专利名称：茉莉根有效成分及提取方法、用途的制作方法
技术领域：
本发明公开一种茉莉根有效成分及提取方法、用途，属于中药有效成分提取、应用技术领域。
背景技术：
本犀科茉莉(素馨)属植物茉莉Jasminum sambac(L.)Aiton，为常绿或落叶灌木。目前尚无该中药系统的研究报道，茉莉根的化学成分除有文献报道含生物碱和甾醇外，尚无明确化合物结构的研究报道。
发明内容
本发明公开的茉莉根有效成分包括茉莉根浸膏及含有的3种有效成分，同时提供了其提取方法；本发明还公开了上述有效成分的医用用途；本发明提供了上述有效成分的药物制剂。
茉莉根粗粉为原料，经溶剂、硅胶柱层析提取等过程分离获得茉莉浸膏及3个有效成分齐墩果酸(oleanolic acid)，以下简称C1。
新化合物5，6-二氢-11-异丙氧基-8，9-亚甲二氧基-3，5-二氧杂屈(5，6-dihydro-11-isopropoxy-8，9-methylenedioxy-3，5-diazoanthracene)。
为黄色絮状结晶，分子式为C20H18N2O3，分子量为334，mp182-184℃(EtOH-H2O)，易溶于乙醇，微溶于氯仿。Molish反应阴性。Liebermann-Burchard反应阴性。其酸性水溶液与碘化铋钾试剂反应生成红棕色沉淀，与磷钨酸试剂反应生成褐色沉淀，以下简称C2。
新化合物3，5-二羟基喹啉-7-葡萄糖苷(3，5-dihydroxyquinoline-7-glycocide)。
为白色粉末，分子式为C15H17NO8，分子量为339，mp203-205℃(CHCl3-MeOH)，易溶于水、乙醇，微溶于氯仿，以下简称C3。
本发明的技术解决方案如下茉莉根醇浸膏制备工艺取茉莉根粉碎成20目左右粗粉，加入3～10倍的50～90％乙醇提取，过滤并回收乙醇，水浴浓缩得浸膏和水浓缩液。
茉莉根单体成分制备工艺将上述浸膏用乙酸乙酯提取，获得乙酸乙酯浸膏，滤集的析出沉淀和回收的水层待用。将乙酸乙酯浸膏用酸水解后，上硅胶柱层析，采用氯仿∶丙酮＝10∶2洗脱剂洗脱分离，后上硅胶柱层析，用苯∶乙酸乙酯＝9∶1洗脱剂洗脱分离，洗脱物用甲醇∶氯仿＝1∶1重结晶，得单体成分C1。
将上述滤集的析出沉淀用酸水溶解后，上硅胶柱层析，用洗脱剂氯仿∶甲醇∶水＝2∶6∶1洗脱，洗脱物用乙醇重结晶得单体成分C2。
将上述回收的水层调pH中性，浓缩后上大孔树脂，用50～90％甲醇洗脱，洗脱液浓缩得醇洗浓缩膏。用酸水溶液溶解醇洗浓缩膏后，上硅胶层析，洗脱剂为氯仿∶甲醇∶水＝8∶4∶1，洗脱物再上硅胶柱层析，洗脱剂为氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水＝2∶4∶4∶1。洗脱物用氯仿∶甲醇＝1∶1重结晶，得单体成分C3。
以茉莉根醇浸膏、齐墩果酸、化合物5，6-二氢-11-异丙氧基-8，9-亚甲二氧基-3，5-二氧杂屈及化合物3，5-二羟基喹啉-7-葡萄糖苷为茉莉根有效成分单独或分别用于镇痛、镇静和戒毒的药物。
上述的药物是以茉莉根有效成分和药学上可接受的载体或辅料组成的药物组合物。
本发明的茉莉根总浸膏作为药物制剂含有治疗有效量的提取物为活性成分，以及含有一种或多种药学上允许的药物载体。
本发明可以根据需要制成口服、直肠给药、肌肉注射等给药方式用于镇痛、镇静和戒毒病。按药剂学领域的常规生产方法制成各种剂型，如片剂、颗粒剂、滴丸.冲剂、液体制剂、胶囊剂、栓剂、喷雾剂、气雾剂和注射剂。也可将其活性成分与一种或多种载体或药物混合，制成所需剂型。
上文的载体是指药剂学常规应用的载体，其中包括防腐剂、矫味剂、稀释剂、崩解剂、吸附剂、着色剂、赋形剂等。
本发明的药物对人的用药剂量可根据年龄、体重和病的类型及病情的严重程度而确定。
茉莉根浸膏的中枢镇痛、镇静、催眠作用一、实验材料(一)药品1、茉莉根醇浸膏，临用前用蒸馏水配成所需浓度后灌胃给药。
2、戊巴比妥钠，上海化学试剂分装厂产品，批号84-06-12。
3、盐酸吗啡注射液，沈阳第一制药厂产品，批号930508，用前以蒸馏水配制。
4、冰醋酸，长春化学试剂厂产品。
(二)仪器XZC-1型小动物自主活动测定仪，黑龙江省牡丹江市中华电器厂出品。
(三)实验动物昆明种小鼠，雌雄各半，体重18~22g，由白求恩医科大学实验动物部提供。
(四)实验数据的统计处理采用组间t检验，实验结果均用X+S表示。
二、实验方法与结果(一)对醋酸所致小鼠镇痛作用的影响取小鼠50只，随机分成5组，即空白对照组(给予同体积生理盐水)，阳性药腹腔注射盐酸吗啡(1.5mg/kg)，茉莉根醇浸膏3个剂量组(0.25g/kg、0.5g/kg、0.75g/kg)。实验时各组小鼠分别灌胃给药，于给药后30min各组小鼠腹腔注射1％冰醋酸0.2mg/只，稳定5min后，观察10min内小鼠的扭体次数(P＜0.01，P＜0.001)，具有一定的镇痛作用。结果见表1。
表1茉莉根醇浸膏对小鼠的镇痛作用(n＝10，X+S)组别 剂量(g/kg)扭体次数抑制率空白对照组-- 32.20±9.79注射吗啡组1.5mg5.40±2.11***83.2％茉莉根醇浸膏组0.25 18.10±6.87**43％0.50 18.20±5.53*** 43％0.75 16.40±3.53*** 49％与空白对照组比较，**P＜0.01，***P＜0.001(二)对小鼠自主活动的影响取小鼠50只，雌雄兼用，随机分为5组，即空白对照组(给予同体积生理盐水)，阳性药腹腔注射戊巴比妥钠(25mg/kg)，茉莉根醇浸膏3个剂量组(0.15g/kg、0.25g/kg、0.5kg/kg)。灌胃给药，分别测定各组小鼠给药前、给药后30min、60min的自主活动，方法是将小鼠置于小鼠自主活动仪中稳定5min，测定10min内小鼠自主活动次数的减少，给药后30min、60min与对照组比较具有明显统计学意义(P＜0.01，P＜0.001)，结果见表2。结果表明茉莉根醇浸膏具有一定的镇静作用。
表2茉莉根醇浸膏对小鼠自主活动的影响(n＝10，X+S)剂量自主活动次数组别(g/kg) 给药前 给药后30’ 给药后60’空白对照组-- 1690.30±396.841694.1±427.15 1746.60±489.14注射戊巴比25mg 1682.40±531.761010.60±625.19* 941.20±439.84**妥钠组茉莉根醇浸0.15 1634.00±361.67960.00±651.00** 764.00±501.40***膏组0.25 1696.60±404.301110.00±590.39** 1042.40±541.22**0.51529.20±485.90933.50±266.38*** 1073.00±222.16***与空白对照组比较，**P＜0.01，***P＜0.001
(三)对戊巴比妥钠阈下、阈上剂量催眠作用的影响1、对戊巴比妥钠阈下剂量催眠作用的影响取小鼠40只，随机分为4组，即空白对照组，茉莉根醇浸膏3个剂量组(0.25g/kg、0.5g/kg、0.75g/kg)。实验时各组小鼠灌胃给药，于给药后30min各组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(25mg/kg)，翻正反射消失达1min以上者为发生睡眠。实验结果见表3。
表3 莉根醇浸膏对戊巴比妥钠阈下催眠剂量的影响 (n＝10，X+S)组别 剂量(g/kg) 睡眠小鼠数目空白对照组 -- 0茉莉根醇浸膏组 0.25 00.5 00.75 3由表3可见，茉莉根醇浸膏对戊巴比妥钠阈下催眠剂量在高剂量组可使少量动物产生催眠作用，其它各组无明显影响，卡方检验无统计学意义。
2、对戊巴比妥钠阈上剂量催眠作用的影响取小鼠40只，随机分为4组，即空白对照组，茉莉根醇浸膏3个剂量组(0.25g/kg、0.5g/kg、0.75g/kg)。实验时各组小鼠灌胃给药，于给药后30min各组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)，以翻正反身为指标，观察各组小鼠催眠潜伏期的缩短(P＜0.05)，以及睡眠时间的延长(以小鼠翻正反射消失为睡眠指标，P＜0.05)，结果见表4。
结果表明，茉莉根醇浸膏具有一定的催眠作用。
表4 茉莉根醇浸膏对戊巴比妥钠阈上催眠剂量的影响(n＝10，X+S)组别剂量(g/kg)睡眠潜伏期(min)睡眠保持时间(min)空白对照组 -- 8.50±1.95 14.90±2.55茉莉根醇浸膏组 0.25 7.60±1.04 17.40±2.750.5 6.70±1.76*18.40±4.140.75 6.50±1.64*20.70±5.90*与空白对照组对比，*P＜0.05小结与讨论茉莉根醇浸膏为用乙醇水浴提取茉莉根粗粉，回收乙醇浓缩后所得浸膏。有人对茉莉根醇浸膏进行了深入研究，证明其与当归、人参、五加皮等合用具有戒毒作用，脱瘾率达70％[27]。本课题组采用茉莉根醇浸膏配伍其它中药进行戒毒作用的研究，也取得良好效果。本实验发现茉莉根醇浸膏对小鼠具有减少自主活动、抑制扭体反应及延长戊巴比妥钠阈上剂量睡眠时间的作用，提示该药对中枢神经系统具有抑制作用。实验结果提示，茉莉根醇浸膏对小鼠0.15g/kg体重给药明显减少其自主活动，而对阈下剂量的戊巴比妥钠催眠作用不明显，说明该药具有明显的镇静作用。亦提示该药可能对中枢的抑制作用以镇静为主。在较高剂量0.5-0.75g/kg体重对小鼠可产生催眠与镇痛作用，与文献报告相一致[17]。吸毒成瘾的患者停药后可出现明显焦虑、不安及其它中枢兴奋症状，该药的中枢镇静、催眠及镇痛作用可明显对抗戒毒的某些戒断症状，为其临床应用提供实验室依据。
C1、C2、C3单体成分的中枢镇痛、镇静、催眠作用上述成份分别以10mg/kg，20mg/kg剂量给实验模型小鼠，结果表明C1具有镇痛作用；C2、C3具有镇痛、镇静作用。C1、C2、C3是茉莉根浸膏中主要的药理活性物质。
实验方法同前述，结果如表5表5 C1、C2、C3成分对小鼠的镇痛作用(n＝5，X+S)组别剂量(mg/kg) 扭体次数 抑制率空白对照组 -- 31.17±7.78C3 10 12.20±2.11***60.86％20 10.11±3.41***67.63％C2 10 15.40±5.57** 49.40％20 10.45±3.27** 66.48％C1 10 10.18±3.21** 67.33％20 8.10±2.88** 74.40％与空白对照组比较，**P＜0.01，***P＜0.001表6 C1、C2、C3成分对小鼠自主活动的影响(n＝5，X+S)剂量自主活动次数组别(mg/kg) 给药前给药后30’给药后60’空白对照组 --1690.30±396.841694.1±427.15 1746.60±489.14戊巴比妥钠组251682.40±531.761010.60±625.19941.20±439.84**C3 201674.00±365.17960.00±651.00** 794.00±501.40***C2 201679.60±414.301015.00±390.39** 942.10±531.42**C1 201558.20±475.701233.50±266.381673.00±122.13与空白对照组比较，**P＜0.01，***P＜0.001C1、C2、C3混合戒毒作用C1、C2、C3混合药品以10mg/kg剂量给吗啡依赖性大鼠，结果表明此三种混合药品可明显减轻急性戒断症状，减轻吗啡产生的地点偏爱效应。
材料与方法一.材料盐酸吗啡沈阳第一制药厂，10mg/ml。盐酸纳洛酮北京四环制药厂，0.4mg/ml。
正常雌性Wistar大鼠，体重150-200克，本校实验动物部提供。除指定处理方法外，大鼠正常饲养。
二.方法(一)动物分组及处理35只大鼠随机分成五组，每组7只，喂普通固体食料，自由饮水，同条件饲养。
第一组对照组，第1-7天每天两次腹腔注射生理盐水(注射体积及时间与当日实验组注射盐酸吗啡相同)；最后一次注射后断头处死。
第二组吗啡依赖组，第1-7天每天两次腹腔注射盐酸吗啡(9:00及21:00)，日剂量为第1、2日20mg/kg，第3日40mg/kg，第4日60mg/kg，第5日80mg/kg，第6日90mg/kg，第7日100mg/kg，第8日早9:00断头处死。
第三组吗啡戒断1组，吗啡注射情况与第二组相同；每次注射后立即进行吗啡相关的条件性位置偏爱训练；于实验第4、6、8日观察条件性位置偏爱情况(8:00)。第8日，腹腔注射4mg/kg盐酸纳洛酮，5-10分钟后戒断体征明显时断头处死(9:00)。
第四组吗啡戒断2组，F3、D2、B3混合药品以10mg/kg剂量灌胃组，每日灌胃两次(7:00及19:00)，日剂量为20mg/kg体重，其它处理及观察与第三组相同。
(二)行为观察1.戒断体征的观察及评定(作为吗啡身体依赖性评估指标)
吗啡戒断2组大鼠末次注射吗啡12h、第8日用纳洛酮催瘾，注射1分钟后开始观察，共观察10分钟。评定方法是(1).10分钟内齿颤和咀嚼次数、直立、寒战、跳跃、稀便次数，直接记录得分；(2).每2分钟评定1次上睑下垂、眨眼、竖毛体征，此期间内某征无为0分，严重为2分，连续评定5次，计算总分进行综合评价。
2.条件性位置偏爱实验(作为吗啡精神依赖性评估指标)装置60cm×30cm×30cm的实验箱，顶盖为透明玻璃。箱内中段有一块30cm高的抽动隔板，将实验箱分成两个相同体积的小箱。一侧小箱内侧各面涂成黑色，光滑底面另一侧小箱侧各面涂成白色，毛毯底面。两个小箱的顶部均为透明的玻璃板。
预实验建立条件反射前先对所有大鼠对两侧箱的天然偏爱情况进行观察，剔除对某侧有偏爱者。
动物的训练大鼠给予吗啡后，将动物放置于一侧箱中，视为吗啡侧；并封闭两箱间通道，1小时后将动物取出。同日间隔3小时给动物以生理盐水作对照剂，并将其放入另一侧箱中，1小时后将动物取出。
位置偏爱的观察自使用吗啡第二天开始，在每次给予吗啡后10-12小时，不给药的情况下，抽掉两箱间隔板，将动物放入两箱中部，使其可自由出入两侧实验箱，观察15min，记录其在某一侧箱中停留的时间。停留时间大于500秒的一侧被视为偏爱侧。
结果一、吗啡依赖及戒断大鼠条件性位置偏爱实验观察结果表7.条件性位置偏爱实验(n＝7，x ±s)时间(秒)组3 组4d4721.4±183.6 681.4±272.4d6667.1±153.4 588.3±232.5d8823±40.6 483±217.7**P＜0.05 Compared with Group3二、吗啡成瘾大鼠戒断症状观察结果表.8戒断体征次数.(n＝7，X XXXX±s)体征 跳跃 腹泻 竖毛 综合评价组315.236±4.5 3.142±1.235 2.867±0.989 7.2±17.9组46.8±2.1*1.142±0.76 0*46.7±13.5*p＜0.05 Compared with Group3结论1.吗啡戒断1组大鼠在第4、6、8天可见明显的吗啡相关的条件性位置偏爱。吗啡戒断2组，即注射吗啡当日以C1、C2、C3混合药品10mg/kg剂量灌胃，第8天无条件性位置偏爱。
2.吗啡戒断1组大鼠在戒断(纳洛酮催瘾)后几分钟内即产生强烈的戒断反应，各项观察指标评分均较高。吗啡戒断2组，即注射吗啡当日以C1、C2、C3灌胃组大鼠在整个戒断过程中的戒断反应均较吗啡戒断1组大鼠轻。
具体实施例方式实施例1将茉莉根粗粉15kg用5倍体积80％乙醇温浸超过48小时，过滤除去药渣，减压回收乙醇，水浴浓缩的醇浸膏1200g。
600g上述浸膏用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯得乙酸乙酯浸膏，酸水溶解后上硅胶柱层析，用氯仿∶丙酮＝10∶2洗脱剂洗脱，洗脱物上硅胶柱层析，洗脱剂为苯∶乙酸乙酯＝9∶1；洗脱物用甲醇∶氯仿＝1∶1重结晶，得白色粉末状单体成分C1(80mg)。
所得白色粉末状单体C1(80mg)经TCL分析，结构鉴定为齐墩果酸(oleanolic acid)。
实施例2将茉莉根粗粉15公斤，用6倍体积85％乙醇温浸48小时，过滤除去药渣，减压回收乙醇，水浴浓缩的醇浸膏1200g。
600g上述醇浸膏加5倍体积水溶液，2％硫酸溶液调pH5～6，60℃水浴2小时，浓缩，过滤，酸溶液用(1～5％)氢氧化钠调pH8～9，用氯仿萃取，回收水层。滤集析出的沉淀20g(待用)。
水层调中性，浓缩后上大孔树脂，水洗树脂后用80％甲醇洗脱，洗脱液浓缩得醇洗浓缩膏，酸水溶解后上硅胶柱层析，氯仿∶甲醇∶水＝8∶4∶1洗脱，洗脱物再上硅胶柱层析洗脱，洗脱液为氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水＝2∶4∶4∶1，洗脱物用氯仿∶甲醇＝1∶1重结晶得白色粉末状单体成分C3(40mg)。
所得白色粉末状单体成分C3(40mg)，经TCL分析，结构鉴定为3，5-二羟基喹啉-7-葡萄糖苷(3，5-dihydroxyquinoline-7-glycocide)。
实施例3将实施例2得析出的沉淀20g，酸水溶解后上硅胶柱层析，用氯仿∶甲醇∶水＝2∶6∶1洗脱，洗脱物用无水乙醇重结晶，得黄色絮状单体成分C2(55mg)。
所得黄色絮状单体成分(55mg)，经TCL分析结构鉴定为5，6-二氢-11-异丙氧基-8，9-亚甲二氧基-3，5-二氧杂屈(5，6-dihydro-11-isopropoxy-8，9-methylenedioxy-3，5-diazoanthracene)；制剂的制备方法1.茉莉根浸膏制剂将10％羧甲基纤维素钠，0.2％山梨醇，0.1％维生素C，2％茉莉根浸膏制备成混合液，分装10ml/支，105℃，10分钟，高压灭菌。
2. 2％C3生理盐水注射液将C3溶于生理盐水，超滤除菌，分装1ml/支。
3. 2％C2生理盐水注射液将C2溶于适量的5％HCl溶液中，再用NaOH调至pH7.0±2，用生理盐水配成2％D2溶液，超滤除菌，分装1ml/支。
权利要求
1.茉莉根有效成分茉莉根醇浸膏，通过以下步骤制备的取茉莉根粉碎成20目左右粗粉，加入3～10倍的50～90％乙醇提取，过滤并回收乙醇，水浴浓缩得浸膏和水浓缩液。
2.一种新化合物5，6-二氢-11-异丙氧基-8，9-亚甲二氧基-3，5-二氧杂屈；为黄色絮状结晶，分子式为C20H18N2O3，分子量为334，mp182-184℃(EtOH-H2O)，易溶于乙醇，微溶于氯仿；Molish反应阴性；Liebermann-Burchard反应阴性，其酸性水溶液与碘化铋钾试剂反应生成红棕色沉淀，与磷钨酸试剂反应生成褐色沉淀。
3.一种新化合物为3，5-二羟基喹啉-7-葡萄糖苷；为白色粉末，分子式为C15H17NO8，分子量为339，mp203-205℃(CHCl3-MeOH)，易溶于水、乙醇，微溶于氯仿。
4.茉莉根有效成分齐墩果酸的提取方法，包括以下步骤将权利要求1所得浸膏用乙酸乙酯提取，获得乙酸乙酯浸膏，滤集的析出沉淀和回收的水层待用；将乙酸乙酯浸膏用酸水解后，上硅胶柱层析，采用氯仿∶丙酮＝10∶2洗脱剂洗脱分离，后上硅胶柱层析，用苯∶乙酸乙酯＝9∶1洗脱剂洗脱分离，洗脱物用甲醇∶氯仿＝1∶1重结晶，得单体成分齐墩果酸。
5.权利要求2化合物的制备方法，将权利要求4滤集的析出沉淀用酸水溶解后，上硅胶柱层析，用洗脱剂氯仿∶甲醇∶水＝2∶6∶1洗脱，洗脱物用乙醇重结晶得单体成分化合物。
6.权利要求3化合物的制备方法，将权利要求4回收的水层调pH中性，浓缩后上大孔树脂，用50～90％甲醇洗脱，洗脱液浓缩得醇洗浓缩膏；用酸水溶液溶解醇洗浓缩膏后，上硅胶层析，洗脱剂为氯仿∶甲醇∶水＝8∶4∶1，洗脱物再上硅胶柱层析，洗脱剂为氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水＝2∶4∶4∶1。洗脱物用氯仿∶甲醇＝1∶1重结晶，得单体成分化合物。
7.一种以茉莉根醇浸膏、齐墩果酸、化合物5，6-二氢-11-异丙氧基-8，9-亚甲二氧基-3，5-二氧杂屈及化合物3，5-二羟基喹啉-7-葡萄糖苷为茉莉根有效成分单独或分别用于镇痛、镇静和戒毒的药物。
8.根据权利要求7所述的药物是以茉莉根有效成分和药学上可接受的载体或辅料组成的药物组合物。
全文摘要
本发明公开一种茉莉根有效成分及提取方法、用途，以茉莉根粗粉为原料，经溶剂、硅胶柱层析提取等过程分离获得茉莉浸膏及3个有效成分以茉莉根醇浸膏、齐墩果酸、化合物5，6－二氢－11－异丙氧基－8，9－亚甲二氧基－3，5－二氧杂屈及化合物3，5－二羟基喹啉－7－葡萄糖苷，作为茉莉根有效成分单独或分别用于镇痛、镇静和戒毒的药物或药物组合物。
文档编号A61K31/7042GK1524872SQ0311108
公开日2004年9月1日 申请日期2003年2月25日 优先权日2003年2月25日
发明者洪敏 , 曹瑞敏, 刘剑凯, 闰大勇, 洪 敏 申请人:洪敏 , 洪 敏