟钩虫的性别差异通过用于两个相关组的Wilcoxon-Signed Ranks试验进行统计学比较。如果所计算的P值等于或小于0.10(双侧)或-0.05(单侧)，则差异被认为是统计上显著的。
实施例4的结果。
成熟的犬钩口线虫(Ancylostoma canium)抗原3个重组犬钩口线虫(Ancylostoma canium)抗原被选择用于犬免疫接种。其中的两个Ac-AP以及Ac-TMP仅仅是由成虫期钩虫分泌的蛋白酶抑制剂。Ac-AP是91个氨基酸的因子Xa抑制剂抗凝血剂(Cappello等，1995；1996)，而Ac-TMP是140个氨基酸的推测的金属蛋白酶的组织抑制剂，并且是由犬钩口线虫(Ancylostoma canium)分泌的最丰度的蛋白。第三个选择的抗原是Ac-APR-1，为422个氨基酸的天冬氨酸组织蛋白酶(Harrop等，1996)。SDS-PAGE分析重组融合蛋白后进行考马斯蓝染色。正如所预料的，重组融合蛋白Ac-APR-1和Ac-TMP在SDS-PAGE上迁移的表观分子量分别为45,000和18,000。表示为具有一个N-末端多聚组氨酸标记的pET28融合蛋白的Ac-AP的预测分子量是12,191Da(Cappello，1996)。通过SDS-PAGE，重组Ac-AP融合蛋白被观察为一个分子量为22,000的主要条带和一个在大约15,000Da处迁移的较微弱的条带。这种观测结果可对应于多肽寡聚体的构成。这种现象从前出现在Ac-AP天然产物的纯化过程中(Cappello等，1995)。因子Xa的抑制活性，编码重组Ac-AP融合蛋白的pET28质粒的DNA序列分析，以及22kDa条带通过Edman降解法进行的氨基末端肽序列分析证实了基因产物的同一性(数据没有显示)。
犬抗体应答.选择的犬免疫接种程序为，在开始的4天期间的两次(第1天和第4天)皮下剂量的给药进行初级免疫，接着两次随后的皮下免疫加强在初级免疫后30天开始(第34天以及第38天)进行。Ac-TMP以及Ac-APR-1以明矾-沉淀蛋白的形式注射。相反，Ac-AP没有与明矾形成沉淀物。因此，对于起始的两次剂量，Ac-AP皮下给药没有佐剂。然而，在第二和第三次免疫之间的30-天时间段，使用磷酸钙凝胶的方案表明可有效地沉淀Ac-AP(数据没有显示)。因为这种原因，磷酸钙被选作佐剂用于最后两次剂量的Ac-AP免疫给药。
3个疫苗抗原的IgG1抗体滴度的几何平均值显示在图34A-C中。在针对Ac-APR-1免疫接种的狗中(图34A)，在初级免疫大约6周后接着进行最后的两次免疫加强，抗原-特异性IgG1增加。与此相反，抗Ac-TMP IgG1抗体应答被进一步加强(图34B)，且在初级免疫后2周，在第三次和第四次剂量之前开始增加。在最后的两次加强后抗Ac-TMP抗体滴度第二次增加，滴度超过1∶10,000。六只免疫接种抗Ac-AP的狗中有五只没有对抗原产生免疫应答。如图34C所示，对Ac-AP免疫接种应答的单个犬在最后两次给药后显示出抗原-特异性抗体应答。
从小肠回收成熟犬钩口线虫(Ancylostoma canium)钩虫从免疫接种狗的小肠回收的成熟犬钩口线虫(Ancylostoma canium)的数目显示在表III中。免疫接种狗相对于仅用明矾单独注射的狗体内钩虫数的减少介于4.5％到18％的范围之内。上述的减少不能充分的表明组之间的统计显著性(克鲁斯凯-沃利斯检验，P＝0.19)。然而，从免疫接种有Ac-APR-1的狗的小肠回收的钩虫数目减少18％(在一个组中最大的减少)的概率通过Dunn法小于0.05，而通过Mann-Whitney U单侧检小于0.03。免疫接种抗Ac-TMP的狗也显示出成熟钩虫数量的减少(10.8％)，尽管这些不是统计上显著的。没有显示出抗Ac-AP抗体应答的5只狗，也显示出不显著的钩虫数量的减少。然而，具有显著的抗Ac-AP抗体应答的单独的狗，显示出成熟钩虫数量减少34.7％。如表III所示，数据不能提供充分的证据证明免疫接种的狗和对照狗之间的定量钩虫卵计数在统计学上有显著的减少。类似地，免疫接种没有影响狗的血液学参数，包括血细胞比容，血红蛋白，白血细胞数，以及嗜酸性粒细胞(数据没有显示)。正如所预料的，用于这个研究中的钩虫的攻击剂量在对照明矾注射的狗中没有引起贫血(数据没有显示)。
从结肠回收成熟的犬钩口线虫(Ancylostoma canium)。
表III.免疫接种的狗相对于明矾-注射的狗小肠中成熟钩虫的减少

*阳性免疫应答**P＜0.05(Dunn法)反之，从免疫接种狗的小肠回收的成熟钩虫数目减少，从结肠回收的成熟钩虫数目却相应的增加(表IV)。
表IV.免疫接种的狗相对于明矾-注射的狗的结肠中成熟犬钩口线虫的增加

*阳性免疫应答**P＜0.05(Dunn法)从大肠回收的成熟钩虫数目的增加在统计学上是显著的(克鲁斯凯-沃利斯检验，P＝0.07)。免疫接种Ac-TMP(增加500％)或Ac-APR-1(300％增加)的狗，相对于用明矾注射的狗显示出统计学上显著增加(Dunn法，P＜0.05)。用Ac-AP接种但没有显示出抗原-特异性抗体应答的狗在从结肠回收的成熟钩虫数目方面没有统计学上显著增加。然而，单个的具有显著的抗-Ac-AP抗体应答的狗显示出其结肠中成熟钩虫数目有1083％的增加。
总之，在接种以及对照狗之间对于在从小肠以及大肠回收的成熟钩虫组合的总数统计学上没有显著的差异(数据没有显示)。相反，对重组体钩虫抗原的抗体应答导致成熟钩虫离开小肠并进入结肠的显著性迁移。在Ac-TMP和Ac-APR-1接种的狗中，小肠中成熟钩虫相对于结肠中成熟钩虫的比率从明矾-注射狗的43.9分别减少至6.6和7.3之间的比率。显示抗Ac-AP抗体应答的单独狗小肠中与结肠中钩虫数量的比率为1.6，表明这条狗中有几乎一半的钩虫数量已经转移到结肠中。
性别-依赖的差异.迁移远离小肠并迁移到结肠的雌雄钩虫数目是不等的。如图35所示，从结肠回收的雌性成熟钩虫比回收到的雄性钩虫更普遍。对用Ac-APR-1(P＝0.04)和Ac-AP(P＝0.06)接种的狗而言，寄生在结肠中的雌性钩虫数量较多在统计学上是显著的。雄钩虫比雌性钩虫更可能被从小肠回收到，尽管差异不是统计学上显著的。雌雄鉴别不是在附着于1-2cm区段的被保存用于组织病理学分析的小肠的钩虫上进行的。这些区段中钩虫数目的平均数介于5和6只肠虫的范围之间。这些少量的肠虫对雌雄依赖性差异的评分没有显著性贡献(数据没有显示)。
这些实例证明了用重组融合蛋白接种哺乳动物来引发抗原特异性应答是可行的，而且所述的抗体应答相关于肠中钩虫数量的减少或肠中寄生的钩虫的转移。
实施例5.Ac-MTP-1和Ac-TTR的犬疫苗试验实施例5A.抗体滴度和钩虫的减少获得自大肠杆菌的抗原Ac-MTP-1和Ac-TTR在狗的疫苗试验中进行测试。抗原与佐剂SBAS2一起给药。接种疫苗的动物显示出高水平的犬IgG2抗原-特异性抗体，以及抗原-特异性IgE的适度增加。随后，狗通过皮下注射L3钩虫幼虫进行攻击。
如图36A和B所示，自具有高的抗-犬钩口线虫(Ancylostomacanium)IgG2抗-MTP-1抗体滴度的免疫接种狗的肠中回收的成熟钩虫数目有统计学上显著的减少。抗体滴度和成熟钩虫数量之间的皮尔曼相关系数为-0.89(P＝0.04)。自具有最高抗体滴度(98只钩虫)的狗回收的钩虫数目与自具有最低抗体滴度(189只钩虫)的狗回收的成熟钩虫数目相比有相当于50％肠虫数量的减少。相同的关系被表示在IgG2抗体滴度和中值定量卵计数之间。
Ac-MTP-1重组融合蛋白的SDS-PAGE分析之后用考马斯蓝染色，显示迁移蛋白具有酶原的预测分子量61kDa的表观分子量。同样地显示了三个一组的条带，以较低的表观分子量迁移，很可能对应于部分加工的Ac-MTP-1。免疫之后，每个接受疫苗的狗显现高滴度的IgG2抗Ac-MTP-1-特异性抗体，范围介于1∶40,500和1∶364,500之间；抗Ac-MTP-1-特异性IgE抗体应答范围介于1∶500和1∶1,500之间。来自免疫接种的狗的血清识别三个一组的紧密迁移的蛋白，具有酶原和加工形式Ac-MTP-1的预测分子量，所述酶原和加工形式Ac-MTP-1处于宿主活化的L3而非未活化的L3的分泌产物中。
关于TTR抗原的使用，可参见图37A和B，针对TTR具有高水平IgE和IgG1抗体的一条狗显示出钩虫数量降低(6％)。
这个实施例证明了用MTP或TTR接种的哺乳动物引发了保护性抗体应答，而且在具有高抗体滴度的哺乳动物体内观察到钩虫数量的减少。
实施例5B.由于免疫接种钩虫抗原防止失血并减少钩虫大小动物还被测试以确定用钩虫抗原接种是否防止失血。用Ac-TTR接种表明显著的防止了失血(附图38A和B)。利用Mann-Whitney试验，TTR和佐剂对照组之间的血红蛋白(38B)浓度(P＝0.036)和hematicrit(38A)浓度(P＝0.009)二者的差异是统计学上显著的。
此外，血红蛋白浓度的差异被解释为肠虫大小统计学上的显著减小。利用基于从宿主回收肠虫的扫描的成像系统收集数据。肠虫用CoolSnapPro数码摄象机(Media Cybernetics)拍照，并利用宏的ImagePro软件来测定成像从而确定处理之间所比较的肠虫长度(mm)。如附图39所示TTR接种疫苗的组相对于佐剂对照组，肠虫大小在统计学上显著减小(在1和2mm之间)。
这个实施例显示用TTR接种，除了降低体内钩虫数量，同样也减少失血。
实施例6.嵌合钩虫抗原本实施例研究了表达对应于Na-ASP-1的氨基酸291-303(同样也发现在Ac-ASP-1中)的肽抗原决定簇的两种不同乙型肝炎核心颗粒的保护效应。之前通过研究Na-ASP-1和Ac-ASP-1推测氨基酸序列的相对亲水性(疏水性和亲水性)的，人们发现两个分子都显示出亲水序列，所述亲水序列的模型预测可代表该分子的环出区域。肽对KLH(钥孔血蓝素)的共价吸附证实嵌合分子可保护小鼠免于攻击感染。
构建了两种表达ASP-1的不同嵌合分子。ICC-1546表达ASP-1氨基酸291-303作为“环出”的栓系结构，而ICC-1564表达相同的肽作为N-末端结构。早先的研究已经证明小鼠抗L3抗体识别ICC-1546，而不识别ICC-1564。
抗原嵌合体如上所述用铝胶作为佐剂被给药。DSM(成熟犬钩口线虫(Ancylostoma canium)的去污剂溶解的膜提取物)用作阴性对照。幼虫的攻击通过皮下注射L3阶段的幼虫来进行。
结果表明用任一粒子免疫接种的狗产生高水平的抗粒子抗体。大多数抗体直接抗肝炎核心抗原成分。然而，在一只用ICC-1546接种的狗体内，具有高水平抗ASP-1(和抗-肽)抗体。这条狗显示出钩虫数量的明显减少(表V)。
表V.抗ASP-1抗体和钩虫数量的比较

这个实施例证明针对ASP-1相关的特异性抗原决定簇的高抗体滴度会导致体内钩虫数量降低。
实施例7.抗原在杆状病毒/昆虫细胞以及酵母中表达钩虫抗原在真核生物表达系统，诸如杆状病毒/昆虫细胞以及巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达，为获得可溶性和生物活性的重组蛋白提供了最大可能。
A.在巴斯德毕赤酵母中的表达抗原Na-ASP-1，Ac-TTR，Ac-API，以及Ay-ASP-2已被成功地用毕赤酵母发酵系统表达。通过用便于分离的多聚组氨酸标记分离抗原。
B.在杆状病毒/昆虫细胞系统中的表达抗原Na-CTL，Ac-MEP-1，Ac-ASP-2，以及Ac-MTP-1已被成功地在杆状病毒/昆虫细胞表达系统中表达。利用便于分离的多聚组氨酸标记分离抗原。
实施例8.锡兰钩口线虫直向同源抗原Ay-ASP-1，Ay-ASP-2以及Ay-MTP的cDNAs的克隆在锡兰钩口线虫幼虫cDNA文库构建之后来自仓鼠寄生钩虫锡兰钩口线虫(A.Ceylancium)的直向同源抗原被成功地克隆。
ASP-1的锡兰钩口线虫直源基因(orthologue)通过利用一个900bp的32P-标记的Ac-ASP1 cDNA片段作为探针筛选锡兰钩口线虫L3cDNA文库进行克隆。筛选大约500,000个克隆得到85个阳性克隆。其中有21个克隆被测序，这其中又有19个编码相同的cDNA。没有发现其它的ASP-1的直源基因。该克隆显示出与Na-ASP-1有85％的同一性以及92％的相似性。
通过利用一个600bp32P-标记的Ac-asp-2 cDNA片段作为探针筛选锡兰钩口线虫L3 cDNA文库的大约100,000个噬斑，获得30个阳性克隆，其中的10个被测序且发现等同于Ay-ASP-2预测的ORF(直向同源克隆)。
通过利用一个590bp32P-标记的Ac-MTP cDNA片段作为探针筛选大约500,000个锡兰钩口线虫L3 cDNA文库，获得700个阳性克隆，且其中的8个被测序。8个中又有7个编码Ay-MTP-1，而另外的一个编码一种推定的同种型(Ay-MTP-2)。
这个实施例证明在来自犬钩口线虫(Ancylostoma canium)和锡兰钩口线虫种类的钩虫抗原之间有高度的相似性，且数据显示大多数钩虫抗原之间有高度的同一性(＞80％)。
实施例9.免疫定位一些主要的疫苗抗原的免疫定位在成熟钩虫切片中进行。免疫定位的测定如下Ac-103作为钩虫表面抗原，Ac-FAR-1和Ac-API作为假体腔流体的组分，(Ac-API也是一种咽部蛋白)，Ac-CP-1作为双器腺(amphidial gland)蛋白，分泌腺中的Ac-TMP，和ASP-3作为双器和食道的蛋白。此外，该钩虫ES产物的总蛋白定位到双器和分泌腺，以及钩虫消化道的刷状边界膜。
这个实施例证明许多钩虫抗原被暴露在肠虫的表面上或由肠虫分泌，并因此对通过宿主抗体或宿主免疫活性细胞的靶向敏感。
实施例10.在巴西Minas Gerais州进行人类研究以前在中国和其它地方已有报道，人钩虫传染与其它土壤-传播的钩虫病(例如，蛔虫病和鞭虫病)以及血吸虫病相比较显示出独特的流行病学特征(Gandhi等，2001)。其它这些蠕虫感染的流行程度和强度在童年和青春期间到达高峰且随后成人期时下降，然而钩虫传染的流行程度和强度随年龄而增加。在许多中国人和巴西比利亚赫斯村庄(以及假定的其它地方)中中年甚至老年的居民显示出最严重的感染。
解释这个观测结果的基础免疫学机制已被研究。如附图40和41所示，CD-4+淋巴细胞从钩虫感染居民的全血进行门控，并用L3可溶性钩虫抗原(图40)或毕赤酵母-表达的重组Na-ASP-1(图41)进行刺激。宿主细胞因子的产生通过胞内细胞因子染色技术进行测定。两种抗原均刺激高水平的IL-10和IL-5而非IL-4。IL-10是一种具有下调，抗炎特性的强免疫调节剂，而IL-4与抗体产生和TH-2型免疫相关。这些发现表明钩虫感染的个体可能对钩虫以及其他可能的抗原刺激无反应。
与此相反，研究发现用钩虫处理的个体产生IL-4。这些观察结果表明其从肠中去除钩虫有助于重构患者的免疫力。这是一个重要的观察结果，因为其提示缺少重组钩虫疫苗的处理可能不会对被主动感染的患者起治疗性疫苗的作用，而且提示在免疫接种之前驱虫化学疗法可能是必要的。
此外，这些观测结果也表明钩虫传染可能阻碍针对诸如HIV和疟疾病原的成功免疫接种。在Subsaharan非洲的一些区域，钩虫与HIV和疟疾重迭，在HIV或疟疾免疫接种前监控研究参与者的钩虫状况，以及对那些在免疫之前已发现被主动感染的参与者进行处理可能是必需的。
尽管本发明已通过优选实施方案的方式被描述，本领域的技术人员应认识到本发明可在附属权利要求的精神和范围内经过改变来加以实施。因此，本发明不应被所述的实施方案所限定，而应该进一步包括在此提供的说明书的精神和范围内的所有改变及其等同物。
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权利要求
1.一种组合物，包括来自钩虫的重组或合成的抗原或其片段，以及，可药用载体。
2.权利要求1的组合物，其中所述重组或合成的抗原显示与选自下列的抗原有至少大约80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API，和Ay-TTR。
3.权利要求2的组合物，其中所述抗原是Ac-TMP。
4.权利要求2的组合物，其中所述抗原是Ac-MEP-1。
5.权利要求2的组合物，其中所述抗原是Ac-MTP-1。
6.权利要求1的组合物，其中所述钩虫的种类选自美洲板口线虫(Nector americanus)，犬钩口线虫(Ancylostoma canium)，锡兰钩口线虫(Ancylostoma ceylancium)，和十二指肠钩口线虫(Ancylostomaduodenale)。
7.一种引发哺乳动物体内对钩虫免疫应答的方法，所述方法包括如下步骤给所述哺乳动物施用有效量的组合物，所述组合物包括来自钩虫的重组或合成的抗原或其片段，以及可药用载体。
8.权利要求7的方法，其中所述重组或合成的抗原显示与选自下列的抗原有至少大约80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API，和Ay-TTR。
9.权利要求8的方法，其中所述抗原是Ac-TMP。
10.权利要求8的方法，其中所述抗原是Ac-MEP-1。
11.权利要求8的方法，其中所述抗原是Ac-MTP-1。
12.权利要求7的方法，其中所述钩虫的种类选自美洲板口线虫，犬钩口线虫，锡兰钩口线虫，和十二指肠钩口线虫。
13.一种免疫接种哺乳动物抗钩虫的方法，所述方法包括如下步骤给所述哺乳动物施用有效量的组合物，所述组合物包括来自钩虫的重组或合成的抗原或其片段，以及可药用载体。
14.权利要求13的方法，其中所述重组或合成的抗原显示与选自下列的抗原有至少大约80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API，和Ay-TTR。
15.权利要求14的方法，其中所述抗原是Ac-TMP。
16.权利要求14的方法，其中所述抗原是Ac-MEP-1。
17.权利要求14的方法，其中所述抗原是Ac-MTP-1。
18.权利要求13的方法，其中所述钩虫的种类选自美洲板口线虫，犬钩口线虫，锡兰钩口线虫，和十二指肠钩口线虫。
19.一种组合物，包括来自钩虫的重组或合成的抗原或其片段，其中所述重组或合成的抗原显示与选自下列的抗原有至少大约80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API，和Ay-TTR，以及，可药用载体。
20.权利要求19的方法，其中所述抗原是Ac-TMP。
21.权利要求19的方法，其中所述抗原是Ac-MEP-1。
22.权利要求19的方法，其中所述抗原是Ac-MTP-1。
23.权利要求19的方法，其中所述钩虫的种类选自美洲板口线虫，犬钩口线虫，锡兰钩口线虫，和十二指肠钩口线虫。
24.一种疫苗，包括来自钩虫的重组或合成的抗原或其片段，其中所述重组或合成的抗原显示与选自下列的抗原有至少大约80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API，和Ay-TTR，以及，可药用载体。
25.权利要求24的方法，其中所述抗原是Ac-TMP。
26.权利要求24的方法，其中所述抗原是Ac-MEP-1。
27.权利要求24的方法，其中所述抗原是Ac-MTP-1。
28.权利要求24的方法，其中所述钩虫的种类选自美洲板口线虫，犬钩口线虫，锡兰钩口线虫，和十二指肠钩口线虫。
29.一种引发免疫应答的组合物，所述组合物包括来自钩虫的重组或合成的抗原或其片段，其中所述重组或合成的抗原显示与选自下列的抗原有至少大约80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API，和Ay-TTR，以及，可药用载体。
30.权利要求29的方法，其中所述抗原蛋白，多肽或者其片段是Ac-TMP。
31.权利要求29的方法，其中所述抗原蛋白，多肽或者其片段是Ac-MEP-1。
32.权利要求29的方法，其中所述抗原蛋白，多肽或者其片段是Ac-MTP-1。
33.权利要求29的方法，其中所述钩虫的种类选自美洲板口线虫，犬钩口线虫，锡兰钩口线虫，和十二指肠钩口线虫。
34.一种能够免疫接种患者抗传染病的方法，所述方法包括如下步骤a)治疗钩虫感染到足以增加淋巴细胞增殖的程度；以及b)免疫接种所述患者抗所述传染病。
35.权利要求34的方法，其中所述传染病选自HIV，结核病，疟疾，麻疹，破伤风，白喉，百日咳，以及脊髓灰质炎。
36.一种用于钩虫免疫接种的方法，所述方法包括如下步骤a)化学治疗钩虫感染的患者来改善钩虫传染；以及b)在改善钩虫传染后用来自钩虫的重组或合成的抗原或其片段免疫接种所述患者。
37.权利要求36的方法，其中所述重组或合成的抗原显示与选自下列的抗原有至少大约80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API，和Ay-TTR。
38.一种降低钩虫感染患者失血的方法，所述包括如下步骤给所述患者施用一种组合物，所述组合物包括来自钩虫的重组或合成的抗原或其片段，以及，可药用载体。
39.一种减小钩虫感染患者体内钩虫大小的方法，所述方法包括如下步骤给所述的患者施用一种组合物，所述组合物包括来自钩虫的重组或合成的抗原或其片段，以及可药用载体。
40.一种降低感染钩虫患者体内钩虫数量的方法，所述方法包括如下步骤给所述的患者施用一种组合物，所述组合物包括来自钩虫的重组或合成的抗原或其片段，以及可药用载体。
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95.一种Ac-APR-2抗原。
96.一种来自线虫的Ay-TTR抗原。
97.权利要求96的Ay-TTR抗原，其中所述线虫是钩虫。
全文摘要
本发明提供了一种引发对钩虫抗原的免疫应答且可被用作钩虫疫苗的制剂。此外，本发明还提供了一种增加感染钩虫的患者体内抗传染病的免疫接种有效性的方法。所述方法包括在施用疫苗之前化学治疗钩虫群袭。
文档编号A61K39/00GK1571677SQ02820769
公开日2005年1月26日 申请日期2002年10月17日 优先权日2001年10月17日
发明者彼得·霍特兹, 詹姆斯·阿什科姆, 玛赫纳兹·巴姆钱, 詹彬, 王艳, 约翰·霍当, 亚历山大·劳卡斯, 安杰拉·威廉森, 布赖恩·琼斯 申请人:乔治华盛顿大学