专利名称：一个新的krab型锌指蛋白znf333的生物学功能的制作方法
技术领域：
本发明为一个新的具有转录抑制活性的锌指蛋白基因/蛋白质(命名为ZNF333)，涉及生物医学高技术中该表达基因所编码蛋白质的开发与应用领域。
背景技术：
我室在2001年在19号染色体上筛选多指家系的侯选基因中获得了一个新的锌指蛋白的全长cDNA克隆。命名为ZNF333(GenBank号AF372702)。ZNF333编码蛋白质中有两个功能结构域，KRAB结构域在其氨基末端，锌指蛋白结构域在其羧基末端，属KRAB型锌指蛋白，KRAB结构域能够与KAP-1特异结合，后者在染色体水平的转录抑制中发挥重要作用。KRAB锌指蛋白质家族的成员都含有KRAB结构域，通过KRAB结构域所形成的复合物来介导蛋白质间的相互作用，并在染色体水平发挥转录抑制活性，我们克隆的ZNF333具有两个KRAB结构域，实验证明ZNF333蛋白片段在体外具有转录抑制活性，并具有细胞特异性。同时我们鉴定znf333的两个转录本，全长的转录本包括两个KRAB型结构域和锌指基序，短转录本只包括一个KRAB结构域，无锌指基序。KRAB型锌指蛋白在细胞生长分化和发育过程中发挥重要的生物学功能。
ZNF333基因在人多种组织中表达。
目前研究主要集中于探讨ZNF333基因/蛋白质在发挥转录抑制方面的功能，应用哺乳动物单杂交系统，细胞免疫荧光定位及缺失和突变检测实验发现ZNF333蛋白首先定位于核内，是核因子，具有转录抑制活性，能够与KAP-1相互作用，在染色体水平参与基因的表达调控。
阐明ZNF333基因/蛋白质的生理生化功能不仅对了解此基因在细胞生长分化和发育中所起的重要功能提供依据，了解在染色体水平上发挥转录抑制活性的机制具有重要的意义，还可以利用关键的结构域可定向抑制目标基因，比如癌基因，提供可能的治疗药物的靶向载体。
发明内容
应用基因组信息学原理、DNA序列测定技术、5’-RACE、重叠区扩增基因拼接法、分子克隆、哺乳动物单杂交技术、基因表达与蛋白质纯化技术、免疫组织化学、Western Blot检测、细胞培养技术、细胞免疫荧光、以及激光共聚焦显微技术等，克隆鉴定了ZNF333全长cDNA，进行了基因表达谱分析；借助细胞培养、细胞免疫荧光及激光共聚焦显微等技术，确定了ZNF333核定位；综合运用细胞培养、缺失突变分析，哺乳动物单杂交以及Western Blot检测技术初步确定了ZNF333基因/蛋白质的生物学功能。
该基因/蛋白质达到的技术指标为1、NF333基因编码蛋白质定位在细胞核中。
2、ZNF333基因有两个转录本，在不同细胞系中有不同的表达。
3、一系列缺失表达分析证明ZNF333的KRAB结构域具有转录抑制活性。
4、突变分析证明关键的KRAB结构域的氨基酸发生突变将丧失转录抑制活性。
5、两个不同的KRAB结构域在不同的细胞系中发挥不同的抑制活性。
6、KRAB结构域可与共抑制子KAP-1相互作用
图1.ZNF333的KRAB结构域和锌指基序之间的比较分析。
图2.ZNF333在不同组织的表达谱。利用ZNF333第15到第467个核苷酸作为探针进行检测。
图3.Western blot检测pC-Myc-ZNF333在HEK 293细胞中的表达。
1.低分子量蛋白Marker；2.Myc-tag-znf333在细胞中的表达。
图4.ZNF333在HEK293细胞中的定位。
左图中绿色荧光显示Myc-tagged-ZNF333定位于HEK 293细胞核中；右图中红色荧光显示PI染色在HEK 293细胞胞核中；中图为前两张图片叠加的结果中间，呈现黄色，两种荧光叠加后，显示ZNF333蛋白定位在细胞核内。
图5.ZNF333的转录抑制活性的研究A.一系列缺失和突变重组体构建示意图(表达载体)；B.相对转录活性的检测。
实施例1.通过半定量RT-PCR检测两个转录本在不同细胞系中的表达(1)逆转录从培养细胞Hela，HepG2，HEK293，K562，U937，Jurkat中提取RNA，每个样品取1μg RNA进行逆转录。按Promega逆转录试剂盒实验(2)PCR取相同量的模板cDNA，分别用两个转录本的特异序列引物进行扩增，在到达平台期前分别扩出600bp和350bp的片段，分别代表长剪接子和短剪接子。PCR循环数为25-30轮。如图2。
Northern blot检测ZNF333在不同组织中的表达将提取的不同组织的RNA电泳完毕后用DEPC水冲洗凝胶3次，在凝胶的左上角切去一角作为方位标记，在EB中染色20～30分钟。在凝胶旁放一把荧光尺，在紫外灯下照相，照相后将凝胶放在一个瓷盘中，加入蒸馏水在水平摇床上洗30分钟(其间换3次蒸馏水)，然后用10×SSC洗1小时。转膜剪一张长宽分别比凝胶大1mm的尼龙膜，用DEPC水浸透，然后用20×SSC浸泡至少5min，待用。转移槽中加入适量20×SSC，槽上放一玻璃板作为平台，横跨玻璃板放一与槽同宽的滤纸，滤纸的两端浸泡在转移槽中的20×SSC。加20×SSC使平台上的滤纸浸透，然后用玻棒赶出所有气泡。将凝胶翻转后(加样孔向下)置平台上湿润的滤纸上，赶出凝胶与滤纸之间的气泡，处理好的尼龙膜覆盖在凝胶上，赶出膜与胶之间的气泡转膜24～48小时，吸水纸浸湿后需更换，并注意添加转移槽中20×SSC转膜完毕后，用铅笔在尼龙膜上标记所有加样孔的位置，用6×SSC漂洗尼龙膜5min，然后将膜放在干燥的滤纸上放置30分钟以上自然凉干。将尼龙膜的正面朝上放在紫外交联仪上进行紫外交联，将RNA固定在尼龙膜上。此时尼龙膜可直接用于杂交，如暂不使用，用铝箔宽松的包裹起来室温保存。杂交探针的标记后，将纯化好的标记探针于100℃变性5分钟，立即置冰上放置5分钟，然后全部加入到预杂交后的杂交液中(勿将探针直接加到膜上)，轻轻摇匀，再放回杂交炉中68℃杂交2小时或杂交过夜。洗膜及放射自显影将杂交液倒入同位素专用桶中，用50ml Wash Solution I(2×SSC，0.05％SDS)洗膜一次，再用50～100ml的Wash Solution I于室温洗膜2次，每次40分钟(于杂交炉中摇动)。Wash SolutionII(0.1×SSC；0.1％SDS)于50～65℃洗膜3次，每次40分钟。将膜封在保鲜膜中，在磷屏上暴光12～24小时，然后在磷成像仪上扫描获取图象，也可用X光片在-80℃进行放射自显影分析。如图22.Western Blot检测ZNF333在HEK293细胞中的表达情况将ZNF333克隆入pc-Myc质粒，构建融合蛋白质表达载体，并对重组质粒进行测序鉴定。在HEK 293细胞中进行质粒转染。提取细胞裂解液，实验方法如下12％SDS-PAGE电泳，电泳完毕，取下凝胶在凝胶一角切下一小块作为标记。将凝胶放入电转缓冲液(3.03g Tris-HCl，14.41g甘氨酸，150ml甲醇，加去离子水至1000ml)中平衡5min，PVDF膜经100％甲醇浸透，电转液平衡20min，夹好支架在冰浴中进行电转，80V，2h；或14V，12h。电转结束后，将膜置于TBS漂洗三次，每次5min。切下边侧的蛋白质分子量Marker条带，入0.2％氨基黑染液染色1-2min，然后以10％乙酸脱色至可见蛋白质条带，蒸馏水漂洗观察转移效果，并密封保存留待以后作为分析结果时分子量的参照。转移的转印膜勿干，加入适量封闭液中，室温轻摇2h。将转印膜放入杂交袋内，按照0.1ml/cm2分别加入用封闭液以适当比例稀释的一抗，除尽气泡，封口。于4℃轻摇过夜。取出转印膜，用TBS-T洗三次，每次10min。将膜放入杂交袋内，按照0.1ml/cm2加入用封闭液配制的碱性磷酸酶标记或辣根过氧化物酶标记的相应抗体，赶除气泡封口，室温振荡2h。取出转印膜，用TBS-T洗三次，每次10min。
碱性磷酸酶显色反应碱性磷酸酶显色缓冲液(100mmol/L NaCl，5mmol/L MgCl2，100mmol/L Tris-HCl pH9.5)洗膜5min。将转印膜浸入含100μl Reagent A与100μl Reagent B(Bio-Rad)的10ml显色缓冲液中，于室温下轻轻摇晃使蛋白质条带显现，蒸馏水中漂洗，4℃避光保存并照相。
辣根过氧化物酶化学发光法各取等体积ECL试剂A液、B液混合(按每平方厘米转印膜0.125ml ECL混合液计算)。将转印膜轻轻接触滤纸吸干液体，有蛋白质的一面朝上放在保鲜膜上。将ECL混合液加到转印膜上，反应1min，提起转印膜，轻轻接触滤纸吸干液体。用保鲜膜覆盖转印膜，注意表面要平整。用透明胶带将保鲜膜覆盖的转印膜固定在显影盒中，有蛋白质的一面朝上。于暗室与X光片曝光10sec，30sec，1min不等，冲片观察结果。如图33.ZNF333在HEK 293细胞中的定位将ZNF333克隆入pc-Myc质粒，构建融合蛋白质表达载体，并对重组质粒进行测序鉴定。在HEK 293细胞中进行质粒转染。实验方法如下准备将盖玻片分次置于浓酸中浸泡2小时，用去离子水洗净后室温干燥。将经酸处理的盖玻片置于10倍稀释的多聚赖氨酸溶液中，室温放置5分钟后取出，置于60℃干燥1小时或室温过夜。用前将盖玻片浸泡于75％乙醇中至少30分钟。
实验前两天将处理过的盖玻片放置于6孔培养板中，将处于对数生长期的HEK 293细胞接种于6孔板中，每孔1×106个细胞，37℃，5％CO2培养至90％饱和度。用50μl无抗生素无血清DMEM分别稀释5μg质粒和5μl LipofectAMINETM2000 Reagent(Invitrogen)。室温放置2分钟后将稀释的质粒和LipofectAMINE 2000 Reagent混匀，室温放置20分钟。将上述混合物加到6孔培养板中，来回振荡混匀后放置于CO2孵箱。转染4-6小时后，将培养基换为有血清DMEM培养基，于37℃，5％CO2孵箱中继续培养。
细胞免疫荧光染色1)细胞固定用PBS清洗细胞两次，取出盖玻片，用滤纸将残留液体吸干，以4％多聚甲醛固定液室温固定10分钟。2)PBS漂洗，3×5分钟。3)细胞透化室温下，0.5％Triton/PBS透化处理10分钟。4)PBS漂洗，3×5分钟。5)细胞封闭以3％BSA/PBS封闭，37℃，30分钟或4℃过夜。6)一抗孵育1∶100稀释抗体，37℃，30分钟。7)PBS漂洗，3×5分钟。8)二抗孵育1∶50稀释抗体，37℃，30分钟。9)PBS漂洗，3×5分钟。10)去离子水漂洗，2×5分钟。11)封片取10μl封片剂滴在载玻片上，将盖玻片有细胞的一面朝下封片，四周用指甲油封住。12)用激光共聚焦显微镜观察照相。如图44.哺乳细胞单杂交系统检测转录抑制活性哺乳细胞单杂交可用于检测所研究的蛋白是否具有转录因子活性。将所研究的蛋白与酵母Gal4蛋白(一种转录因子)的DNA结合结构域(BD)融合，将融合蛋白质粒(pM-ZNF333)和荧光素酶报告基因pGAL45tkLUC(在荧光素酶基因的上游含5个Gal4结合位点和胸苷激酶最小启动子)共转染细胞，pM-pZNF333所表达的融合蛋白通过Gal4 BD与pGAL45tkLUC上Gal4结合位点结合，如果ZNF333具有转录因子的抑制结构域(RD)，将抑制报告基因的转录。
按下列体系用脂质体转染法转染细胞(单位μg)质粒 对照组实验组pGAL45tkLUC 2.5 2.5pRL-SV40 0.1 0.1pM-ZNF333/1pM 1/转染24～48小时后检测荧光素酶活性。
转染细胞前一天将HEK293细胞接种到24孔板中，2×105细胞/孔，用脂质体转染法转染细胞在所转染的质粒中，pGAL45tkLUC为带Gal4的TK启动子的Fluc荧光素酶报告基因质粒，pRL-SV40为内参质粒，能高表达Rluc荧光素酶，用于转染效率的标准化。pM为对照质粒，pM-znf333为表达ZNF333的真核表达质粒。
荧光素酶检测(Promega公司双重荧光素酶检测试剂盒)(1).准备工作LARII的准备将荧光素酶检测底物重悬于10ml Luciferase Assay Buffer II中，充分混匀后分装(0.2～0.5ml/管)，标识LAR II(Luciferase Assay Reagent II)，置-80℃保存。使用时取一管室温融化，混匀备用。
Stop&Glo试剂的准备从提供的250μl Stop&Glo底物溶剂中转移200μl至盛有干燥的Stop&Glo底物的瓶中，盖好盖子，轻轻振荡10s使之溶解混匀。在管壁上标“50×”作为储备溶液。置-80℃保存。实验当天配制足够量实验所需Stop&Glo试剂将一体积50×Stop&Glo底物加入到50倍体积的Stop&Glo缓冲液中，混匀。
配制1×PLB根据实验所需量将5×PLB用ddH2O稀释成1×PLB
(2).细胞裂解液的制备吸去细胞培养液，用PBS洗去多余培养基和脱落细胞，吸出PBS。再洗一次，35mm培养皿中加入500μl 1×PLB，要求PLB完全覆盖细胞将培养皿置水平摇床室温摇动30min..在测量管中加入20μl LAR II，再加4μl细胞裂解液，用吸头混匀2-3次。将测量管置于荧光检测仪中测量萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)的活性。从检测仪中取出样品管，加入20ul Stop&Glo试剂，短暂混匀，重新测量Renilla Luciferase活性。弃去反应管，重复步骤3-4对其他样品进行检测。用Firefly Luciferase与Renilla Luciferase活性的比值作为待测荧光素酶报告基因的活性。如图5。
权利要求
1.本发明涉及一个新的KRAB型的锌指蛋白，具有基因转录调控功能的蛋白质片段，命名为ZNF333。
2.根据权利要求1所述之ZNF333基因/蛋白质，其特征在于该蛋白质是一个KRAB型的锌指蛋白，利用锌指结构域特异结合DNA序列，利用KRAB结构域发挥转录调控作用。
3.根据权利要求1、2所述之ZNF333基因/蛋白质，其特征在于ZNF333基因编码蛋白质定位细胞核中，是核因子。
4.根据权利要求1、2、3所述之ZNF333基因/蛋白质，其特征在于在HEK293细胞中，ZNF333发挥序列特异性的转录抑制活性。
5.根据权利要求1、2、3、4所述之ZNF333基因/蛋白质，其特征在于ZNF333与共抑制子KAP-1相互作用，在染色体水平发挥转录抑制活性，在细胞生长分化和发育过程起重要作用。
6.根据权利要求1、2、3、4、5所述之ZNF333基因/蛋白质，其特征在于在不同的细胞系中，两个KRAB结构域表现转录抑制活性具有细胞特异性。
7.根据权利要求1、2、3、4、5、6所述之ZNF333基因/蛋白质，其特征在于利用关键的KRAB2结构域和KRAB1结构域在抗肿瘤的载体设计与开发中具有潜在的应用前景。
全文摘要
本发明涉及一个人类特异表达的KRAB型锌指蛋白基因的生物学功能，该基因/蛋白质命名为ZNF333(GenBank注册号AF372702)。内容包括应用基因组信息学原理、DNA序列测定技术、5’－RACE、重叠区扩增基因拼接法得到编码人的KRAB型锌指蛋白665个氨基酸的cDNA片段；Northern blot检测显示，ZNF333在多种组织和细胞系中表达；细胞免疫荧光定位结果显示，在HEK293细胞中，ZNF333分布于细胞核中；哺乳动物单杂交系统检测ZNF333具有转录抑制活性，并与共抑制子KAP－1作用，在染色体水平调控基因表达。这些结果提示znf333蛋白不仅是核因子，而且具有转录抑制活性，参与基因的表达调控，在细胞的生长分化和发育过程中起重要作用。
文档编号A61K38/17GK1597696SQ03157190
公开日2005年3月23日 申请日期2003年9月18日 优先权日2003年9月18日
发明者陈冀榛, 田勇, 黄尚志, 荆哲, 石立松, 杨涛, B·A·奥斯特拉 申请人:中国医学科学院基础医学研究所