专利名称：5,7,4'-取代黄酮在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及5，7，4’-取代黄酮的应用，具体地说，涉及5，7，4’-取代黄酮在制药领域中应用。
背景技术：
5，7，4’-取代黄酮是由中药凌宵花、茺蔚子、女贞子、荆芥、麻黄中提取或由提取物经化学修饰而获得，其结构通式如下 式中R1＝H，CH3，CH3CO或-C6H11O5(glucosyl，葡糖基)；R2＝H或-C6H11O5(rhammosyl，鼠李糖基)。
5，7，4’-取代黄酮目前已知医药用途是在制备抗肿瘤药中的应用，而将其应用于制备治疗或预防肝硬化的药品中未见报道。
发明内容
本发明目的在于，提供5，7，4’-取代黄酮的新的用途，即涉及5，7，4’-取代黄酮作为制备治疗或预防肝硬化的药品中的应用。
本发明所用的5，7，4’-取代黄酮均采用现有技术由中药凌宵花、茺蔚子、女贞子、荆芥、麻黄中提取或由提取物经化学修饰而获得，具体的提取和化学修饰方法参见<中草药>1981；12(8)372，Biochem Syst Ecol 1993；21(4)531，Anal Chem 1965211190，沈阳药学院学报1984；(1)44，中药通报1985；10(8)36，其中R1＝CH3CO，R2＝H的取代物由5，7，4’-三羟基黄酮与乙酰氯反应，再经硅胶柱sephadex LH-20分离制备。
为了更好地理解本发明的实质及方便说明，下面以5，7，4’-三羟基黄酮(俗称芹黄素，apigenin，缩写AP)为例，通过其的药理试验及结果来说明5，7，4’-三羟基黄酮在制药领域中的新用途。其它取代黄酮化合物均采用相同的药理试验方法且有相同的结论，限于篇幅，在此不一一例举。因此，下面所举例子并不限制本发明的保护范围。
1、芹黄素对SD大鼠实验性肝纤维化的保护作用。
以Sprague-Dawley(SD)大鼠(雌雄各半，体重164±30g)进行实验，实验共设阴性对照组(生理盐水)、阳性对照组(苦参碱)、芹黄素(AP)10mg/kg及50mg/kg组。均灌胃(ig)给药。
试验方法SD大鼠随机分组，皮下注射50％四氯化碳(tetrachloride，CCL4)-橄榄油0.1ml/kg，每周2次，制备大鼠肝纤维化模型，模型对照组仅注射橄榄油。阴性对照组、阳性对照组和药物组同时每日ig生理盐水，苦参碱50mg/kg以及芹黄素10mg/kg和50mg/kg。于实验第3，6，12周处死动物，取血制备血清测定丙氨酸转移酶(ALT)和透明质酸(hyaluronate，HA)；取肝脏组织进行病理检查以及测定肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline，HyP)。
试验结果(1)对血清中ALT、HA和HyP的影响在四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型中，3周时血清中ALT和HA明显升高，HyP未明显变化；6周和12周时ALT、HA和HyP均明显升高。在此基础上，观察AP对ALT、HA和HyP的影响。结果发现，芹黄素10和50mg/kg以及阳性对照组苦参碱50mg/kg均能显著降低升高的ALT、HA和HyP。(表1)。
表1芹黄素对血清中丙氨酸转移酶、透明质酸和肝脏羟脯氨酸的影响正常组 溶剂对照组芹黄素 芹黄素 苦参碱(模型组) 10mg/kg 50mg/kg 50mg/kg第3周ALT(U/L)157±16 555±178**425±64Δ350±28Δ406±89HA(ng/ml) 183±17 466±37** 362±76Δ295±102Δ334±31ΔΔHyP(μg/mg) 1.18±0.20 1.35±0.111.36±0.12 1.23±0.12 1.37±0.34第6周ALT(U/L)194±58 506±57** 336±28ΔΔ304±69ΔΔ374±70ΔΔHA(ng/ml) 181±48 451±80** 228±78ΔΔ191±67ΔΔ307±59ΔΔHyP(μg/mg) 1.23±0.72 4.85 ±2.92±0.32Δ2.28±0.64Δ3.15±1.031.76*第12周ALT(U/L)182±60 881±50** 644±35ΔΔ605±23ΔΔ685±58ΔΔHA(ng/ml) 169±33 448±78** 211±75ΔΔ184±82ΔΔ313±26ΔΔHyP(μg/mg) 1.33±0.51 6.28±2.27** 2.89±0.43Δ2.52±0.55Δ3.35±0.96Δ与正常组比较，**P＜0.01，与溶剂对照组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01(2)对肝脏病理变化的影响组织病理检查结果显示，在四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型中，3周时可见肝细胞大量变性、坏死及炎症细胞浸润；6周和12周时肝细胞变性、坏死且伴有成纤维细胞大量浸润，胶原纤维增生。芹黄素10和50mg/kg以及阳性对照组苦参碱均能显著减轻大鼠肝细胞变性、坏死和结缔组织形成(表2)。
表2 芹黄素对肝脏病理变化的影响变性坏死 炎性细胞浸润纤维组织增生3周 6周12周3周 6周12周3周6周12周正常组 -- - - -～+ -～+- - -溶剂对照组 ++～++ ++～++ ++ +++ - + ++～+++ +++AP 10mg/kg --～+ ++ -～++ + - -～+ +AP 50mg/kg --～+ + -～+-～+ + - -～+ -～+苦 参 碱 --～+ ++ -～++ + - -～+ +50mg/kg2、芹黄素对大鼠肝星状细胞增殖和胶原合成的作用。
试验方法HSC-T6细胞增殖试验 96孔细胞培养板每孔加入1×104个大鼠肝星状细胞HSC-T6，在37℃ CO2孵箱中孵育24h，然后加入100μl含有不同药物浓度和10％新生牛血清(NCS)的DMEM培养液或无药培养液(含最大药物浓度时的溶剂量)，继续培养48h后结晶紫染色法测定吸收度值D(595)。试验血小板衍生生长因子(PDGF)对细胞增殖的影响，则将细胞培养上清液弃去，加入含0.4％NCS的培养液孵育48h，然后加入药物与PDGF，再孵育24h，最后测定吸D(595)。
HSC-T6胶原合成的测定 采用3H-脯氨酸同位素法。将细胞浓度调整为2.5×105个/ml，在96孔板上每孔加100μl，培养24h使之形成单层，以消除细胞生长对胶原合成的影响。然后加入含50μg.ml-1的维生素C的药物与10％NCS或转化生长因子β1(TGFβ1)再培养48h，同时加入每孔[3H]-脯氨酸18.5kBq。细胞用胰酶消化后，收集于玻璃纤维滤纸上，用液闪仪测定细胞3H-脯氨酸掺入值(cpm)。
试验结果(1)芹黄素对血清促HSC-T6细胞增殖和胶原合成的影响芹黄素(6.25～50μmol.L-1)能显著浓度依赖地抑制10％的小牛血清刺激的HSC-T6细胞增殖以及胶原合成的作用，苦参碱2mmol.L-1也有同样的抑制作用(表3)。
表3芹黄素对血清刺激的HSC-T6细胞增殖和胶原合成的影响组别细胞增殖/胶原合成/[n＝6，D(595)] (n＝6，A/cpm)溶剂对照组 1.00±0.053089±258苦参碱2mmol.L-10.58±0.07**2172±241**芹黄素(μmol.L-1)6.25 0.98±0.113051±24712.5 0.84±0.02**2668±314*25.0 0.72±0.05**2288±425**50.0 0.46±0.08**2114±310**与溶剂对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01(2)芹黄素对PDGF促HSC-T6细胞增殖和TGFβ1促胶原合成的影响PDGF 10ng.ml-1能显著促进HSC-T6细胞增殖，增殖率为42.86％，TGFβ12ng.ml-1能增加细胞胶原合成，增加百分率为86.1％(P＜0.01)。芹黄素(6.25～50μmol.L-1)能浓度依赖地抑制PDGF和TGFβ1的作用，苦参碱2mmol.L-1也有同样的抑制作用(表4)。
表4 芹黄素对血小板源生长因子促HSC-T6细胞增殖和转化生长因子β1促胶原合成的影响组别 细胞增殖/ 胶原合成/[n＝6，D(595)](n＝6，A/cpm)DMEMa0.63±0.03 3688±255对照组b0.90±0.07++6717±699++苦参碱2mmol.L-10.64±0.07**3256±112**芹黄素(μmol.L-1)6.25 0.82±0.06*6538±48412.5 0.73±0.04**5328±159**25.0 0.64±0.02**3964±502**50.0 0.58±0.05**2909±347**a含0.5％ NCS，b含药物溶剂和PDGF(10ng.ml-1)或TGFβ1(2ng.ml-1)；与DMEM组相比，++P＜0.01，与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01本发明具有如下优点
(1)本发明发掘了已知化合物5，7，4’-取代黄酮的新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。
(2)本发明的5，7，4’-取代黄酮安全无毒，药理作用强，预示着很好的药用前景。
(3)提取本发明的5，7，4’-取代黄酮的原料来源丰富，提取技术成熟，并可做成口服剂型或注射剂型等，使用方便。
权利要求
1.5，7，4’-取代黄酮，其结构式如下 式中R1＝H，CH3，CH3CO或-C6H11O5(glucosyl)；R2＝H或-C6H11O5(rhammosyl)在制备治疗或预防肝硬化的药品中的应用。
全文摘要
本发明涉及5，7，4’－取代黄酮的新用途，所述的5，7，4’－取代黄酮是由中药凌宵花、茺蔚子、女贞子、荆芥、麻黄中提取或由提取物经化学修饰而获得，能明显抑制肝星状细胞增殖以及胶原合成，对实验性肝纤维化和肝硬化具有防治作用，等效剂量明显低于苦参碱。本发明拓宽了5，7，4’－取代黄酮的应用领域。
文档编号A61K31/352GK1526389SQ0311563
公开日2004年9月8日 申请日期2003年3月3日 优先权日2003年3月3日
发明者张俊平, 肖振宇, 谢天培 申请人:张俊平, 肖振宇, 谢天培