专利名称：紫锥松果菊提取物的抗sars作用及其药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及中草药的提取、筛选及活性研究，具体涉及紫锥松果菊抗SARS活性部位的提取、筛选及其药物组合物。
背景技术：
紫锥松果菊(Echinacea purpurea (L)Muench，简称紫锥菊)是菊科松果属植物，紫苑家簇，主要分布在北美草原地区。80年代后在新西兰、欧洲及我国等地进行了引种栽培。紫椎花是极受欢迎的天然草药，广泛地用于医疗、化妆品和日常饮料中，其成分包括精油、多糖类、葡糖、多炔、甜菜碱、倍半萜烯等；此外，亦含有铜、铁、单宁酸、蛋白质、脂肪酸，以及维生素A、C及E。紫锥花的活性成分能促使人体增加T细胞的数目，增强免疫力。除有助于预防上呼吸道的感染、感冒发烧外，紫锥花亦有助于减轻皮肤感染症状，例如蚊叮虫咬、粉刺、湿疹等。大量研究证实，紫锥花能增强及刺激人体免疫系统，有助于消炎杀菌，抵抗病毒。对发烧、流感、过敏症、关节炎、喉咙发炎等病症，紫锥花均有预防及治疗效用。在众多草药中，紫锥花作为很有价值的免疫调节剂而倍受关注。它的药理活性归因于咖啡酸衍生物如紫锥菊甙(echinocoside)、菊苣酸(cichoric acid)、绿原酸(chlorogenic acid)(图1)，以及亲脂性聚乙炔类衍生物如烷基酰胺类(alkylamides)包括异丁酰胺类(isobutylamides)(图2)以及其他水、醇提取物。
有人报道，在可见光和紫外光下，紫锥菊的提取物有体外抗I型单纯疱疹病毒作用，正己烷提取物的最小抑菌浓度(MIC)＝0.12mg/mL，菊苣酸(cichoric acid)的MIC为0.045mg/mL。含紫锥的Chizukit N可使健康人血中单核细胞产生细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的量下降。紫锥菊新鲜压榨的汁可激活免疫系统，0.012mg/ml即可使巨噬细胞产生IL-1，TNF-α、IL-6和IL-10。紫锥菊可通过增加抗原特异性免疫球蛋白的产生增强免疫反应。菊苣酸(cichoric acid)在体内体外均显示具有噬菌活性，而紫锥菊甙(echinocoside)兼有抗菌和抗病毒活性。最近的研究表明，菊苣酸具有抑制透明质酸酶的作用，保护胶原质III不形成游离基，防止其降解。紫锥菊的亲脂性成分聚乙炔类烷基酰胺(如异丁酰胺)及糖蛋白和多聚糖也有免疫调节活性。当测试紫锥松果菊的地上部分和根部的醇提取物的噬菌活性时，烷基酰胺表现出很高的活性。大部分的烷基酰胺有抑制环氧化酶的作用，同时也抑制5-脂氧酶。这与传统使用这种植物治疗炎症性疾病是一致的。
传染性非典型肺炎称为严重急性呼吸综合征(Severe AcuteRespiratory Sydrome，SARS)。研究发现，其病因极可能是一种新型的冠状病毒，在香港和加拿大的病人和死亡病人的尸体中都分离出了这种病毒，在一些SARS病人的血清中也发现了抗hMPV的抗体。2003年4月16日，世界卫生组织(WHO)正式确认SARS病毒是传染性非典型肺炎的病因。SARS病人的呼吸道切片和细胞培养物的电子显微镜照片显示，存在冠状病毒颗粒。这是一种新型的冠状病毒，与冠状病毒属中其他已知的成员不同，该病毒可引起绿猴肾细胞(VERO-E6)发生病变效应，病毒复制能够被SARS感染康复人的血清所抑制，可以利用感染的细胞和康复病人的血清进行免疫荧光检测法(Immunofluorescence assays，IFA)检测培养细胞中细胞感染有SARS病毒的情况，该方法表现出特异性的反应。基因组测序和生物信息学分析表明，SARS-CoV病毒主要含有以下功能蛋白聚合酶、穿刺(Spike，S)糖蛋白、小信封(E)蛋白、基质(M)蛋白、核衣壳(N)蛋白以及类3C(3CL)蛋白酶。本申请人在另一项专利申请CN03129067.1中公开了通过分子模拟获得的SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的三维结构，并以此为药物作用靶标用虚拟筛选方法筛选了现有药物数据库。通过将紫锥松果菊提取物进行分子和病毒水平测试，发现其具有抑制SARS-CoV病毒3CL蛋白酶和抗SARS-CoV病毒活性，并用计算机模拟了其中主要成分和SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的作用方式，从而促进了本发明的进行。
本发明的一个目的是提供紫锥松果菊提取物抗SARS-CoV病毒的新用途。
本发明的另一个目的是提供含紫锥松果菊提取物的抗SARS药物组合物。
发明内容
本发明的一个方面是提供紫锥松果菊提取物抗SARS-CoV病毒的新用途。
1.计算机模拟紫锥松果菊提取物的主要成分和SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的作用方式选择3CLpro蛋白催化活性残基H41和C145周围6范围内的残基组成底物结合口袋作为虚拟筛选的模型，结合口袋的表面图见图3。用分子对接(Molecular Docking)虚拟筛选(Virtual Screening)方法，将紫锥松果菊提取物中的咖啡酸衍生物如紫锥菊甙(echinocoside)、菊苣酸(cichoric acid)、菜蓟菊(cynarin)对接到3CLpro蛋白的结合口袋。紫锥菊甙(echinocoside)、菊苣酸(cichoric acid)、菜蓟菊(cynarin)与3CLpro蛋白结合方式见图3。
2.紫锥松果菊粗提物的提取方法将植物紫锥松果菊的地上部分和根部用95％乙醇渗滤，回收乙醇。浓缩液用水混悬后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。
3.病毒细胞水平的筛选以Vero-E6细胞作为病毒宿主细胞(易感细胞)，测试紫锥松果菊粗提物对病毒感染细胞的保护作用，检测指标为细胞变性反应(CPE)以及观察感染细胞保护率。结果表明紫锥松果菊粗提物有较明显的抑制SARS-CoV病毒感染Vero-E6细胞的作用。
本发明的另一个方面是提供抗SARS药物组合物，所述药物组合物包含有效量的紫锥松果菊提取物和一种或几种药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的药物组合物还可包含维生素C，其中紫锥松果菊提取物与维生素C的重量比为10∶1-1∶10。
本发明的药物组合物可制成不同的剂型，例如口服剂型，如片剂、胶囊、乳剂、溶液等，也可制成制成固体分散片、脂质体制剂、靶向制剂和控释制剂等。口服剂型中的典型药物载体或赋形剂包括乳糖；淀粉及其衍生物，如玉米淀粉、羧甲基淀粉钠等；纤维素衍生物，诸如甲基和乙基纤维素；明胶；无机类化合物如轻质氧化镁、滑石粉等；油，诸如植物油、芝麻油等；包合剂如β-环糊精；以及二元醇类如聚乙二醇。
在片剂中，本发明的药物组合物可与碳酸氢钠和酒石酸或枸橼酸混合组成的崩解剂一起制成泡腾片，当遇水时产生二氧化碳气体使片剂迅速崩解。
本发明的药物组合物还可制成注射剂，所述注射剂中的典型药物载体或赋形剂包括等渗盐水、5％葡萄糖水溶液、注射用水、茶油、大豆油、麻油、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、苯甲酸苄酯、吐温80、卵磷脂、脱氧胆酸钠、蛋黄磷脂、聚乙烯吡咯烷酮、醋酸、醋酸钠、枸橼酸及钠盐、乳酸、酒石酸及钠盐、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠和碳酸钠、明胶、羧甲基纤维素钠、果胶、山梨醇溶液、肌酐、甘氨酸、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚磷酸钠、硫代硫酸钠、苯甲醇、对羟基苯甲酸丁酯及乙酯酚、三氯叔丁醇、脑磷脂、大豆磷脂等。注射制剂的典型形式为粉针剂、混悬型注射剂等。
本发明的药物组合物也可制成气雾剂，例如采用聚氯乙烯糊状树脂苯二甲酸二丁酯、苯二甲酸二辛酯、硬脂酸钙、硬脂酸锌等配制而成气雾剂。
本发明药物组合物的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、病症的严重程度、服药时间等。
图1示出了紫锥松果菊提取物的亲水性成分。式(1)为菊苣酸，式(2)为绿原酸，式(3)为紫锥菊甙。
图2示出了紫锥松果菊提取物的亲脂性成分。式(4)为十一碳-2E，4Z-二烯-8，10-二炔酸异丁酰胺，式(5)为十一碳-2Z，4E-二烯-8，10-二炔酸异丁酰胺，式(6)为十二碳-2E，4Z-二烯-8，10-二炔酸异丁酰胺，式(7)为十三碳-2Z，7Z-二烯-10，12-二炔酸异丁酰胺，式(8)为十二碳-2E，4Z-二烯-8，10-二炔酸甲基丁酰胺，式(9)为十二碳-2E，4E，8Z，10E-四烯酸异丁酰胺，式(10)为十二碳-2E，4E，8Z，10Z-四烯酸异丁酰胺，式(11)为十二碳-2E，4E，8Z-三烯酸异丁酰胺，式(12)为十一碳-2Z-烯-8，10-二炔酸异丁酰胺，式(13)为十一碳-2E-烯-8，10-二炔酸异丁酰胺。
图3为计算机模拟紫锥松果菊提取物的主要成分与SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的作用方式示意图。(A)示出了CLpro蛋白和底物的结合模式；(B)-(D)分别示出紫锥菊甙(echinocoside)、菜蓟菊(cynarin)和菊苣酸(cichoric acid)(CPK模型表示)契合在结合口袋中。
具体实施方案下面的实施例是对本发明进行说明的优选实施方案，这些实施例绝不是对本发明的任何限制。
实施例1紫锥松果菊粗提物的提取方法将植物紫锥松果菊地上部分和根部用95％乙醇渗滤，回收乙醇。浓缩液用水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。
多糖的提取将植物紫锥松果菊地上部分和根部与0.1％-50％乙醇(w/w)混合，在20℃-80℃提取48小时-14天。将提取液液减压浓缩，然后加入95％乙醇沉淀，过滤沉淀，真空干燥，得多糖粗提物。
富含烷基酰胺类化合物部位的提取将植物紫锥松果菊地上部分和根部与50％-90％乙醇(w/w)混合在4℃-85℃提取24小时-7天。将提取物减压浓缩至干，加入20-30％乙醇搅匀，放置，析出叶绿素，过滤。减压浓缩滤液，除去乙醇，用乙酸乙酯萃取水液，得富含烷基酰胺类化合物的部位。
富含菊苣酸等咖啡酸衍生物部位的提取将乙醇提取液减压浓缩，除去乙醇，依次用氯仿和正丁醇萃取剩余水液，减压浓缩正丁醇萃取液，得富含菊苣酸等咖啡酸衍生物的部位。
实施例2 紫锥松果菊提取物保护Veto-E6感染SARS-CoV病毒测试以Vero-E6细胞作为病毒宿主细胞(易感细胞)，测试样品对病毒感染细胞的保护作用，检测指标为细胞变性反应(CPE)以及感染细胞保护率。
把Vero-E6细胞接种于96孔培养板，置37℃、5％CO2孵箱培养，分别加入SARS病毒和不同稀释浓度的紫锥松果菊提取物，设病毒对照、细胞对照和样品对照。每日镜下观察结果，记录CPE，并用中性红染色测定OD值，参照对照进行样品抗SARS病毒活性作用的计算和评价。测试结果见表1。
表1.不同浓度紫锥松果菊粗提物对防止Vero-E6细胞感染SARS-CoV病毒的保护率浓度(μg/ml)CPE 感染细胞保护率100 + 2.2520 ++ 1.704 ++++ 0.85细胞病变法(CPE)以加号表示细胞病变程度，＜25％+，25％~50％++，50％~75+++，＞75％++++。
感染细胞保护率通过比较病毒对照、细胞对照和样品对照的OD值，计算样品对病毒感染细胞的保护活性，保护率＞1.5倍率，初步被认为样品对病毒感染细胞具有一定的保护活性。
*样品细胞毒性如果样品的细胞毒性与细胞对照比＞50％时，不做CPE评价和保护率计算。
实施例3 计算机模拟紫锥松果菊提取物的主要成分和SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的作用方式三维结构模建采用InsightII的MODELLER软件，并用3D-Profile和Prostat软件评价结构模型的质量。获得复合物的初始结构，再用分子力学进行优化，采用的力场参数到Amber力场和Kollman-all-atom电荷。用分子对接(Molecular Docking)虚拟筛选(Virtual Screening)方法，将紫锥松果菊的提取物中的咖啡酸衍生物如紫锥菊甙(echinocoside)、菊苣酸(cichoricacid)、菜蓟菊(cynarin)对接到3CLpro蛋白的结合口袋(见图3)。
实施例4 含紫锥松果菊提取物的药物组合物制剂例例一紫锥松果菊提取物400克维生素C 400克羟丙基纤维素20克微粉硅胶60克预胶化淀粉 120克硬脂酸镁 适量制成1000粒将紫锥松果菊提取物、维生素C、羟丙基纤维素和微粉硅胶混合均匀，用10％预胶化淀粉浆作为粘合剂，湿法制粒，烘干，加入适量硬脂酸镁混合，压制成片剂。
例二紫锥松果菊提取物 80克维生素C 720克羟丙基纤维素 20克微粉硅胶 48克乙醇 适量硬脂酸镁 适量制成 900个将紫锥松果菊提取物、维生素C、羟丙基纤维素和微粉硅胶混合，用适量70％乙醇做湿润剂，湿法制粒，过40目筛选成颗粒，烘干，加入硬脂酸镁，混合，装入硬胶囊。
例三紫锥松果菊提取物800克维生素C 400克蔗糖40克防腐剂 适量蒸馏水 适量制成20000ml
取蒸馏水适量，加入紫锥松果菊提取物，边加热边搅拌使溶解，过滤，再加入维生素C。另将蔗糖和防腐剂用蒸馏水加热溶解，在搅拌下缓缓加入上述溶液中，加蒸馏水至全量，混合，冷藏，过滤，灌封，灭菌，得口服液。
例四紫锥松果菊提取物2400克维生素C 400克吐温80 适量注射用水适量制成45000ml取适量注射用水，加入紫锥松果菊提取物，加热，搅拌使充分溶解，加入4％吐温80，充分搅匀，过滤，加盐酸调pH至6.8，再加入维生素C，加注射用水至足量，中空纤维超滤，精滤，灌封，灭菌，得注射液。
权利要求
1.紫锥松果菊提取物在制备抗SARS-CoV病毒感染的药物上的用途。
2.抗SARS药物组合物，包含有效量的紫锥松果菊提取物和一种或几种药学上可接受的载体或赋形剂。
3.如权利要求2所述的药物组合物，其中还包含维生素C，紫锥松果菊提取物与维生素C的重量比为10∶1-1∶10。
4.如权利要求2或3所述的药物组合物，所述药物组合物是片剂、胶囊剂、口服液或注射剂。
全文摘要
本发明进行分子模拟紫锥松果菊提取物的主要成分和SARS－CoV病毒3CL蛋白酶的作用方式，测试紫锥松果菊提取物防止Vero－E6细胞受SARS－CoV感染的作用，揭示了紫锥松果菊提取物在制备抗SARS－CoV病毒感染的药物上的新用途。本发明还提供抗SARS药物组合物，所述药物组合物包含有效量的紫锥松果菊提取物和一种或几种药学上可接受的载体或赋形剂，较佳地还包含维生素C，紫锥松果菊提取物与维生素C的重量比为10∶1－1∶10。
文档编号A61P31/00GK1476836SQ0312924
公开日2004年2月25日 申请日期2003年6月10日 优先权日2003年6月10日
发明者柳红, 蒋华良, 赵维民, 左建平, 庄贤韩, 沈旭, 沈建华, 罗小民, 杨以阜, 陈凯先, 沈竞康, 杨一鸣, 柳 红 申请人:中国科学院上海药物研究所, 上海先导药业有限公司