抗体可变区的糖基化的制作方法

专利名称：抗体可变区的糖基化的制作方法
技术领域：
本发明涉及纯化抗体分子制剂，其特征是其中重链可变区(VH)中至少一个抗原 结合位点包含糖基化的天冬酰胺(Asn)。更具体说，所提供的纯化抗体分子能特异性识别 3-A4肽/AP4并在重链可变区(VH)中包含糖基化。本发明具体涉及包含在重链可变区中 有糖基化天冬酰胺(Asn)的一个或两个糖基化抗原结合位点的抗体混合物、即重链可变区 (VH)中含有糖基化Asn的抗体同种型的混合物。也公开了包含特定糖基化抗体同种型的组 合物或抗体制剂。而且提供了这些抗体的药学和诊断性用途。所述抗体同种型可用于(例 如)药学干预淀粉样蛋白形成或淀粉样蛋白斑形成和/或其诊断性用途。
背景技术：
所有痴呆病例中约70%源于阿尔茨海默病，阿尔茨海默病与对认知至关重要的脑 区和神经环路的选择性损伤有关。阿尔茨海默病的特征是神经纤维缠结，特别是在海马锥 体神经元和众多包含大多数淀粉沉积致密核心和缓和晕圈(defused halos)的淀粉样蛋白 斑中发生的神经纤维缠结。胞外神经炎性斑包含大量优势纤维肽，称为“ 3淀粉样蛋白”、“A-P ”、“A34”、 “ 3 -A4” 或 “AP ” ；参见 Selkoe (1994)、Ann. Rev. Cell Biol. 10，373-403，Koo(1999)，PNAS 96 卷，9989-9990，US 4，666，829 或 Glenner (1984)，BBRC 12，1131。这种 ^ 淀粉样蛋白衍 生自“阿耳茨海默前体蛋白/P-淀粉样蛋白前体蛋白”(APP)。APP是膜内在糖蛋白(参 见5匕0乜&(1992)沖應5，89卷，6075页)和并被一种质膜蛋白酶a-分泌酶在A0序列内 蛋白酶内切(参见Sisodia(1992)、如上述引文)。而且，其它分泌酶活性，具体说是0 -分 泌酶和分泌酶活性引起淀粉样蛋白(AP)的胞外释放、AP包含氨基酸39 (A 0 39)、 氨基酸 40 (A 0 40)、氨基酸 42 (A 0 42)或氨基酸 43(A0 43);参见 Sinha (1999)，PNAS 96， 11094-1053 ；Price(1998), Science 282，1078-1083 ；W0 00/72880 或 Hardy (1997), TINS 20，154。值得注意的是，AP具有数种天然产生的形式，其中人形式指上述提及的A0 39、 AMO、A 0 41、A M2和A M3。最主要的形式A P 42具有如下氨基酸序列(从N-末端开 始)DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA(SEQ ID NO :3)。在 A3 41、A3 40、 A 3 39中，分别丢失了 C-末端氨基酸A、IA和VIA。在A 0 43形式中，上述序列(SEQ ID NO: 3)的C末端还包含一个苏氨酸残基。40原纤维成核所需时间明显长于AP 42纤维成核；参见上述Koo引文和 Harper(1997)，Ann. Rev.Biochem. 66,385-407。如 Wagner(1999)，J. Clin. Invest. 104, 1239-1332所述，更常见AP42与神经炎性斑相关，认为它在体外更易形成纤维。Jarrett (1993)，Cell 93，1055-1058提示A 0 42在有序非结晶性A ^肽的成核依赖性多聚 化中用作“晶种”。修饰的APP加工和/或产生包含蛋白样沉积物的细胞外斑不仅从阿尔茨海默病病 理学中获知，也从患有其它神经病和/或神经变性疾病的对象中获知。这些疾病特别包括 唐氏综合征、荷兰型遗传性脑出血伴淀粉样变、帕金森病、ALS(肌萎缩侧索硬化)、库贾氏 病、HIV-相关痴呆和运动神经病。迄今，仅描述过有限的淀粉样蛋白相关疾病的医疗干预方案。例如，已讨论过胆碱 脂酶抑制剂如加兰他敏、卡巴拉汀(rivastigmine)或多奈哌齐仅对于轻度到中度阿尔茨 海默病患者有益。然而，此类药物的胆碱能作用引起的不良事件也有报道。虽然此类胆碱 能增强性治疗确能对某些症状产生益处，但大多数治疗病人未能产生满意的治疗响应。据 估计仅在约5%治疗病人中发生显著的认知提高，很少有证据表明该治疗能够显著改变此 进行性疾病的进程。因此，临床上急切需要更有效的治疗手段，尤其需要那些能够阻止或延 迟疾病进展的治疗手段。同样，近来常用NMDA-受体拮抗剂，如美金刚胺。然而，由于其药理学活性引起的 不良事件也有报道。此外，此类利用NMDA-受体拮抗剂的治疗仅仅被认为是对症治疗方法 而非改善疾病的方法。同样也提出了利用免疫调节的方法治疗淀粉样蛋白相关疾病。W099/27944公开 了包含AP肽的某部分和运载体分子的偶联物，其中所述运载体分子应增强免疫应答。W0 00/72880提及另一主动免疫方法，其中也使用AP片段诱导免疫应答。W0 99/27944或W0 01/62801中也提出了使用常规抗_A 0抗体的被动免疫方法， W0 02/46237、W0 02/088306和W0 02/088307描述了抗A 0某部分的特异性人源化抗体。 W0 00/77178描述了与水解中淀粉样蛋白采用的过渡状态结合的抗体。W0 03/070760 公开了识别A0肽上两个不连续氨基酸序列的抗体分子。W0 03/016466描述了一种人源化抗-AP抗体，该抗体被修饰以避免其重链发生 糖基化，因为Wallick(1988) J. Exp. Med. 168,1099-1109已假定抗体可变区中的糖基化。

发明内容
本发明的根本技术问题在于提供有效的手段和方法以医学控制淀粉样蛋白疾病， 尤其是在需要(相应)医疗干预的病人中用于减少有害淀粉样蛋白斑的手段和方法。首先，本发明提供了一种纯化抗体分子，其特征是重链可变区(VH)中至少一个抗 原结合位点包含糖基化的天冬酰胺(Asn)。本文提供的本发明纯化抗体或抗体组合物尤其 靶向A3和/或A3片段。本文提供的纯化抗体分子，具体是本发明抗体组合物或抗体制 剂可用于制备药学或诊断性组合物以治疗、改善、预防淀粉样变和/或淀粉样斑形成相关 性疾病。此类疾病的例子如阿尔茨海默病。本发明中，惊人地发现重链可变区中至少一个抗原结合位点包含N-连接的糖基 化的纯化抗体分子尤其可用于减少淀粉斑。而且，发现本发明上下文中所提供的糖基化抗 体或抗体组合物特别有用，并通过有效斑结合显示能够有效跨越血脑屏障/血脑边界。本文与现有技术的知识形成鲜明对比，W0 03/016466公开了特别工程改造以使重 链缺少N-糖基化位点的抗体，并指出可变区中的糖基化对于抗体亲和力有消极作用。现有技术中指出所述重链可变〔082区去糖基化形式的抗4 0抗体对体外合成和纯化的ム日肽 的亲和力明显较高。因此，本发明涉及改进的、纯化的抗体分子或抗体制剂，尤其是抗六0 4/ム0肽(3 淀粉样蛋白)并在体内非常有效的抗体分子或抗体制剂。本发明抗体分子/抗体制剂的改 进在于提供在至少ー个重链可变区，如所述重链可变区的〔082区中包含か糖基化的纯化 抗体分子。如前所述，这与现有技术如^) 03/016466形成对比，10 03/016466指出在八3 抗体中必须避免此类N-糖基化。本发明抗体分子的例子为免疫球蛋白分子，如な6分子。な6的特征在于包含两条 重链和两条轻链(如图14所示)，并且该类分子包含两个抗原结合位点。所述抗原结合位 点包含“可变区”，其由重链(VH)某部分和轻链(\)某部分组成。抗原-结合位点由乂11和 ん结构域并列形成。关于抗体分子或免疫球蛋白分子的ー般信息也可參见普通教科书，如 Abbas的“细胞和分子免疫学”，ff. B. Sounders Company (ff. B.森德公司)Q003)。ー方面，例如提供本发明鉴定的ー种免疫球蛋白分子时，描述了ー个抗原结合位 点的相应重链可变区(VH)中含有糖基化的天冬酰胺(Asn)的抗体。所述抗体在下文中称 为“单糖基化的抗体”；參见图14。另ー方面，提供两个抗原结合位点的对应重链可变区(VH)中均包含糖基化的天冬 酰胺(Asn)的免疫球蛋白分子。所述抗体分子在下文中称为“双糖基化的抗体”，參见图14。抗原结合位点的重链可变区(VH)无糖基化的天冬酰胺(Asn)的免疫球蛋白在下 文中称为“未糖基化的抗体”。单糖基化的抗体、双糖基化的抗体和未糖基化的抗体可包含同样的氨基酸序列或 不同氨基酸序列。因此，术语“抗体”包括抗体分子，尤其是重组产生的抗体分子如免疫球 蛋白。然而，如下文所讨论的，术语“抗体分子”也包含免疫球蛋白的已知同种型和修饰物， 如单链抗体或单链ド￥片段(scAB/scFv)或双特异性抗体构建物，所述同种型和修饰物的特 征是包含至少ー个如本文定义的糖基化VH区。此类同种型或修饰物的具体例子可为VH-\ ■ VfVHM《_sc(._)抗体，其中所述乂11包含本文所述糖基化。同样考虑到双特异性 scFV,其形式如VH-VfVH-\、VL-VH-VH-VL, VH-VL-VL-VH,其OTR_2区域包含本文所述糖基化。本发明上下文中，使用大写字母的术语“抗体”(ANTIBODY)是为了更清晰地表述。 然而，小写的术语“抗体，ル壯丨ん(^)也用于本申请上下文中。“ANTIBODY”/ “ANTIBODIES” / “antibody” 和 “antibodies” 可互换使用。单糖基化的抗体和双糖基化的抗体在上文中称为“糖基化的抗体同种型”。特征在 于重链可变区(VH)中至少一个抗原结合位点包含糖基化天冬酰胺(Asn)的纯化抗体分子 为单糖基化的抗体，它不含或含有很少的双糖基化抗体或未糖基化抗体，即是“纯化的单糖 基化的抗体”。本发明上下文中双糖基化抗体不含或含有很少的单糖基化抗体或未糖基化 抗体，即是“纯化的双糖基化抗体”。术语“不含或含有很少”指完全不含其它(糖基化)同种型或其它(糖基化)同 种型的浓度最多10%、如最多5%、如最多4%、如最多3%、如最多2%、如最多1%、如最多0. 5%、 如最多0. 3%、如最多0. m。下文和所附实施例将进一步提供此方面的信息。本发明上下文中，术语“单糖基化的抗体”涉及在单一抗体分子(如免疫球蛋白， 如な6，如1861)的ー个ひ^-区域中含有か糖基化的抗体分子。例如，所述“单糖基化形式”的重链的一个可变区中包含糖基化，如下文所定义的天冬酰胺“Asn 52”位置。该“单 糖基化的IgGl形式或单糖基化的同种型”也可包含(如本文所示)Fc-部分很保守的糖基 化位点的糖基化，如非可变FC-部分的天冬酰胺Asn 306。本发明所意的术语“双-糖基化的抗体”包括本文定义的两个重链可变区(VH)的 糖基化。再次，此“双糖基化的形式”的两条重链可变区均包含糖基化，具体指下文以及所 附实施例所示的天冬酰胺Asn 52位点。此“双糖基化的IgGl形式或双糖基化的同种型”也 可包含(如本文所示)在非可变/恒定Fc-部分很保守的糖基化位点的糖基化，具体如免 疫球蛋白的306位。附图14展示了相应的抗体分子。在本发明上下文中，将可变区，如重链可变区(两个(VH)区)缺乏此类翻译后修饰 的抗体被称为“未糖基化形式”，它的重链可变区不含糖基化。然而，此“未糖基化形式”仍 可在抗体恒定区(C-区)，如Fc-部分通常很保守的糖基化位点，具体为本文所定义的非可 变/恒定Fc-部分的天冬酰胺(Asn) 306中包含糖基化，参见SEQ ID NO :6。重链可变区(VH)的糖基化天冬酰胺(Asn)可位于互补决定区2 (⑶R2区)。所述 重链可变区(VH)的糖基化天冬酰胺(Asn)可位于可变区52位，如下文和SEQ ID No. 2所 示(或在SEQ ID N0 :6的52位，也包含本文所述的抗体重链的Fc-部分的)。抗体同种型在抗体分子的恒定/非可变部分，如IgG的Fc-部分，如IgGl的Fc-部 分也可包含其它糖基化。Fc-部分的糖基化与很保守的糖基化(位点)有关，其特征是位于 重链的Asn306位点，参见下列序列 QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 6)下文同样描述了该序列，并且指出了 CDR、CH-区、重链区以及两个N-糖基化位点 (N52 和 N306)QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS .(gFTFSSYAMsI WVRQAPGKGLEWVS|a1NASGTRTYYADSVKG| RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARiGKGNTHKPYGYVRYFDVl ffGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSffNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV
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m ch3 mm* Asn-306 ±mmtFc f￡) 50 f & (Jefferis (1998) Immunol Rev. 163>50~76) 0Jefferis (2002) Immunol Lett. 82 (1-2), 57-65Krapp (2003) J Mol Biol. 325 (5),979-89
IgG-FcoFc- itLS Asn-306
% Kabat- %. “Asn-297” X'tM (Rabat (1991) ^^^4 tJ S l￥ i (Sequenceof Proteins of Immunological Interest), % 5 Jüx,
(Public Health Service>National Institutes of Health, S/Mil'll(Bethesda
MD)) o:caggtggaattggtggaaagcggcggcggcctggtgcaaccgggcggcagcctgcgtctgagctgcgcggcctccggatttacctttagcagctatgcgatgagctgggtgcgccaagcccctgggaagggtctcgagtgggtgagcgctattaatgcttctggtactcgtacttattatgctgattctgttaagggtcgttttaccatttcacgtgataattcgaaaaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgcggaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtggtaagggtaatactcataagccttatggttatgttcgttattttgatgtttggggccaaggcaccctggtgacggttagctcagcctc caccaagggtccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccagatatcgtgcgatatcgtgcaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgggtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga(SEQ ID NO :5)0) ' Tjm“Itr:atgaaacacctgtggttcttcctcctgctggtggcagctcccagatgggtcctgtcc(Jnílc )caggtggaattggtggaaagcggcggcggcctggtgcaaccgggcggcagcctgcgtctgagctgcgcggcctccggatttacctttagcagctatgcgatgagctgggtgcgccaagcccctgggaagggtctcgagtgggtgagcgctattaatgcttctggtactcgtacttattatgctgattctgttaagggtcgttttaccatttcacgtgataattcgaaaaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgcggaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtggtaagggta
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Cctctctgggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagectgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacaegeagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga(SEQ ID NO :25):MKHLWFFLLLVAAPRWVLS ( B c )QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDffLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO :26)m^,pmn^mmníérXímmmj^mm,nT$mnp)í^ ■.1 atff'gagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtga51 ttcatggaga aatagagaga ctgagtgtga gtgaacatga gtgagaaaaa101 ctggatttgt gtggcatttt ctgataacgg tgtccttctg tttgcaggtg151 tccagtgtca ggtggagctg gtggagtctg ggggaggcct ggtccagcct201 ggggggtccc tgagactctc ctgtgcagcg tctggattca ccttcagtag251 ctatgccatg agctgggtcc gccaggctcc aggcaagggg ctcgagtggg301 tgtccgccat aaacgccagc ggtacccgca cctactatgc agactccgtg351 aagggccgat tcaccatctc cagagacaat tccaagaaca cgctgtatct401 gcaaatgaac agcctgagag ccgaggacac ggctgtgtat tactgtgcga451 gaggcaaggg gaacacccac aagccctacg gctacgtacg ctactttgac501 gtgtggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc tcctcaggtg agtcctcaca551 acctctctcc tgcggccgca gcttgaagtc tgaggcagaa tcttgtccag601 ggtctatcgg actcttgtga gaattagggg ctgacagttg atggtgacaa651 tttcagggtc agtgactgtc tggtttctct gaggtgagac tggaatatag701 gtcaccttga agactaaaga ggggtccagg ggcttttctg cacaggcagg751 gaacagaatg tggaacaatg acttgaatgg ttgattcttg tgtgacacca801 agaattggca taatgtctga gttgcccaag ggtgatctta gctagactct851 ggggtttttg tcgggtacag aggaaaaacc cactattgtg attactatgc901 tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcaggtaaga951 atggcctctc caggtcttta tttttaacct ttgttatgga gttttctgag
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3601 ggccggctcg gcccaccctc tgccctgaga gtgaccgctg taccaacctc3651 tgtccctaca gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat3701 cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa3751 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc3801 ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct3851 tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg3901 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac 3951 gcagaagagc ctctccctgt ccccgggcaa atga(SEQ ID NO :23)SEQ ID NO :23^“iê#fê”Sa^J^%li—:DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQ
GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO :8)gatatcgtgctgacccagagcccggcgaccctgagcctgtctccgggcgaacgtgcgaccctgagctgcagagcgagccagagcgtgagcagcagctatetggcgtggtaccagcagaaaccaggtcaagcaccgcgtctattaatttatggcgcgagcagccgtgcaactggggtcccggcgcgttttagcggctctggatccggcacggattttaccctgaccattagcagcctggaacctgaagactttgcgacttattattgccttcagatttataatatgcctattacctttggccagggtacgaaagttgaaattaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag(SEQ ID NO :7)0fóJbt (( ima )■.atggtgttgcagacccaggtcttcatttctctgttgctctggatctctggtgcctacggg()
gatatcgtgctgacccagagcccggcgaccctgagcctgtctccgggcgaacgtgcgaccctgagctgcagagcgagccagagcgtgagcagcagctatctggcgtggtaccagcagaaaccaggtcaagcaccgcgtctattaatttatggcgcgagcagccgtgcaactggggtcccggcgcgttttagcggctctggatccggcacggattttaccctgaccattagcagcctggaacctgaagactttgcgacttattattgccttcagatttataatatgcctattacctttggccagggtacgaaagttgaaattaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag(SEQ ID NO :27)■.MVLQTQVFI SLLLff ISGAYG ( B c )DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV
DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO :28)■.1 atff gacatga gggtcctcgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctgttt51 cccaggtaag gatggagaac actagcagtt tactcagccc agggtgctca101 gtactgcttt actattcagg gaaattctct tacaacatga ttaattgtgt151 ggacatttgt ttttatgttt ccaatctcag gcgccagatg tgatatcgtg201 ttgacgcagt ctccagccac cctgtctttgtctccagggg aaagagccac251 cctctcctgc cgggccagtc agagtgttagcagcagctac ttagcctggt301 accagcagaa acctggccag gcgcccaggctcctcatcta tggcgcatcc
351 agcagggcca ctggcgtgcc agccaggttcagtggcagtg ggtctgggac401 agacttcact ctcaccatca gcagcctggagcctgaagat ttcgcgacct451 attactgtct gcagatttac aacatgcctatcacgttcgg ccaagggacc501 aaggtggaaa tcaaacgtga gtagaatttaaactttgcgg ccgcctagac551 gtttaagtgg gagatttgga ggggatgaggaatgaaggaa cttcaggata
601gaaaagggct gaagtcaagt tcagctcctaaaatggatgt gggagcaaac651tttgaagata aactgaatga cccagaggatgaaacagcgc agatcaaaga701ggggcctgga gctctgagaa gagaaggagactcatccgtg ttgagtttcc751acaagtactg tcttgagttt tgcaataaaagtgggatagc agagttgagt801gagccgtagg ctgagttctc tcttttgtctcctaagtttt tatgactaca851aaaatcagta gtatgtcctg aaataatcattaagctgttt gaaagtatga
901ctgcttgcca tgtagatacc atgtcttgctgaatgatcag aagaggtgtg951actcttattc taaaatttgt cacaaaatgtcaaaatgaga gactctgtag1001gaacgagtcc ttgacagaca gctcaaggggtttttttcct ttgtctcatt1051tctacatgaa agtaaatttg aaatgatcttttttattata agagtagaaa1101tacagttggg tttgaactat atgttttaatggccacggtt ttgtaagaca1151tttggtcctt tgttttccca gttattactcgattgtaatt ttatatcgcc1201agcaatggac tgaaacggtc cgcaacctcttctttacaac tgggtgacct1251cgcggctgtg ccagccattt ggcgttcaccctgccgctaa gggccatgtg1301aacccccgcg gtagcatccc ttgctccgcgtggaccactt tcctgaggca1351cagtgatagg aacagagcca ctaatctgaagagaacagag atgtgacaga1401ctacactaat gtgagaaaaa caaggaaagggtgacttatt ggagatttca1451gaaataaaat gcatttatta ttatattcccttattttaat tttctattag1501ggaattagaa agggcataaa ctgctttatccagtgttata ttaaaagctt1551aatgtatata atcttttaga ggtaaaatctacagccagca aaagtcatgg1601taaatattct ttgactgaac tctcactaaactcctctaaa ttatatgtca1651tattaactgg ttaaattaat ataaatttgtgacatgacct taactggtta1701ggtaggatat ttttcttcat gcaaaaatatgactaataat aatttagcac1751aaaaatattt cccaatactt taattctgtgatagaaaaat gtttaactca1801gctactataa tcccataatt ttgaaaactatttattagct tttgtgtttg1851acccttccct agccaaaggc aactatttaaggacccttta aaactcttga1901aactacttta gagtcattaa gttatttaaccacttttaat tactttaaaa1951tgatgtcaat tcccttttaa ctattaatttattttaaggg gggaaaggct2001gctcataatt ctattgtttt tcttggtaaagaactctcag ttttcgtttt2051tactacctct gtcacccaag agttggcatctcaacagagg ggactttccg2101agaggccatc tggcagttgc ttaagatcagaagtgaagtc tgccagttcc2151tcccaggcag gtggcccaga ttacagttgacctgttctgg tgtggctaaa2201aattgtccca tgtggttaca aaccattagaccagggtctg atgaattgct2251cagaatattt ctggacaccc aaatacagaccctggcttaa ggccctgtcc2301atacagtagg tttagcttgg ctacaccaaaggaagccata cagaggctaa2351tatcagagta ttcttggaag agacaggagaaaatgaaagc cagtttctgc2401tcttacctta tgtgcttgtg ttcagactcccaaacatcag gagtgtcaga2451taaactggtc tgaatctctg tctgaagcatggaactgaaa agaatgtagt2501ttcagggaag aaaggcaata gaaggaagcctgagaatacg gatcaattct
2551 aaactctgagggggtcggatgacgtggcca ttctttgcct aaagcattga2601 gtttactgcaaggtcagaaaagcatgcaaa gccctcagaa tggctgcaaa2651 gagctccaacaaaacaatttagaactttattaaggaatag ggggaagcta
2701 ggaagaaactcaaaacatcaagattttaaa tacgcttctt ggtctccttg2751 ctataattatctgggataagcatgctgttttctgtctgtc cctaacatgc2801 cctgtgattatccgcaaacaacacacccaa gggcagaact ttgttactta2851 aacaccatcctgtttgcttctttcctcagg aactgtggct gcaccatctg2901 tcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctgg aactgcctct2951 gttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggcca aagtacagtg3001 gaaggtggataacgccctccaatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag3051 agcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcac cctgacgctg3101 agcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcg aagtcaccca3151 tcagggcctgagctcgcccgtcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt3201 ag (SEQ ID NO :24)“mmmvr&isx
nmm/IgM>IgD>IgE>
IgAi￡ IgG,￡n IgGU IgG2> IgG2b> IgG3 & IgG4,
Fab- Fab’ - in'IS; > F (ab) 2- Jt'I&'.'K'pj' F (ab) 2Fab’Fab-
H W V CDR- E (V sg CDR- ESI^A^IfMefctiAffi^tg^E”) A
wo 00/24782 ^3
gjtfc,(vH)” (vH)
m&i iim CDRU2 m / ^ 3,
(vH) Wcdrí￡M >-
CDRo(vH)
(ASn)0 m^e (vh) “mrnm^mx
SEQ ID NO : 12CDR2 E ( S Cê SEQ ID NO :11) -
AMikiiiWopm“^±Amimw”ft “^±\”^m# b￡r
" >Knappik (2000) J Mol Biol. 296(1),57-86 ^R Rauchenberger(2003), J Biol
Chem. 278 (40), 38194-205Y-1 (IgGl) iüM ^M^ f è, ^ifiíP^RiU IgGIgGl
^\￡^^llWgfìlMfìl>FaKFab/c,Fv,Fab, íRF(ab> )2 “ iW X-, Wfil Fvs (scFv) mKW -
s vHmmùmum/化VH-⑶R。术语“抗体分子”也涉及重组生产的抗体分子/抗体构建物，它们除一种特异性 外(如抗AP/AP)，还可包括其它或更多特异性。此类构建物可包括但不限于“双特异性” 或“三特异性”构建物。本发明术语“抗体分子”的其它细节见下。上文指出并考虑到至少一个抗原结合位点，如至少一个本文所述的糖基化的重链 可变区中包含本文所定义的糖基化的单链抗体、嵌合抗体、CDR-嫁接抗体、二价抗体_构建 物、抗体融合蛋白、交叉克隆抗体或合成抗体。例如当生产单链抗体时，本文所述的“重链可 变区”不限于重链本身，还涉及起源于完整抗体重链，如完整免疫球蛋白，如IgG的对应部 分。此部分可独自或与对应框架部分一起作为对应的CDR。而且，本文上下文也考虑到免疫 球蛋白基因的遗传变体。如免疫球蛋白重G链亚类l(IgGl)的遗传变体可在CH1结构域中 包含Glm(17)或Glm(3)同种异型标记、或在CH3结构域中包含Glm(l)或Glm(非-1)同种 异型标记。本文中优选使用Gm(17)(z)和Gm(l)(a)同种异型的IgGl。本发明的抗体分子 也包含修饰或突变的抗体，如Fc-受体结合或补体结合增强或削弱的突变IgG。在一个实施 方式中，本发明提供的抗体是完全人源化抗体或“完全人”抗体。因此，本发明的抗体也包含交叉克隆抗体，即本文所述包含来自一种或多种亲本 或亲和优化抗体的不同抗体区(如CDR-区)的抗体。这些交叉克隆抗体可以是数个不同 框架，如IgG-框架，如(人)IgGl-、IgG2a或IgG2b-框架中的抗体。例如，所述抗体框架为 哺乳动物如人的框架。轻链和重链的结构域的总体结构相同，每一结构域含有四个框架区， 其序列相对保守并由三个超变结构域(称为互补决定区)(CDR1-3)连接。本文所用“人框架区”涉及与天然产生的人免疫球蛋白框架区基本相同(约85% 或更多，通常90-95%或更多)的框架区。抗体的框架区(如组成性轻链和重链的框架区组 合)用于排定CDR的位置。CDR主要负责结合抗原表位。值得注意的是，不仅本文所述的交 叉克隆抗体可存在于优选的(人)抗体框架中，包含本文所述抗体的CDR的抗体分子同样 可被引入免疫球蛋白框架。框架区的例子包括IgGl、IgG2a和IgG2b。最优选的是人框架 和人IgGl框架，如SEQ ID NO 6显示的抗体重链。在一个实施方式中，抗体同种型的重链可变区可包含含有下列氨基酸的 CDR1GFTFSSYAMS(SEQ ID NO: 10)所述⑶R1可由下列核酸序列编码ggatttacctttagcagctatgcgatgagc(SEQ ID NO 9)抗体同种型的重链可变区中可包含下列CDR2:AINASGTRTYYADSVKG(SEQ ID NO: 12)(N :完整重链Asn-52的N_连接糖基化位点)所述('丨可由下列核酸序列编码gctattaatgcttctggtactcgtacttattatgctgattctgttaagggt(SEQ ID NO 11)依照本发明在所述⑶R2区中发生N-糖基化，位于重链可变区的对应Asn52位点， 所述可变区(VH)由SEQ ID NO :1所示核酸分子编码并具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列。而且，抗体同种型的重链可变区可包含含有下列氨基酸序列的CDR3:
GKGNTHKPYGYVRYFDV(SEQ ID NO: 14)TOCDR3:ggtaagggtaatactcataagccttatggttatgttcgttattttgatgtt(SEQ ID NO :13)(L) fj|,CDR :CDRl: RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO :16)agagcgagccagagcgtgagcagcagctatctggcg(SEQ ID NO :15)CDR2: GASSRAT(SEQ ID NO :18)
ggcgcgagcagccgtgcaact(SEQ ID NO :17)CDR3: LQIYNMPI(SEQ ID NO :20)cttcagatttataatatgcctatt(SEQ ID NO :19)
^ Asn 306 (Kabat- J“Asn297” (Kabat(1991)jg ù J￥
3H) (Sequence of proteins of Immunological Interest), % 5 Jljx, ^ M è=l j'H Jil M Tü : H J|C ê ^ ^ H ALA fff ;ü 41 ;L> (National Center for Biotechnology
Information, National Library of Medicine))
PMPéKj'a'W Asn-X-Ser/ThrSEQ ID NO :5
#J, BP SEQ ID NO :6o
(VH)(Asn),MVH êT3W^Jtfe 3 :(a) &y3 ü SEQ ID NO :1:CAGGTGGAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCTATTAATGCTTCTGGTACTCGTACTTATTATGCTGATTCTGTTAAGGGTCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA(SEQ ID NO :1) ;(b)SEQ ID NO :2=QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMSWVRQAPGKGLEWVSA I M ASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO :252 M Asn) ;(c)(a) sg (b) -A4 It /A 415 :DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGA11GLMVGGVVIA (SEQ ID NO :3) ;
(d)与核酸分子(a)或(b)杂交并编码能够与下列3 -A4肽/A P 4氨基酸序列中 至少两个区域或与包含至少15个氨基酸的SEQ ID NO 3片段的至少两个区域结合的多肽 的核酸分子DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO :3)。其中所述P -A4肽A 0 4的两个区域或其所述片段包含SEQ ID No. 3的3_6位和 18-26位氨基酸；或(e)简并至(a)-(d)中任一项定义的核酸序列的核酸序列。本领域技术人员了解本文所用术语“与核酸分子(a)或(b)杂交并编码能够与 3 -A4肽/AP 4上至少两个区域结合的多肽的核酸分子”涉及双链核酸分子的编码链，其中 非编码链与上述核酸分子(a)和(b)杂交。如上所述，含有本文定义Asn-糖基化的纯化抗体分子可鉴定和表述为重链包含 含糖基化的可变区的抗体分子，所述重链选自(a) SEQ ID NO :5、23或25所示核酸分子编码的重链多肽；(b)含有SEQ ID NO 6或26所示氨基酸序列的重链多肽；(c)核酸分子编码的重链多肽，该核酸分子能与核酸分子(a)杂交，并编码能与下 列氨基酸序列所示P -A4肽/AP 4或包含至少15个氨基酸的它的片段结合的多肽DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID NO 3);或(d)核酸分子编码的重链多肽，该核酸分子能与核酸分子(a)杂交，并编码能与下 列氨基酸序列所示P -A4肽/AP 4上至少两个区域或包含至少15个氨基酸的SEQ ID NO. 3片段的至少两个区域结合的多肽DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO 3)；其中所述P -A4肽A 0 4上两个区域或其所述片段包含3_6位和18_26位氨基酸。上述鉴定的抗体(如本文的示例性抗体)也可包含具有下列氨基酸序列的L-链
DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO 22)或由(例如)下列核酸序列编码的L链gatatcgtgctgacccagagcccggcgaccctgagcctgtctccgggcgaacgtgcgaccctgagctgc agagcgagccagagcgtgagcagcagctatctggcgtggtaccagcagaaaccaggtcaagcaccgcgtctattaa tttatggcgcgagcagccgtgcaactggggtcccggcgcgttttagcggctctggatccggcacggattttaccctga ccattagcagcctggaacctgaagactttgcgacttattattgccttcagatttataatatgcctattacctttggcca gggtacgaaagttgaaattaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctgg aactgcctctgttg
tgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag(SEQ ID NO :21)Asn-
yìmmà ■.
(a) SEQ ID NO :7,21,24 ^ 27;(b) If SEQ ID NO =8,22 s!c 28aJ;(c)(a)
-A4 li /A 415:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID NO :3) ;sJt (d) mmftxmmmàMXAmmftxtkmmftx (a)
-A4 It /A 415SEQ ID NO.DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO :3) ;j /dna^Rrmmmnmi^rm
Sambrook, Russell(Molecular Cloning,A Laboratory Manual),
i(Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. ) (2001) ;Ausubel,
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lxSSC, 0. 1%SDS, 65°C o fflTMJIsIMsK 6xSSC, 1%SDS, 65°C <.
#f^0 ^ :nTMiJPAiP /
(Denhardt’s)
i^O>BLOTTOjf*, ììf|DNAìR^WM^[Jo éT^#lé|ìì ,
CDR12
TO,15 >h,18 >h,21 >h,30 >h,
40 ^h,60 ^ho MJ=L, -%_t yfi
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(￡n Cot sgRot frfir)的核酸序列和另一条固化于固体支持物(如膜、滤器、芯片、插脚或如固定细胞的载玻片) 的核酸序列之间形成。术语互补或互补性指在允许的盐和温度条件下多核苷酸通过碱基配 对自然结合。例如，序列“A-G-T”与互补序列“T-C-A”结合。两个单链分子的互补可为仅 有部分核酸结合的“部分”互补，或为单链分子间全部互补的完全互补。核酸链间的互补程 度显著影响核酸链间的杂交效率和长度。当进行依赖于核酸链间结合的扩增反应时，这点 尤其重要。术语“杂交序列”优选指与上述编码抗体分子的核酸序列序列相同性为至少40%、 优选至少50%、更优选至少60%、更优选至少70%、特别优选至少80%、尤其更优选至少90%、尤 其更优选至少95%以及最优选至少97%的序列。而且，术语“杂交序列”尤指编码与本文上 述抗体分子的氨基酸序列序列相同性为至少40%、优选至少50%、更优选至少60%、更优选至 少70%、尤其优选至少80%、尤其更优选至少90%、尤其更优选至少95%以及最优选至少97% 的抗体分子的序列。按照本发明，当出现两个或多个核酸或氨基酸序列时，术语“相同”或“相同性百分 数”指利用本领域熟知序列比较算法、或人工比对或视觉检视在比较窗口或指定区域上比 较和比对最大对应性时，两个或多个序列或亚序列相同、或有特定百分比的氨基酸残基或 核苷酸相同(如60%或65%相同,优选70-95%相同，更优选至少95%相同)。例如序列相同 性为60%-95%或更高时认为是二序列基本相同。此定义也应用于测试序列的互补链。优选 在至少长约15-25个氨基酸或核苷酸的区域，更优选在至少长约50-100个氨基酸或核苷酸 的区域上存在所述的相同性。本领域技术人员知道如何判断序列间的相同性百分数，例如 采用本领域熟知的基于CLUSTALW计算机程序的算法(Thompson Nucl. Acids Res. 2(1994), 4673-4680)或基于 FASTDB 的算法(Brutlag Comp. App. Biosci. 6 (1990)，237-245)。尽管FASTDB算法通常不考虑序列内部非匹配删除或加入，即缺口，但在计 算中，可人工纠错以避免高估相同性％。然而，CLUSTALW不将序列缺口计入相同性计 算中。本领域技术人员也可使用BLAST和BLAST 2. 0算法(Altschul，Nucl. Acids Res. 25(1997) ,3389-3402 ；Altschul, J. Mol. Evol. 36(1993) ；290-300 ；Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990)，403-410)。核酸序列BLASTN程序使用默认字长(W)为11，期望值(E)为 10，M=5、N=4，并进行双链比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用默认字长(W)为3，期望 值(E)为 10。BL0SUM62 评分矩阵(Henikoff Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 89 (1989)，10915) 使用比对值⑶为50、期望值(E)为10、M=5、N=4并进行双链比较。而且，本发明也涉及核酸分子，与上述杂交分子相比其序列是简并序列。本发明所 用术语“由于遗传密码而成为简并性”意味着由于遗传代码的冗余，同一氨基酸可由不同核 苷酸序列编码。为了检测在给定抗体序列中的氨基酸残基或核苷酸残基是否对应SEQ ID N0U 5、23和25中的任一氨基酸序列或核苷酸序列的特定位置，技术人员可使用本领域中熟知 的手段和方法(如比对法)，通过人工途径或使用计算机程序途径，例如下文提及的与“杂 交”和同源程度的定义有关的途径确定。例如，可使用代表基础本地比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool BLAST)的 BLAST 2.0 (Altschul(1997)，同上；Altschul(1993)，同上；Altschul (1990)，同 上)搜索本地序列比对。如上文讨论的BLAST能够比对核苷酸和氨基酸序列以确定序列相似性。因为比对的局部属性，BLAST在确定精确配对或识别相似序列时尤其有用。BLAST算 法输出的基本单位是高分节段对(High-scoring Segment Pair) (HSP)。HSP由两个任意等 长的序列片段组成，其比对是局部最大的，该比对评分达到或超过用户设定的域值或截止 评分。BLAST方法是为了在查询序列和数据库序列间寻找HSP，评价任何找到的配对的统计 学显著性，并仅报告道那些满足用户选择的显著性域值的配对。参数E确立了报告数据库 序列配对的统计学显著性域值。E可解释为在整个数据库搜索的环境中，所期望的HSP (或 一组HSP)出现频率的上限。程序输出报告任何满足E的配对的数据库序列。使用BLAST的类似计算机技术(Altschul (1997)，同上；Altschul (1993)，同上和 Altschul (1990)，同上)在核苷酸数据库，如GenBank或EMBL中搜索相同的或相关的分子。 该分析明显快于基于膜的多重杂交。此外，可更改计算机搜索的灵敏度以确定任何特定配 对是否归类为精确或相似。搜索的基础是产物评分，其定义如下%序列相同件x%最大BLAST分数100考虑了两序列间的相似程度以及序列配对的长度。例如，产物评分为40时，配对 精确到有1-2%的误差；若为70，配对则为精确。选择产物评分在15-40间的分子以鉴定 相似的分子，尽管更低的分数可能鉴定相关分子。本领域内所知能够产生序列比对的程 序的例子是 CLUSTALW 计算机程序(Thompson, Nucl. Acids Res. 2 (1994)，4673-4680)或 FASTDB(Brutlag Comp. App. Biosci. 6(1990)，237-245)。在一个实施方式中，本发明提供糖基化的抗体同种型，其中位于VH区的Asn糖基 化选自(a)双触角复合物型无核心岩藻糖化的糖结构；(b)双触角杂合型的糖结构；(c)双触角寡甘露糖型的糖结构；和(d)附图5或27提供的任意结构的双触角结构。在本发明抗体的一个实施方式中，对应糖结构不包含核心岩藻糖化。对应的N-糖基化可主要由双触角复合物型无核心岩藻糖化的糖结构(> 75% ;主 要80 - 90%)组成，并且高达80%以上触角高度唾液酸化。少数糖结构分别属于双触角杂合 子和寡甘露糖型25%)，也参见附图5和27。可变区的糖基化结构不被来自蛋白质(氨 基酸多肽)的N-糖苷酶F切割(氨基酸多肽)。在一个实施方式中，通过以下方法进一步鉴定主要的复合物双触角糖结构-含有连接于一个或另一个或两个触角的一个或两个唾液酸。唾液酸是N-乙酰基 神经氨酸类型，最可能以a-2，3连接结合于末端@1，4连接的半乳糖。-缺少核心岩藻糖化，即在糖链的还原性末端缺少通过a-1 — 6连接连接于最核 心的N-乙酰葡糖胺的岩藻糖残基。在一个实施方式中，通过以下方法进一步鉴定杂合糖结构-含有复合型触角(连接于核心糖结构的乳糖胺单位(GlcNAc-Gal))作为双触角 结构的一个臂。该臂主要包含连接于末端0-1，4连接半乳糖的N-乙酰基神经氨酸。-含有连接于核心糖结构的1-3个其它甘露糖亚基作为其它触角。-缺少核心岩 藻糖化，即在糖链的还原性末端缺少通过a -1 — 6连接连接于最核心的N-乙酰葡糖胺的岩藻糖残基。在一个实施方式中，通过以下方法进一步鉴定寡甘露糖型糖结构-在完整的糖结构里含有4个(Man4— GlcNAc2)、5个(Man5 — GlcNAc2)或6个(Man6 — GlcNAc2)甘露糖亚基，即典型N-连接的核心糖结构中存在3个分支甘露糖亚基。-缺少核心岩藻糖化，即在糖链的还原性末端缺少通过α-I — 6连接连接于最核心的N-乙酰葡糖胺的岩藻糖残基。在本发明另一实施方式中，提供了一种组合物，包含特征是在重链可变区(Vh)的一个抗原结合位点包含糖基化的天冬酰胺(Asn)的抗体分子，和特征是在重链可变区(Vh)的两个抗原结合位点包含糖基化的天冬酰胺(Asn)的抗体分子，亦即包含单糖基化抗体和双糖基化抗体的组合物，下文中称作抗体组合物。术语抗体组合物也涉及包含含有至少一个本文所述糖基化Vh区或至少一个所述Vh区的糖基化CDR的分子的组合物，其中所述分子可为上述免疫球蛋白或免疫球蛋白同种型和修饰物。例如，所述组合物也可包含单链抗体(scFvs)或含有糖基化Vh衍生CDR区的双特异性分子。在下文提供本发明抗体组合物的其它定义。抗体组合物不含或仅含极少量的“￥11未糖基化”的抗体分子，即可变区，具体为重链可变区(Vh)不含本文定义的糖基化的抗体。在本发明的上下文中，尤其在本文所提供的抗体混合物中，术语“不含或仅含极少量的未糖基化的抗体分子”意为抗体组合物包含本文所述未糖基化同种型少于10%，如少于5%，如少于4%，如少于3%，如少于2%，如少于1%，如少于O. 5%或更少。因此，在一个实施方式中，本发明提供了包含单糖基化和/或双糖基化抗体(糖基化位于重链可变区)但不含可变区无糖基化的抗体分子的抗体制剂。再次，术语“不含可变区无糖基化的抗体分子”涉及其中本文所述未糖基化同种型的含量至多为 10%、5%、4%、3%、2%、1%、0· 5%，例如至多为 4%、3%、2%、1%、0. 5%、0· 3%、0· 2% 的抗体制剂/抗体混合物/抗体库。在一个实施方式中，本发明提供了不含有多于O. 5%可变区未糖基化(，例如重链可变区未糖基化)的抗体同种型的组合物。如上文指出，在本发明的实施方式中，提供了单糖基化抗体和双糖基化抗体，如免疫球蛋白的混合物，所述混合物不含可变区无糖基化的抗体分子。在本发明中将可变区如两个重链可变区(两个(Vh)-区)不含此类翻译后修饰的抗体称为“未糖基化形式”，它在重链的可变区中不含糖基化。然而，该“未糖基化形式”仍可包含抗体恒定区(C-区)的糖基化，例如，最常见位于Fe-部分的高度保守的糖基化位点，具体为本文所定义的在非可变/恒定Fe-部分的天冬酰胺(Asn) 306。单独的糖基化抗体同种型或单糖基化和双糖基化同种型的混合物是治疗阿尔茨海默病(AD)及其它淀粉样蛋白相关疾病如唐氏综合征、荷兰型遗传性脑出血伴淀粉样变、帕金森病、ALS (肌萎缩侧索硬化)、库贾氏病、HIV-相关痴呆和运动神经病中非常有用且有 利的治疗性抗体制剂。单独的糖基化抗体同种型或单糖基化和双糖基化同种型的混合物也是独特的诊断工具。本文所述两种糖基化同种型在体内的脑穿透性改善且高效。一种AD相关的淀粉样变小鼠模型PS2APP小鼠显示了有效的大脑穿透性和对β淀粉斑的特异性结合。
而且，体外免疫组织化学染色检测到提高了对真人β淀粉斑的特异性并显著降低了非特异性黏性。如所附实施例所述，人β淀粉斑一致性染色(consistent staining)的最小有效浓度测定为10ng/ml。如所附实施例所述， 不同糖基化抗体如免疫球蛋白的分离及表征揭示了重链可变区的糖基化对于抗原结合Αβ肽、诊断价值、药理学特性及功能活性有着惊人的影响。可对纯化抗体分子进行MS-分析、与可溶性Αβ结合的结合研究(Biacore)和表位作图(Pepspot分析)、聚集的Aβ的解离以及体内外结合β淀粉斑的显微术分析。在本发明的一个实施方式中，纯化抗体或抗体组合物能够特异性识别β -Α4肽/Αβ40如本文所述，在一个具体的实施方式中，纯化抗体或抗体组合物涉及能够特异性识别Αβ /Αβ 4两个区域(N-末端区域和中央/中间部分)的抗体或抗体组合物。本发明所用术语“特异性识别”指能够与本文所定义的β -Α4的两个区域中每一区域至少两个氨基酸特异性作用和/或结合的抗体分子。所述术语涉及抗体分子的特异性，即涉及其区分本文所定义β_Α4肽特定区域和β_Α4肽的另一不相关区域或另一非APP-相关蛋白质/肽/(不相关的)测试肽的能力。因此，特异性可通过本领域已知方法和本文所述公开的方法进行检测。此类方法包括但不限于Western印迹、ELISA-、RIA_、ECL_、IRMA-检测和肽扫描。此类方法还包括检测Kd值，如所附实施例所述。肽扫描(P印spot矩阵)常被用于描绘多肽抗原的线性表位图。在活化纤维素上将肽互相重叠连续合成多肽的一级序列。可通过常规发色法(含有酶或染料，如辣根过氧化物酶或4-氯萘酚或过氧化氢的第二抗体)、化学发光反应或本领域所知的相似方法对准备测试其检测或识别特定抗原/表位的能力的抗体对特定肽的识别进行评分。使用化学发光反应或荧光第二抗体时，反应可定量。当抗体与某组重叠肽反应时，可推断出该反应必需的最小氨基酸序列；见本发明提供的说明性实施例。同样的实验可揭示反应肽的两个远距离簇，表明对抗原性多肽中非连续即构象表位的识别(Geysen (1986)，Mol. Immunol. 23，709-715)。除P印spot实验外，可进行标准ELISA实验。如所附实施例所示，小六肽可与蛋白质偶联并包被到免疫检测板上，与受试抗体反应。可通过标准发色进行评分(如辣根过氧化物酶和第二抗体以及四甲基联苯胺和过氧化氢)。通过光密度(如450nm)对某些孔中的反应进行评分。背景(=阴性反应)一般可为O. 10D，阳性反应一般为10D。这意味着阳性/阴性反应的差异(比率)大于10倍。所附实施例将给出更多细节。此外，下文中将给出用于检测特异性和“特异性识别”本文定义β -Α4肽两个区域的能力的定量方法。术语“ β -Α4肽两个区域”涉及的两个区域与SEQ ID No. 3 ( β _Α4肽)N-末端氨基酸3-6和氨基酸18-24的中央/中间表位有关。如所附实施例所述，本文具体提供并举例的双糖基化抗体A同种型(见所附实施例)检测了 Αβ分子的两个部分，第一部分包含N-末端氨基酸1-10，第二部分包含A β中央/中间部分氨基酸17-26(如SEQ ID No. 3所示)。因此，在本文提供的包含本文所述单糖基化抗体和双糖基化抗体同种型的抗体混合物中，两个区域某种程度上也可放宽至包含氨基酸1-10(或-11或-12)或其较短部分和氨基酸17-26 (或氨基酸16-27)或包含氨基酸17-26间较短部分，如氨基酸19-26或20-26。本发明上下文中术语“ β -Α4肽”涉及上文所述A β 39、A β 41、A β 43，尤其涉及A β 40和A β 42。所附SEQ ID NO :3中也描述了 Αβ 42。值得注意的是术语“ β _Α4肽的两个区域”也涉及包含本文所定义β_Α4肽两个区域或其部分的“表位”和/或“抗原决定簇”。依照本发明，在β-Α4肽一级结构中(在氨基酸序列水平上)所述β_Α4肽两个区域之间间隔了至少一个氨基酸，如至少两个、三个、四个、五个和六个氨基酸。如本文所示以及所附实施例所记录，本发明抗体/抗体分子检测/作用于和/或结合本文所定义β -Α4肽的两个区域，其中所述两个区域间隔(在氨基酸序列一级结构水平上)至少一个氨基酸，其中间隔所述两个区域/ “表位”的序列可包含多于七个、八个、十个甚至约十四个氨基酸。术语“ β -Α4肽两个区域”也涉及由所述两个区域或其部分组成的构象表位或不连续表位；参见Geysen (1986),同上。在本发明的上下文中，通过在一级序列中隔开、但当多肽折叠为天然蛋白时在表面集中的两个或多个离散氨基酸序列确定的构象表位(Sela，
(1969) Science 166，1365 和 Laver，(1990) Cel，161，553-6)。考虑到本发明的抗体分子与由本文所述β -Μ两个区域或下文公开的其部分组成或包含所述区域或部分的构象表位特异性结合和互相作用。认为本发明“抗体分子”对(a)含有i3-A4(SEQ ID NO. 3)氨基酸1-11(或其部分)的氨基酸臂以及(b)含有i3-A4(SEQ ID NO. 3)氨基酸16-27 (或其部分)的氨基酸臂具有同时和独立的双重特异性。这些臂的片段或部分包含至少两个，大多数情况下至少三个氨基酸。抗体分子，如免疫球蛋白等可在以下三种系统中进行表达a)含有爱波斯坦-巴尔病毒核抗原的瞬转的人胚肾细胞(HEK 293 EBNA，英杰公司(InvitiOgen))，b)瞬转的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)以及c)稳转CHO细胞系(CHO Kl和CHO Kl SV，龙杂生物公司(LonzaBiologies))。利用特定的纯化步骤可以分离三种不同的抗体分子(未糖基化、单糖基化或双糖基化的抗体分子)，包括如下详述的蛋白A纯化、阳离子交换色谱以及大小排阻柱分离。在本发明的一个实施方式中，在(如)CHO细胞或HEK 293细胞、优选CHO细胞中重组产生抗体分子。在一个具体的实施方式中，在CHO细胞中表达后可获得上述鉴定的糖基化模式。CHO细胞在本领域内为人熟知，包括实验部分中使用的CHO细胞，如CHO Kl或CHO Kl SV 细胞。常用的 HEK 293 细胞是 HEK 293 EBNA。如实施例所述在真核表达系统尤其在CHO细胞中重组表达糖基化的发明抗体。然而，也考虑到其它表达细胞即真核细胞。真核细胞包括(如)真菌或动物细胞。合适真菌细胞的例子是酵母细胞，如酵母属、酿酒酵母种。合适的动物细胞如昆虫细胞、脊椎动物细胞，如哺乳动物细胞，如 NSO、MDCK, U2-0SHela、NIH3T3、MOLT-4、Jurkat, PC-12, PC-3, MR、NT2N、Sk-n-sh、CaSki、C33A。也考虑到人细胞系。这些宿主细胞如CHO细胞提供对本发明抗体分子的翻译后修饰，包括前导肽或信号肽序列的移除、H(重)和L(轻)链的折叠和组装，最重要的是在分子正确位点的糖基化，即在重链可变区的糖基化。如在CHO细胞中，在重组生产过程的分泌过程中，此类信号肽或前导序列被宿主的信号肽酶酶切。其它本领域所知合适的细胞系可获自细胞系仓库，如美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection) (ATCC)。依照本发明，还考虑到原代细胞/细胞培养物可用作宿主细胞。所述细胞具体衍生自昆虫(如果蝇或蜚蠊类昆虫)或哺乳动物(如人、猪、小鼠或大鼠)。所述宿主细胞也可包含来自和/或衍生自细胞系如神经母细胞瘤细胞系的细胞。因此，通过重组表达系统制备本发明的抗体分子。此类系统的一个例子(如上所述)是使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的哺乳动物表达系统。这些系统可与谷胺酰胺合成酶(GS)系统一起使用(W0 87/04462 ；W0 89/01036 ;Bebbington，1992，Biotechnology (纽约)，10，169-75)。该系统包括用编码GS酶的基因和所需抗体基因转染CHO细胞。利用无谷氨酰胺培养基培养选择CHO细胞，并使用甲硫氨酸亚氨基代砜(MSX)抑制GS酶。为了生存，该细胞将增加GS酶表达并伴随表达mAb。
另一种可能的表达系统是CHO dhfr系统，其中CHO细胞为二氢叶酸还原酶(dhfr-)缺陷型，并且依赖胸苷和次黄嘌呤才能生长。利用抗体和dhfr基因转染亲本(parenteral)CHO dhfr-细胞系从而能够选择dhfr+表型的CHO细胞转化子。在缺乏胸苷和次黄嘌呤的条件下进行选择。使用甲氨蝶呤(MTX)可使抗体基因的表达升高。该药物是dhfr酶的直接抑制剂，以便分离在此条件下足以生存的扩增dhfr基因拷贝数及抗体基因的抗性集落。可通过包括以下步骤的方法制备纯化抗体分子，如免疫球蛋白(a)在哺乳动物细胞，如CHO或HEK 293细胞中重组表达编码如上所述抗体分子的异源核酸分子；和(b)通过包括以下步骤的方法纯化所述重组表达的抗体分子(bI)蛋白A柱纯化；(b2)离子交换柱纯化，如阳离子交换色谱；以及，任选(b3)大小排阻柱纯化。纯化实验方案还可包括其它步骤，如其它浓缩步骤如渗滤，或分析步骤，如使用分析柱。该方法/步骤还可包括病毒灭活步骤和/或病毒去除步骤，如过滤/纳米过滤。同样考虑到可行的是重复特定步骤(如可进行两步离子交换色谱)或省去某些步骤(如大小排阻柱色谱)。蛋白A是一组能够与大多数IgGl同种型Fe区域结合的特异性配体。它由某些金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌株合成并可从中分离,并与色谱珠偶联。可购得数种类型的凝胶制剂。可使用的蛋白A柱的例子是MabSelect (商标)柱。理想的,使用25mMTris/HCl、25mM NaCl、5mM EDTA平衡该柱，并将细胞培养物上清上柱。利用IM Tris/HCl pH 7. 2洗柱，用IOOmM乙酸pH 3. 2洗脱抗体。阳离子交换色谱则利用固定相中带正电的基团和处于流动相中样品的相互作用。当使用弱阳离子交换柱(如CM Toyopearl 650* )时，进行如下色谱
步骤用IOOmM乙酸pH 4预平衡后，将蛋白A洗脱液上柱，用IOOmM乙酸pH 4洗涤，250mM乙酸钠(pH 7.8-8.5)和500mM乙酸钠(pH 7.8-8.5)洗脱抗体并分馏。第一步时，正常洗脱双糖基化同种型组分和单糖基化同种型组分的混合物，使用第二步则正常洗脱未糖基化同种型组分。当使用强阳离子交换柱(如SP Toyopearl 650)时,利用盐的步骤洗脱抗体用50mM乙酸pH 5. O预平衡后，蛋白A洗脱液上柱并使用50mM乙酸和2IOmM氯化钠以pH 4进行第一步洗脱。第二个洗脱步骤使用50mM乙酸和350mM氯化钠。通过第一个盐步骤正常洗脱双糖基化同种型组分和单糖基化同种型组分的混合物，通过第二个盐步骤正常洗脱未糖基化同种型。
此外，也可从强阳离子交换柱(如SP- Sepharoseft )通过盐梯度来洗脱抗体预
平衡、上柱并在PH 4. 5洗柱后，使用50mM MES pH 5. 8 -至50mMMES/lM氯化钠pH 5. 8的盐梯度。通常，双糖基化同种型、单糖基化的同种型和未糖基化同种型组分分别被洗脱。接着可收集双糖基化同种型组分和单糖基化同种型组分，形成产物库和/或所需的抗体混合物。进一步纯化双糖基化抗体分子和单糖基化抗体分子的混合物如免疫球蛋白可使用大小排阻色谱。有用柱子的例子是Superdex 200' 柱。运行缓冲液的例子包括组氨酸/
氯化钠，如IOmM组氨酸/125mM氯化钠/pH 6和磷酸盐缓冲盐水(PBS)。流过模式的阴离子交换色谱后接浓缩/渗滤步骤是另一种纯化步骤。Q Sepharose*是阴离子交换步骤树脂的例子。例如，用37. 5mM Tris/HCl pH 7. 9三倍稀释SP色谱洗脱液并通过25mM Tris/83 mM乙酸钠预平衡的Q-S印harose柱。收集流出液并调节至pH 5. 5,利用如Hydrosart 30 kDK膜超滤浓缩。接下来用10体积的20mM组氨酸/HCl pH 5. 5渗滤浓缩液。上述纯化方案也可还包含另一步骤(C)分析色谱步骤,如使用Mono_SHR5/5柱。然而，也考虑到其它步骤如渗滤来浓缩抗体分子。在本发明的一个实施方式中，提供了包含本文所述抗体分子或上文所述方法制备的抗体分子的组合物、抗体制剂或抗体库。在本发明的这个实施方式中，所述组合物包含单糖基化或双糖基化抗体。在另一实施方式中，所述组合物包含单糖基化或双糖基化(在重链可变区)抗体并且所述组合物衍生自可变区缺少糖基化的抗体分子。在本实施方式的上下文中，术语“抗体库”涉及单糖基化或双糖基化(在重链可变区)抗体的混合物，这些抗体可单独分离并混合成一种混合物。本文所提供抗体混合物或抗体库可包含50%单糖基化的抗体和50%双糖基化的抗体(如本文定义)。然而，也考虑了比率为30/70至70/30。然而，本领域熟练技术人员明白本发明抗体混合物中也能采用其它比率。例如，本发明上下文中也可使用10/90或90/10、20/80或80/20以及40/60或60/40。如实施例所述，本文抗体混合物包含本文所定义的双糖基化和单糖基化的抗体的尤其有用的比率为40/60 -至45/55。本文提供的组合物在诊断或药物组合物中尤其有用。因此，本发明提供包含下述成分的诊断或药物组合物(a)包含一个具有糖基化Asn的抗原结合位点的上述抗体分子；(b)包含两个具有糖基化Asn的抗原结合位点的上述抗体分子；或者，最优选(C)抗体分子(a)与(b)的混合物。本文提供的包含一个具有糖基化Asn的抗原结合位点的抗体分子以及两个具有糖基化Asn的抗原结合位点的抗体分子的混合物缺少未糖基化(涉及重链可变区)的同种型。如上文指出，术语“缺少未糖基化(涉及重链可变区)的同种型”涉及混合物/抗体库 /抗体制剂，所述混合物中重链可变区未糖基化的抗体种类少于5%、4%、3%、2%、1%、甚至少于O. 5%。如实施例所述，所述混合物/抗体库/抗体制剂可能几乎不包含(少于O. 5%)未糖基化的同种型。使用本领域已知方法容易测定给定抗体组合物中给定糖基化同种型(如本文所述，重链可变区的糖基化，见附图14)的百分数和/或数量，这些方法包括但不限于质谱、SDS-PAGE分析、离子交换、HPLL, ELISA等。如所附实施例所示，本发明抗体对真阿尔茨海默病β淀粉斑进行特异、灵敏的免疫修饰通过使用AD病人脑组织的冰冻切片进行免疫组化染色实验得以证明。利用来自Αβ免疫接种病人的人抗Aβ抗体同样显示了对脑切片的β淀粉斑有效染色(Hock，2002，Nature Medicine，8，1270-1275)。此外，在荷 载人β淀粉斑的转基因动物模型上也显示了免疫修饰(Richards, 2003, J. Neuroscience, 23,8989-9003)。在类似的动物模型上证明这种斑结合导致其清除并最终引起疾病相关症状的改善，讨论了 Fe-依赖过程的参与(Bard、2000，Nature Medicine,6, 916-919 ；ffilcock,2003, Neurobiology Disease,15，11-20 ;Wilcock, 2004, J. Neuroscience, 24,6144-6151)。而且，有报道称抗-A β 抗体与 β 淀粉斑的有效结合与疾病进展减缓有关(Hock，2002，Nature Medicine，8，1270-1275 ;Hock，2003，Neuron, 38, 547-554)。这个发现以及人脑组织的尸检分析表明小胶质细胞的吞噬作用参与了人体斑清除机制(Nicoll, 2003,Nature Medicine, 9,448-452)。因此本发明抗体或包含于药物组合物的特定抗体是人IgGl，IgGl主要负责人体中FcR依赖的过程。本发明抗体/混合物有效免疫修饰β淀粉斑表明药物能够在人体中有效引起被动免疫以清除存在的β淀粉斑并防止β淀粉斑的形成。此外，抗体优选可透过血脑屏障到达其目的地。对于大分子如人IgG而言，该过程显著减少，因此CSF中仅能达到约0. 1-0. 2%血浆抗体浓度。斑清除的机制还是一个存在争议的话题，Αβ肽的外周效应可能参与其中(Dodart, 2002, Nature Neuroscience, 5 452-457)。因此，产生的治疗性抗体或本发明相应的单糖基化和双糖基化(重链可变区)的混合物对于体外无需Fe-依赖过程参与的A β多聚体解聚以及与CSF中可溶性A β单体和寡聚体结合同样具有价值，因为中和可溶性单体Αβ肽或寡聚Αβ肽(如聚集中间体)同样也可有利于整体的淀粉样变的减轻(Du，2003，Brain, 126 :1_5)。本发明组合物可以固体或液体形式给药，可为粉末、片剂、溶液或气溶胶等形式。所述组合物可包含一种或多种本发明的抗体/抗体分子，最优选本文提供的单糖基化和双糖基化抗体的混合物。所述药物组合物优选任选地包含药学上可接受的运载体和/或稀释剂。本文公开的药物组合物对于治疗神经病和/或神经变性疾病尤其有用。所述疾病包括但不限于阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、荷兰型遗传性脑出血伴淀粉样变、唐氏综合征、HIV-痴呆、帕金森病和衰老相关性神经元疾病。可考虑将本发明药物组合物用作淀粉斑形成的有效抑制剂或淀粉斑解聚的有效刺激剂。因此，本发明提供包含本发明化合物的药物组合物，用于治疗淀粉样蛋白形成疾病/失调。术语“淀粉样蛋白形成疾病/失调”包括淀粉样纤维的形成或沉积和/或病理性APP蛋白水解相关或引起的任何疾病。淀粉样蛋白形成疾病的示例包括但不限于阿尔茨海默病(AD)、唐氏综合征、Lewy体形成相关性痴呆、帕金森病痴呆、轻度认知损伤、大脑淀粉样蛋白血管病和血管性痴呆。不同的淀粉样蛋白形成疾病定义为或特征是淀粉样蛋白沉积物的多肽组分的特性。例如，β淀粉样蛋白的特征是在阿尔茨海默病对象中发现淀粉样蛋白沉积。合适的药学运载体、赋形剂和/或稀释剂的例子为本领域所熟知，包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂如油/水乳剂、各种类型的湿润剂、消毒溶液等。利用已知常规方法可配制包含此类运载体的组合物。合适的运载体可包含与抗Aβ特异性结合试剂或抗体联用时，保留对A β的高度亲和结合性，并不与对象免疫系统反应的任何材料，包括赋形剂、表面活性剂、增强剂等；参见《雷明顿药物科学》(Remington' s Pharmaceutical Sciences)(1980) 16版，0801，1编。这些药物组合物可以合适剂量给予对象。可通过不同方式给予合适组合物，如胃肠道外、皮下、腹膜内、外用、支气管内、肺内和鼻内给药，并且，如需局部治疗，可进行损伤内给药。胃肠道外给药包括腹膜内、肌肉内、皮内、皮下、静脉内或动脉内给药。尤其优选的给药方式是注射和/或递送至脑动脉的某部位或直接递送至脑组织。本发明组合物也可直接给予靶位点，如通过生物射弹递送至外部或内部靶位点，如脑。将所需纯度的抗体与任意生理上可接受的运载体、赋形剂、稳定剂、表面活性剂、缓冲液和/或张力剂混合制备包含本文所述糖基化抗体的药物组合物。在所使用的剂量和浓度下，可接受的运载体、赋形剂和/或稳定剂没有毒性，并且包含缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、甲硫氨酸和柠檬酸； 防腐剂(如乙醇、苄醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、杀藻胺或其组合)；氨基酸如精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、脯氨酸和其组合物；单糖、二糖和其它糖；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，如明胶或血清白蛋白；螯合剂如EDTA ;糖如海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、葡糖胺、N-甲基葡糖胺(所谓“甲葡胺”)、半乳糖胺和神经氨酸；和/或非离子表面活性剂，如吐温、Brij普朗尼克、Triton-X或聚乙二醇(PEG)。药物组合物可为液体形式、冻干形式或冻干形式重建的液体形式，其中在给药前用无菌溶液重建冻干制剂。重建冻干组合物的标准步骤是将一定体积的纯水(通常与冻干中去除的水等量)加回，然而含有抗菌药的溶液也可用于生产胃肠道外给药的药物组合物;参见 Chen (1992)Drug Dev Ind Pharm 18,1311-54。药物组合物中示例性的抗体浓度范围可为约lmg/mL-200mg/ml或约50mg/mL-200mg/mL、或约150mg/mL-200mg/mL。明确起见,需要强调的是本文标明的浓度是液体中的浓度或自固体形式精确重建的液体中的浓度。抗体的水性制剂可在pH-缓冲液中制备，如pH范围约4. 0-7. O,或约5. 0-6. O、或约5. 5。pH在该范围内的合适缓冲液的例子包括磷酸盐、组氨酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、醋酸盐缓冲液和其它有机酸缓冲液。根据缓冲液和所需制剂张力，缓冲液浓度可为约ImM-lOOmM、或约 5mM-50mM。抗体制剂可包含张力剂以调节制剂的张力。示例性的张力剂包括氯化钠、氯化钾、甘油和来自氨基酸组的任何组分、糖及它们的组合。尽管高渗或低渗溶液可可能合适，但优选等张的水性制剂。术语“等张的”指与其它溶液相比该溶液具有相同的张力，如生理盐溶液和血清。张力剂的用量可以是约5mM-350mM，尤其是105mM_305nM。也可在抗体制剂中加入表面活性剂以减少制剂抗体的聚集和/或最大程度减少制剂中形成的颗粒和/或降低吸附性。表面活性剂的示范性例子包括聚氧乙基山梨聚糖脂肪酸酯(吐温)、聚氧乙烯烧基醚(Bri j)、烧基苯基聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚 氧丙烯共聚物(泊洛沙姆(Poloxamer)、普朗尼克(Pluronic))和十二烧基硫酸钠(SDS)。优选的聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯是聚山梨酯20(商标吐温20 )和聚山梨酯80(商标吐温80 )。优选的聚乙烯-聚丙烯共聚物是商标为普朗尼克 F68或泊洛沙姆188 的物
质。优选的聚氧乙烯烷基醚是商标为Bri j 的物质。表面活性剂的示例性浓度范围可以是约 O. 001%-l%w/v。也可加入冻干保护剂(Iyoprotectant)对抗冻干过程中的不稳定条件以保护不稳定活性成分(如蛋白质)。例如，已知的冻干保护剂包括糖(包括葡萄糖和蔗糖)、多元醇(包括甘露醇、山梨糖醇和甘油)和氨基酸(包括丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸)。冻干保护剂用量通常为约10mM-500nM。在一个实施方式中，该制剂包含上述物质(即糖基化的抗体、表面活性剂、缓冲齐U、稳定剂和/或张力剂)，基本不含一种或多种防腐剂，如乙醇、苄醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、杀藻胺或其组合。在另一实施方式中，制剂中可包含防 腐剂，如浓度范围为约O. 001-2%(w/v)的防腐剂。在一个实施方式中，本发明抗体制剂为适合肠道外给药的液体或冻干制剂，可包含-约l-200mg/mL本文所述的糖基化抗体或抗体组合物；-约O.001-1%至少一种表面活性剂；-约I-IOOmM 缓冲剂；-任选约10-500mM稳定剂和/或约5_305mM张力剂；-pH 约 4. 0-7. O。在优选实施方式中，本发明的胃肠道外制剂为含有以下组分的液体或冻干制剂-约l-200mg/mL本文所述糖基化的抗体或抗体组合物，-O. 04% 吐温 20w/v、-20mM L-组氨酸，-250mM 蔗糖，-pH 5. 5。在更优选实施方式中，本发明胃肠道外制剂也可包括含有以下组分的冻干制剂-15mg/mL本文所述的糖基化抗体或抗体组合物，-O. 04% 吐温 20w/v，-20mM L-组氨酸，-25OmM 蔗糖，-pH 5. 5 ；或者-75mg/mL本文所述的糖基化抗体或抗体组合物，-O. 04% 吐温 20w/v,-20mML_ 组氨酸，-250mM 蔗糖，-pH 5. 5 ；或者-75mg/mL本文所述的糖基化抗体或抗体组合物，-O. 02% 吐温 20w/v，
-20mM L-组氨酸，-250mM 蔗糖，-pH 5. 5 ；或者-75mg/mL本文所述的糖基化抗体或抗体组合物 ，-O. 04% 吐温 20w/v，-20mM L-组氨酸，-250mM 海藻糖，-pH 5. 5 ；或者-75mg/mL本文所述的糖基化抗体或抗体组合物，-O. 02% 吐温 20w/v，-20mM L-组氨酸，-250mM 海藻糖，-pH 5. 5在另一更优选实施方式中，本发明胃肠道外制剂也可包括含有以下组分的液体制剂-I. 5mg/mL本文所述的糖基化抗体或抗体组合物，-O. 022% 吐温 20w/v，-120mML_ 组氨酸，-250 125mM 鹿糖，-pH 5. 5 ；或者-37. 5mg/mL本文所述的糖基化抗体或抗体组合物，-O. 02% 吐温 20w/v，-IOmM L-组氨酸，-125mM 蔗糖，-pH 5. 5 ；或者-37. 5mg/mL本文所述的糖基化抗体或抗体组合物，-O. 01% 吐温 20w/v,-IOmM L-组氨酸，-125mM 蔗糖，-pH 5. 5 ；或者-37. 5mg/mL本文所述的糖基化抗体或抗体组合物，-O. 02% 吐温 20w/v，-IOmM L-组氨酸，_125mM 海藻糖，
-pH 5. 5 ；或者-37. 5mg/mL本文所述的糖基化抗体或抗体组合物，-O. 01% 吐温 20w/v ，-IOmM L-组氨酸，_125mM 海藻糖，-pH 5. 5 ；或者-75mg/mL本文所述的糖基化抗体或抗体组合物，-O. 02% 吐温 20w/v，-20mM L-组氨酸，-250mM 海藻糖，-pH 5. 5 ；或者-75mg/mL本文所述的糖基化抗体或抗体组合物，-O. 02% 吐温 20w/v，-20mML_ 组氨酸，-250mM 甘露醇，-pH 5. 5 ；或者-75mg/mL本文所述的糖基化抗体或抗体组合物，-O. 02% 吐温 20w/v，-20mM L-组氨酸，-140mM 氯化钠，-pH 5. 5 ；或者-150mg/mL本文所述的糖基化抗体或抗体组合物，-O. 02% 吐温 20w/v，-20mM L-组氨酸，-250mM 海藻糖，-pH 5. 5。或者-150mg/mL本文所述的糖基化抗体或抗体组合物，-O. 02% 吐温 20w/v，-20mM L-组氨酸，-250mM 甘露醇，-pH 5. 5。或者-150mg/mL本文所述的糖基化抗体或抗体组合物，
-O. 02% 吐温 20w/v，-20mM L-组氨酸，-140mM 氯化钠，-pH 5. 5。或者-10mg/mL A β 抗体，-O. 01% 吐温 20w/v， -20mML_ 组氨酸，-140mM 氯化钠，-pH 5. 5。在一个实施方式中，本发明药物组合物为包含下列组分的液体制剂-10mg/mL A β 抗体，-O. 01% 吐温 20w/v、-20mM L-组氨酸，-140mM 氯化钠，-pH 5. 5。在另一个实施方式中，本发明的药物组合物为包含下列组分的冻干制剂-75mg/mL A β 抗体，-O. 04% 吐温 20w/v，-20mM L-组氨酸，-250mM 蔗糖，-pH 5. 5。在示例性制剂的上下文中术语“本文所述的糖基化抗体”可包括本发明所述的单糖基化的抗体、本文所述的双糖基化抗体及其混合物。主治医师和临床因素决定给药方案。如医学领域所熟知，任一病人的给药方案取决于很多因素，包括；病人大小、体表面积、年龄、所给具体化合物、性别、给药时间和方式、总体健康状况和同时给予的其它药物。蛋白质性质的药物活性物质的给药量为每剂量lng-20mg/kg体重，例如O. lmg-10mg/kg体重、O. 5mg-5mg/kg体重；然而，也考虑到低于或高于此示例范围的剂量，特别是考虑到上述因素时。若方案为连续输注，每分钟给药量应在I μ g-10mg/kg体重的范围内。本文所述药物组合物可配制为短效型、速释型、长效型或缓释型制剂。因此，该药物组合物可适于缓释或控释。利用本领域熟知方法制备缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括包含抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，其中所述基质为塑形制品形式如薄膜或微胶囊。缓释基质的例子包括聚酯、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸的共聚物、非降解型乙烯-乙酸乙烯酯、水凝胶、聚交酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。通过使用合适的添加剂、控制水分含量、开发特异性聚合物基质组合物可防止缓释制剂中所含抗体可能发生的生物学活性损失和免疫原性改变。定期评估监测该过程。可局部或全身给予该组合物，即本发明的单糖基化抗体或双糖基化抗体或其混合物。值得注意的是，外周给药的抗体可进入中枢神经系统，参见Bard(2000), Nature Med. 6，916-919等。胃肠道外给药制剂包含水性和非水性无菌溶液、悬液和乳液。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，以及可注射有机酯如油酸乙酯。水性运载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬液,包括盐水和缓冲介质。胃肠道外载体包括氯化钠溶液、林格右旋糖溶液、右旋糖和氯化钠、乳糖化林格注射液、或不挥发油。静脉内载体包括液体和营养补充物、电解质补充物(如基于林格右旋糖溶液的补充物)等。也可存在防腐剂和其它添加剂，如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。而且，根据药物组合物的计划用途，本发明的药物组合物还可包含其它物质。所述物质可为作用于中枢神经系统的药物，如神经保护因子、胆碱酶抑制剂、Ml蕈碱样受体激动剂、激素、抗氧化剂、炎症抑制剂等。尤其优选的是，所述药物组合物中包含其它物质如神经递质和/或神经递质替代分子、维生素E或α硫辛酸。本领域技术人员，具体说但不限于生化学家、生物学家、化学家、药师和上述专业人员组成的小组，不难工作产生上述药物组合物。医学领域技术人员，如主治医师也清楚如何将此类药物组合物给予需要本文所述药物组合物治疗的病人。此类给药可包含全身给药，如通过输注和/或注射给药。然而，也考虑到将本发明化合物和/或化合物混合物直接给予脑。例如，该化合物或化合物混合物或化合物制剂可经脑室内或鞘内注射直接给予脑，优选通过缓慢输注以减少对脑实质的影响。也可使用脑内缓慢植入。也考虑到使用基因治疗的方法,例如植入产生本发明所述抗体的重组细胞。这些“重组细胞”应该能够提供本文所定义的可变区糖基化/本文所述抗体，尤其是本发明的抗-Aβ抗体的某部分。然而，如上文所指出的，本发明抗体/抗体组合物的优点在于它们能够通过血脑屏障并与淀粉斑结合。下文所述的本发明药物组合物可用于治疗迄今未知的或者关于或依赖病理APP聚集或病理APP加工的所有疾病类型。它们在治疗阿尔茨海默病或胞外β淀粉样蛋白沉积似乎起一定作用的其它疾病中尤其有用。它们宜用于人，但本文所述方法、应用及组合物也可用于动物治疗。在本发明的优选实施方式中，上述本发明组合物为诊断性组合物，还任选包含合适的检测手段。诊断性组合物包含上述本发明化合物，即本文所述糖基化抗体中的至少一种。所述诊断性组合物可包含本发明化合物，尤其是本发明的糖基化抗体分子、可溶形式/液相，但也考虑到所述化合物结合于/附连于和/或连接于固体支持物。固体支持物可与本文所述的诊断性组合物联用，或者可将本发明化合物可直接结合于所述固体支持物上。此类支持物为本领域所熟知，包括市售柱材料、聚苯乙烯珠、乳胶珠、磁珠、胶体金属颗粒、玻璃和/或娃芯片和表面、硝基纤维素条、膜、薄片、duracytes、反应容器的孔和壁、塑料管等。本发明化合物，尤其是本发明的抗体，可结合于许多不同的运载体。熟知的运载体的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、右旋糖苷、尼龙、直链淀粉、天然和改性的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁石。根据本发明的目的，运载体特性可为可溶性或不溶性。上面鉴定了合适的标记和标记方法，下文中作进一步描述。适合固定/固化本发明化合物的方法为人熟知，包括但不限于离子、疏水、共价相互作用等。
尤其优选将本发明的诊断性组合物用于检测和/或定量测定APP和/或APP-加工产物，如β淀粉样蛋白，或用于检测和/或定量测定病理性和/或(遗传)修饰的APP切割位点。如所附实施例所示，本发明糖基化抗体分子尤其可用作以直接免疫荧光法检测阿尔茨海默病病人脑切片中真正人淀粉斑的诊断试剂。优选在诊断性组合物中使用的所述本发明化合物是可检测标记的。利用本领域熟练技术人员所知且属于本发明范围内的数种技术标记生物分子。本领域一般技术人员了解数种不同标记和标记方法。可用于本发明的标记类型的例子包括酶、放射性同位素、胶体金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物。常用标记包括荧光染料(如荧光素、罗丹明和得克萨斯红等)、酶(如辣根过氧化物酶、β -半乳糖苷酶、碱性磷酸酶)、放射性同位素(如32P或125I)、生物素、地高辛、胶体金属、化学或生物发光化合物(如二氧杂环丁烧(dioxetane)、发光胺或吖聢彳翁)等。标记 过程，如酶或生物素基团的共价偶联、碘化、磷酸化、生物素化等为本领域所熟知。检测方法包括但不限于放射自显影、荧光显微术、直接和间接酶反应等。常用检测方法包括放射性同位素或非放射性同位素方法。这些方法包括Western印迹、覆盖(overlay)实验、RIA (放射性免疫实验)和IRMA (免疫放射性免疫测定实验)、EIA(酶免疫实验)、ELISA (酶连免疫吸附实验)、FIA (荧光免疫实验)和CLIA (化学发光免疫实验)。而且，本发明提供了本发明糖基化抗体分子、或本发明方法生产的抗体分子、或本文提供的单、双糖基化抗体混合物用于制备预防、治疗和/或诊断淀粉样蛋白形成和/或淀粉斑形成相关疾病的药物或诊断组合物的应用。进一步优选的是，本文所述化合物，特别是本发明抗体分子用于预防和/或治疗与改变或异常的APP加工和/或淀粉样蛋白形成有关的神经病的应用。将抗体分子，如(工程改造的)免疫球蛋白形式，如IgG框架、特别是IgGl框架中的抗体，或嵌合抗体形式(尤其是完全人源化抗体或完整抗体)、双特异性抗体、单链Fv(scFv)或双特异性scFv等用于制备本文所述药物组合物。然而,本文所提供的抗体分子和混合物也可用于诊断，如所附实施例所述，因为本发明抗体分子能特异性作用于或检测A β 4和/或淀粉样蛋白沉积/斑。因此，本发明化合物的发明用途是用于制备治疗需要改善的神经病的药物组合物的用途，例如通过分解β淀粉斑、清除淀粉样蛋白(斑)或对抗β淀粉斑形成的被动免疫来改善该疾病。如所附实施例所示，本发明抗体分子在阻止Αβ聚集和已形成淀粉样蛋白聚集的解聚中尤其有用。因此，本文所述的本发明糖基化抗体或单、双糖基化抗体混合物可用于减少淀粉样沉积物/斑，清除淀粉斑/斑前体以及保护神经元。尤其考虑到将本发明抗体分子用于防止体内形成淀粉斑以及体内清除已存在的淀粉斑/沉积物。而且，本发明抗体分子或混合物可用于对Aβ肽和Αβ聚集体即β淀粉斑产生被动免疫。医学使用包含Fe-部分的本发明抗体可达到清除A β 4/Α β 4沉积物的目的。所述抗体的Fe-部分在Fe-受体介导的免疫应答，例如吸引巨噬细胞(吞噬细胞和/或小胶质细胞)和/或助细胞中尤其有用。介导Fe-部分相关的免疫应答时，本发明的抗体分子优选位于(人)IgGl框架中。如本文所讨论，优选使用本发明抗体分子或抗体混合物治疗的对象为人对象。也考虑到其它框架，如IgG2a-或IgG2b-框架可用于本发明抗体分子。在小鼠中尤其考虑了 IgG2a和IgG2b形式的免疫球蛋白框架，例如在本发明抗体分子的科学应用中，如在表达(人)野生型或突变型APP、APP-片段和/或Αβ 4的转基因小鼠中的测试。
上述淀粉样蛋白形成和/或淀粉斑形成相关疾病的例子包括但不限于痴呆、阿尔茨海默病、运动神经病、帕金森病、ALS (肌萎缩侧索硬化)、痒病、HIV-相关痴呆痴呆以及库贾氏病、荷兰型遗传性脑出血伴淀粉样变、唐氏综合征和衰老相关性神经元疾病。本发明抗体分子及本文提供的组合物也可用于改善和/或防止与淀粉样蛋白形成和/或淀粉斑形成相关的炎症过程。因此，本发明也提供了治疗、预防和/或延迟神经病和/或神经变性疾病的方法，其包括给予患有所述神经病和/或神经变性疾病的对象和/或给予神经病和/或神经变性疾病易患个体有效量的抗Αβ抗体分子或本文提供的本发明单、双糖基化Α-β抗体的混合物和/或上文定义的组合物的步骤。本文提供的治疗可包括单独给予本发明化合物/组合物或以共同治疗的形式给药，即与其它药物和医药品联合给药。在本发明尤其优选的实施方式中，提供了治疗、预防和/或延迟神经病和/或神经变性疾病的方法，包括给予需要相应医疗干预的患者本文所提供的包含单、双糖基化抗A β抗体的抗体混合物的步骤。本文所用术语“治疗”考虑给予需要的患者本文所述单、双糖基化抗体(或其混合物)。所述患者可为人患者，在一个实施方式中为患有或易患病理APP加工相关性疾病的人。因此，本文所用术语“治疗”包括预防性和治疗性给予本文提供的化合物或化合物混合物。可用本文提供化合物和组合物治疗的一种疾病是阿尔茨海默病。根据国立神经和语言障碍、中风/阿尔茨海默病和相关疾病协会的诊断标准(NINCDS/ADRDA标准)(Mckhann等，1984)，可能诊断有阿尔茨海默病的病人。在本发明的上下文中也可考虑到“共同治疗”情况下使用本文提供的化合物和/或组合物，例如当治疗APP相关疾病，如阿尔茨海默病时。在所述情况下，考虑到与其它批准药物如美金刚胺、多奈哌齐、酒石酸卡巴拉汀或加兰他敏共同治疗。在又一实施方式中，本发明提供了包含至少一种本文定义的糖基化抗体分子或本文提供的本发明单和/或双糖基化方法的混合物的试剂盒。方便地，本发明试剂盒还任选包括缓冲液、储存液和/或医学、科学或诊断实验或目的所需的其它试剂和材料。而且，本发明试剂盒的一部分可单独包装于小瓶或瓶中，或者组合包装于容器或多容器单元中。本发明试剂盒宜用于进行本发明方法，并可用于本文引用的数种应用，如用作诊断试剂盒、研究工具或医学工具。此外，本发明试剂盒可包括适合科学、医学和/或诊断目的的检测手段。优选依照本领域熟练人员所知的标准步骤生产试剂盒。


图I :重链和轻链序列插入位点的质粒2 :分析色谱图例图3 :文中所述的CMT柱色谱图。双糖基化和单糖基化同种型在双峰I中洗脱，未糖基化同种型在峰2洗脱。 图4 :抗体A同种型的完整IgG ESI-MS分析。主峰的分子量以Da表示。A :未糖基化的抗体A ；Β :单糖基化的抗体A ；C :双糖基化的抗体A图5 :抗体N-糖基化模式的推导方案。以括号表示只发生部分糖基化的结构。A 复合物类型:杂合子类型；C :寡聚甘露糖类型；GlcNAc=N-乙酰基-葡糖胺、Man=甘露糖；Gal=半乳糖；Fuc=岩藻糖；NeuAc=N-乙酰神经氨酸。图6 :MS和HPAEC-PAD分析推断出的抗体A Asn306糖结构的示意图。以括号表示只发生部分糖基化的结构。GlcNAc=N-乙酰基-葡糖胺、Man=甘露糖；Gal=半乳糖；Fuc=岩藻糖；NeuAc=N-乙酰神经氨酸图7 :抗体A同种型与固化纤维状A β 40结合(Biacore传感器芯片)。抗体浓度60ηΜ。显示了纯化前所有同种型混合物的结合曲线。图8 :Pepspot分析抗体A组合物的表位作图。A)所示单独重叠的十肽点的pepspot信号。B)单独重叠十肽点的信号强度的密度分析。图9 :解聚实验。抗体A组合物和抗体A同种型诱导从聚集的A β中释放生物素 化A β。图10 :包含抗体A同种型的抗体A组合物从人脑脊液(CSF)中捕获可溶性Αβ。平均在2个库中分析4个阿尔茨海默病人的脑脊液样品。每库进行两次免疫沉淀，然后进行Western印迹分析,并利用Western印迹光密度对捕获的A β进行定量。给定系列Western印迹中最高的Aβ值定为100%。图11 :体外利用抗体A对人淀粉斑进行间接免疫荧光染色。利用10ng/ml抗体A浓度对真正离体人β淀粉斑染色后，进行高度灵敏和特异的检测。利用(A)抗体A组合物；(B)双糖基化的抗体A; (C)单糖基化的抗体A;和⑶未糖基化的抗体A的山羊抗人(H+L) -Cy3抗体检测结合的抗体A。标尺=80 μ m。图12 :共聚焦显微术揭示含有糖基化抗体A同种型的PS2APP转基因小鼠斑的体内免疫修饰。免疫修饰揭示对小鼠单次给予Img抗体A同种型3天后抗体A同种型的体内结合。图中显示了抗体A同种型分布的代表性图片，这些同种型包括双(A)、单(B)和未糖基化的(C)抗体A同种型。标尺=80 μ m。图13 :抗_Αβ抗体与细胞表面APP的结合分析。流式细胞术分析人APP转染的ΗΕΚ293细胞和非转染的对照细胞与抗体的结合。图14 :抗体A非糖基化、单糖基化和双糖基化抗体分子(免疫球蛋白)的示意图。图15 :抗体组合物(包含单和双糖基化抗体Α)、双糖基化的和单糖基化的抗体A同种型(每周20mg/kg，i.v.)或载体治疗5个月后，丘脑区总斑表面积(A)、总斑数目(B)以及斑数目和大小分布(C)。图16 :抗体组合物(包含单和双糖基化抗体A)、双糖基化的和单糖基化的抗体A同种型(每周20mg/kg，i. V.)或载体治疗5个月后皮层和胼胝体区总斑表面积(A)、总斑数目⑶以及斑数目和大小分布(C)。图17 :抗体组合物(包含单和双糖基化抗体A)、双糖基化的和单糖基化的抗体A同种型(每周20mg/kg，i.v.)或载体治疗5个月后海马区总斑表面积(A)、总斑数目(B)以及斑数目和大小分布(C)。图18 :抗体组合物(包含单和双糖基化抗体A)、双糖基化的和单糖基化的抗体A同种型(每周20mg/kg，i. V.)或载体治疗5个月后下脚区总斑表面积(A)、总斑数目(B)以及斑数目和大小分布(C)。 图19 :每两周I次共1、2和4次经i. V.将O. lmg/kg给予PS2APP小鼠后，测量结合于β淀粉斑的免疫染色抗体A组合物的荧光强度。最后一次注射2周后进行分析。
图20 :每月I次共2和3次经i. V.将O. 15mg/kg给予PS2APP小鼠后，测量结合于β淀粉斑的免疫染色抗体A组合物的荧光强度。最后一次注射2周后进行分析。图21 :两周I次共4次经注射将O. 05,0. I和O. 30mg/kg给予PS2APP小鼠后，测量结合于β淀粉斑的免疫染色抗体A组合物的荧光强度，表明淀粉斑结合为剂量相关性。最后一次注射2周后进行分析。
图22 :两月I次共3次经注射将O. 075、O. 15和O. 45mg/kg给予PS2APP小鼠后，测量结合于β淀粉斑的免疫染色抗体A组合物的荧光强度，表明淀粉斑结合为剂量相关性。最后一次注射2周后进行分析。图23 :人AD脑切片与所示浓度抗体A组合物及活的分化的人原代巨噬细胞(80万细胞/毫升)共孵育40小时后，利用抗A β鼠单克隆抗体(ΒΑΡ-2)对切片中A β进行染色。结果显示淀粉样蛋白载量减少，表明了抗体A组合物对β淀粉斑的抗原依赖性细胞吞噬作用。标尺=300 μ m。图24 :将人AD脑切片与80万细胞/毫升孵育后，抗体A组合物对切片中β淀粉斑的剂量反应。(A)显示总斑面积，(B)是染色强度。图25 :用0、0. I、I和10 μ g/ml抗体A组合物孵育的P388D1细胞的荧光显微照片(分别为A-D)。图26:利用Αβ偶联荧光珠及P3881D1细胞定量测定抗体A组合物的剂量反应(表示为相对荧光单位，RFU)。两次独立实验表明抗体A组合物的效能范围相当大。图27 :显示重链恒定区(Asn 306 ;前2列)和重链可变区(Asn52 ;第3、4列)中抗体A的不同糖结构的表格。
具体实施例方式实施例用下列非限定性实施例举例说明本发明。实施例I :通过克隆技术产生抗体A根据本发明，通过常用克隆技术产生IgGl分子。用重链可变区(Vh)来鉴定抗体A的编码序列及表达的氨基酸序列。以下DNA序列编码相应的重链例子caggtggaattggtggaaagcggcggcggcctggtgcaaccgggcggcagcctgcgtctgagctgcgcggcctccggatttacctttagcagctatgcgatgagetgggtgcgccaagcccctgggaagggtctcgagtgggtgagcgctattaatgcttctggtactcgtacttattatgctgattctgttaagggtcgttttaccatttcacgtgataattcgaaaaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgcggaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtggtaagggtaatactcataagccttatggttatgttcgttattttgatgtttggggccaaggcaccctggtgacggttagctcagcctccaccaagggtccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggct
gcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccagatatcgtgcgatatcgtgcaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaact
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SAINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEffESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 6)如下所示包含额外“前导序列”的序列也可编码同样的重链atgaaacacctgtggttcttcctcctgctggtggcagctcccagatgggtcctgtcccaggtggaattggtggaaagcggcggcggcctggtgcaaccgggcggcagcctgcgtctgagctgcgcggcctccggatttacctttagcagctatgcgatgagetgggtgcgccaagcccctgggaagggtctcgagtgggtgagcgctattaatgcttctggtactcgtacttattatgctgattctgttaagggtcgttttaccatttcacgtgataattcgaaaaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgcggaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtggtaagggtaatactcataagccttatggttatgttcgttattttgatgtttggggccaaggcaccctggtgacggttagctcagcctccaccaagggtccatcggtctt
ccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgggtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga(SEQ ID NO :25)对应的氨基酸序列为MKHLffFFLLLVAAPRffVLSQVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL
GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO :26)
类似地，下列核苷酸序列编码抗体A的轻链gatatcgtgctgacccagagcccggcgaccctgagcctgtctccgggcgaacgtgcgaccctgagctgcagagcgagccagagcgtgagcagcagctatctggcgtggtaccagcagaaaccaggtcaagcaccgcgtctattaatttatggcgcgagcagccgtgcaactggggtcccggcgcgttttagcggctctggatccggcacggattttaccctgaccattagcagcctggaacctgaagactttgcgacttattattgccttcagatttataatatgcctattacctttggccagggtacgaaagttgaaattaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagetcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag(SEQ ID NO :7)并编码下列氨基酸序列(L链)DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO 8)同样可使用“前导序列”，相应的序列为atggtgttgcagacccaggtcttcatttctctgttgctctggatctctggtgcctacggggatatcgtgctgacccagagcccggcgaccctgagcctgtctccgggcgaacgtgcgaccctgagctgcagagcgagccagagcgtgagcagcagctatctggcgtggtaccagcagaaaccaggtcaagcaccgcgtctattaatttatggcgcgagcagccgtgcaactggggtcccggcgcgttttagcggctctggatccggcacggattttaccctgaccattagcagcctggaacctgaagactttgcgacttattattgccttcagatttataatatgcctattacctttggccagggtacgaaagttgaaattaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagetcgcccgtcacaaagagcttcaa caggggagagtgttag(SEQ ID NO :27)该序列编码下列氨基酸序列MVLQTQVFISLLLffISGAYGDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY
GASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO :28)上述序列与WO 03/070760所述的MAB31有区别。然而，示例性抗体A的重链和轻链也可由下列序列编码a)重链atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgattcatggagaaatagagagactgagtgtgagtgaacatgagtgagaaaaactggatttgtgtggcattttctgataacggtgtccttctgtttgcaggtgtccagtgtcaggtggagctggtggagtctgggggaggcctggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagctatgccatgagetgggtccgccaggctccaggcaaggggctcgagtgggtgtccgccataaacgccagcggtacccgcacctactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagaggcaaggggaacacccacaagccctacggctacgtacgctactttgacgtgtggggccaaggaaccctggtcaccgtctcctcaggtgagtcctcacaacctctctcctgcggccgcagcttgaagtctgaggcagaatcttgtccagggtctatcggactcttgtgagaattaggggctgacagttgatggtgacaatttcagggtcagtgactgtctggtttctctgaggtgagactggaatataggtcaccttgaagactaaagaggggtccaggggcttttctgcacaggcagggaacagaatgtggaacaatgacttgaatggttgattcttgtgtgacaccaagaattggcataatgtctgagttgcccaagggtgatcttagctagactctggggtttttgtcgggtacagaggaaaaacccactattgtgattactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcaggtaagaatggcctctccaggtctttatttttaacctttgttatggagttttctgagcattgcagactaatcttggatatttgccctgagggagccggctgagagaagttgggaaataaatctgtctagggatctcagagcctttaggacagattatctccacatctttgaaaaactaagaatctgtgtgatggtgttggtggagtccctggatgatgggatagggactttggaggctcatttgagggagatgctaaaacaatcctatggctggagggatagttggggctgtagttggagattttcagtttttagaatgaagtattagctgcaatacttcaaggaccacctctgtgacaaccattttatacagtatccaggcatagggacaaaaagtggagtggggcactttctttagatttgtgaggaatgttccacactagattgtttaaaacttcatttgttggaaggagctgtcttagtgattgagtcaagggagaaaggcatctagcctcggtctcaaaagggtagttgctgtctagagaggtctggtggagcctgcaaaagtccagctttcaaaggaacacagaagtatgtgtatggaatattagaagatgttgcttttactcttaagttggttcctaggaaaaatagttaaatactgtgactttaaaatgtgagagggttttcaagtactcatttttttaaatgtccaaaatttttgtcaatcaatttgaggtcttgtttgtgtagaactgacattacttaaagtttaaccgaggaatgggagtgaggctctctcataccctattcagaactgacttttaacaataataaattaagtttaaaatatttttaaatgaattgagcaatgttgagttgagtcaagatggccgatcagaaccggaacacctgcagcagctggcaggaagcaggtcatgtggcaaggctatttggggaagggaaaataaaaccactaggtaaacttgtagctgtggtttgaagaagtggttttgaaacactctgtccagccccaccaaaccgaaagtccaggctgagcaaaacaccacctgggtaatttgcatttctaaaataagttgaggattcagccgaaactggagaggtcctcttttaacttattgagttcaaccttttaattttagcttgagtagttctagtttccccaaacttaagtttatcgacttctaaaatgtatttagaattcgagctcggtacagctttctggggcaggccaggcctgaccttggctttggggcagggagggggcta
aggtgaggcaggtggcgccagcaggtgcacacccaatgcccatgagcccagacactggacgctgaacct
CgCggacagttaagaacccaggggcctctgcgcctgggcccagctctgtcccacaccgcggtcacatggcaccacctctcttgcagcctcca ccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtga
CCgtgCcctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtgggaaagttggtgagaggccagcacagggagggagggtgtctgctggaagccaggctcagcgctcctgcctggacgcatcccggctatgcagccccagtccagggcagcaaggcaggccccgtctgcctcttcacccggagcctctgcccgccccactcatgctcagggagagggtcttctggctttttcccaggctctgggcaggcacaggctaggtgcccctaacccaggccctgcacacaaaggggcaggtgctgggctcagacctgccaagagccatatccgggaggaccctgcccctgacctaagcccaccccaaaggccaaactctccactccctcagctcggacaccttctctcctcccagattccagtaactcccaatcttctctctgcagagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccaggtaagccagcccaggcctcgccctccagctcaaggcgggacaggtgccctagagtagcctgcatccagggacaggccccagccgggtgctgacacgtccacctccatctcttcctcagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaaggtgggacccgtggggtgcgagggccacatggacagaggccggctcggcccaccctctgccctgagagtgaccgctgtaccaacctctgtccctacagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatg aggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggcaaatga(SEQ ID NO 23)b)轻链atggacatgagggtcctcgctcagctcctggggctcctgctgctctgtttcccaggtaaggatggagaacactagcagtttactcagcccagggtgctcagtactgctttactattcagggaaattctcttacaacatgattaattgtgtggacatttgtttttatgtttccaatctcaggcgccagatgtgatatcgtgttgacgcagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgccgggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggcgcccaggctcctcatctatggcgcatccagcagggccactggcgtgccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctggagcctgaagatttcgcgacctattactgtctgcagatttacaacatgcctatcacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgtgagtagaatttaaactttgcggccgcctagacgtttaagtgggagatttggaggggatgaggaatgaaggaacttcaggatagaaaagggctgaagtcaagttcagctcctaaaatggatgtgggagcaaactttgaagataaactgaatgacccagaggatgaaacagcgcagatcaaagaggggcctggagctctgagaagagaaggagactcatccgtgttgagtttccacaagtactgtcttgagttttgcaataaaagtgggatagcagagttgagtgagccgtaggctgagttctctcttttgtctcctaagtttttatgactacaaaaatcagtagtatgtcctgaaataatcattaagctgtttgaaagtatgactgcttgccatgtagataccatgtcttgctgaatgatcagaagaggtgtgactcttattctaaaatttgtcacaaaatgtcaaaatgagagactctgtaggaacgagtccttgacagacagctcaaggggtttttttcctttgtctcatttctacatgaaagtaaatttgaaatgatcttttttattataagagtagaaatacagttgggtttgaactatatgttttaatggccacggttttgtaagacatttggtcctttgttttcccagttattactcgattgtaattttatatcgccagcaatggactgaaacggtccgcaacctcttctttacaactgggtgacctcgcggctgtgccagccatttggcgttcaccctgccgctaagggccatgtgaacccccgcggtagcatcccttgctccgcgtggaccactttcctgaggcacagtgataggaacagagccactaatctgaagagaacagagatgtgacagactacactaatgtgagaaaaacaaggaaagggtgacttattggagatttcagaaataaaatgcatttattattatattcccttattttaattttctattagggaattagaaagggcataaactgctttatccagtgttatattaaaagcttaatgtatataatcttttagaggtaaaatctacagccagcaaaagtcatggtaaatattctttgactgaactctcactaaactcctctaaattatatgtcatattaactggttaaattaatataaatttgtgacatgaccttaactggttaggtaggatatttttcttcatgcaaaaatatgactaataataatttagcacaaaaatatttcccaatactttaattctgtgatagaaaaatgtttaactcagctactataatcccataattttgaaaactatttattagcttttgtgtttgacccttccctagccaaaggca
actatttaaggaccctttaaaactcttgaaactactttagagtcattaagttatttaaccacttttaattactttaaaatgatgtcaattcccttttaactattaatttattttaaggggggaaaggctgctcataattctattgtttttcttggtaaagaactctcagttttcgtttttactacctctgtcacccaagagttggcatctcaacagaggggactttccgagaggccatctggcagttgcttaagatcagaagtgaagtctgccagttcctcccaggcaggtggcccagattacagttgacctgttctggtgtggctaaaaattgtcccatgtggttacaaaccattagaccagggtctgatgaattgctcagaatatttctggacacccaaatacagaccctggcttaaggccctgtccatacagtaggtttagcttggctacaccaaaggaagccatacagaggctaatatcagagtattcttggaagagacaggagaaaatgaaagccagtttctgctcttaccttatgtgcttgtgttcagactcccaaacatcaggagtgtcagataaactggtctgaatctctgtctgaagcatggaactgaaaagaatgtagtttcagggaagaaaggcaatagaaggaagcctgagaatacggatcaattctaaactctgagggggtcggatgacgtggccattctttgcctaaagcattgagtttactgcaaggtcagaaaagcatgcaaagccctcagaatggctgcaaa
gagctccaacaaaacaatttagaactttattaaggaatagggggaagctaggaagaaactcaaaacatcaagattttaaatacgcttcttggtctccttgctataattatctgggataagcatgctgttttctgtctgtccctaacatgccctgtgattatccgcaaacaacacacccaagggcagaactttgttacttaaacaccatcctgtttgcttctttcctcaggaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgct
gaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagetcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag (SEQ ID NO :24)实施例I. I载体构建抗体A序列来源于初筛合成噬菌体展示文库MorphoSys HuCAL文库后的二次成熟。最初在德国MorphoSys的载体pMorph中提供抗体A的DNA，对应于WO 03/070760,附件P6/43中图2所示Fab表达载体。出于本发明目的的载体构建中，编码载体pEE6. I和pEE14. 4 (均购自龙杂生物公司)以在同一载体中获得含两条链的构建物，参见附图I ;参见WO87/04462或WO 89/01036。应用下列方案进行克隆利用弓丨物ACGTAAGCTTGCCGCCACCATGGTGTTGCAG(正义链；HindIII ;SEQ IDNO. 29)和引物 ACGTGAATTCCTAACACTCTCCCCTGTT(反义链，EcoRI ；SEQ ID NO. 30)从载体MS-Roche#7. 9. H7_Ig_ κ 链(如 W003/070760 所述)PCR 分离 IgK 链，插入 pCR 2. I TopoTA中，并对插入物进行完全测序。HinDIII/EcoR消化pCR Topo 2. I从而移出IgK链插入物，并将其作为Hindlll/EcoRI插入物连接入载体pEE14. 4中。利用引物ACGTAAGCTTGCCGCCACCATGAAACACCTG(正义链，HindIII ;SEQ ID NO :31)和引物 ACGTGAATTCTCATTTACCCGGAGACAG(反义链，EcoRI ;SEQ ID NO :32)从载体 pMorphMS-Roche #7. 9. H7_IgGl中PCR克隆Ig Y I重链，插入pCR 2. I Topo TA中，并对插入物进行完全测序。Hindlll/EcoRI消化pCR Topo 2. I从而移出IgY I重链插入物，将其作为HindIII/EcoRI插入物连接入载体pEE 6. 4中。Notl/Sall消化pEE 6. 4 IgGl移出重链表达盒，并将分离片段插入Sall/Notl消化的pEE14. 4 κ中得到最终双基因构建物pEE 14. 4mAb-31ο实施例I. 2 :转染CHO细胞并表达抗体A根据标准实验方法进行转染。宿主细胞系CHO Kl衍生自龙杂生物公司工作细胞库(WCB) #028-W2(Lonza，2002，1-179)，宿主细胞系CHO Kl SV衍生自龙杂生物公司主细胞库(MCB)#269-M(Lonza，2003，1-87)。利用脂质体转染(Fugene，罗氏诊断公司)用含有重链和κ轻链基因的载体pEE14. 4 MAb31转染衍生自WCB#028-W2的贴壁CHO Kl细胞。在DMEM、GS补充物(均来自JRH生物科技公司(JRH Biosciences) )、10% 透析 FCS (PAA 实验室公司(PAA Laboratories),CoS#R0-CEP 2001-083-Rev 00)和50 μ M甲硫氨酸砜亚胺(MSX购自西格玛公司(sigma))存在下选择转染分离物。2周后，挑选集落并转移至96孔培养板，利用ELISA检测抗体的产生。通过有限连续稀释克隆抗体A表达量最高的4个集落，以获得单细胞衍生的培养物，一周后衍生出82个克隆并进行扩增。选择其中一个克隆，其贴壁状态下有着最高特异性产率48pg/细胞/天。通过有限稀释进一步亚克隆以获得具有高稳定性的良好抗体生产者(Pu，(1998)Mol Biotechnol,10，17-25)。此外，利用电穿孔将载体pEE 14. 4 MAb31转染至CHO Kl细胞的悬浮变体CHOKl SV细胞(来自MCB #269-M)中。如前所述选择转染子，通过有限稀释对得到的克隆进行单细胞克隆，得到数个抗体A的高产克隆。
实施例I. 3使抗体A表达克隆适应悬浮培养在含有不同蛋白水解产物的DHI培养基中检测CHO Kl克隆的最佳生长性质细胞最终适应含有/不含谷胺酰胺(英杰公司(Invitrogen))的DHI培养基，这种培养基是DMEM>HamJ s F12 和 IMDM 分别以 1: 1:2 (v: v: V)比例混合的混合物(Schlaeger 和 Schumpp,1992，J Immunol Methods，146，111-20)，其中有如下改变大豆和稻米水解产物0. 2% soyHyPep 1510 和 O. 2% rice HyPep 5603 (凯瑞生物科技公司(Kerry Bioscience))、0. 03%普朗尼克F68 (英杰公司)、25 μ M MSX (西格玛公司)和5%透析FCS (PAA实验室公司)。逐渐降低FCS浓度，直到细胞在无血清DHI培养基中指数生长。用无血清DHI培养基冻存数种重组细胞克隆的原代种子细胞库。利用两步过程(Lonza)使CHO Kl SV克隆适应从含10%透析FCS的DMEM改变为在含25 μ M MSX的化学成分明确的CD-CHO培养基(吉布科-英杰公司(Gibco-Invitrogen))中悬浮生长。在⑶-CHO中产生细胞库。任选地，任何其它供CHO细胞生长的无血清、无蛋白培养基均可用于悬浮培养并作为抗体表达的基础。实施例2 :生产抗体A生产抗体A (通过补料-分批发酵)利用下述方法从振荡培养或旋动培养的储存培养物中发酵制备CHO克隆在IOOml振荡培养瓶或标称容积50_75ml的旋瓶中分别用含25 μ MMSX的各培养基解冻一冻存管的各克隆。以I :5比例连续分瓶扩增细胞，在振荡培养瓶或旋瓶得到体积为400-500ml的储存培养物。用于发酵接种的细胞可衍生自解冻后至多90天的这些储存培养物。在2L振荡培养瓶或旋瓶中，种子列车(seed train)由2x1000ml步骤组成，随后接种于另一个IOL发酵罐中。或者，IOL发酵罐本身可用作补料-分批发酵容器或用于接种IOOL通过补料-分批发酵罐。培养基中含有MSX作为选择条件，直到接种IOL发酵罐时除去MSX。发酵过程第O天从3-4xl05/毫升细胞开始(由种子培养物1:4_1:5分瓶而来)。第2-3天开始补料，细胞密度应高于I. 5xl06/毫升。补料每天2%连续或一次性补料。在整个发酵过程中，利用离子交换色谱监测抗体A同种型组合物(见下)。第14-18天当细胞活力开始下降(50%)并达到预期滴度，则通过离心和/或过滤和过滤除菌收集细胞上清，并按照下一章节所述进一步处理。按照标准步骤进行发酵，参见如Werner, (1993), Arzneimittelforschung,43,1242-9 或 RendalI，(2003)，第十八届 ESACT 会议录(Proceedings of the 18th ESACTmeeting)，2003 年 5 月 11-14 日，1，701-704)。实施例3:纯化抗体A纯化过程基于三个色谱步骤和一个渗滤步骤蛋白A亲和色谱、阳离子交换色谱、阴离子交换色谱和利用IOOkD膜进行渗滤。凝胶类型和柱尺寸为IlMabSelect (GE保健公司(GE Healthcare), Art. 17-5199,柱直径 9cm,床长度 18+/_2cm)、0· 41 CM-Toyopearl650M (托所生物科技公司(Toso Bioscience)，Art. 007972，小离子容量=85微当量/毫升，直径 5. Ocm，床长度 20+/-2cm)、1· 31 Q-Sepharose FF(GE 保健公司，Art. 17-0510-04)、直 径9cm，床长度20+/-2cm。柱子在室温下运行。组分储存于2 - 8°C。在280nm处进行检测。使用面积为O. Im2的Biomax 100超滤模块(密立博集团公司，Art. P2B100A01)进行浓缩和渗滤。蛋白A色谱使用纯化水制备下列溶液溶液A(平衡缓冲液)25mM Tris, 25mM NaCl，5mM EDTA，利用 HCl 调节至 pH7. 1+/-0. I溶液B (洗涤缓冲液I) IOOmM乙酸，用NaOH调节至pH 4. 5+/-0. I溶液C (洗脱缓冲液)IOOmM乙酸，用NaOH调节至pH 3. 2+/-0. I溶液D (洗涤缓冲液 2) =IOOmM 乙酸，75mM NaCl，pH 3+/-0. I溶液E (再生缓冲液)2M盐酸胍，IOOmM Tris，用HCl调节至ρΗ7· 5+/-0. I溶液F (储存缓冲液)200mM苄醇，IOOmM乙酸，用NaOH调节至pH 5. 0+/-0. I首先用3床体积的溶液A平衡柱子。接下来利用澄清的细胞培养物上清装柱(451，386mg/l抗体)用5床体积的溶液A洗涤，用3床体积的溶液B洗涤，用3. 5床体积的溶液C洗脱，并收集洗脱液，用3柱体积的溶液D洗涤，和用2柱体积的溶液E再生，用3床体积的缓冲液A平衡，并且用床体积的缓冲液F洗涤以便储存。所有色谱步骤均使用100cm/h的线性流速。柱载量为17. 4g抗体/I Mabselect凝胶，全部同种型混合物的产率为96%。病毒灭活使用纯化水制备下列溶液溶液G (调节溶液)2M乙酸钠加入浓乙酸或2M乙酸钠(溶液G)将蛋白A洗脱液的pH调节至pH3. 5-3. 7。搅动15分钟然后加入2M乙酸钠(溶液G)调节至pH 4+/-0. I。阳离子交换色谱
使用纯化水制备下列溶液溶液H (平衡缓冲液)100mM乙酸，用NaOH调节至pH 4· 0+/-0. I溶液I (洗脱缓冲液I) 250mM乙酸钠，无需调节pH，pH 7. 8-8. 5溶液J (洗脱缓冲液2) 500 mM乙酸钠，无需调节pH，pH 7. 8-8. 5溶液K (再生溶液)0· 5M氢氧化钠溶液L (储存缓冲液):0. OlM氢氧化钠 首先利用2床体积的溶液K再生柱，然后用5床体积的溶液H平衡。接着用蛋白A洗脱液等份装柱，并用I床体积的溶液H洗涤。接着用6床体积的溶液I洗脱。此步骤中，双糖基化和单糖基化同种型被洗脱。在下一步骤中，用3床体积的溶液J洗脱未糖基化同种型。在使用两床体积的溶液K再生柱后，将柱储存于该缓冲液中24小时，接着再用2床体积的溶液K洗涤。用3床体积的溶液L洗涤以便存储。图3显示了色谱图例。如下所述通过分析性IEX分析色谱组分。所有的色谱步骤均使用100cm/h的线性流速。柱载量为14. 3g抗体/I CM Toyopearl 650M，双糖基化和单糖基化同种型混合物的产率为79%，未糖基化同种型的产率为6. 2%。利用 Q-Sepharose FF 讲行流过(Flow through)色谱使用纯化水制备下列溶液溶液M(稀释缓冲液)37.5mM Tris，用乙酸调节至pH 7· 9+/-0. I溶液N(调节溶液)2M Tris溶液0(平衡缓冲液)83mM 乙酸钠，25mM Tris, pH 7. 5+/-0. I溶液P (再生缓冲液 I) :0. 5M NaOH/IM NaCl溶液Q (再生缓冲液2) :0. 2M乙酸/IM NaCl溶液R(储存缓冲液):0· OlM NaOH首先，利用溶液M I :3稀释CMT柱(酸性)的洗脱液并用溶液N调节至pH 7. 5。首先利用2床体积的溶液O平衡柱，接着将稀释的CMT柱洗脱液过柱并收集流出液。利用溶液O洗掉柱上的产物直至280nm吸光度低于O. I (收集流出液)。用I. 5床的溶液P再生该柱，储存I小时后再用I. 5床体积的溶液P再生该柱。然后再用2床体积的溶液Q再生该柱,用3床体积的溶液R洗涤并储存。所有的色谱步骤均使用100cm/h的线性流速。柱载量为3. 5g抗体/I Q Sepharose FF，双糖基化和单糖基化同种型混合物的产率为91%。渗滤使用纯化水制备下列溶液溶液S (渗滤缓冲液)20mM组氨酸，用HCl调节至pH 5. 5滤器支架Pellicon 2 (密立博集团公司)配备有I个型号为Biomax 100 (密立博集团公司，面积=0. lm2、Art. P2B100A01)的超滤模块。配有硅树脂管的WATS0N-MARL0W 501U泵用于泵吸。用缓冲液O冲洗该系统，然后于4-irC在I小时内将3. 8升(I. Ig抗体/I)的QS色谱流出液(用浓乙酸调节至pH 5. 5)浓缩至250-300ml。接着用31缓冲液S (约为10体积)进行渗滤(V=常量)(4-11° )。最后利用Millipac 20滤器(密立博集团公司)对产物进行过滤除菌。超滤/渗滤步骤的产率为91%。产物浓度为15mg/ml。产物冻存于-70°C。用于分析组分的分析性IEX方法柱Mono-SHR 5/5 (GE 保健公司，Art. 17-0547-01)缓冲液I :50mM吗啉代乙磺酸，用氢氧化钠调节至pH 5. 8缓冲液2 50mM吗啉代乙磺酸，IM NaCl，用氢氧化钠调节pH 5. 8流速lml/min检测280nm上样量36-72μ梯度
时M %缓冲液2。分钟OI O25 63
2763
28O35 O图2给出示例性色谱产率
权利要求
1.一种制备组合物中所含有的抗体分子的方法，所述抗体分子能特异性识别3-A4肽/Aβ4的抗体分子，所述方法包括以下步骤 Ca)在培养的哺乳动物细胞中重组表达编码抗体分子的异源核酸分子； (b)采用包括以下步骤的方法纯化所述重组表达的抗体分子 (bl)蛋白A柱纯化； (b2)离子交换柱纯化；和 (b3)大小排阻柱纯化；和 所述组合物中所含的所述抗体分子是单糖基化的抗体分子或双糖基化的抗体分子，或所述组合物所含的所述抗体分子是所述单糖基化的抗体分子和所述双糖基化的抗体分子的混合物， 其中，所述抗体分子在重链可变区含有SEQ ID NO : 10所示的CDR1、SEQ ID NO:12所示的CDR2、和SEQ ID NO : 14所示的CDR3，在轻链可变区中含有SEQ ID NO :16所示的CDR1、SEQ ID NO 18 所示的 CDR2 以及 SEQ ID NO 20 所示的 CDR3 ;和 其中，所述单糖基化的抗体分子在重链(VH)可变区含有一个糖基化的天冬氨酰(Asn)，所述双糖基化的抗体分子在两个抗原结合位点的重链(VH)可变区含有糖基化的天冬氨酰(Asn)，其中，重链(VH)可变区的所述糖基化天冬氨酰(Asn)位于SEQ ID NO 12所示的CDR2中； 所述组合物中少于5%的抗体分子的抗原结合位点的重链可变区(Vh)不含糖基化的天冬酰胺(Asn)。
2.如而对方I所述的方法，其特征在于，所述离子交换柱纯化包括阳离子交换色谱。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法还包括额外的步骤(c):分析色谱和/或进一步的浓缩步骤。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述P-A4肽/A￠4具有如下序列或所述序列中至少15个氨基酸的部分DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ IDNO 3)。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述抗体分子的至少一个抗原结合位点的重链可变区(Vh)包含一个糖基化的天冬酰胺(Asn)，所述Vh由以下序列编码 (a)包含SEQID NO : I所示核苷酸序列的核酸序列CAGGTGGAAITGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCTATTAATGCTTCTGGTACTCGTACTTATTATGCTGATTCTGTTAAGGGTCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA ； (b)编码含有SEQID NO :2所示氨基酸序列的多肽的核酸序列QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO :2);或 (c)简并为(a)-(b)中任一项所述核酸序列的核酸序列。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，包含糖基化的天冬酰胺(Asn)的可变区包含在选自下组的重链中(a)SEQ ID NO :5,23或25所示核酸分子编码的重链多肽；或 (b)含有SEQID NO 6或26所示氨基酸序列的重链多肽。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述位于Vh区的Asn糖基化选自 (a)双触角复合物型糖结构； (b)双触角杂合型糖结构； (C)双触角寡甘露糖型的糖结构； 和 (d)附图5或27提供的任意结构的双触角糖结构。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述糖结构不包含核心岩藻糖化。
9.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述抗体分子是重组产生的
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗体分子是在CHO细胞中产生的。
11.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述CHO细胞为CHOKl或CHO KlSV0
12.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述组合物为诊断性或药物组合物。
13.采用权利要求I一 12中任一项所述的方法制备得到的含有抗体分子的组合物。
14.权利要求13所述的组合物在制备预防、改善和/或治疗淀粉样蛋白形成和/或淀粉斑形成相关性疾病的药物中的应用。
15.权利要求13所述的组合物在制备检测淀粉样蛋白形成和/或淀粉斑形成相关性疾病的诊断试剂盒中的应用。
16.权利要求13所述的组合物在制备分解P淀粉斑的药物中的应用。
17.权利要求13所述的组合物在制备用于对3淀粉斑形成产生被动免疫的药物组合物中的应用。
18.权利要求13所述的组合物在制备预防性治疗淀粉样蛋白形成和/或淀粉斑形成相关性疾病的药物组合物中的应用。
19.如权利要求18所述的应用，其特征在于，预先存在的P淀粉斑或P淀粉斑聚集中间体将减少。
20.权利要求13所述的组合物在制备诊断病人的淀粉样蛋白形成和/或淀粉斑形成相关性疾病或诊断病人对患上淀粉样蛋白形成和/或淀粉斑形成相关性疾病的易感性的诊断试剂盒中的应用。
21.如权利要求14、15、18-20中任一项所述的应用，其特征在于，所述疾病为痴呆、阿尔茨海默病、运动神经病、唐氏综合征、库贾氏病、荷兰型遗传性脑出血伴淀粉样变、帕金森病、肌萎缩侧索硬化或衰老相关性神经元疾病。
22.如权利要求21所述的应用，所述痴呆是Lewy体形成相关性痴呆或HIV相关性痴呆。
23.—种试剂盒，其包含权利要求13所述的组合物或采用权利要求I 一 12中任一项所述的方法制备得到的抗体。
全文摘要
本发明涉及纯化抗体分子的制剂，其特征是重链可变区(VH)中的至少一个抗原结合位点包含糖基化的天冬酰胺(Asn)。更具体说，提供了包含所述抗体分子和抗体混合物的药学和诊断性组合物，该组合物能够特异性识别β-A4肽/Aβ4。本发明具体涉及包含在重链可变区中有一个或两个具有糖基化天冬酰胺(Asn)的糖基化抗原结合位点的抗体混合物，即重链可变区(VH)中含有糖基化Asn的抗体同种型的混合物。也公开了包含特异性糖基化抗体同种型的组合物或抗体制剂。而且提供了这些抗体的药学和诊断性用途。所述抗体同种型可用于药学干预淀粉样蛋白形成或淀粉样蛋白斑形成和/或这些病症的诊断。
文档编号A61P25/16GK102659943SQ201210137369
公开日2012年9月12日 申请日期2006年12月11日 优先权日2005年12月12日
发明者A·绍布玛, B·宝曼, D·舒鲍尔, H·洛茨西尔, H·科尔, K·兰奇, K·魏尔, M·布洛克豪斯, W·赫伯 申请人:豪夫迈·罗氏有限公司