专利名称：一种老年性痴呆疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及用生物技术制备的疫苗及其制备方法，特别是一种老年性痴呆疫苗及其制备方法。
用Aβ42的完整片段作为免疫原，存在以下几个问题(1)Aβ42肽含有Aβ毒性片段(25～35位氨基酸)，其用作免疫原的安全性受到质疑；(2)Aβ的β片层结构是脑内Aβ沉积物和老年斑中Aβ多肽存在的重要形式，而人工合成的Aβ42需经过变构才具有较好的免疫原性；(3)Aβ42肽分子量＜10000，免疫原性差。
为实现上述目的，本发明采取以下设计方案一种合成肽Aβ42亚单位疫苗，它包括至少一条耦联到载体蛋白或载体多肽形成耦联物的含有Aβ42的中和表位的人工合成的多肽。其中，所述中和表位的人工合成的多肽可以是以下七种之一、或其中之二或更多种(1)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln(Aβ1～15)(2)Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala(Aβ36～42)(3)Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr(Aβ4～10)(4)Glu-Phe-Arg-His(Aβ3～6)(5)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg(Aβ1～5)(6)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu(Aβ1～11)(7)Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys(Aβ22～28)其中采一种的为单一亚单位疫苗，采两种或两种以上的为多联亚单位疫苗。
其中，耦联剂可以是载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)，或载体多肽多重抗原肽系统(multiple antigens peptide system，MAPs)，寡聚赖氨酸是一个理想的MAPs核心框架，如七聚赖氨酸(heptalysine)，因为七聚赖氨酸本身无抗原性，避免了载体蛋白如BSA带来的过敏反应，使免疫反应特异性更强，安全性更好；同时，由于其本身分子小，位于大分子复合物的核心，不会封闭抗原表位的活性。又如三聚赖氨酸，十二聚赖氨酸等。
为了适宜于注射，疫苗中还应该包括可接受的药用佐剂。如MF59(意大利政府1997年批准用于人体流感疫苗的佐剂)佐剂，铝佐剂等。
本发明制备合成肽Aβ42亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤(1)人工合成至少一条可耦联到载体蛋白或载体多肽形成耦联物的包含Aβ42的中和表位的人工合成的多肽；(2)将上述多肽分别耦联到载体蛋白或载体多肽上形成耦联物；(3)将上述耦联物配以可接受的佐剂制备成老年痴呆Aβ42亚单位疫苗。
其中人工合成多肽的方法一般从C端(羧基端)向N端在(氨基端)合成。以往的多肽合成是在溶液中进行的。现在多数采用固相合成法，选用多肽固态合成仪，在合成柱上合成，从而大大减轻产品提纯的难度。为了防止副反应的发生，合成柱和添加氨基酸的侧链是被保护的。羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。化学合成法多采用Fmoc法。
交联可以采用本领域的常用方法，如采用交联剂N-琥珀酰亚胺-M-马来酰亚胺基苯甲酸酯(MBS)交联，采用制备高效液相(HPLC)柱纯化，经质谱仪(MS)分析鉴定。
本发明选择Aβ42的某些片段作为免疫原，这样既去除了共有的毒性片断，从而改进疫苗结构，增强免疫原性，又保留了有效抗原决定簇。
实施例1 制备以中和表位1为基础的合成肽Aβ42亚单位疫苗，包括以下步骤(1)利用多肽固态合成仪人工合成中和表位1的多肽Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln(Aβ1～15)，过柱纯化到95％以上；(2)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimideester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育；经HPLC色谱纯化到95％以上；以灭菌的0.0lmol/L PBS(pH7.4)稀释抗原；(3)将耦联物配以等体积的MF59佐剂，用旋涡振荡器混匀约30min，制备成疫苗。
实施例2 制备以中和表位2为基础的合成肽Aβ42亚单位疫苗，包括以下步骤(1)人工合成中和表位2的多肽Val-Gly-Gly-Val-Val-lle-Ala(Aβ36～42)(2)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimideester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育；(3)将耦联物配以铝佐剂制备成疫苗。
实施例3 制备以中和表位3为基础的合成肽Aβ42亚单位疫苗，包括以下步骤(1)人工合成中和表位3的多肽Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr(2)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimideester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育；(3)将耦联物配以MF59佐剂制备成疫苗。
实施例4 制备以中和表位4为基础的合成肽Aβ42亚单位疫苗，包括以下步骤(1)人工合成中和表位4的多肽Glu-Phe-Arg-His(2)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimideester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育；(3)将耦联物配以MF59佐剂制备成疫苗。
实施例5 制备以中和表位5为基础的合成肽Aβ42亚单位疫苗，包括以下步骤(1)人工合成中和表位5的多肽Asp-Ala-Glu-Phe-Arg(2)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimideester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育；(3)将耦联物配以铝佐剂制备成疫苗。
实施例6 制备以中和表位6为基础的合成肽Aβ42亚单位疫苗，包括以下步骤(1)人工合成中和表位6的多肽Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu(2)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimideester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育；(3)将耦联物配以MF59佐剂制备成疫苗。
实施例7 制备以中和表位7为基础的合成肽Aβ42亚单位疫苗，包括以下步骤(1)人工合成中和表位7的多肽Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys(2)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimideester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育；(3)将耦联物配以铝佐剂制备成疫苗。
实施例8 制备以Aβ1-15和Aβ36-42为基础的合成肽多联疫苗，包括以下步骤(1)人工合成中和表位1的多肽Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln(2)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育，形成耦联物I；(3)人工合成中和表位2的多肽
Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala(4)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimideester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育，形成耦联物II；(5)将耦联物I与II按1∶1或1∶2摩尔比混合。
(6)将混合物配以MF59佐剂制备成疫苗。
实施例9 将实施例2的耦联剂由七聚赖氨酸换成牛血清白蛋白，其余其实施例2。
实施例10 实施例2及实施例9疫苗接种正常SD大鼠后的行为学观察试验。1材料与方法1.1实验动物 32只健康的成年3月龄雄性SD大鼠(SPF级，购自第一军医大学实验动物中心，动物质量合格证号码为粤检证字第2001A051号)，体重180-200g。饲养一周后，观察正常，然后随机分为4组实施例2组(MAP组)，实施例9组(BSA组)，Aβ42全肽组和对照组，每组各8只。1.2免疫接种 大鼠麻醉后固定在台上。消毒大鼠背部中线两侧的皮肤，用1.00ml的皮试针抽取抗原，沿背部中线两侧进行多点(15-20个点)皮下注射。首次接种后2周进行第二次加强注射，以后每隔1个月进行一次加强注射，总共接种4次，每只大鼠皮下接种的总体积为0.40ml。1.3间接ELISA法检测血清中和脑匀浆中抗Aβ42的滴度1.4行为学观察 整个实验过程中SD大鼠的行动和反应均正常。最后一次接种后一周采用Morris水迷宫方法检测SD大鼠的定位航行和空间探索能力。定位航行实验测试前一天将SD大鼠在水池中(不含平台)自由游泳2min，使其熟悉迷宫环境。试验共历时5天，每天分上、下午两个时间段(blocks)，每个时间段训练4次，每天共8次(trials)。测试时平台置于EN象限，鼠分别从东、南、西、北(E、S、W、N)四个象限面对池壁放入水池，记录该鼠找到平台所用的时间(逃避潜伏期，escape latenkcky)。大鼠找到平台后或120s找不到平台则由实验人员将其引上平台(潜伏期记为120s)，在平台上休息30s后，再行下一次测试。连续四天，共八个时间段。空间探索实验于第五天的第五次(紧接第四次)撤除平台，任选一入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录2min内大鼠的游泳路线。在整个测试中，水池周围参照物(迷宫外线索)包括实验者的位置不变，同时为消除外界声音干扰，室内持续播放强度适中的白噪音。主要比较各实验组逃避潜伏期和平台象限的游泳距离占总游泳距离的百分比。2结果2.1一般情况喂养过程中所有接种大鼠外观正常，毛发无改变，皮肤无溃疡，行动和行为反射均无异常，饮食、饮水和睡眠均正常，体重均增加。第四次接种后实验组大鼠的抗Aβ42抗体均达到1∶10000以上，而对照组为1∶100。经迅速解剖称重，脑、肝、脾、肾的主要脏器的湿重和HE形态学观察未发现改变。其湿重与对照组比较，无显著性差别。
Western Blotting实验表明实施2和实施例8血清中的抗体确实为特异性的抗Aβ42抗体。
免疫组化实验表明实施例2、实施例8和Aβ42组的血清中抗体能与老年性痴呆病人的脑切片的老年斑特异性结合。2.2血清和脑匀浆上清液中的抗体滴度第1次接种后各实验组均未能检测出特异性的抗Aβ42抗体，第2次接种后各实验组血清开始有抗Aβ42抗体产生，且随接种次数的增多，抗体滴度均逐渐增高；第2次所得血清中，MAP组和Aβ42组各有一只滴度为1∶12800；第3次所得血清中，MAP组有3只，BSA组有4只，Aβ42组有6只的滴度为1∶12800。各组大鼠血清和上清液的抗体的平均滴度见表1。表1疫苗接种后接种SD大鼠的血清和脑匀浆上清液中抗Aβ42抗体的平均滴度血 清 脑匀浆上清滴第一次 第二次对照组(control group) ＜1∶50 1∶110BSA组(BSA group) ＜1∶50 1∶259MAP组(MAP group) ＜1∶50 1∶951*ΔAβ42组(Aβ42group)＜1∶50 1∶1131**Δ血 清 脑匀浆上清液第三次 第四次对照组(control group) 1∶159 1∶110 1∶10BSA组(BSA group) 1∶8445**1∶25404**1∶476**MAP组(MAP group) 1∶5702**1∶15048**Δ 1∶1467**ΔΔAβ42组(Aβ42group)1∶10160**1∶17689**1∶4133**ΔΔ##与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与BSA组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与MAP组比较，##P＜0.01；2.3Morris水迷宫测试结果各接种组大鼠的逃避潜伏期曲线均呈下降趋势，表明SD鼠经训练后寻找平台的时间均缩短。分别对各接种组的总逃避潜伏期，进行两两比较，均无显著性差别(P＞0.05)；再各自对其前5次逃避潜伏期和后3次逃避潜伏期进行两两比较，同样地均无显著性差别(P＞0.05)。(各接种组的平均逃避潜伏期具体数值参见表2)表2接种大鼠的平均逃避潜伏期(秒)(S，X±SD)平均逃避潜伏期总逃避潜伏期前5次 后3次对照组(Control group) 29.62±8.88 34.68±6.29 21.18±5.14BSA组(BSA group)28.94±6.55 33.49±2.22 21.36±1.62MAP组(MAP group)26.34±8.19 31.06±6.24 18.48±2.84Aβ42组(Aβ42group) 30.40±6.43 34.55±3.83 23.50±1.08组间两两比较，均为P＞0.05。
以平台象限的游泳距离占总游泳距离的百分比判断大鼠的空间学习记忆能力，MAP组，BSA组，Aβ42组，对照组的百分比(％)分别为30.40±16.19，31.58±7.75，19.38±9.00，23.80±8.45。两两比较均无显著性差别(P＞0.05)。
从检测的血清和脑匀浆上清液结果来看，Aβ42亚单位(Aβ36～42)疫苗与Aβ42全肽疫苗一样，能产生高滴度的抗Aβ42抗体，而且在产生高滴度的特异性抗体的前提下，用药组的大鼠的学习和认知行为正常。而我们的实验结果表明脑、肝、脾和肾未发现病理性改变。表明Aβ42亚单位(Aβ36-42)有潜在的临床价值。
实施例1、3～8的试验表明，实施例1、3～8具有与实施例2、9相似的结果。本发明的多联疫苗可采用任何两、两联合或更多联合的方式，而不限于实施例8；实际上，实验表明，采用两两联合或更多联合的方式制成的多联疫苗，较单一亚单位制成的疫苗效果更佳。氨基酸列表(1)Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln1 5 10 15(2)Val Gly Gly Val Val lle Ala1 5(3)Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr1 5(4)Glu Phe Arg His1(5)Asp Ala Glu Phe Arg15(6)Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu15 10(7)Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys1权利要求
1.一种老年性痴呆疫苗，它包括至少一个耦联到载体蛋白或载体多肽形成耦联物的包含Aβ42的中和表位的人工合成的多肽。
2.根据权利要求1所述的一种老年性痴呆疫苗，其特征在于所述中和表位的多肽选自以下的一种或两种或更多种(1)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln(Aβ1～15)(2)Val-Gly-Gly-Val-Val-He-Ala(Aβ36～42)(3)Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr(Aβ4～10)(4)Glu-Phe-Arg-His(Aβ3～6)(5)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg(Aβ1～5)(6)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu(Aβ1～11)(7)Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys(Aβ23～38)
3.根据权利要求1或2所述的一种老年性痴呆疫苗，其特征在于疫苗还包括可接受的药用佐剂。
4.根据权利要求3所述的一种老年性痴呆疫苗，其特征在于药用佐剂为MF59佐剂。
5.根据权利要求3所述的一种老年性痴呆疫苗，其特征在于药用佐剂为铝佐剂。
6.一种老年性痴呆疫苗的制备方法，包括以下步骤(1)人工合成至少一条含有Aβ42的中和表位的多肽；(2)将上述多肽分别耦联到载体蛋白或载体多肽上形成耦联物，耦联物经孵育老化；(3)将上述耦联物配以可接受的佐剂制备成老年痴呆Aβ42亚单位疫苗。
7.根据权利要求6所述的一种老年性痴呆疫苗的制备方法，其特征在于所述中和表位的多肽选自以下的一种或两种或更多种(1)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln(Aβ1～15)(2)Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala(Aβ36～42)(3)Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr(Aβ4～10)(4)Glu-Phe-Arg-His(Aβ3～6)(5)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg(Aβ1～5)(6)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu(Aβ1～11)(7)Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys(Aβ22～28)
8.根据权利要求6或7所述的一种老年性痴呆疫苗的制备方法，其特征在于所述的载体多肽是寡聚赖氨酸。
9.根据权利要求8所述的一种老年性痴呆疫苗的制备方法，其特征在于所述的寡聚赖氨酸是七聚赖氨酸。
全文摘要
本发明涉及一种老年性痴呆疫苗及其制备方法，它包括至少一个耦联到载体蛋白或载体多肽形成耦联物的包含Aβ
文档编号A61K38/07GK1456353SQ0311404
公开日2003年11月19日 申请日期2003年3月31日 优先权日2003年3月31日
发明者姚志彬 申请人:姚志彬, 中山大学中山医学院科技开发中心, 中炬高新技术实业(集团)股份有限公司