使用深度过滤从生物液体中捕获、浓缩和定量异常朊病毒蛋白的制作方法

专利名称：使用深度过滤从生物液体中捕获、浓缩和定量异常朊病毒蛋白的制作方法
背景技术：
可传染的海绵状脑病(TSEs)是由在中枢神经系统(CNS)中的进行性痴呆、共济失调、淀粉样斑形成和海绵状变性表征的神经变性疾病的集合(Prusiner，S.B.，1993，Dev.Biol.Stand.80，31-44)。如今该疾病的致病因子认为是异常的朊病毒蛋白。TSEs的基本特征，如人类的克雅病(CJD)、牛的牛海绵状脑病(BSE)以及绵羊的瘙痒病为正常细胞朊病毒蛋白PrPc向致病型PrPsc的转变。朊病毒感染的动物脑中PrPsc的积累与感染性朊病毒效价的提高相关，且可用作朊病毒病的诊断标记。由于BSE向人类的种间传播的威胁，大量家畜必须测试脑中或其他合适的材料中PrPsc的存在。在能使PrPsc和PrPc区分的共价修饰缺乏时，利用PrPsc而不是PrPc具有部分蛋白酶抗性的事实，PrPsc在蛋白酶K(PK)处理的组织匀浆中通过蛋白质印迹法或酶联免疫吸附试验(ELISA)常规检测。特别地，这些目前所用的测定法没有利用PrPsc形成凝集物的事实。如今确信具有去污剂抗性的PrPsc凝集物的形成是PrPsc通常的生化特性，即使是对于那些PrPsc对蛋白分解消化敏感的极少的朊病毒株。凝集作用在朊病毒暴露于凝集作用辅助剂，例如包括复合剂时发生。
致死的人神经变性疾病CJD也通过一系列途径送原性地传播，其暗示致病因子也可以通过血制品传播的可能性。一种人TSE新型的鉴定，命名为“变体”CJD(vCJD)，其与牛海绵状脑病(BSE)因子有关的证实以及在人组织中vCJD因子的分布可能与经典的CJD不同的证据揭示了血或血制品可以传播PrPsc的理论风险的存在(参见Turner等.，Blood Reviews 1998；12255-68)。
许多血制品从包含正常或特殊的免疫球蛋白、凝固因子浓缩物和白蛋白溶液的人血浆供体库中制备用于医药用途。现在有一个值得关注的关于从人或动物来源的生物医药产品可能传播TSEs可能性的忧虑。人血浆蛋白的肠胃外施用固有地带有疾病传播的风险。现有的血浆筛选和处理步骤以去除或灭活病毒的技术已经大大提高这些产品的安全性，这方面参见Burnouf T，等.，Blood Reviews 2000；1494-110。然而，对异常的PrPsc合适的筛选测验仍旧没有得到发展，其对化学或物理的灭活方法具有极端的抗性。为确定vCJD已通过源于该血浆的产品传播到病人的概率，有必要确定PrPsc在临床相关环境中的传播力、对血浆分离物使用的操作能从血浆产品中去除PrPsc的程度以及在生物制品中用有效的测定法检测因子PrPsc的程度。
人血浆随着大量细胞碎片的去除而从全血中获得。最近的由血浆分离产业作的研究表明在人血浆产品制造中使用的加工步骤可减少PrPsc(参见Foster P.，Trans.Med.1999，93-14；Lee DC等.，J.Virol.Methods 2000，8477-89；Foster P.等.，Vox Sang 2000，7886-95，and Lee D.等.，输血.2001，41449-55)。这些加工步骤包括Cohn分离、深度过滤和层析。Foster等(Vox Sang，supra.)证实深度过滤对于从免疫球蛋白和白蛋白中去除大量的异常朊病毒蛋白(PrPsc)是有效的。
因此有必要发展有效的从动物或人来源的医药产品或食品中捕获和去除异常的感染性朊病毒而基本上没有降低和/或去除产品的生物学活性或食品价值的方法。因目前异常朊病毒检测和定量的方法的限制，在浓缩至上述检测限以上以及随后从样品中检测和精确定量异常的朊病毒蛋白(PrPsc)的能力上存在未解决的需求。
本发明是基于令人惊讶的发现，即包含生物制品，如生物活性蛋白的水样液体，用一个或多个具有孔径小于约6微米的深度过滤器的深度过滤对去除异常感染性朊病毒蛋白是非常有效的。更具体而言，本发明人做了令人惊讶的发现，即包含生物制品，如生物活性蛋白的水样液体，在凝集作用辅助剂处理后，用一个或多个具有孔径小于约6微米的深度过滤器的深度过滤对去除异常感染性朊病毒蛋白是非常有效的。
本发明提供了与TSEs相关的PrPsc的捕获、去除、浓缩和随后的精确定量的方法，而该TSEs包含于生物或食物制品中。
尤其是，本发明提供了与TSEs相关的PrPsc的捕获、去除、浓缩和随后的精确定量的方法，该TSEs在生物制品中，已用一种或几种凝集作用辅助剂处理而导致PrPsc的凝集，使得可在过滤器中或上捕获PrPsc。任何能导致凝集作用的方法可如此处考虑的凝集作用辅助剂一样而应用。尤其是，已发现溶剂如醇可被应用。在本发明的方法中，凝集作用辅助剂如已与生物学或食物产品混合的液体溶剂通过过滤器，过滤器由硅藻土或类似的过滤材料浸制的纤维素基质形成，可用阳离子树脂包被而使过滤器的平均孔径为约0.1微米至约6微米。一般，过滤器为一次性使用的过滤器。
尤其是，本发明提供了与TSEs相关的PrPsc的捕获、去除、浓缩和随后的精确定量的方法，该TSEs在生物制品中，已用一种或几种凝集作用辅助剂如溶剂，例如醇、醇分离的免疫球蛋白溶液，其包括将含有生物或食物制品的溶剂液体通过深度过滤器，该过滤器由包含多孔材料的固体颗粒的基质形成，且具有的孔径能使小于约6μm的产生滞留。一般，过滤器为一次性使用的过滤器。用凝集作用辅助剂的处理可由一种或多种辅助剂混合使用或依次使用完成。
术语“去除”或“捕获”理解为从含有目的蛋白的液体中PrPsc确实的物理去除。因实际的目的，目的蛋白从其起始生物状态的回收应当基本上维持至少超过50％的水平，优选80％，更优选＞90％。
使用本发明的方法，异常的感染性朊病毒蛋白的去除可达到至少102.5、103、优选104、更优选＞105。
除了从生物或食物制品中去除感染性PrPsc，本发明还涉及从一种或多种过滤器上洗脱及随后用洗脱缓冲液对捕获的和已洗脱的PrPsc的浓缩，缓冲液可包含，例如，高渗溶液如高盐溶液以使PrPsc可用有效的测定法精确定量。
因此，本发明提供了朊病毒的凝集以及随后为纯化生物或食物制品而进行的过滤、朊病毒从过滤器上的洗脱及PrPsc的浓缩，以使本领域技术人员能应用有效的测定法对生物或食物样品中的总朊病毒和PrPsc定量。本发明还进一步提供对大量样品的PrPsc快速高通量的检测。
本发明还涉及已处理的生物或食品溶液。
由于人血浆的来源为大量细胞组分去除后的全血，因此，为了模拟所期望的TSE因子在血浆中的状态用于分离，在此使用瘙痒病感染的仓鼠脑部分作为接种物，其中完整的细胞和更大的碎片已被去除。已确信TSE疾病可通过蛋白酶K抗性、构象异常的朊病毒蛋白(PrPsc)传播。在此，我们公开了一种体外分析方法，用以确定作为vCJD的分布标记的仓鼠适合的瘙痒病PrPsc的分布。
TSE因子对灭活作用有高抗性，因此任何产品相关风险的降低将依赖于产品制造过程中感染性材料的物理去除。血浆产品制造中使用的加工技术包括通过沉淀和层析而使蛋白分离和通过深度和膜过滤步骤而使最终蛋白溶液得到澄清和灭菌的各自进行。一些技术，通过用本发明的方法对其改进，可从产物流中去除TSE因子。
在此PrP蛋白用对仓鼠PrP特异的单克隆抗体3F4的蛋白质印迹法检测。该抗体仅与人、仓鼠和猫的PrP109-112残基反应。与3F4抗体在0.6μg/ml浓度下至少孵育1小时，随后过量抗体被洗去且膜用兔抗鼠的辣根过氧化物酶结合物(1∶1000稀释)孵育至少1小时。在多次用TTBS洗涤后，膜用增强的化学发光剂显影。
在代理商制造RhoGAMRHO(D)免疫球蛋白(人)过程中，PrPsc在深度过滤步骤时被去除至检测限，该步骤也在免疫球蛋白的制造过程中使用。
蛋白质印迹法是用于鉴定和表征PrPsc的方法。PrPsc通过提取而分离且通过对蛋白酶K消化的部分抗性而区分。PrPRES(对蛋白酶消化具抗性的PrPsc)通过糖基化形式和片段的迁移位点而得到鉴定。该测定法的灵敏度低于感染性测定法灵敏度约3个数量级(logs)。灵敏度问题可通过离心酶消化制备物、去除上清和重悬朊病毒物质于较小体积、形成朊病毒物质的浓缩物而部分克服。我们已表明朊病毒可通过在用凝集作用辅助剂处理后通过过滤器而过滤，以及随后通过洗脱而收集于小体积而很容易地浓缩。该技术可用于从产品流中大规模地去除朊病毒。
该操作将对免疫蛋白印迹法和事实上任何其他朊病毒检测测定法用于测定生物基质中PrPsc的存在产生主要的影响。本发明允许TSE材料得到快速定量浓缩以增强检测。当想要纯化PrPsc的生物、食品或化妆品溶液时，本发明在该生物、食品或化妆品溶液易于通过大的额定孔径过滤器而过滤方面具有优势。
本发明的方法在通过去除、洗脱PrPsc和进一步定量PrPsc而对生物、食物和化妆品处理方面是有用的，所述的处理有赖于所用的凝集作用辅助剂。可经过如此处理的生物材料为血和血液组分如，全血、血清、血浆、尿、脑脊髓液和血液来源的生物制品如抗体和免疫球蛋白。该抗体的一种为已知的单克隆的抗-D免疫球蛋白或RhoGAMRho(D)免疫球蛋白(人)。该多克隆的免疫球蛋白用于新生儿溶血疾病的预防，其中母亲感染了人源的Rho(D)免疫球蛋白。该产品称为RhoGAM，可从其代理商处获得，且它通过预防未受免疫的Rho(D)阴性母体免于对红细胞上的和从Rho(D)阳性婴儿“接受的”Rho(D)抗原产生免疫应答而起作用。因此，通过母体预防抗Rho(D)产生，该母体随后的Rho(D)阳性婴儿就可免于新生儿溶血疾病。该有用的产品目前通过Cohn醇分馏类型的方法生产。
RhoGAMRho(D)免疫球蛋白(人)是获得抗体介导的免疫抑制的首次成功预防应用的特异抗体。RhoGAM是一种含有每剂量300微克抗-D活性剂量的抗-Rho(D)的IgG免疫球蛋白溶液。RhoGAM可在适当的时间给予未受免疫的、Rho(D)阴性妊娠妇女以预防其Rho(D)阳性后代中未来的疾病。该疾病称为新生儿溶血疾病或更特定地，Rh-胎儿成红细胞增多病。
更小剂量的抗-Rho(D)，MICRhoGAMRho(D)免疫球蛋白(人)微-剂量(50微克抗-Rho(D))也由其代理商销售，用于治疗在12周妊娠期或更早时堕胎和流产的妇女。受体保护的全剂量为15ml Rho(D)阳性红细胞，而提供保护的更小剂量为2.5ml Rho(D)阳性红细胞。RhoGAM在26至28周妊娠期用作出生前的预防。其他适应症包括继续妊娠时在妊娠任何时期的先兆流产、在妊娠13周或之前的流产或妊娠终止、腹部创伤或遗传羊膜腔穿刺术、绒毛活检(CVS)和经皮的脐带血活检(PUBS)。
大部分经FDA和生物局批准应用的可注射免疫球蛋白物质已通过醇分馏方法而生产，其由哈佛的E.Cohn博士开发且在Cohn等.，J.Am.Chem.Soc.68，459(1946)中描述，在此引入作为参考。该方法与肝炎病毒、HIV，和其他血源性病原体阴性血浆的谨慎选择联合使用，该选择通过最灵敏有效的测试来测定。由该方法生产的产品的确是安全的可很容易地由数百万未受感染的产品接受者来证实。发明人发现在上述参考的Cohn方法中使用的醇足以作为一种凝集作用辅助剂，其引起足够数量的PrPsc颗粒凝集，致使PrPsc可被去除至使用本发明的深度过滤器检测的限度，以及PrPsc可被洗脱和浓缩至足以用于该检测的水平。
所用的溶剂组合物对IgG颗粒只有极小的影响，但足以凝集PrPsc至其可被去除至低于用有效的测定法所能测定的水平。
因此，本发明的一个目的是提供使用朊病毒凝集作用辅助剂和膜或深度过滤器从生物或食物制品中去除PrPsc和如果需要，PrPc的方法。深度过滤器优选使用。
本发明的另一个目的是在没有对蛋白的自然或生物学活性产生不可接受的影响下，从含有蛋白的，尤其是那些来源于人血浆的液体中去除PrPsc和如果需要，PrPc的方法。
本发明进一步的目的是使用此处公开的方法从任何生物液体中捕获、浓缩和精确定量检测PrPsc。
本发明的一个目的是提供用于注射的异常感染性朊病毒清除的，纯的免疫球蛋白。该基本上纯的产品用本发明的方法生产。
本发明进一步的目的是提供从异常的感染性朊病毒中纯化免疫球蛋白的制造方法，其适于即时的、令人满意速度和蛋白产量的需求。
本发明进一步的目的是提供深度过滤器，其可为单次使用的过滤器，在从方法流程中去除PrPsc后可被抛弃。
本发明进一步的目的是通过从深度过滤器和过滤器洗涤物中洗脱所述朊病毒而提供浓缩的PrPsc溶液。
本发明另一更进一步的目的是提供一种快速测定法用于评估在包含生物液体和人血和血浆来源的产品的不同生物样品中的PrPsc。该测定法的使用，如，蛋白质印迹法，需要在未朊病毒凝集、未过滤的生物溶液中不能利用的朊病毒达到足够的水平。该方法提供了一种捕获、洗脱和浓缩朊病毒以使其可用目前有效的测定法检测的实用方法。这些新的捕获和洗脱方法的使用提高了约3个数量级灵敏度，使得能够降低所需体积而实施该检测测定法。
发明概述本发明的方法用于生产基本上纯化的异常朊病毒蛋白的免疫球蛋白(优选单克隆的)。基本上纯化的免疫球蛋白为例如单克隆或多克隆抗-D免疫球蛋白，如RhoGAM或MICRhoGAM。该免疫球蛋白制剂包含约4.0％至6.0％重量比的免疫球蛋白，和从约80至200ppm的聚山梨酯80，更优选约5.0％重量比的免疫球蛋白和约130ppm的聚山梨酯80。
上述引用的免疫球蛋白制剂通常通过使用凝集作用辅助剂如醇分馏人血浆的步骤制得，其中分馏包含过滤步骤；重悬所得到的沉淀物II；用含有赋形剂的高离子强度缓冲液与重悬的沉淀物II混合；和对免疫球蛋白进行毫微过滤。
醇可优选甲醇且在分馏过程中对上清液III实施过滤步骤，可用深度过滤器如Cuno Zeta Plus 90S深度过滤器。
该方法公开了对异常朊病毒蛋白基本上纯的抗-D抗体的制造方法，包括在凝集作用辅助剂如醇存在时分馏人血浆，其中分馏包含过滤步骤。该过滤步骤可使用深度过滤器如Cuno Zeta Plus 90S深度过滤器，其孔径值为约0.6至6微米。得到的上清液，在分馏过程中作为“上清液III”提及，经处理形成沉淀物(在方法中称“沉淀物II”)，其随后重悬且与处理辅助剂混合，之后立即对得到的抗-D抗体实施毫微过滤。该处理辅助剂包括高离子强度缓冲液和非离子赋形剂，例如150mM Nacl-甘氨酸缓冲液和聚山梨酯80。
在此进一步公开了对异常朊病毒蛋白基本上净化了的生物制品的制造方法，其通过将生物制品与凝集作用辅助剂如足以形成凝集的异常或正常朊病毒蛋白的溶剂混合；以及用深度过滤器过滤由此得到的混合物而进行。该生物制品为血或血制品、脑脊液或尿。当制品为血时，血液首先经临床离心，在与凝集作用辅助剂混合前红细胞和血小板从血液中去除。在过滤步骤后，红细胞和血小板加回血液中。深度过滤器可包括例如Cuno Zeta Plus 90S深度过滤器。凝集作用辅助剂可以是醇，如浓度为约2％至约100％的乙醇或甲醇。
另外在此进一步公开了在生物溶液中定量异常朊病毒的方法。该方法包括将生物溶液与凝集作用辅助剂如足以凝集异常朊病毒蛋白的溶剂混合、用深度过滤器过滤混合物、通过用洗脱缓冲液冲洗过滤器而将异常朊病毒蛋白从深度过滤器上洗脱、任选地通过诸如离心的方法浓缩洗脱物和对洗脱缓冲液实施异常朊病毒蛋白的测定。生物溶液可以是血或血制品(例如免疫球蛋白)、脑脊液或尿。
附图简述

图1为显示分馏人血浆以获得抗-Rh球蛋白过程的流程图。在分馏过程中材料经过滤以捕获朊病毒蛋白。
发明详述本发明使用一种或多种凝集作用辅助剂以在液体中凝集朊病毒，致使朊病毒(正常和/或异常)可被洗脱、捕获、浓缩和检测。一类凝集作用辅助剂可在液体，如生物液体中凝集异常感染性朊病毒(PrPsc)和正常朊病毒，朊病毒凝集物可随后被去除、洗脱、浓缩，以及异常、正常或两种类型的朊病毒可用本发明的方法精确定量。
本发明进一步涉及其为复合剂的凝集作用辅助剂的用途，该制剂凝集正常或异常朊病毒依赖于该配位剂的特性。所述配位剂包括金属离子如例如Cu2+、Ni、Zn和Ag。
本发明提供了过滤器例如用于包含球状蛋白质分子如免疫球蛋白或抗体的生物液体的深度过滤器，期间没有可察觉的产量损失和免疫球蛋白亚类、免疫球蛋白凝集水平或免疫球蛋白稳定性的显著变化。
本发明的方法生产出基本上无异常感染性朊病毒(PrPsc)和如果需要，正常朊病毒(PrPc)的生物液体。当凝集作用辅助剂选择适当时，本发明的凝集和过滤方法事实上可以确保所有分类学上可能的朊病毒，不管正常还是异常，从制品中去除。
该方法尤其适用于全血、血液组分(如，血清、血浆)、尿、CSF或任何生物材料如含有白蛋白、免疫球蛋白(例如IgG)和其片段的液体、凝血因子如因子IX、凝血酶、纤连蛋白、纤维蛋白原、因子VIII、因子II、VII、IX和X以及其他来源于血浆的蛋白的处理。其也适用于血浆、因子XI、因子XIII、血红素、α-2-巨球蛋白、半抗原球蛋白(haptogobin)、转铁蛋白、载脂蛋白、蛋白C、蛋白S、C1-酯酶抑制剂、酶(例如链激酶)、间(inter)-α-胰蛋白酶抑制剂、生长激素和冯·威利布兰德因子的处理。上述天然存在的和重组类似物可得到处理。另外，本发明适用于其他天然制品包括食物、饮料、化妆品的处理。其还适用于其他非血浆动物来源制品，如肝素和激素的处理。
如此处所述，可用本发明的方法处理的生物液体包括血和血液组分如全血和其组分，包括血清和血浆、尿、脑脊液，和任何生物制品如抗体和免疫球蛋白。本发明中处理和过滤的人血浆可通过Cohn等(“Cohn方法”)的分馏方法，上述作为参考，由批样或柱交换层析，或通过亲和层析而获得。在生产免疫球蛋白，特别是抗-D免疫球蛋白如RhoGAM Rho(D)免疫球蛋白(人)的方法中，普通转让的美国专利No.6,096,872(2000年8月1日授予Van Holten等专利权)在此作为参考，其内容引入作为参考。
Cohn(美国专利No.2,390,074，其内容在此引入作为参考)公开了分馏血的方法，通过其制得γ球蛋白。由Cohn方法制得的γ球蛋白包含19S球蛋白、纤连蛋白原和脂类。虽然γ球蛋白非常适于预防诸如麻疹和破伤风疾病，19S球蛋白、纤连蛋白原和脂类的存在却是非必要的污染物，且会降低其在预防免疫法中对胎儿红细胞Rh-因子的效力。
由本发明有效的方法制造的基本上纯的抗-Rh球蛋白从人血浆中制得，该血浆包含白蛋白、纤连蛋白原、α、β、γ球蛋白和各种脂类。特定地，本发明的抗Rh-球蛋白为γ球蛋白。
为获得抗-Rh球蛋白的人血浆分馏依照上述Cohn等，以及普通转让于Pollack等的美国专利No.3,449,314的方法进行，该专利的教导在此引入作为参考。关于所附的流程1，分馏人血浆的能力依赖于血浆中各种组分的溶解度。在分馏的每个时期，分馏组分的分离和抗-Rh球蛋白中不需要的那些组分的最终去除通过pH、温度、沉淀物的浓缩和系统离子强度的严格控制而确定。
各种凝集作用辅助剂可用于在本发明生物液体中驻留的朊病毒的凝集作用。有许多类的凝集作用辅助剂可使用，其发挥作用的原理为不发生凝集作用而改变朊病毒的特性(如，大小)或反之影响包含朊病毒的环境。
值得高兴的是一些凝集作用辅助剂可凝集异常和正常的朊病毒。此类凝集作用辅助剂包括低介电常数的有机溶剂，如丙酮和醇，其被熟知用于沉淀蛋白且已用于血浆分馏。更特别地，本发明方法中使用的有机溶剂包括各种醇类，其为彻底的水易溶的，以及不与蛋白反应的，如乙醇、甲醇、异丙基、异丙醇、n-丙醇、异丙醚、酮、醛等，和丙酮，优选甲醇。本类中可使用的其他类似凝集作用辅助剂，某种程度上能与受处理的生物材料共处，其包括硫酸胺、辛酸和化学制剂三氯乙酸(TCA)、双醛、杂多酸和乳酸盐单水合物C18H21N3O4H2O。
更令人高兴的是，某些凝集作用辅助剂可凝集异常朊病毒因而使其能被去除，而使正常朊病毒保留其原状态，反之亦然，该类凝集作用辅助剂为配位剂。这些配位剂与朊病毒结合，且包括杂多钼酸盐、杂多钨酸盐、磷酸钨酸钠(NaPTA)(所有只凝集异常朊病毒)，和生物制剂如抗体(单克隆或多克隆)，抗体的作用基于其特性，酶如纤连蛋白原(其只凝集异常朊病毒)和多肽，多肽的选择性作用基于其构成。更进一步的凝集作用辅助剂其为配位剂包括金属离子Cu2+，其凝集正常朊病毒。其他类似的金属离子可包括Ni、Zn和Ag。这些制剂在结合在基底时可用作朊病毒捕获装置。在一实施方案中，涉及配位剂可系列使用，比方说，离子Cu2+可与生物溶液混合，通过过滤将正常朊病毒去除，随后将所得的生物溶液过滤物和NaPTA混合以复合异常朊病毒，其可随后用已知的测定方法捕获、洗脱和浓缩以及检测。
凝集作用辅助剂甲醇因其相对于其他有机溶剂较低的毒性和操作安全性(如，爆炸危险)而首选用于去除免疫球蛋白溶液中的朊病毒。当使用此溶剂时，一般以与生物液体约2％至约100％的体积比浓度存在于与生物液体的混合物中。溶剂浓度通过最小的凝集朊病毒所需浓度来指示较低的范围，以及通过生物材料和过滤介质的完整性来指示较高的范围。
发明人已发现本发明的用诸如上述凝集作用辅助剂的处理导致朊病毒(PrPsc和PrPc之一或两者，基于应用时所用的凝集作用辅助剂和方法)蛋白的凝集，以及使用本发明方法时，所述凝集物可用过滤去除。然后，使用本发明的方法，包括过滤和随后从过滤器洗脱和过滤器洗涤，和如果需要，浓缩洗脱物，PrPsc可以以足以能精确定量的浓度获得。使用本发明的方法，已发现所述处理足以从免疫球蛋白制剂中去除PrPsc至低于其检测限。用于检测所述朊病毒的测定法的灵敏度提高了约3个数量级，使得体积减少以及因此提高了样品中朊病毒的浓度。
为了本发明PrPsc凝集作用方面，可使用的凝集作用辅助剂为任何已发现可沉淀异常感染性朊病毒蛋白原纤维的试剂，其能与受处理的生物材料相容，以及与所用的滤器相容。
本发明的过滤可在任何适合被过滤的生物材料的温度下进行，事实上过滤的环境由经过滤器的生物、食品或化妆品制品确定，而不是捕获朊病毒物质所需的环境。为防止分馏和过滤中蛋白变性，应用的分馏和过滤可优选在低温下进行。由于蛋白溶解度是温度依赖性的，分馏的每个步骤温度的选择必须是最低可能的，其允许所需分离和/或过滤进行以防止变性。pH环境应当由受纯化的生物制品的易感性确定。
本发明实际使用的深度过滤器为那些带电荷或不带电荷的深度过滤器。所使用的深度过滤器的实施例包括Celite(World Minerals，Lompoc，CA)、Millipore过滤器75DE和SA(Millipore公司，Bedford，MA)，和Cuno 35P和Cuno Zeta Plus 90SP(Cuno公司，Meriden，CT)。
最优选在本发明中使用的为47mm Cuno Zeta Plus 90SP深度过滤器，带有适当的不锈钢过滤套，用于小规模过滤作业，以及在制造过程中使用的16平房英尺的筒。本发明实际使用的过滤器优选深度过滤器，然而非-深度过滤器也可用于去除凝集的PrPsc，只要过滤物经过滤器时没有导致滤器的堵塞。所述替代滤器例如有薄膜滤器，带电荷或不带电荷。所述滤器包括例如，一次性注射器滤器Swinex或Millex 25mm PVDF注射器驱动的过滤单元、0.22微米Opticap和Optiseal筒(Millipore公司，Bedford MA)。
在实际去除和捕获本发明的PrPsc凝集物中使用滤器的孔径相对不重要，然而孔径可影响过滤的生物制品的回收。过滤基质的孔径优选在0.2至6微米的范围，特别是0.6至1.5微米。孔径以其上滞留颗粒的颗粒大小的方式来定义。一般已定义大小的颗粒如右旋糖酐或微生物用于校准目的。
在本发明基本上纯的、无异常感染性朊病毒免疫球蛋白制品的生产中应用的过滤单元的孔径小于约6μm，最优选小于约0.6μm。然而任何具有足以从蛋白质溶液中降低或消除异常感染性朊病毒的截留率滤器都可在本发明的处理方法中应用。例如，作为深度过滤器，CunoZeta Plus 90S滤垫(Cuno公司，Meriden，Conn.)可被应用，所述单元具有0.1至5微米范围的分子量孔径。
同样地，滤器组合物应当只对滤器捕获凝集的PrPsc的能力具有很小的影响，然而，朊病毒物质从所述滤器的回收将需要诸如高盐溶液或表面活性剂的洗脱缓冲液。
滤器材料可包含深度过滤器，其通常包含自身结合的纤维素基质，以及固体多孔微粒材料如Kieselguhr、珍珠岩或硅藻土。
深度过滤器通常具有1-10mm范围的厚度，尤其是2-5mm。深度过滤器所用的材料应当对涉及的所需蛋白只有很小的或没有影响。合适的深度过滤器包括孔径为0.6-1.5μm的Seitz KS80、Seitz K200P、Cuno Delipid Del 1小筒，有效过滤范围为27cm3、Millipore滤器，尤其是Millipore CP20，还包括常规的超过滤器，如Millipore PTHK聚醚砜膜、AMICON ym-100再生的纤维素超滤膜(Millipore公司，Bedford Mass.)、PALL Filtron Omega VR、Pall UltraporeVFDV50(Pall公司，East Hills，NY)，和其他筒过滤器，如AsahiPlanova再生纤维素筒过滤器(Asahi，Tokyo Japan)。其他可使用的过滤器为带电荷的深度过滤器如E.Begerow GmbH&Co.，Langenlonsheim，德国。然而，在此最优选的实施方案应用Cuno ZetaPlus 90S滤垫，47mm过滤器。
生物材料通过滤器的流速为那些适于确保生物材料适当过滤而不损害滤器完整性的流速，或，对于包含大量球状蛋白质的生物材料，为不损害蛋白结构而使得制备物无法用于其接下来的目的的流速。例如在免疫球蛋白制剂的深度过滤中，过滤速率范围从约0.01至约20ml/min，更优选约10ml/min，更优选约1ml/min。
该方法可在pH范围4-10，优选5-9，更优选6-8中进行。然而pH范围由保持受处理生物材料完整性所需的pH和所用的滤器来确定，而不受凝集或过滤操作本身的任何限制。
加热的应用是不必要的，该方法可在基本上室温或更低温度下进行，尤其是-5至20℃的温度，其适于维持生物材料和过滤介质的完整性。
如上所述，本发明的一个方面是用凝集作用辅助剂对生物材料的处理，该辅助剂为如足以凝集其中所含朊病毒而使其能通过过滤捕获和洗脱至用已知的方法如蛋白质印迹足以检测的浓度的溶剂。一些生物液体如此处理将作为其制品的一个参数，例如，Cohn方法中用醇处理的免疫球蛋白。当生物液体未经过如此处理，它将用如上面所述的适当的凝集作用辅助剂来处理，以凝集其中所含的朊病毒。所述生物液体为上面所列举的，以及可包括血液及其组分、尿、脑脊液，以及免疫球蛋白。
随着用凝集作用辅助剂处理生物材料，滤垫从套中除去以及朊病毒从其中洗脱，如果需要，用诸如离心的方法浓缩，且用有效的测定法定量，全部依照本发明的其他方面，所有的在此得到描述。
在感染朊病毒病的动物和人尿中存在一种蛋白酶抗性的朊病毒蛋白异构体。Shaked等(2001，J.Biol.Chem.276(34)31479-31482)详述了从尿中分离朊病毒的步骤。Shaked等描述的方法需要2-15ml尿样品在3000rpm沉淀5分钟，随后在纤维素膜管中透析过夜。随后尿样品以高速(100,000×g)在4℃离心1小时。
Shaked等的方法是费时的，且受易于浓缩的样品数量的限制。在此公开的为从生物液体如尿中精确定量朊病毒的方法，其可在几分钟内完成且不受体积的限制。在用本发明的方法从尿过滤和洗脱朊病毒时，尿体积达到1升都可用47mmCuno滤器过滤。相对于现有技术而言，体积的不同使得该方法在浓缩容量上有数量级上的提高。参见此处实施例9。
本发明中当全血用作生物液体时，其一定数量，例如1升，可首先在适于分离细胞各组分的条件下离心。所得到的血浆与凝集作用辅助剂如一定量的甲醇，按照如约5份血浆和1份甲醇的比率混合以凝集朊病毒物质。混合物用旋转振荡器轻轻混合一段时间，足以凝集所在朊病毒，例如约1(1)分钟。随后混合物流经滤器如47mm Cuno ZetaPlus 90S滤器。随后该物质用此处所述洗脱缓冲液从滤器上洗脱，且用任何适当的测定法定量朊病毒，如蛋白质印迹测定法。如果需要，该检测限可进一步由包括PrPsc沉淀的步骤来改进。样品被稀释且用蛋白酶-K(PK)处理，随后用AEBSF(4-(2-氨乙基)苯磺酰氟化物)抑制蛋白酶活性。随着PK的处理，样品在4℃，20,000×g离心1小时。沉淀物制备用于SDS Page。
当用朊病毒凝集作用辅助剂处理的生物物质为免疫球蛋白时，该物质将在血浆分馏过程中达到如此的处理。关于此处的图1和实施例1，将血浆单元混合，然后在特定条件下离心以及相关部分保留用凝集作用辅助剂作进一步处理，在这种情况下，优选甲醇。在获得上清液III的分馏时，上清液III用膜或深度过滤器过滤，其过滤去除其中可能含有的凝集朊病毒。因此获得的凝集朊病毒可从滤器洗脱以及用已知测定法检测和定量。
本发明的捕获和洗脱操作导致测定的检测限提高超过100倍，目前达到传染性测定法的检测限。用现有技术中已有的方法，传染性测定法依赖于所研究的种类需要数月才得到结果，相比较，使用本发明方法数小时产生结果。
随着驻留于生物液体的朊病毒的凝集，无论是通过溶剂还是其他方法，接下来的步骤为朊病毒(例如，PrPsc)的洗脱和回收。在这些步骤中滤器或滤垫被除去且用洗脱液洗涤。一种方法就是将垫放置在容器如培养皿、烧杯或类似合适的容器中，合适体积例如约15ml至约100ml的洗脱缓冲液加入其中，然后容器在室温下置于旋转振荡器上约25分钟。滤器结合的PrPsc因此通过用洗脱缓冲液温和的洗涤从中洗脱。合适的洗脱缓冲液包括任何水样缓冲液，如，高渗的盐溶液例如1.0-2.0M的Nacl缓冲液、浓度为1.0M至约2.0M的醋酸钠-甲醇缓冲液。
如果需要，凝集的朊病毒可由离心或现有技术中任何已知的方法进一步浓缩以获得更高的浓度。
考虑到血制品朊病毒污染的理论可能性，因此阐明深度过滤的有效性以及从免疫球蛋白制品RhoGAMUltra-Filtered Rho(D)免疫球蛋白(人)的中间产物中去除朊病毒的机制就尤为重要。为完成该目标，发明人使用瘙痒病-感染的仓鼠来源的瘙痒病脑组织匀浆(SBH)，作为PrPsc的来源。为实现该研究，PrPsc“活性种”首先用洗涤剂处理以溶解，随后超声波处理以裂解原纤维。该活性种得到处理以使得PrPsc小至能通过过滤系统。超声波处理的SBH随后用0.45、0.22和0.1微米的膜过滤，以便在掺加示踪剂之前更好地确定PrPsc活性种的大小。早先的研究(Van Holten R，等.，输血(提交公开))表明该处理不会对PrPsc有不利影响，且另外确保深度过滤将要去除的颗粒和感染相关的单体原纤维大小更相近。深度过滤后PrPsc的减少表明朊病毒的去除归因于原纤维吸附在正电荷滤膜上，而不是机械过滤。将活性种加入到稀释在磷酸缓冲液/甲醇混合物中的IgG中导致形成絮状物质沉淀，其产生浑浊现象。
Cuno Zeta Plus SP带电的深度过滤器用于过滤掺加入SBH的RhoGAMRho(D)免疫球蛋白(人)。在经过Zeta Plus SP滤器过滤时，浑浊物被去除。一层白色沉淀可在过滤后的滤器上观察到。用蛋白质印迹法检测PrPRES，过滤的物质没有瘙痒病病毒。用2.0M盐洗涤液将朊病毒物质从滤器上回收。蛋白质印迹的结果在此显示在表1中。
同时进行两个对照组。第一个对照组中，PrPsc掺入的免疫球蛋白中间产物首先通过0.22μm滤器过滤以确保PrPsc没有凝集成大的颗粒而通过机械过滤由深度过滤器去除。第二组中，超声波处理和过滤的SBH掺入Tris缓冲液生理盐水而非免疫球蛋白中间产物中，随后经过深度过滤。
深度过滤器从免疫球蛋白过滤液中去除超过4个数量级的PrPsc。PrPsc的大部分可通过用高浓度Nacl溶液洗脱从免疫球蛋白过滤液中回收。有掺入的上清液III在深度过滤前的0.22μm的预过滤去除了所有可检测的PrPsc。小于1 log的PrPsc通过深度过滤从缓冲液对照中去除。参见实施例6和7。
因此发现深度过滤从免疫球蛋白中去除PrPsc是通过机械过滤而不是通过吸附到过滤基质。免疫球蛋白制备物引起PrPsc从＜0.1μm的颗粒凝集为＞0.22μm的颗粒，可能是因为免疫球蛋白制备物中存在甲醇的缘故。深度过滤未能从缓冲液对照组样品中去除PrPsc。
在此处实施例3中，在掺入SBH的上清液III(“SupIII”)深度过滤前进行超声波处理的SBH的膜过滤，以确保进行深度过滤的颗粒大小不大于0.1微米。这对深度过滤将提出最大的挑战且可以对PrPsc的去除机制进行表征。SBH首先经超声波处理打碎PrPsc凝集物而促进膜过滤。尽管有超声波处理，还是有必要系列通过渐小的过滤器(0.45和0.22微米)过滤SBH而将0.1微米滤器的堵塞减到最小。
Cuno Zeta Plus 90SP深度过滤器利用两种机制去除颗粒。超过约0.1微米额定孔径的颗粒通过机械过滤大都滞留。小于0.1微米的，带负电荷的颗粒通过电动吸附至带正电荷的过滤基质(美国专利No.4,859,340)而滞留。因大于0.1微米的颗粒已在加入到上清液III和随后的深度过滤前从SBH中去除，这表明通过深度过滤的PrPsc的滞留是由于暴露于甲醇而引起的颗粒大小的增加。然而，去除朊病毒的电荷捕获机制在非处于其等电点的朊病毒被捕获时是有效的。
在掺入SBH的SupIII过滤后以及用1.0M和2.0MNacl溶液洗脱前的深度过滤器的检查显示少量物质存在于深度过滤器表面。其被认为是当SBH加入SupIII时形成的沉淀物，由SupIII中存在的甲醇引起。为确定沉淀物是否包含PrPsc，执行第二组操作，其中SBH掺入的SupIII在深度过滤前首先通过0.22微米滤器的预过滤。预过滤去除PrPsc至不可检测的水平，表明在前组中PrPsc是通过沉淀和机械过滤去除的，而不是通过静电吸附到深度滤器上。Prusiner等.(Biochemistry 1980；194883-91)表明乙醇容易沉淀PrPsc，所以分馏方法中使用的甲醇的存在具有同样的效果是不令人奇怪的。
为确定在沉淀醇缺乏时深度过滤是否去除了PrPsc，设计对照(参见实施例4)，其中PrPsc掺入到水样缓冲液且随后被深度过滤。缓冲液对照中PrPsc去除的缺乏表明深度过滤没有通过机械过滤的方法(因为PrPsc之前已通过0.1微米滤器)或静电吸附保留蛋白。
这些研究表明深度过滤去除PrPsc有效性的先前报道可能是误导的。事实上，深度过滤确实去除PrPsc，不是通过通常与深度过滤相关的吸附机制，而是通过沉淀蛋白质的机械过滤。本研究结果表明单独的深度过滤在去除PrPsc方面是无效的。然而，当与在前的沉淀步骤联合使用时，深度过滤或膜过滤对于从血浆分馏物中去除异常朊病毒蛋白是有效的机制。
任何合适的检测朊病毒的测定法都可用于本发明的定量方面。测定法中有ELISA、SDS-Page、蛋白质印迹法、EG&G Wallac、DELFIA、Prionics测定法、Enfer ELC ELISA、CEA ELISA、构象依赖的测定法、DELFIA和毛细管电泳，上面只提到一部分，所有这些都是本领域技术人员熟知的。
在此发明人应用蛋白质印迹法来从已过滤和洗脱的生物液体样品中检测朊病毒。蛋白质印迹是一种用来鉴定和表征PrPsc的方法。PrPsc通过提取而分离而且通过对蛋白酶K消化的部分抗性而区分。PrPRES(抗蛋白酶消化的PrPsc)通过糖基化形式及其片段的迁移位点而鉴定。该测定法的灵敏度低于传染性测定法灵敏度约3个数量级。灵敏度问题可通过离心制备物、去除上清和重悬朊病毒物质于较小体积、形成朊病毒物质的浓缩物而部分克服。然而，为替代旋转离心大体积生物液体例如体液，发明人已表明可通过用凝集作用辅助剂处理含有朊病毒的生物液体而捕获朊病毒，随后可通过过滤器过滤而浓缩，以及随后通过洗脱而收集于小体积。该技术可用于大规模的从产品流中去除朊病毒。
该方法将对免疫蛋白印迹法用于测定生物基质中PrPsc的存在产生主要的影响。本发明允许TSE材料得到快速定量浓缩以增强检测。当想要纯化生物或食品溶液的PrPsc时，本发明在使生物或食品溶液和物质易于通过大额定孔径过滤器而过滤方面具有优势。
用于确定特异朊病毒捕获的标准蛋白质印迹测定法依赖于首先用蛋白酶K处理捕获的物质，蛋白酶水消化所有正常朊病毒(PrPc)但不明显消化异常朊病毒(PrPsc或PrPres)。消化依照Lee等.，J VirolMethods 2000，8477-89的方法，在SDS凝胶上以及转印迹到硝酸纤维素或PVDF(聚偏乙烯氟化物)膜进行。分离的PrPres条带用3F4或6H4显影。通常用PBS聚山梨酯20-5％脱脂奶粉缓冲液将3F4(贮液1mg/ml)稀释为1∶2000或将6H4(贮液2.5mg/ml)稀释为1∶5000，总体积10mL。抗体用羊抗鼠IgG-HRP结合物(同样的缓冲液中1∶50,000)检测。条带用通常为化学发光的HRP底物检测，且在暴露于x-射线胶片后显影。参见上述Lee等。
特异的PrPsc单抗如16A18可在磁珠(Dynal甲苯磺酰活化的，Dynal Biotech，Oslo，挪威)上特异性地结合PrPsc，该抗体可用于检测PrPsc的存在，好于蛋白质印迹法。该家族大部分抗体能捕获PrPsc但是检测就依赖于上述蛋白质印迹方式中的3F4或6H4。
其他检测PrPsc的方法包括ELISA和SDS-Page和上述公开的其他通常采取的检测方法。
在PrPsc物质在滤器例如灭菌滤器上捕获的情况下，其中滤器例如用朊病毒特异的抗体特异性地结合朊病毒，蛋白质印迹法就不需要用于检测PrPsc了。更好地，朊病毒特异的抗体例如单克隆抗体可用于检测和定量朊病毒。这样的抗体包括普通的朊病毒抗体6H4或3F4，其识别正常(PrPc)和异常(PrPsc和PrPres)朊病毒。如果膜结合所有形式的朊病毒，PrPsc的相对数量将很低(例如约少于存在朊病毒的1％)。异常朊病毒的特异单克隆抗体，例如16A18或12A5，可用于在膜结合所有形式(正常和异常)朊病毒的情况下检测PrPsc。如果信号可被放大，使用所述单克隆抗体将有可能检测PrPsc，如果需要，可使用化学发光底物或聚HRP结合物。
在此公开的本发明方法导致测定法的检测限提高超过100倍，目前达到传染性测定法的检测限。用现有技术中已有的方法，传染性测定法依赖于所研究的种类需要数月才得到结果。本发明人还表明测定法可通过不需要洗脱而检测膜上异常朊病毒的存在来简化。
在免疫球蛋白中PrPsc凝集和去除的本发明方法的使用中，以及尤其在抗-D免疫球蛋白，特别是RhoGAM Rho(D)免疫球蛋白(人)的制备中，参考图1的流程图和Cohn等，J.Am.Chem.Soc.，Vol.68，pages 459-475的方法，分馏从人全血浆进行。血浆冷却至约1℃然后从上清液中离心分离冷的未溶解的沉淀物。上清液进一步分馏产生沉淀物I和上清液I。弃去主要由纤维蛋白原组成的沉淀物I。上清液I进一步分馏产生上清液II+III和沉淀物II+III。上清液II+III(被弃去)含有α和β球蛋白和脂类。沉淀物II+III主要由β和γ球蛋白和同种凝集素组成，但也包含凝血酶原、纤连蛋白原、胆固醇和其他脂类。沉淀物II+III，经进一步分馏产生上清液II+IIIW和沉淀物II+IIIW。β球蛋白、胆固醇和其他脂类在弃去的上清液II+IIIW中被大量去除。沉淀物II+IIIW主要由γ球蛋白、同种凝集素、纤连蛋白原和凝血酶原以及一些β球蛋白、胆固醇和其他脂类组成。经进一步分馏，沉淀物II+IIIW产生上清液III+沉淀物III。沉淀物III(被弃去)含有同种凝集素、纤连蛋白原和凝血酶原。上清液III主要由γ球蛋白和少量纤维蛋白原和脂类组成。分馏的最后一个步骤产生沉淀物II，其为基本纯净的γG球蛋白。由本发明方法制备的沉淀物II为抗Rhγ球蛋白。
在本发明优选方法中，用于重悬的免疫球蛋白起始材料为从改进的Cohn方法得来的沉淀物II糊状物。若蛋白在赋形剂存在下冻干，则冻干的沉淀物II糊状物也可使用，赋形剂为如美国专利No.6,096,872所涉及的那些。在这种情形下本发明捕获朊病毒的过滤步骤优选在沉淀物II的分馏中进行；参考上面所述以及图1，导致朊病毒捕获的免疫球蛋白的分馏在沉淀物II获得前、获得上清液III后，或最优选在上清液III和已过滤的上清液III之间进行，如所示。所述用凝集作用辅助剂甲醇处理材料，以及以约4∶1的MeOH∶上清液III比率，在上清液III中凝集朊病毒，其凝集物随后可用本发明进一步的方法去除。本发明的捕获朊病毒的过滤步骤也可在制成的免疫球蛋白制品中进行。然而，用凝集作用辅助剂处理和过滤也可作为制品处理的最后阶段进行，只要该阶段的处理和过滤没有影响生物学活性或另外损害终产物。
本发明制备物的施用模式将确定生物体中化合物递送的部位和/或细胞。通过本发明方法纯化的化合物能单独施用但通常与药用载体或稀释剂一起以混合物形式施用，载体或稀释剂按照施用的预期途径和标准的药学实践选择。制备物可经胃肠外注射，例如，动脉内或静脉内注射。制备物也可通过口服、皮下或肌肉途径递送。对于胃肠外施用，它们可以以，例如，灭菌的、水溶液形式使用，其可含有其他溶剂，例如，足够的盐或葡萄糖以使溶液等渗。
对于口服施用，本发明纯化的组合物能以片剂、胶囊、锭剂、粉剂、糖浆剂、酏剂、水溶液和悬浮液等等形式使用。在片剂情形中，可用的载体包括乳糖、柠檬酸钠和磷酸盐。各种崩解剂如淀粉，和润滑剂如硬脂酸镁通常在片剂中使用。对于胶囊形式的施用，有用的稀释剂为乳糖和高分子量聚乙二醇。当水溶液需要口服使用时，可加入一些甜味料和/或调味剂。
本发明基本上纯化的制备物可施用于受试者如哺乳动物，包括人。对于疾患处理中的施用，处方医师或兽医将最终确定所给人或动物受试者的合适剂量，且这可根据体重、年龄和个体的应答以及个体症状的性状或严重性而不同。
在本发明基本上纯化的抗-D免疫球蛋白的情形下，每剂剂量可在约300μg RhoGAM和约50μg MICRhoGAM的范围，每种都按照指导和上述讨论的目的以及各自的产品说明书施用。上述提及的每种制品也可以是多剂量的，总体施用由治疗医师确定。
本发明无朊病毒的制备物可包括生物物质、药剂、食品和饲料，且本发明的方法可在同样的处理过程中使用。
各种专利和文献作为参考贯穿本发明始终。此处将其内容完整引入本发明作为参考，以使得更充分地描述本领域普通技术人员已知的技术状态和本发明所要求保护的内容。
下列实施例的提供仅是为了说明的目的，而不能视作对本发明范围的限制。
实施例实施例1-用凝集作用辅助剂的Rho(D)免疫球蛋白沉淀物II的生产该实施例描述了对人血浆分馏的方法以获得在Rho(D)免疫球蛋白生产中使用的沉淀物II。
血浆单元(抗-D)(总共约943L)在2℃至8℃贮藏4天以融解。在不锈钢水套罐中混合收集，5℃-10℃水循环通过。的血浆在1℃-3℃搅拌30分钟。血浆加入以1000mL/min的速率连续流动的离心器中离心。冷的未溶解上清液(离心的血浆)收集在不锈钢套罐中且搅拌至获得均一的混合物。此时的批样体积为905L的上清液(澄清的血浆)。
整批样上清液的pH用2.172 L5.0N NaOH调至pH9.45。甲醇(71％)，160.185 L在-5.3℃加入pH已调节的批样中。pH为9.37。该批样可在-5.2℃存放13.5小时。终体积为1067.357L。
该批样在-5.8℃加入以1000mL/min的速率连续流动的离心器中离心。上清液I收集在不锈钢套管罐中，充分混合。沉淀物I作为医疗废弃物弃去。上清液I通过加入3.132L，pH4.0的浓缩醋酸钠缓冲液和627.444L 71％的甲醇调节pH。该批样的温度为-5.5℃，pH6.75。该批样可存放14小时。
该批样在-5.5℃加入以1000mL/min的速率连续流动的离心器中离心。沉淀物II+III转移到不锈钢罐中；收集到40.220KG净重；净重沉淀物II+III在+1.1℃下重悬入两倍体积(L)注射用水，U.S.P.(80.440L)中，且搅拌4 5分钟至获得均一的悬浮液。加入三倍体积(120.660L)0.0187M磷酸氢二钠且在2.1℃下搅拌30分钟。
在不锈钢套罐中，19倍体积(764.180L)注射用水，U.S.P.冷却至1.0℃。使用高容量转移泵，该批样与19倍体积注射用水，U.S.P.缓慢混合，且搅拌30分钟。
71％甲醇的体积调节至等于15倍沉淀物II+III的重量。甲醇(603.300L)冷却至-14℃，且用不锈钢Sparger设备和计数泵将甲醇加入批样中同时逐渐降低温度至-5.5℃。在甲醇加入完全后将批样搅拌1小时。pH为7.23。批样可存放10小时20分钟。
通过在-5.8℃以500mL/min的速率连续流动的离心器中离心批样而形成沉淀物III。沉淀物II+IIIw从盘中转移入不锈钢罐；净重为22.760kg。
沉淀物II+IIIw在+1.3℃下重悬入两倍体积(L)(45.520L)注射用水，U.S.P.中，且搅拌45分钟至获得均一的悬浮液。加入两倍体积(45.520L)0.175M醋酸钠且在1.4℃下搅拌30分钟。全部批样的pH通过加入0.489L pH4.0的醋酸钠缓冲液于22.760L注射用水，U.S.P.中(总体积137.049L)，再将两者加入到批样中调节，且在1.5℃搅拌1小时。pH为5.38。在不锈钢套罐中，将13.5倍体积(307.260L)注射用水，U.S.P.搅拌冷却至2.5℃。使用高容量转移泵，将该批样与该注射用水混合，总计算体积为444.309L。NaCl(6.168L，1.33M)加入22.760Kg沉淀物II+III中，搅拌30分钟。
71％甲醇的体积调节至等于8.78倍沉淀物II+III的重量。甲醇(199.833L)冷却至-10.5℃，且甲醇用不锈钢Sparger设备和计数泵加入批样中同时逐渐降低温度至-6.6℃。在甲醇加入完全后批样搅拌1小时。pH为5.38。批样可在-6.3℃存放8小时30分钟。
沉淀物III的形成如下进行该批样在-6.3℃以500mL/min的速率连续流动的离心器中离心。上清液III收集在不锈钢罐中。沉淀物III作为血废弃物弃去。
上清液III的过滤如下进行CUNO滤器90SP套包括(4)16sq.ft.筒，按照制造商的说明装配。醋酸钠-甲醇缓冲液(320L)冷却至-6.5℃，且通过滤器筒过滤55分钟。醋酸钠-甲醇缓冲液洗涤溶液在开始前从滤器筒中完全吹出。该批样用Cuno滤器90SP按照良好的制造实践和使用制造商的说明书过滤。当全部体积的上清液III过滤时，滤器筒中的压力释放。过滤的上清液III的体积为622L，且在中等速度搅拌。NaCl(1.33M，23.387mL)缓慢加入上清液III，在6.5℃搅拌30分钟。pH为5.38，用4.840L1.0M碳酸氢钠调节至7.10且混合30分钟。等于0.166倍上清液III体积(103.252L)的甲醇(100％)用Sparger设备和计数泵加入到上清液III中且强力搅拌。PH为7.3。
沉淀物II的分馏如下进行该批样在-6.3℃以500mL/min的速率连续流动的离心器中离心且弃去上清液。干氮用于切断供给线且干燥旋转15分钟。沉淀物II(7,420g)从离心盘转入焦油化的不锈钢罐中，在-22.1℃下贮存。该物质在病毒清除过程中按照共同转让给VanHolten等的在2000.8.1公布的美国专利No.6,096,872的方法使用。
实施例2-从实施例1来的朊病毒的洗脱和检测用于过滤通过上述实施例1的方法获得的上清液III的Cuno深度过滤器上收集的朊病毒用下面实施例3的方法洗脱、定量和检测。
尤其是，实施例1中使用的Cuno深度过滤垫从滤器套中去除且置于含有45ml 1.0M NaCl(洗脱缓冲液)的培养皿中。培养皿置于旋转振荡器上且轻轻涡动约20-30分钟。去除滤器且用45ml 2.0M NaCl(洗脱缓冲液)第二次洗涤20-30分钟。
对洗脱物PrPsc的蛋白质印迹分析用源于1.0M NaCl洗脱缓冲液的洗脱物进行，且用源于2.0M NaCl洗脱缓冲液的洗脱物单独进行第二个蛋白质印迹分析，均按照实施例3的蛋白质印迹方法进行。
实施例3-免疫球蛋白制备物中PrPsc的去除和定量含有抗-D的上清液III(SupIII)(190mL)从全部的(约450升)修饰的Cohn-Oncley分馏物(Ortho-Clinical Diagnostics，Raritan N.J)中获得(参见上述实施例1)。SupIII在-70℃贮存而在加入瘙痒病脑组织匀浆前于25℃融解，然后在-5.5℃--7.5℃平衡。
脑组织匀浆瘙痒病脑组织匀浆(10％)用263K仓鼠适合制剂感染的仓鼠脑制备。冷冻的脑(约3-20，每脑0.5克)在冰上融解，然后在9倍体积pH8.0的Tris缓冲盐溶液中匀浆。匀浆通过在2-8℃1200r.c.f.下离心20分钟澄清。百分之一(1％)的溶血卵磷脂加入上清液中至终浓度0.1％(w/v)。该物质贮存于-70℃备用。使用前，SBH在室温水浴融解，然后用角质杯进行超声波处理(Misonix Sonicator XL2020)(Heat Systems，Farmingdale，N.Y.)约每毫升2分钟直至溶液由浑浊变为半透明。处理的匀浆随后系列通过Millex25mm PVDF注射器驱动的过滤单元，(Millipore公司)0.45/0.22/0.1微米过滤器连续过滤，其进一步使物质澄清。从Cohn分馏过程来的上清液III(SupIII)(200mL)中掺入已过滤的SBH(1∶51稀释)。第二组在深度过滤开始前经过0.22微米滤器的过滤以去除任何可能在混合物中形成的凝集物(参见实施例5)。SHB样品在处理前和超声波处理及过滤后抽样用于蛋白质印迹评估。
过滤47mm CUNO Zeta Plus 90SP滤垫(Cuno公司，Meridan Conn.)置于其不锈钢过滤套中。蠕动移液泵用于控制过滤的流量至约1ml/min的速率。整个滤器套置于隔离的氯化钠冰浴中冷却滤器至约-5.5℃至-7.5℃。醋酸钠-甲醇缓冲液(80ml 0.01N醋酸钠甲醇缓冲液，22.7％MeOH)在-5.5℃至-7.5℃用于洗涤滤器。SBH掺入的SupIII(180ml)在-5.5℃至-7.5℃以1.0ml/min的流速经过CUNO滤器过滤。在过滤起始(75ml)、中间(75ml)和结束(30ml)等分收集滤液。在整个过滤时系统压力得到监控且为约2psi。
从滤器洗脱PrPsc过滤后，滤垫从滤器套去除，粗面向上，置于烧杯中且用45mL1.0MNaCl洗脱缓冲液通过在旋转振荡器上轻轻的涡动而洗涤20-30分钟。去除滤器且用45ml 2.0M NaCl通过在旋转振荡器上轻轻的涡动而第二次洗涤20-30分钟。通过在4℃下，100,000×g离心约1小时进一步浓缩PrPsc是可能的，然而这不是必要的，因其已得到足够的浓缩可用于蛋白质印迹分析，如表1所示。
除了掺入SBH的SupIII首先经过了Millex0.22微米滤器预过滤之外，第二组与第一组完全相同。
执行对照组，冷却过滤装置至0℃且用80mLTBS洗涤深度滤垫。用已过滤的SBH(1∶51稀释)掺入的TBS(180mL)在与前述相同的流速下过滤，随后滤器被洗涤。参见实施例4。
对洗脱物PrPsc的蛋白质印迹分析用源于1.0M NaCl洗脱缓冲液的洗脱物进行，且用源于2.0M NaCl洗脱缓冲液的洗脱物单独进行第二个蛋白质印迹分析，均按照下述蛋白质印迹方法进行。
参见表1，数据显示，其中两次洗脱后PrPsc显示已从滤器上洗脱。蛋白质印迹样品制备样品制备和测定方法按照Lee等.，J Virol Methods 2000；8477-89进行。样品用蛋白酶K消化步骤处理，其用于区分PrPsc和PrPc。蛋白酶K处理后，样品在4℃ 20,000r.c.f.下离心1小时。沉淀物重悬于10μl每份2×十二烷基硫酸钠(SDS)样品缓冲液中且在100℃加热5分钟。在加入到凝胶用蛋白质印迹法检测PrPsc前制备半-对数连续稀释液，所有的按照Lee等。(上述)测定按照上述Lee等的方法测定样品。每个样品在12％SDS-Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上以125伏恒定电压电泳60分钟。凝胶在125mA恒定电流下向硝酸纤维素膜转移60分钟，随后浸于TBS及在5％脱脂奶粉中封闭60分钟。转移和封闭后，膜在3F4单抗中孵育。洗涤后，膜暴露于碱性磷酸酶偶联的抗-鼠IgG二抗中。印迹随后浸于CDP-Starplus NitroBlock II中，然后曝光在Kodak XAR-2胶片上。有效的测试通过在33kDa分子标记处显示条带的阳性对照确定。一般，两条小于33kDa的稍弱的条带也可观察到。三条带一般为PrPRES的蛋白质印迹图像(上述，Lee等)。
结果超声波处理和依次的膜过滤从SBH中去除了所有的浑浊物。随后掺入SBH的免疫球蛋白制备物的深度过滤降低了滤液中PrPsc的浓度至低于蛋白质印迹测定法的检测限(表1)。大量PrPsc通过用高盐溶液洗脱从滤垫回收。深度过滤前掺入SBH的SupIII经过0.22微米滤器的过滤去除PrPsc至不可检测的水平。掺入SBH的缓冲液对照的深度过滤很少或没有去除PrPsc。
此处实施例3中，超声波处理的SBH的膜过滤在SBH掺入的SupIII的深度过滤前进行以确保深度过滤看到的颗粒大小不大于0.1微米。这对深度过滤将提出最大的挑战且允许对PrPsc的去除机制进行表征。SBH首先经超声波处理打碎PrPsc凝集物而促进膜过滤。尽管有超声波处理，还是有必要通过一系列逐渐变小的过滤器(0.45和0.22微米)连续过滤SBH而将0.1微米滤器的堵塞减到最小。
在掺入SBH的SupIII过滤后以及用1.0M和2.0MNacl溶液洗脱前的深度过滤器的检查显示少量物质存在于深度过滤器表面。其被认为是当SBH加入SupIII时形成的沉淀物，由SupIII中存在的甲醇引起。为确定沉淀物是否包含PrPsc，执行第二组，其中SBH掺入的SupIII在深度过滤前首先通过0.22微米滤器的预过滤。参见实施例6。预过滤去除PrPsc至不可检测的水平，表明在前组中PrPsc是通过沉淀和机械过滤去除的，而不是通过吸附到深度滤器上。
表1通过蛋白质印迹测定法测定掺入瘙痒病脑组织匀浆(SBH)的免疫球蛋白制备物中的PrPsc
*Log10降低系数为相对于过滤中在掺入量II中PrPRES的区别。
掺入加样II为SBH掺入的免疫球蛋白(即.掺入加样I)，其经过0.22μm过滤以去除任何潜在的通过加入SBH至IgG形成的凝集物。
“＜”表明最大值；在任何滤液样品中无PrPRES被检测到。
实施例4-对照为确定在沉淀物醇缺乏时深度过滤是否去除了PrPsc，执行一对照组，其中PrPsc掺入到水样缓冲液且随后被深度过滤。
实施例3的材料和方法重复进行，其中同浓度和体积(3.6ml)的SBH掺入到180ml 0.1MTris缓冲盐溶液(TBS)中。缓冲液对照中PrPsc去除的缺乏表明深度过滤没有通过机械过滤的方式(因为PrPsc之前已通过0.1微米滤器)或静电吸附保留蛋白。参见表1。
这些数据表明深度过滤去除PrPsc有效性的先前报道可能是误导的。事实上，深度过滤确实去除PrPsc，但不是通过通常与深度过滤相关的吸附机制，而是通过沉淀蛋白质的机械过滤。这些研究结果表明单独的深度过滤在去除PrPsc方面是无效的。然而，当与在前的沉淀步骤联合使用时，深度过滤或膜过滤对于从血浆分馏物中去除异常朊病毒蛋白是有效的机制。
实施例5-从滤器洗脱PrPsc实施例3中使用的滤垫从滤器套中去除且置于带有45ml 1.0MNaCl(洗脱缓冲液)的培养皿中。培养皿置于旋转振荡器上且轻轻涡动约20-30分钟。去除滤器且用45ml 2.0M NaCl(洗脱缓冲液)第二次洗涤20-30分钟。
对洗脱物PrPsc的蛋白质印迹分析用源于1.0M NaCl洗脱缓冲液的洗脱物进行，且用源于2.0M NaCl洗脱缓冲液的洗脱物单独进行第二个蛋白质印迹分析，均按照实施例3的蛋白质印迹方法进行。参见表1，数据显示，其中两次洗脱后PrPsc显示已从滤器上洗脱。
实施例6-SBH在0.22微米滤器中的预过滤为确定实施例3的深度过滤步骤前滤器上观察到的沉淀物是否包含PrPsc，执行第二组，其中SBH掺入的SupIII在深度过滤前首先通过0.22微米滤器的预过滤。实施例3的材料和方法重复进行，其中SBH掺入的SupIII在深度过滤前经过0.22微米滤器的预过滤。参见表1，表明预过滤去除PrPsc至不可检测的水平，表明在前组中PrPsc是通过沉淀和机械过滤去除的，而不是通过静电吸附到深度滤器上。
实施例7-PrPsc从滤器的洗脱实施例6中使用的滤垫从滤器套中去除且置于带有45ml 1.0MNaCl(洗脱缓冲液)的培养皿中。培养皿置于旋转振荡器上且轻轻涡动约20-30分钟。去除滤器且用45ml 2.0M NaCl(洗脱缓冲液)第二次洗涤20-30分钟。
对洗脱物PrPsc的蛋白质印迹分析用源于1.0M NaCl洗脱缓冲液的洗脱物进行，且用源于2.0M NaCl洗脱缓冲液的洗脱物单独进行第二个蛋白质印迹分析，均按照实施例3的蛋白质印迹方法进行。
参见表1，数据显示，其中两次洗脱后PrPsc显示已从滤器上洗脱。
实施例8-朊病毒从血样品的清除牛全血(250ml)在100×g离心以去除红细胞。得到的血浆与75ml 22.7％的甲醇混合以凝集朊病毒物质。混合物在旋转混合器上轻轻涡动5分钟。混合物流经由上述实施例3准备的47mm Cuno ZetaPlus 90S滤器。随后该物质通过在5ml 1.0M NaCl-15mg/mL甘氨酸溶液中洗涤滤垫而洗脱用于蛋白质印迹分析。随着按照Lee等的提取和浓缩，0.5ml该物质通过按照实施例3方法的蛋白质印迹法得到分析。
上述方法导致测定法的检测限提高超过100倍，目前达到传染性测定法的检测限。用现有技术中已有的方法，传染性测定法需要数月才得到结果，其依赖于所研究的种类。本发明人还表明测定法可通过不需要G17洗脱而检测膜上异常朊病毒的存在来简化。
实施例9-朊病毒从尿样品的清除人尿样品(200ml)在3000rpm沉淀5分钟以弃去偶尔的细胞碎片。尿样与75ml 22.7％的甲醇混合以凝集朊病毒物质。混合物在旋转混合器上轻轻涡动5分钟。混合物流经由上述实施例3准备的47mm CunoZeta Plus 90S滤器。随后该物质通过在5ml 1.0M NaCl-15mg/mL甘氨酸溶液中洗涤滤垫而洗脱用于蛋白质印迹分析。随着按照Lee等的提取和浓缩，0.5ml该物质通过按照实施例3方法的蛋白质印迹法得到分析。
本领域技术人员可以理解前面的描述和实施例对实现本发明是例证性的，绝非限制性的。在不违背本发明范围和精神下可以作出对此处所呈现细节的变动。
权利要求
1.从含有生物或食品制品的水样液体中去除朊病毒的方法，其包括(a)使水样液体和一种或多种凝集作用辅助剂混合；和(b)通过滤器过滤步骤(a)的混合物由此去除朊病毒蛋白。
2.权利要求1的方法，其中朊病毒蛋白为正常朊病毒蛋白、异常感染性朊病毒蛋白，或正常和异常感染性朊病毒蛋白的混合物。
3.权利要求2的方法，其中生物制品选自全血，血液组分，尿，CSF，包含白蛋白、免疫球蛋白及其片段的液体，凝血因子如因子IX、凝血酶、纤连蛋白、纤维蛋白原、因子VIII、II、VII、IX、X、XI、XIII，血红素，α-2-巨球蛋白，半抗原球蛋白，转铁蛋白，载脂蛋白，蛋白C，蛋白S，C-1-酯酶抑制剂，酶，间-α-胰蛋白酶抑制剂，生长激素和冯·威利布兰德因子。
4.权利要求1的方法，其中食品包含食物和饮料。
5.权利要求3的方法，其中血液组分包含血清和血浆。
6.权利要求3的方法，其中免疫球蛋白为多克隆的或单克隆的。
7.权利要求6的方法，其中免疫球蛋白为IgG。
8.权利要求7的方法，其中IgG免疫球蛋白为IgG抗-D免疫球蛋白。
9.权利要求8的方法，其中权利要求8的IgG免疫球蛋白在包含约4.0％至6.0％重量比的免疫球蛋白和约80至200ppm聚山梨酯80的药物组合物中。
10.权利要求3的方法，其中一种或多种凝集作用辅助剂混合在一起或依次使用。
11.权利要求10的方法，其中一种或多种凝集作用辅助剂包含低介电常数的有机溶剂。
12.权利要求11的方法，其中有机溶剂选自丙酮和水易溶的醇。
13.权利要求11的方法，其中有机溶剂选自乙醇、甲醇、异丙基、异丙醇、n-丙醇、异丙醚、酮和醛。
14.权利要求13的方法，其中醇为浓度为约2％至约100％的乙醇或甲醇。
15.权利要求10的方法，其中一种或多种凝集作用辅助剂选自硫酸胺、辛酸、三氯乙酸(TCA)、双醛、杂多酸、乳酸盐单水合物(C18H21N3O4H2O)，以及金属离子Cu2+、Ni、Zn和Ag。
16.权利要求10的方法，其中当朊病毒蛋白包含异常朊病毒蛋白时，一种或多种凝集作用辅助剂为复合剂。
17.权利要求16的方法，其中复合剂选自杂多钼酸盐、杂多钨酸盐、磷酸钨酸钠(NaPTA)、抗体、酶和肽。
18.权利要求10的方法，其中滤器为膜或深度过滤器。
19.权利要求18的方法，其中滤器为深度过滤器。
20.权利要求18的方法，其中滤器具有的孔径能使小于约6μm的产生滞留。
21.权利要求20的方法，其中滤器具有的孔径能使约0.6至约1.5微米的产生滞留。
22.权利要求19的方法，其中深度滤器具有的孔径能使小于约0.6μm的产生滞留。
23.权利要求22的方法，其中生物蛋白从其起始生物状态的回收基本上维持至少超过约50％的水平。
24.权利要求22的方法，其中异常感染性朊病毒蛋白可达到至少约102.5的程度。
25.基本上纯的药物组合物，其包含按照权利要求24的方法制备的用于注射的异常感染性朊病毒清除的免疫球蛋白。
26.权利要求25的基本上纯的免疫球蛋白，其中免疫球蛋白为IgG抗-D免疫球蛋白。
27.权利要求26的基本上纯的IgG抗-D免疫球蛋白，其中IgG抗-D免疫球蛋白在包含约4.0％至6.0％重量比的免疫球蛋白和约80至200ppm聚山梨酯80的药物组合物中。
28.从全血中去除朊病毒蛋白的方法，其包括(a)临床离心血液以由此分离红细胞和血小板；(b)从红细胞和血小板倾析出步骤(a)离心的上清液；(c)使上清液和一种或多种凝集作用辅助剂混合；(d)通过膜或深度过滤器过滤步骤(c)的混合物，由此从滤液中去除朊病毒蛋白；和(e)将步骤(a)分离的红细胞和血小板加回滤液中。
29.权利要求28的方法，其中凝集作用辅助剂混合在一起或依次使用。
30.权利要求29的方法，其中一种或多种凝集作用辅助剂包含低介电常数的有机溶剂。
31.权利要求30的方法，其中有机溶剂选自丙酮和水易溶的醇。
32.权利要求30的方法，其中有机溶剂选自乙醇、甲醇、异丙基、异丙醇、n-丙醇、异丙醚、酮和醛。
33.权利要求32的方法，其中醇为浓度为约2％至约100％的乙醇或甲醇。
34.权利要求29的方法，其中一种或多种凝集作用辅助剂选自硫酸胺、辛酸、三氯乙酸(TCA)、双醛、杂多酸、乳酸盐单水合物(C18H21N3O4H2O)，以及金属离子Cu2+、Ni、Zn和Ag。
35.权利要求28的方法，其中当朊病毒蛋白包含异常朊病毒蛋白时，一种或多种凝集作用辅助剂为复合剂。
36.权利要求35的方法，其中复合剂选自杂多钼酸盐、杂多钨酸盐、磷酸钨酸钠(NaPTA)、抗体、酶和肽。
37.权利要求28的方法，其中滤器为膜或深度过滤器。
38.权利要求37的方法，其中滤器为深度过滤器。
39.权利要求38的方法，其中滤器具有的孔径能使小于约6μm的产生滞留。
40.权利要求39的方法，其中滤器具有的孔径能使约0.6至约1.5微米的产生滞留。
41.权利要求38的方法，其中深度过滤使用具有的孔径能使小于约0.6μm的产生滞留的深度滤器进行。
42.一种用于生物或食品制品的水样液体中与TSEs相关的异常感染性朊病毒蛋白的捕获、洗脱、浓缩和定量的方法，其包括(a)使水样液体和一种或多种凝集作用辅助剂混合；(b)通过滤器过滤步骤(a)的混合物由此去除朊病毒蛋白；(c)从滤器洗脱朊病毒；和(d)用测定法定量异常朊病毒蛋白。
43.权利要求42的方法，其中生物制品选自全血，血液组分，尿，CSF，包含白蛋白、免疫球蛋白及其片段的液体，凝血因子如因子IX、凝血酶、纤连蛋白、纤维蛋白原、因子VIII、II、VII、IX、X、XI、XIII，血红素，α-2-巨球蛋白，半抗原球蛋白，转铁蛋白，载脂蛋白，蛋白C，蛋白S，C-1-酯酶抑制剂，酶，间-α-胰蛋白酶抑制剂，生长激素和冯·威利布兰德因子。
44.权利要求42的方法，其中食品包含食物和饮料。
45.权利要求43的方法，其中血液组分包含血清和血浆。
46.权利要求43的方法，其中免疫球蛋白为多克隆的或单克隆的。
47.权利要求46的方法，其中免疫球蛋白为IgG。
48.权利要求47的方法，其中IgG免疫球蛋白为IgG抗-D免疫球蛋白。
49.权利要求48的方法，其中权利要求48的IgG抗-d免疫球蛋白在包含约4.0％至6.0％重量比的免疫球蛋白和约80至200ppm聚山梨酯80的药物组合物中。
50.权利要求42的方法，其中一种或多种凝集作用辅助剂混合在一起或依次使用。
51.权利要求50的方法，其中一种或多种凝集作用辅助剂包含低介电常数的有机溶剂。
52.权利要求51的方法，其中有机溶剂选自丙酮和水易溶的醇。
53.权利要求51的方法，其中有机溶剂选自乙醇、甲醇、异丙基、异丙醇、n-丙醇、异丙醚、酮和醛。
54.权利要求53的方法，其中醇为浓度为约2％至约100％的乙醇或甲醇。
55.权利要求50的方法，其中一种或多种凝集作用辅助剂选自硫酸胺、辛酸、三氯乙酸(TCA)、双醛、杂多酸、乳酸盐单水合物(C18H21N3O4H2O)，以及金属离子Cu2+、Ni、Zn和Ag。
56.权利要求50的方法，其中当朊病毒蛋白包含异常朊病毒蛋白时，一种或多种凝集作用辅助剂为复合剂。
57.权利要求56的方法，其中复合剂选自杂多钼酸盐、杂多钨酸盐、磷酸钨酸钠(NaPTA)、抗体、酶和肽。
58.权利要求50的方法，其中滤器为膜或深度过滤器。
59.权利要求58的方法，其中滤器为深度过滤器。
60.权利要求58的方法，其中滤器具有的孔径能使小于约6μm的产生滞留。
61.权利要求60的方法，其中滤器具有的孔径能使约0.6至约1.5微米的产生滞留。
62.权利要求59的方法，其中深度滤器具有的孔径能使小于0.6μm的产生滞留。
63.权利要求62的方法，其中生物蛋白从其起始生物状态的回收基本上维持至少超过约50％的水平。
64.权利要求62的方法，其中异常感染性朊病毒蛋白可达到至少102.5的程度。
65.权利要求42的方法，其中洗脱包含用洗脱缓冲液对滤器的温和洗涤。
66.权利要求65的方法，其中洗脱缓冲液包含高渗溶液。
67.权利要求66的方法，其中高渗溶液包含高渗盐溶液。
68.权利要求67的方法，其中高渗盐溶液选自1.0-2.0M NaCl缓冲液，和浓度为约1.0M至约2.0M的醋酸钠-甲醇缓冲液。
69.权利要求42的方法，其另外在步骤(c)和(d)之间包含一附加步骤，其包括浓缩洗脱缓冲液中的朊病毒至适于用已有的测定法定量的数量。
70.权利要求69的方法，其中步骤(c)和(d)之间的浓缩步骤包含离心洗脱缓冲液中的朊病毒。
71.权利要求42的方法，其中定量步骤(d)包含使用有效的测定法，其选自ELISA、SDS-Page、蛋白质印迹法、EG&G Wallac、DELFIA、Prionics测定法、Enfer ELC ELISA、CEA ELISA、构象依赖的测定法、DELFIA和毛细管电泳。
72.权利要求42的方法，其中定量步骤(d)包含使用抗体测定法，其使用朊病毒抗体6H4、3F4、16A18或12A5。
73.从包含IgG抗-D免疫球蛋白的水样药物组合物中去除朊病毒蛋白的方法，其中药物组合物包含约4.0％至6.0％重量比的免疫球蛋白，和约80至200ppm的聚山梨酯80，其包括(a)使水样组合物和约2％至约10％的甲醇混合；和(b)通过具有的孔径能使小于约0.6μm的产生滞留的深度滤器过滤步骤(a)的混合物，由此去除朊病毒蛋白，其中生物蛋白从其起始生物状态的回收基本上维持至少超过约50％的水平，且其中异常感染性朊病毒蛋白可达到至少约102.5的程度。
74.基本上纯的药物组合物，其包含按照权利要求73的方法制备的用于注射的异常感染性朊病毒清除的免疫球蛋白。
75.从全血去除朊病毒蛋白的方法，其包括(a)临床离心血液以由此分离红细胞和血小板；(b)从红细胞和血小板倾析出步骤(a)离心的上清液；(c)使上清液和甲醇混合；(d)通过具有的孔径能使约0.6至约1.5微米的产生滞留的深度过滤器过滤步骤(c)的混合物，由此从滤液中去除朊病毒蛋白；和(e)将步骤(a)分离的红细胞和血小板加回滤液中。
全文摘要
用于制备生物溶液如基本上无异常朊病毒蛋白的免疫球蛋白和尤其是由此获得的抗－D免疫球蛋白的方法。特别提供用于朊病毒凝集和生物溶液深度过滤以捕获和去除异常以及如果需要，正常朊病毒蛋白的方法。朊病毒蛋白可随后从深度过滤器和滤器洗涤物中洗脱以及浓缩至足以达到已有测定法能检测的程度。
文档编号A61L2/00GK1671293SQ03817437
公开日2005年9月21日 申请日期2003年5月23日 优先权日2002年5月23日
发明者R·W·范霍尔滕, S·M·奥滕里思 申请人:奥索临床诊断有限公司