专利名称：1-庚醇在制备治疗急性和慢性脑血管痉挛药品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物用途发明领域，尤其是涉及1-庚醇在制备治疗急性和慢性脑血管痉挛药品中的应用。
背景技术：
1-庚醇(1-heptanol)(化学分子式CH3(CH2)6OH，分子量C7H16O＝116.20)为无色液体，有芳香气味，能与乙醚和乙醇混合，微溶于水。比重0.8187(25/4℃)，熔点-34.6℃，沸点175.8℃，折光率1.4224(25℃)，闪点170°F。
1-庚醇的通常用途有两种1、有机中间体，溶剂，香料；2、缝隙连接阻断剂，用于减少细胞间的物质传导，主要用于心脏、胚胎、肿瘤等研究。
目前缺乏有效治疗脑血管痉挛(CVS)的药物，现有的药物主要是钙离子拮抗剂(如尼莫地平等)，该类药物仅有预防脑血管痉挛形成的作用，对已形成的脑血管痉挛疗效不满意，尤其对慢性脑血管痉挛没什么作用。
发明内容
本发明的目的在于提供1-庚醇的新用途，即在制备治疗急性和慢性脑血管痉挛药品中的应用，它能有效抑制急性和慢性脑血管痉挛。
1-庚醇在治疗急性和慢性脑血管痉挛的作用机理为1-庚醇通过降低缝隙连接(GJ)的通透性，或关闭部分缝隙连接通道，抑制离子流、第二信使分子、电流在细胞间传递，从而减少参与收缩的平滑肌细胞数量，抑制平滑肌细胞收缩。
为了更好地理解本发明的实质，下面以动物实验和结果来证明1-庚醇的用途。
(一)材料与方法一、体外实验1.试剂与仪器氧合血红蛋白(OxyHb)、1-庚醇(1-heptanol，heptanol)，5-羟色胺(5-HT)购自西格玛(Sigma)公司，其余试剂为国产分析纯。
1-庚醇溶媒为乙醇。文中药物浓度均指浴槽中的终浓度。张力换能器及生理记录仪均为国产。
2.离体基底动脉环的制备新西兰大白兔(由江西医学院动物部提供)共16只，重2.5～3.0kg，雌雄各半。动脉注射空气处死动物后，立即断头取脑，置入4℃的克氏(Krebs)液中，同时通入混合气体(95％O2和5％CO2)，在显微镜下分离基底动脉，去除周围的蛛网膜，将其剪成3～4mm的动脉环，共取64个动脉环，用随机数字表法分组。用穿钢丝法去除内皮，再用直径0.1mm的不锈钢丝穿入并悬挂于盛有20ml克氏液的浴槽中，通入混合气体，温度维持在37.0±0.5℃，pH值为7.4～7.5。每20min更换一次液体(除加试剂后需连续观察变化)。钢丝下端固定，上端连于张力换能器，用生理记录仪记录血管环张力变化。保持400mg的前负荷，稳定90min后，加入40mol/L氯化钾(KCl)溶液200μl，取反应良好的血管环用于实验，每次添加药物量≤200μl，累计不超过1ml。
3.实验方法为证实已除内皮细胞，所有血管环均先用5-羟色胺(10-5mol/L)致其收缩，再加入乙酰胆碱(10-4mol/L)，证实收缩无变化后，方继续下列实验。
(1)实验组分处理组和预处理组1-庚醇处理组(n＝16)先加入10-4mol/L氧合血红蛋白或60mmol/L K+，使血管环收缩，记录两者最大收缩值，稳定2～3min后，从低浓度到高浓度(10-4～10-2mol/L)累积加入1-庚醇，记录10min内各浓度舒张幅度。并将其分别与处理前最大收缩值相除，得到舒张率(R)，绘制浓度-反应曲线。
1-庚醇预处理组(n＝20)先将血管环用10-4mol/L氧合血红蛋白或60mmol/L K+作用达最大值，冲洗并恢复基线稳定1h，再分别用2×10-4、3×10-4、5×10-4mol/L 1-庚醇作用10min，并记录10min内各浓度对血管静张力的影响。随后，加入10-4mol/L氧合血红蛋白或60mmol/L K+记录最大收缩值。并将3×10-4mol/L浓度的每分钟收缩值(共5min)与处理前最大收缩值相比，绘制时间-收缩反应曲线，与未处理组同时间内反应曲线相比较，观察1-庚醇对氧合血红蛋白引起收缩的时相改变。
(2)对照组分未处理组和溶媒组未处理组(n＝5)仅10-4mol/L氧合血红蛋白或60mmol/L K+作用于血管环，不使用1-庚醇处理或预处理，记录30min内的反应曲线。
溶媒对照组(n＝6)方法同实验组，但仅用溶解1-庚醇所需浓度的等量乙醇处理或预处理血管环。
二、体内实验1.材料新西兰大白兔(由江西医学院动物部提供)共23只，雌雄各半，7-8个月龄，体重2.5-3.0公斤。
2.试剂与仪器1-庚醇购自西格玛公司，照影剂欧乃派克(OMNIPAQUE)(350mg/ml)为丹麦生产，其余试剂为国产分析纯。数字减影血管造影机(DSA)为日本岛津产；5F导管为特鲁默(Terumo)(日本)公司生产；高压注射器马克(MARK)五型(V PLUS)，为麦德莱德(MEDRAD)(美国)公司生产。
3.兔二次蛛网膜下腔出血模型的建立用3％戊巴比妥钠麻醉(1ml/kg)后，用6号针行枕大孔穿刺，见清亮脑脊液流出后，缓慢注入自体非抗凝血0.5ml/kg，立即将兔头低30度，持续5min。次日，依同法注血，建立二次蛛网膜下腔出血(SAH)模型。
4.兔全脑血管造影兔麻醉后仰卧于操作台上，切开皮肤，分离股动脉，将5F导管插入后，在透视下将其送至主动脉弓左锁骨下动脉开口处，导管连接高压注射器，以1ml/s(50PSI的压力)，推注造影剂8ml，并摄片(6桢/秒)。分别在显影的基底动脉的两端、中点及中点与两端的中点取5处测量血管直径，求均数记为基底动脉直径(D)。
5.实验分组将兔随机分为实验组和对照组。
(1)实验组又分为A组(n＝7)，即动脉给药组(处理组)当天(Day0)行全脑血管造影，记录正常基底动脉直径(D0A)，第一天(Day1)枕大池注血0.5ml/kg，30min后行全脑血管造影，记录急性期基底动脉痉挛直径(D1A)。立即动脉给1-庚醇0.2mmol/kg，10min后再次行脑血管造影，记录急性期药物处理后血管直径(D1A’)。第二天(Day2)重复每一天(Day1)操作(注血、动脉给药)，但不造影。第七天(Day7)行脑血管造影，记录药物处理后慢性期痉挛血管直径(D7A)。
B组(n＝7)，即池内给药组(预处理组)当天(Day0)行全脑血管造影，记录正常基底动脉直径(D0B)，第一天(Day1)枕大池给1-庚醇0.02mmol/kg，10min后枕大池注血0.5ml/kg，30min后行全脑血管造影，记录预处理后急性期痉挛基底动脉直径(D1B’)。第二天(Day2)重复第一天(Day1)操作，但不造影。第七天(Day7)行脑血管造影，记录预处理后慢性期痉挛血管直径(D7B)。
(2)对照组(n＝9)，即假处理组方法同实验组，也分动脉给药和池内给药组，但药物用生理盐水代替。记录动脉给药组注血前正常基底动脉直径(D0a)，痉挛急性期血管直径(D1a)，假处理后急、慢性期基底动脉直径(D1a’，D7a)。池内给药组注血前正常基底动脉直径(D0b)，假处理后急、慢性期基底动脉直径(D1b’，D7b)。
(二)结果一、体外实验1.氧合血红蛋白对基底动脉环有明显收缩作用，加入氧合血红蛋白后，动脉环立即收缩，在2min内即可达最大收缩值的80％左右，至5～6min时达到峰值，并可持续稳定30min以上(见图1a)。
2.60mmol/L K+对动脉环的收缩作用强烈，1min即可达最大收缩值，并可持续稳定15min。
3.1-庚醇处理组10-4～10-2mol/L1-庚醇可以阻断10-4mol/L氧合血红蛋白和60mmol/L K+引起的动脉环收缩，其舒张强度呈浓度依赖关系(见图2)。1-庚醇在10-4mol/L时即有舒张作用，而10-3～10-2mol/L时舒张作用强烈，可完全逆转氧合血红蛋白所引起的血管收缩(见图1b)。另外，相同浓度的1-庚醇对10-4mol/L氧合血红蛋白和60mmol/L K+的舒张幅度有所差别，对氧合血红蛋白的阻断作用更加明显，当浓度为5×10-4～10-3时，两者差异有显著意义(P＜0.01，见图2)。
4.1-庚醇预处理组5×10-4mol/L 1-庚醇预处理血管环后，能明显抑制10-4mol/L氧合血红蛋白和60mmol/L K+所引起的血管环收缩(P＜0.01，表1)。低浓度(≤2×10-4mol/L)1-庚醇则作用不明显(表1)。介于两浓度之间的3×10-4mol/L1-庚醇预处理的血管环，对高K+引起的收缩无影响，但能抑制氧合血红蛋白引起的收缩(表1)。该浓度1-庚醇预处理后的收缩时相显示，氧合血红蛋白引起的收缩幅度与未处理组相比有明显下降，但对整个收缩反应过程无影响(见图3)。
表1 heptanol预处理组用heptanol预处理前后动脉环对OxyHb和K+致痉的张力变化(单位克**表示预处理前后有差异，p＜0.01hepheptanol)heptanol(mol/L)2×10-43×10-45×10-4K+2.06±0.372.17±0.33 2.06±0.23**hep+K+2.25±0.522.05±0.30 1.53±0.31**OxyHb 1.70±0.331.72±0.43**1.77±0.38**hep+OxyHb 1.80±0.231.17±0.31**0.74±0.30**5.每次实验经充分洗脱后，血管环的反应性可完全恢复。
6.当1-庚醇浓度在5×10-4mol/L以下时，对正常血管环静张力无影响。
7.溶媒对照组和未处理组各反应曲线无差异。排除了相应浓度的乙醇或克氏液可能对氧合血红蛋白和高K+引起血管环收缩的影响。
二、体内实验1.A组、B组和对照组注血前正常基底动脉直径(D0)三组间无显著差异(P＞0.05)。
2.成功建立兔二次蛛网膜下腔出血模型(见图4)。对照组的动脉给药组中，枕大池注血后30min基底动脉明显痉挛，D0a与D1a有显著差异(P＜0.001，表2)；给生理盐水后基底动脉痉挛无明显变化，D1a’与D1a无显著差异(P＞0.05)；第七天基底动脉痉挛更明显，D7a与D1a有显著差异(P＜0.01，表2)；对照理组的池内给药组中，枕大池预先给予生理盐水后再注血，急性期基底动脉痉挛明显，D1b’与D0b有显著差异(P＜0.001，表3)；第7d基底动脉痉挛更明显，D7b与D1b’有显著差异(P＜0.01，表3)。
3.动脉内注入缝隙连接(GJ)阻断剂1-庚醇能明显缓解SAH引起的急性、慢性CVS(见图5)。在动脉给药组中，枕大池注血后30min基底动脉明显痉挛，D1A与D0A有显著差异(P＜0.001，表2)；动脉给药后基底动脉明显扩张，D1A’与D1A有显著差异(P＜0.001，表2)；第七天基底动脉痉挛不明显，D7A与D0A无显著差异(P＞0.05)，与注血后30min急性痉挛的基底动脉直径(D1A)相比有明显扩张，D7A与D1A有显著差异(P＜0.01，表2)。
表2动脉给药对急、慢性基底动脉痉挛直径的影响(单位mm)D0 D1 D1’ D7动脉给药组0.722±0.094*0.150±0.144*’+’**0.677±0.133+0.622±0.263**对照组(生理盐水) 0.703±0.159*0.204±0.159*’**0.210±0.135 0.056±0.081***痉挛急性期与正常基底动脉直径相比有显著差异(p＜0.001)，+动脉给heptanol后10min与痉挛急性期基底动脉直径相比有显著差异(p＜0.001)，**痉挛慢性期与痉挛慢性期基底动脉直径相比有显著差异(p＜0.01).D0正常基底动脉直径，D1急性期基底动脉痉挛直径，D1’动脉给药后急性期血管直径，D7动脉给药后慢性期血管直径。
4.1-庚醇池内预处理能显著抑制二次蛛网膜下腔出血(SAH)后急性、慢性脑血管痉挛(CVS)的形成(见图6)。池内给药组中，枕大池预先给予1-庚醇后再注血，急性期基底动脉痉挛不明显，D1B’与D0B无显著差异(P＞0.05，表3)；次日再次给药、注血，第七天基底动脉直径虽稍有缩小，但D7B与D0B或D1B’相比，无显著差异(P＞0.05，表3)。
表3 池内预处理对急、慢性基底动脉痉挛直径的影响(单位mm)D0 D1’ D7池内预处理组0.631±0.206+0.555±0.053+0.522±0.184+对照组(生理盐水)0.703±0.159*0.225±0.143*’**0.056±0.081***假处理后痉挛急性期与正常基底动脉直径相比有显著差异(p＜0.001)，**假处理后痉挛慢性期与痉挛慢性期基底动脉直径相比有显著差异(p＜0.01)，+池内给heptanol后急、慢性期基底动脉直径与正常基底动脉直径相比无显著差异(p＞0.05).D0正常基底动脉直径，D1’池内给药后急性期血管直径，D7池内给药后慢性期血管直径.
5.动脉给药组及预处理组治疗后，急性、慢性期基底动脉直径间无显著差异，与对照组比较，有显著差异。动脉给药组与对照组二次蛛网膜下腔出血(SAH)后30min治疗前急性期基底动脉直径(D1)间无差异，D1A与D1a间差异无显著性(P＞0.05)；动脉给药组较池内预处理组治疗后急性期血管直径(D1’)扩张明显，但差异无显著性(P＞0.05)；池内预处理组D1B’与假处理组D1b’有显著差异(P＜0.001)；SAH后第七天慢性期基底动脉直径D7间有差异，假处理组D7a与动脉给药组D7A和假处理组D7b与预处理组D7B差异有显著性(P＜0.001)，但预处理组D7B与动脉给药组D7A差异无显著性(P＞0.05)。
综上所述，本发明经体外实验证实，缝隙连接阻断剂1-庚醇能显著抑制氧合血红蛋白引起的动脉环持续收缩；体内实验证实，动脉注入1-庚醇对实验动物的急、慢性脑血管痉挛有显著治疗作用，池内预先注入1-庚醇能有效抑制急、慢性脑血管痉挛的形成。
图1a为对照组，氧合血红蛋白对血管环的致痉作用纪录原图；图1b为处理组，不同浓度1-庚醇对氧合血红蛋白致痉的抑制作用纪录原图；
图2为1-庚醇处理组，不同浓度1-庚醇对氧合血红蛋白和K+致痉的抑制作用；图3为1-庚醇预处理组，氧合血红蛋白引起血管环的收缩-反应曲线图；图4为对照组脑血管造影片(箭头所示为基底动脉)。A正常基底动脉B注血后30min急性期痉挛基底动脉CDay7慢性期痉挛基底动脉图5为动脉给药组脑血管造影片(箭头所示为基底动脉)。A正常基底动脉B注血后30min急性期痉挛基底动脉C动脉给药后急性期基底动脉DDay7动脉给药后慢性期基底动脉图6为池内预处理组脑血管造影片(箭头所示为基底动脉)。A正常基底动脉B池内预处理后急性期基底动脉CDay7池内预处理后慢性期基底动脉。
具体实施例方式
下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。
实施例用本技术领域公知的方法，以乙醇为溶媒，制成1-庚醇注射液。
权利要求
1.1-庚醇在制备治疗急慢性脑血管痉挛药品中的应用。
全文摘要
本发明涉及1－庚醇在制药领域中的新用途，即1－庚醇在制备治疗急慢性脑血管痉挛药品中的用途。通过动物实验证实了1－庚醇在治疗急性和慢性脑血管痉挛都有效。该物质通过降低缝隙连接的通透性，或关闭部分缝隙连接通道，抑制离子流、第二信使分子、电流在细胞间传递，从而减少参与收缩的平滑肌细胞数量，抑制平滑肌细胞收缩。
文档编号A61K31/045GK1486688SQ03129308
公开日2004年4月7日 申请日期2003年6月12日 优先权日2003年6月12日
发明者洪涛, 汪阳, 蒋丽萍, 高子云, 江志群, 辜斌, 迟海波, 洪 涛 申请人:洪涛, 洪 涛