专利名称：一种人血小板代用品及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医药领域中一种人血小板代用品及其制备方法。
背景技术：
血小板在血栓形成与止血等多种生理、病理过程中是必不可少的，而血小板膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)在这一过程中起着重要作用。
血小板膜蛋白不仅具有一些生理受体，而且还在血小板之间起到传递信息的作用。此外血小板膜蛋白异常还会引起一些疾病，如巨血小板综合征、血小板型血管性假血友病、血小板无力症、血小板第3因子缺乏症等(阮长耿，血小板疾病研究的进展，中华血液学杂志，22767，1983)。在血小板膜表面存在多种糖蛋白，此类糖蛋白主要包含GPIb，GPIIb，GPIIIa，GPIV，GPIX(李家增，贺石林，鸿利主编，血栓病学，科学出版社1998年)等，其中糖蛋白Ib中主要的糖为唾液酸、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺和N-乙酰葡萄糖胺，而麦胚凝集素(WGA)是麦胚中一种凝集细胞的蛋白质，能专一结合N-乙酰葡萄糖胺(GLcNAc)和唾液酸(NANA)。血小板膜蛋白的生物化学分析是进行血小板细胞生物学研究的有力手段，但实际尚存在着如血小板膜的难溶性、膜蛋白提纯困难等许多分析上的问题。
各种动物的血小板膜蛋白SDS-PAGE用考马斯亮蓝(Coomassie blue，CB)和过碘酸-Schiff(PAS)染色通常可以得到2-3条蛋白区带。但不同种属的血小板糖蛋白组成有较大差异，其中以GP I(包括Ia、Ib、Ic)的差异最大，猫科动物包括狮、豹均无GP I，具有GP I的种属其分子量亦差别较大，猪、豚鼠还有一些次要的糖蛋白区带(苏州医学院血栓形成与止血研究组血小板糖蛋白的研究(I)，不同种属血小板的聚丙烯酰胺凝胶电泳(II)，不同种族的血小板与单克隆抗体AN51和J15的反应性，苏医科研资料，35期28-29，1982)。
血小板粘附于血管内皮下组织主要涉及三个因素GPIb，vWF(von willebandfactor)及内皮下组织。
正常情况下血小板不能与血管内皮组织结合，血管受损后，vWF首先结合于内皮下胶原纤维，以致vWF发生构型改变，此时血小板GPIb即与vWF结合，发挥粘附作用，同时释放ADP，提高胞质中钙离子浓度，活化钙离子依赖的GPIIb-IIIa，暴露出纤维蛋白原受体，一个纤维蛋白原可以同时和至少两个GPIIb-IIIa结合使血小板之间形成蛋白桥链，导致血小板的黏附和聚集(周光纪，马丽 综述 巨型血小板综合征的分子变异 国外医学生理病理科学与临床分册200020(3)248-251)，形成白色血栓(Schade et al.Cytoplasmic Truncation of glycoprotein Iba weakens itsinteraction with von willeband factor and impairs celladhesion.Biochemistry，2003；42(7)2244-2251)。血小板膜糖蛋白IIb和IIIa(GPIIb-IIIa)、血浆纤维蛋白原和细胞外的钙离子在血小板聚集过程中起重要作用；血小板膜糖蛋白Iba是vWF、凝血酶、P-选择素、Mac-1、XII因子和高分子量激肽原的受体，是参与粘附作用的主要粘附受体(苏州医学院血栓形成与止血研究组血小板糖蛋白的研究(I)，不同种属血小板的聚丙烯酰胺凝胶电泳(II)，不同种族的血小板与单克隆抗体AN51和J15的反应性，苏医科研资料，35期28-29，1982)。
各种诱导剂与血小板膜上的受体相互作用使血小板活化，腺苷二磷酸钠盐(ADP)诱导血小板聚集时必须有纤维蛋白原存在，GP IIb-IIIa为纤维蛋白原受体。vWF在血小板膜上的受体为GP I b(Yang Shen，et al.Requirement of leucine-rich repeatsof glycoprotein(GP)Ibα for shear-dependent and static binding of vonWilleband factor to the platelet membrane GP Ib-IX-V complex.Blood.200095903-910)，在体外vWF需要瑞斯托霉素(Ristocetin)作为辅助因子才能结合到血小板受体上。
血小板数量减少或血小板功能障碍会引起多种疾病，由此引起的失血过多甚至会危及生命，此类病人最有效的治疗方法就是输入供血者提供的有大量正常功能血小板的血液。然而这种治疗方法会带来一系列的血液供应和安全问题。血小板易失活需在8小时内从新鲜血液中分离，且分离出的血小板寿命只有几天，过期血小板就只能废弃。一个此类病人一次输入的血小板需十个供血者提供，因此需大量的供血者。输入的血小板还有可能带有肝炎病毒、艾滋病病毒等，目前的检测手段也很难完全控制这些病毒。因此，由于血小板供应和安全问题，现在急需一种安全易得的血小板代用品。
猪与人在生理和结构上很接近，所以猪的组织和脏器作为人类器官移植的供体一直是研究的热点。
发明创造内容本发明的目的是提供一种人血小板代用品及其制备方法。
本发明所提供的人血小板代用品，是由猪血小板膜糖蛋白和脂类组成的猪血小板糖蛋白脂质体。
其中，猪血小板膜糖蛋白与脂类的重量份数比为1∶100-1∶5，优选为1∶10。
所述脂类可为卵磷脂、胆固醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油和磷脂酸等，优选为卵磷脂和胆固醇，其重量份数比为4∶1-1∶1。
所述猪血小板膜糖蛋白是通过以下步骤得到的(1)从猪血中提取血小板溶液；(2)纯化步骤(1)中得到的血小板溶液中的糖蛋白，得到猪血小板膜糖蛋白。
上述步骤(1)中，采用1％TritonX-100溶解血小板膜蛋白；步骤(2)中采用麦胚凝集素亲和层析纯化猪血小板糖蛋白，其中采用0.3M N-乙酰葡萄糖胺进行洗脱。
所述猪血小板糖蛋白脂质体是所述猪血小板糖蛋白与所述脂类按下述方法进行连接得到的将4-1g卵磷脂与1g胆固醇溶于1-100mL氯仿，将0.01-1g猪血小板糖蛋白溶于PBS后加入所述卵磷脂、胆固醇氯仿溶液中，经超声处理后，除去有机溶媒，放置20-40分钟，完成连接。
一种制备人血小板代用品的方法，包括以下步骤(1)从猪血中提取血小板溶液；(2)纯化步骤(1)中得到的血小板溶液中的糖蛋白，得到猪血小板膜糖蛋白；(3)将步骤(2)中得到的猪血小板膜糖蛋白与脂类连接，得到猪血小板糖蛋白脂质体即人血小板代用品。
步骤(1)中，采用1％TritonX-100溶解血小板膜蛋白。步骤(2)中采用麦胚凝集素亲和层析纯化猪血小板糖蛋白，其中采用0.3M N-乙酰葡萄糖胺进行洗脱。步骤(3)中，所述脂类可为卵磷脂、胆固醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油和磷脂酸等，优选为卵磷脂和胆固醇，其重量份数比为4∶1-1∶1；所述猪血小板膜糖蛋白与脂类的重量份数比为1∶100-1∶5。步骤(3)中所述猪血小板糖蛋白脂质体是所述猪血小板糖蛋白与所述脂类按下述方法进行连接得到的将4-1g卵磷脂与1g胆固醇溶于氯仿，将0.01-1g猪血小板糖蛋白溶于PBS后加入所述卵磷脂、胆固醇氯仿溶液中，经超声处理后，除去有机溶媒，放置20-40分钟，完成连接。
本发明以非离子表面活性剂TritonX-100溶解血小板膜蛋白，并由麦胚凝集素亲和色谱纯化血小板糖蛋白得到了较纯血小板糖蛋白。由于血小板膜蛋白与膜磷脂紧密结合，蛋白的疏水部分插入磷脂双层中，必须用去垢剂使之溶解或施以外力才能由分离的血小板制成血小板溶液，本发明所用非离子表面活性剂TritonX-100能使血小板膜蛋白很好的溶解。
本发明表明猪血小板膜糖蛋白的组成和分子量与人相似；并可以和鼠抗人GP I b单抗结合；并抑制腺苷二磷酸钠盐(ADP)和瑞斯托霉素(Ristocetin)诱导的人血小板的聚集作用；表明猪血小板膜糖蛋白与人血小板膜糖蛋白有相似的结构和功能。
实验表明，本发明的人血小板代用品具有可促进凝血等方面的作用，是一种安全可靠的人血小板代用品。
图1为经麦胚凝集素亲和层析纯化的猪血小板糖蛋白点印迹杂交2为纯化的猪血小板糖蛋白SDS-PAGE电泳3为碘酸-Schiff(PAS)法鉴定猪血小板糖蛋白结果4为ADP阳性对照血小板聚集曲线图5为纯化前样品对ADP诱导的血小板聚集的抑制曲线图6为纯化后样品对ADP诱导的血小板聚集的抑制曲线图7为Ristocetin阳性对照血小板聚集曲线图8为纯化前样品对Ristocetin诱导的血小板聚集的抑制曲线图9为纯化后样品对Ristocetin诱导的血小板聚集的抑制曲线图10糖蛋白脂质体溶液的聚集曲线图11糖蛋白脂质体溶液中加入PHN89单抗的聚集曲线图12糖蛋白脂质体溶液中加入vWF抗体的聚集曲线具体实施方式
材料EDTA-2Na抗凝剂(54mmol/mlEDTA-2Na，120mmol/lNaCl)，PMSF(苯甲基磺酰氟美国Sigma)，TritionX-100(美国Sigma)，SDS(十二烷基硫酸钠)，丙烯酰胺(Fluka)，Bradford蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)，鼠抗人GPIb单抗PHN89(《中国实验临床免疫学杂志》1989年第1卷第3期)，腺苷二磷酸钠盐，瑞斯托霉素(Ristocetin美国Sigma)，Sephorse 4B麦胚凝集素(Amersham)，其它试剂为国产分析纯。
实施例1、人血小板代用品的制备1、血小板溶液的制备收集新鲜猪血，以10％EDTA-2Na抗凝。100g 22℃离心10min，分离出富血小板血浆(PRP)，PRP以1500g 22℃离心10min沉淀血小板，将沉淀血小板悬于bufferA(PH6.5，4.8mM葡萄糖，3mM KCl，100mM NaCl，10mM EDTA，30mM柠檬酸钠)，洗涤，再以bufferB(PH6.5，30mM葡萄糖，120mM NaCl，10mM EDTA，5mM柠檬酸钠)洗2次，bufferC(PH7.4，134mM NaCl，10mM EDTA，10mM Tris-HCl)洗2次，此后加入与血小板等体积的bufferD(PH7.4，124mM NaCl，20mM EDTA，2mM PMSF，2％TritonX-100，10mM Tris-HCl，2mM N-乙基-顺丁烯二酰亚胺)，室温搅拌30min，4℃ 2500g离心2小时，把上清进一步4℃ 100,000g超离心1小时。将20ml含6％蔗糖的bufferE(PH7.4，154mM NaCl，1mM EDTA，0.06％TritonX-100，10mM Tris-HCl)加入50ml离心管中加热至35℃，小心加入20ml超离心的血小板上清液，30℃ 1000g离心10min。收集上清并加入1％TritonX-100，此上清再用含6％蔗糖的bufferE按同法离心，收集上清即为血小板溶液。
2、亲和层析纯化血小板溶液中的糖蛋白麦胚凝集素Sephorse4B装柱，用binding buffer(PH7.4，20mM Tris-HCl，0.1MNaCl)平衡柱子后上样，以binding buffer冲洗亲和柱中杂蛋白及未结合上的糖蛋白，再以elution buffer(0.3M N-乙酰葡萄糖胺)洗脱结合到凝集素上的糖蛋白，用半自动电脑收集仪收集洗脱样品，每管1ml，并以鼠抗人GPIb单抗PHN89为一抗，做点印迹，结果如图1所示，表明0.3M N-乙酰葡萄糖胺能充分洗脱结合到凝集素上的GPIb。图中右下角四个点为纯化前的样品。合并结果为阳性的收集液，浓缩，透析除盐，过滤除菌，-80℃保存或冻干保存。
3、聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)将步骤2中的纯化后糖蛋白在5％浓缩胶，10％分离胶，50V电压下进行SDS-PAGE至示踪染料达底端，考马斯亮蓝(Coomassie blue，CB)染色。结果如图2所示，表明样品血小板溶液中的糖蛋白纯化后可见2条明显蛋白区带，其中200KDa区带为肌动结合蛋白，约145KDa区带为GPIbα。图2中，1表示蛋白标准，2表示血小板溶液，3表示纯化后糖蛋白。
已知蛋白区带约200KDa为肌动结合蛋白，约145KDa为GPIbα，约90-120KDa为GPIb片段、IIb、IIIa，约45KDa为肌动蛋白和GPIbα片段。
4、测定纯化后猪血小板糖蛋白溶液浓度Bradford考马斯亮蓝G250显色法，以BSA为标准，595nm测定纯化后猪血小板糖蛋白溶液。按碧云天公司的Bradford试剂盒说明书具体测定。结果表明纯化后糖蛋白浓度平均为0.2mg/ml。
5、猪血小板糖蛋白定性采用过碘酸-Schiff(PAS)法(阮长耿 主编 血小板-基础与临床 上海科学技术出版社1987年)。SDS-PAGE电泳结束后，将胶置于12.5％三氯醋酸中固定，1％高碘酸3％醋酸氧化，室温Schiff试剂染色。据报道(苏州医学院血栓形成与止血研究组血小板糖蛋白的研究(I)，不同种属血小板的聚丙烯酰胺凝胶电泳(II)，不同种族的血小板与单克隆抗体AN51和J15的反应性，苏医科研资料，35期28-29，1982)各种动物的血小板溶液运用SDS-PAGE和PAS染色可以得到2-3条糖蛋白区带。结果如图3所示，表明血小板溶液糖蛋白可见2条糖蛋白区带，约145KDa为GPIbα，约120KDa为GPIb片段、IIb、IIIa。
6、纯化前后的猪血小板溶液对ADP和Ristocetin诱导的血小板凝集的抑制试验从健康人采集全血按体积比为1∶10与3.14％的柠檬酸钠混合，100g离心10分钟收集富含血小板的上清(PRP)。以无血小板的血清(PPP)调节血小板浓度为300×106/ml。样品蛋白质(浓度为1.2mg/ml)先与PRP在室温孵育5分钟，后将诱导剂加入PRP。在血小板聚集仪上测定10分钟凝集率，分析对血小板凝集的抑制作用。加入的诱导剂为ADP 30μmol，Ristocetin 1.2mol/ml。
结果如图4-9所示，图4-9中横坐标表示时间(分钟)，纵坐标表示百分率(％)，图4-6表明ADP阳性对照血小板聚集率达74％，纯化前后的样品血小板聚集率分别为42％和3％，图7-9表明Ristocetin阳性对照血小板聚集率高达100％，纯化前后的样品血小板聚集率分别为25％和3％，说明血小板溶液纯化前后对ADP和Ristocetin诱导的血小板聚集有抑制作用，表明本方法所制备的糖蛋白具有生物学活性。
7、糖蛋白脂质体的制备采用逆相蒸发法。
将4g卵磷脂与1g胆固醇溶于10mL氯仿，将0.05g纯化的猪血小板糖蛋白溶于PBS加入上述卵磷脂、胆固醇氯仿溶液中，在浴式超声仪中超声处理5分钟，减压除去有机溶媒，得到一种稠厚的胶状物，加10mLPBS缓冲液再继续减压蒸发除去微量有机溶媒，放置30分钟，将所得的脂质体悬液通过葡聚糖凝胶柱(SephadexG-50)，分离除去未包入的糖蛋白，得到糖蛋白脂质体。
实施例2、糖蛋白脂质体聚集实验将糖蛋白脂质体溶液调为2×1012个/ml，加入50μg/ml vWF，在室温孵育5分钟后将诱导剂Ristocetin(1.2mol/ml)加入。在血小板聚集仪上测定10分钟凝集率，分析其聚集率。
同样加入50μg/ml的抗-vWF或PHN89单抗，在室温孵育5分钟后将诱导剂Ristocetin(1.2mol/ml)加入。在血小板聚集仪上测定10分钟凝集率，分析其聚集率。
结果如图10、图11和图12所示，表明糖蛋白脂质体的最大聚集率为80％，糖蛋白脂质体加入PHN89单抗的最大聚集率为19％，糖蛋白脂质体加入vWF抗体的最大聚集率为35％。说明加有抗-vWF或PHN89单抗的最大聚集率明显低于糖蛋白脂质体的聚集率，表明糖蛋白脂质体在抗-vWF及Ristocetin诱导下能起到血小板的聚集作用。
权利要求
1.一种人血小板代用品，是由猪血小板膜糖蛋白和脂类组成的猪血小板糖蛋白脂质体。
2.根据权利要求1所述的人血小板代用品，其特征在于所述猪血小板膜糖蛋白与脂类的重量份数比为1∶100-1∶5。
3.根据权利要求2所述的人血小板代用品，其特征在于所述猪血小板膜糖蛋白与脂类的重量份数比为1∶10。
4.根据权利要求1、2或3所述的人血小板代用品，其特征在于所述脂类为卵磷脂和胆固醇，卵磷脂和胆固醇的重量份数比为4∶1-1∶1。
5.根据权利要求1所述的人血小板代用品，其特征在于所述猪血小板膜糖蛋白是通过以下步骤得到的(1)从猪血中提取血小板溶液；(2)纯化步骤(1)中得到的血小板溶液中的糖蛋白，得到猪血小板膜糖蛋白。
6.根据权利要求5所述的人血小板代用品，其特征在于步骤(1)中，采用1％TritonX-100溶解血小板膜蛋白；步骤(2)中采用麦胚凝集素亲和层析纯化猪血小板糖蛋白，其中采用0.3M N-乙酰葡萄糖胺进行洗脱。
7.根据权利要求1所述的人血小板代用品，其特征在于所述猪血小板糖蛋白脂质体是所述猪血小板糖蛋白与所述脂类按下述方法进行连接得到的将4-1g卵磷脂与1g胆固醇溶于氯仿，将0.01-1g猪血小板糖蛋白溶于PBS后加入所述卵磷脂、胆固醇氯仿溶液中，经超声处理后，除去有机溶媒，放置20-40分钟，完成连接。
8.一种制备人血小板代用品的方法，包括以下步骤(1)从猪血中提取血小板溶液；(2)纯化步骤(1)中得到的血小板溶液中的糖蛋白，得到猪血小板膜糖蛋白；(3)将步骤(2)中得到的猪血小板膜糖蛋白与脂类连接，得到猪血小板糖蛋白脂质体即人血小板代用品。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于步骤(1)中，采用1％TritonX-100溶解血小板膜蛋白；步骤(2)中采用麦胚凝集素亲和层析纯化猪血小板糖蛋白，其中采用0.3M N-乙酰葡萄糖胺进行洗脱；步骤(3)中，所述脂类为卵磷脂和胆固醇，卵磷脂和胆固醇的重量比为4∶1-1∶1。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于步骤(3)中的猪血小板糖蛋白与所述脂类按照下述方法进行连接将4-1g卵磷脂与1g胆固醇溶于氯仿，将0.01-1g猪血小板糖蛋白溶于PBS后加入所述卵磷脂、胆固醇氯仿溶液中，经超声处理后，除去有机溶媒，放置20-40分钟，完成连接。
全文摘要
本发明公开了一种人血小板代用品及其制备方法。本发明所提供的人血小板代用品，是由猪血小板膜糖蛋白和脂类组成的猪血小板糖蛋白脂质体。制备人血小板代用品的方法，包括以下步骤(1)从猪血中提取血小板溶液；(2)纯化步骤(1)中得到的血小板溶液中的糖蛋白，得到猪血小板膜糖蛋白；(3)将步骤(2)中得到的猪血小板膜糖蛋白与脂类连接，得到猪血小板糖蛋白脂质体即人血小板代用品。实验表明，本发明的人血小板代用品具有可促进凝血等方面的作用，是一种安全可靠的人血小板代用品。
文档编号A61P7/02GK1596910SQ0315719
公开日2005年3月23日 申请日期2003年9月18日 优先权日2003年9月18日
发明者王字玲, 张玉华, 王波, 苏丽, 王广义 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所