专利名称：预防和/或治疗炎症性肠病的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有吡唑啉酮衍生物或其生理学上允许的盐，或者其水合物或溶剂化物为有效成分的预防及/或治疗炎症性肠病的药物、肠粘膜保护剂、嗜中性白细胞的活化抑制剂、以及髓过氧化物酶活性抑制剂。
背景技术：
诸如溃疡性结肠炎(ulcerative colitisUC)及克隆氏病(Crohn’sdiseaseCD)等的炎症性肠病(Inflammatory Bowel DiseaseIBD)的原因尽管有细菌感染学说、自身免疫异常学说等多种，但现在其原因还不明确。但是，由于随着文明的进步，其发生率正在上升，因此显示出与精神紧张等环境因素有关。对于其治疗，现在对于溃疡性结肠炎主要是采用以柳氮磺胺吡啶(Sakazosulfapyridine)或氨基水杨酸(例如，5-氨基水杨酸)为有效成分的药剂的口服、肾上腺皮质类固醇(泼尼松)的口服、灌肠、栓剂治疗。另外，有时也尝试使用硫唑嘌呤(azathioprine)或6-巯基嘌呤(6-MP)等免疫抑制剂。另外，对于克隆氏病来说，主要是营养疗法(要素膳和中心静脉营养)，有时辅助使用肾上腺皮质激素的口服、柳氮磺胺吡啶的口服。但是，在溃疡性结肠炎、克隆氏病中都有治疗抵抗性的病例，并且还存在治疗药物具有副作用的问题。对于这些难治病例、重症病例，现在是选择手术治疗。
糖酐酯(Dextran sulfate sodium)诱发的结肠炎(以下称作DSS诱发结肠炎)作为人溃疡性结肠炎的模型被广泛用于结肠炎产生机理的研究及结肠炎的治疗药物的开发。DSS诱发结肠炎产生的机理尽管还不明确，但是，主要观点是由糖酐酯本身的毒性引起的。最近，研究表明，自由基在DSS诱发结肠炎的进展中具有重要的作用。例如，Dykens等已经报道，由浸润的白细胞髓过氧化物酶(myeloperoxidase(MPO))产生的自由基与DSS诱发结肠炎的发展有关(Dykens，J.A.，et al.，Scand J Gastroenterol，33，628-636，1998).另外，Hori(Hori，Y.，et al.，Jpn J Pharmacol，74，99-103，1997)及Naito(Naito，Y.，et al.，Antioxid Redox Signal，4，195-206，2002)分别发现过氧化物歧化酶(SOD)及螺旋捕捉剂(spin-trapping agent)与DSS诱发的结肠炎具有治疗效果，同样显示自由基对DSS诱发结肠炎的发展有关。而且，Blackburn(Blackburn，A.C.，et al.，Free Radic Biol Med，25，305-313，1998)利用高效液相色谱法证明DSS诱发的结肠炎中产生自由基。另外，Korenagra等发现在DSS诱发的结肠炎中，不仅产生自由基，而且对肠粘膜的自由基的抵抗性降低(Korenaga，D.，et al.，JSurg Res，144-149，102，2002)。
另外，众所周知，用下述通式(I) (式中，R1表示氢原子、芳基、碳数为1～5的烷基或总碳数为3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氢原子、芳氧基、芳巯基、碳数为1～5的烷基或碳数为1～3的羟基烷基，或者R1、R2、合在一起表示碳数为3～5的亚烷基，R3表示氢原子、碳数为1～5的烷基、碳数为5～7的环烷基、碳数为1～3的羟基烷基、苄基、萘基、苯基或由1～3个相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基选自由碳数为1～5的烷氧基、碳数为1～3的羟基烷基、总碳数为2～5的烷氧基羰基、碳数为1～3的烷基巯基、碳数为1～4的烷基氨基、总碳数为2～8的二烷基氨基、卤原子、三氟甲基、羧基、氰基、羟基、硝基、氨基及乙酰胺基组成的组)表示的吡唑啉酮衍生物在药物的应用中具有脑功能正常化作用(日本专利公告No.5-31523号公报)、抑制过氧化脂质生成作用(日本专利公告No.5-35128号公报)、抗溃疡作用(日本专利公开No.3-215425号公报)、以及抑制血糖上升作用(日本专利公开No.3-215426公报)等。
另外，上述通式(1)所示的化合物中，以3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮为有效成分的药剂已经自2001年6月作为脑保健剂(通用名为“依达拉奉”(“エダラボン”·“ラジラボン”)，由三菱制药株式会社制造销售)上市。报告显示该依达拉奉对活性氧具有强的反应性(Kawai，H.，et al.，J.Phamacol.Exp.Ther.，281(2)，921，1997；及Wu，TW.et al.，Life Sci，67(19)，2387，2000)。如上所述，依达拉奉是一种通过消除以活性氧为主的各种自由基，起到防止细胞损害等的作用的自由基清除剂。如上所述，尽管显示由巨噬细胞及白细胞而来的超氧化物阴离子、诸如羟基自由基之类的自由基或者过氧化氢与溃疡性结肠炎的发展有关，但是，还没有研究依达拉奉对炎症性肠病是否有效的报告。
发明内容
本发明的课题在于提供一种对预防及/或治疗炎症性肠病有效的药物、肠粘膜保护剂、嗜中性白细胞的活化抑制剂、以及髓过氧化物酶活性抑制剂。本发明者为了解决上述问题进行了各种研究，结果发现，式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理学允许的盐、或其水合物或溶剂化物在糖酐酯引起的结肠炎模型中，具有显著减少由结肠炎引起的粘膜受损面积或者表示水肿程度的大肠湿重量，并显示出强大的抗结肠炎作用。在上述发现的基础上完成了本发明。
也就是，本发明提供含有下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理学允许的盐、或其水合物或溶剂化物为有效成分的预防及/或治疗炎症性肠病的药物。
(式中，R1表示氢原子、芳基、碳数为1～5的烷基或总碳数为3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氢原子、芳氧基、芳巯基、碳数为1～5的烷基或碳数为1～3的羟基烷基，或者R1、R2、合在一起表示碳数为3～5的亚烷基，R3表示氢原子、碳数为1～5的烷基、碳数为5～7的环烷基、碳数为1～3的羟基烷基、苄基、萘基、苯基或由1～3个相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基选自由碳数为1～5的烷基、碳数为1～5的烷氧基、碳数为1～3的羟基烷基、总碳数为2～5的烷氧基羰基、碳数为1～3的烷基巯基、碳数为1～4的烷基氨基、总碳数为2～8的二烷基氨基、卤原子、三氟甲基、羧基、氰基、羟基、硝基、氨基及乙酰胺基组成的组。)根据本发明优选的实施方式提供的上述药物，其中式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其生理学允许的盐、或者其水合物或溶剂化物。
另一方面，本发明提供了以式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理学允许的盐或其水合物或溶剂化物为有效成分的肠粘膜保护剂、嗜中性白细胞的活化抑制剂、以及髓过氧化物酶活性抑制剂。
再一方面，本发明提供了一种预防及/或治疗炎症性肠病的方法、肠粘膜保护方法、嗜中性白细胞的活化抑制方法、以及髓过氧化物酶活性抑制方法，这些方法包括将预防/或治疗有效量的以式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理学允许的盐或其水合物或溶剂化物对包括人在内的哺乳动物的给药的步骤。
本发明另外还提供一种由式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理学允许的盐、或其水合物或其溶剂化物用于制造预防及/或治疗炎症性肠病的药物、肠粘膜保护剂、嗜中性白细胞的活化抑制剂、或髓过氧化物酶活性抑制剂的用途。
图1(A)显示各给药组的大肠湿重量。图1(B)显示各给药组的受损粘膜面积。
图2显示各给药组的大肠组织的图像((A)对照组(×40)、(B)依达拉奉1mg/kg给药组(×40)、(C)依达拉奉5mg/kg给药组(×40)、(D)依达拉奉20mg/kg给药组(×40)。
图3(A)显示各给药组的受损分数。图3(B)显示各给药组大肠粘膜髓过氧化物酶活性。
图4(A)显示各给药组的大肠粘膜MDA、4-HNE浓度。图4(B)表示各给药组的血浆中的IL-6。
具体实施例方式
本发明的炎症性肠炎疾病的预防及/或治疗用的药物、肠粘膜保护剂、嗜中性白细胞的活化抑制剂、以及髓过氧化物酶活性抑制剂(以下将其总称为本发明的药物)包含本说明书定义的由通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理学允许的盐、或其水合物或其溶剂化物。
由于互变异构性，本发明中使用的式(I)表示的化合物可以具有以下的通式(I’)或(I”)显示的不同结构。为了方便，互变异构体中的一种由本说明书中的通式(I)显示，本领域的技术人员显然知道存在下述的互变异构体。作为本发明药物的有效成分，也可以使用下述的通式(I’)或(I”)显示的化合物或其生理学上允许的盐、或者其水合物或溶剂化物。
式(I)中，在R1定义中的芳基可以是单环或多环芳基中的一种。其实例包括苯基、萘基以及由例如甲基、丁基等烷基、例如甲氧基、丁氧基等烷氧基、例如氯原子等卤原子、或者羟基等取代基取代的苯基等。其它具有芳基部分的取代基(例如芳氧基)中的芳基部分也同样如此。
在R1、R2、R3定义中的碳数为1～5的烷基可以是碳数为1～5的直链状、支链状中的任何一种。例如有甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基等。其它具有烷基部分的取代基(烷氧基羰基烷基)中的烷基部分也同样如此。
在R1定义中的总碳数为3～6的烷氧基羰基烷基的实例包括甲氧基羰基甲基、乙氧基羰基甲基、丙氧基羰基甲基、甲氧基羰基乙基、甲氧基羰基丙基等。
在R2定义中的芳氧基例如有对甲基苯氧基、对甲氧基苯氧基、对氯苯氧基、对羟基苯氧基等，芳基巯基例如有苯基巯基、对甲基苯基巯基、对甲氧基苯基巯基、对氯苯基巯基、对羟基苯基巯基等。
在R2和R3定义中的碳数为1～3的羟基烷基例如有羟基甲基、2-羟基乙基、3-羟基丙基等。在R3定义中的碳数为5～7的环烷基例如有环戊基、环己基、环庚基等。
在R3的定义中，其中所述作为苯基取代基的碳数为1～5的烷氧基的实例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、戊氧基等，总碳数为2～5的烷氧基羰基的实例包括甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、丁氧基羰基等，碳数为1～3的烷基巯基的实例包括甲基巯基、乙基巯基、丙基巯基等，碳数为1～4的烷基氨基的实例包括甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、丁基氨基等，总碳数为2～8的二烷基氨基的实例包括二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、二丁基氨基等。
作为本发明药物的有效成分优选使用的化合物例如有如下的化合物。
3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-1-(2-甲基苯基)-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-1-(3-甲基苯基)-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-1-(4-甲基苯基)-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-1-(3，4-二甲基苯基)-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-乙基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-1-(4-丙基苯基)-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-丁基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3-三氟甲基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-三氟甲基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(2-甲氧基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；
1-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-甲氧基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3，4-二甲氧基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-乙氧基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-1-(4-丙氧基苯基)-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-丁氧基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(2-氯代苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3-氯代苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-氯代苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3，4-二氯代苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-溴代苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-氟代苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3-氯-4-甲基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3-甲基巯基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-甲基巯基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；4-(3-甲基-5-氧代-2-吡唑啉-1-基)苯甲酸；1-(4-乙氧基羰基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-硝基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；3-乙基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；1-苯基-3-丙基-2-吡唑啉-5-酮；1，3-二苯基-2-吡唑啉-5-酮；3-苯基-1-(对甲苯基)-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-氯代苯基)-3-苯基-2-吡唑啉-5-酮；3，4-二甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；4-异丁基-3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；4-(2-羟基乙基)-3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-4-苯氧基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-4-苯基巯基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；3，3’，4，5，6，7-六氢-2-苯基-2H-吲唑-3-酮；
3-(乙氧基羰基甲基)-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1，3-二甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-乙基-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-丁基-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(2-羟基乙基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-环己基-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-苄基-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(α-萘基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-甲基-3-苯基-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-1-(4-甲基苯基)-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-丁基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-甲氧基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-丁氧基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-氯代苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-羟基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3，4-二羟基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(2-羟基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3-羟基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-羟基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3，4-羟基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-羟基苯基)-3-苯基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-羟基甲基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-氨基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-甲基氨基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-乙基氨基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-丁基氨基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-二甲基氨基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(乙酰胺基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；
1-(4-氰基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；作为本发明药物的有效成分，除通式(I)表示的游离形态的化合物之外，也可以使用其生理学允许的盐。该生理学允许的盐例如可以使用与盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸等无机酸形成的盐，与甲磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、乙酸、乙二醇酸、葡糖醛酸、马来酸、富马酸、草酸、抗坏血酸、柠檬酸、水杨酸、烟酸、酒石酸等有机酸形成的盐，与钠、钾等碱金属形成的盐，与镁、钙等碱土金属形成的盐，与氨、三(羟基甲基)氨基甲烷、N，N-二(羟基乙基)哌嗪、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、乙醇胺、N-甲基谷氨酰胺、L-谷氨酰胺等胺形成的盐。另外，与甘氨酸等氨基酸形成的盐。
作为本发明药物的有效成分，例如可以使用上述通式(I)表示的化合物或其生理学允许的盐的水合物，或上述通式(I)表示的化合物或其生理学允许的盐的溶剂化物。对形成溶剂化物的有机溶剂的种类没有特别限制，例如有甲醇、乙醇、乙醚、二恶烷、四氢呋喃等。另外，上述通式(I)表示的化合物有时由于取代基的种类不同而具有1个或更多的不对称碳原子，有时存在光学异构体或非对映物异构体等立体异构体。作为本发明药物的有效成分，也可以使用纯的立体异构体、立体异构体的任意混合物、外消旋体等。
通式(I)表示的化合物可以是任意的公知的化合物，本领域的技术人员利用例如日本专利公报No.5-31523号等记载的方法可以容易地进行合成。
对本发明药物的给药量没有特别限定。通常，按照作为有效成分的由通式(I)表示的化合物的重量，一般口服的剂量为每天0.1～1000mg/kg体重，优选每天0.5～50mg/kg体重，非口服时，该剂量为每天0.01～100mg/kg体重，优选每天0.1～10mg/kg体重。上述剂量优选按一天一次或一天分几次(2～3次)服用，可以根据年龄、病情、症状适当增减。
作为本发明的药物，可以将上述通式(I)表示的化合物或其生理学上允许的盐，或其水合物或溶剂化物直接给药，一般优选将之制备成含有上述物质作为有效成分以及含有药理学和药剂学允许的添加剂的药物组合物，并以该药物组合物的形式给药。
在本发明中可以使用的所述药理学和药剂学允许的添加剂例如有赋形剂、崩解剂或崩解助剂、粘合剂、润滑剂、包衣剂、色素、稀释剂、基剂、溶解剂或溶解助剂、等渗剂、pH调节剂、稳定剂、喷射剂、及粘接剂等。
对于适合口服的药物组合物，作为添加剂例如可以使用，赋形剂如葡萄糖、乳糖、D-甘露糖醇、淀粉、或结晶纤维素等；崩解剂或崩解助剂如羧基甲基纤维素、淀粉或羧基甲基纤维素钙等，粘合剂入羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、或明胶等；润滑剂如硬脂酸镁或滑石粉等，包衣剂如羟基丙基甲基纤维素、蔗糖、聚乙二醇或氧化钛等，基体如凡士林、液体石蜡、聚乙二醇、明胶、高龄土、丙三醇、纯净水、或硬脂肪等。
对于适合注射或点滴用的药物组合物，可以使用诸如注射用蒸馏水、生理盐水、丙二醇等水性或在使用时可以构成溶液型注射剂成分的溶解剂或溶解助剂，诸如葡萄糖、氯化钠、D-甘露糖醇、丙三醇等的等渗剂，诸如无机酸、有机酸、无机碱或有机碱等的pH调节剂等添加剂。
对本发明的药物的形态没有限制，可以制成本领域技术人员可以利用的各种形态。作为适合口服的药物，例如可以使用固体药剂添加剂，制成片剂、粉剂、颗粒剂、硬胶胶囊剂、栓剂、或糖衣剂等；可以使用液状的药剂添加剂，配制成糖浆、乳剂、软胶囊剂等。另外，作为适合非口服的药物，例如可以配制成注射剂、点滴剂、吸入剂、栓剂、经皮吸收剂、经粘膜吸收剂等。另外，以上述通式(I)所示的化合物为有效成分的脑保健剂(点滴剂)因为已经在临床上使用((通用名为依达拉奉(エダラボン)、商品名“ラジカツト”，由三菱制药株式会社制造、销售)，故在本发明的药物中可以直接使用上述市售的制剂。
本发明的药物对炎症性肠病有效。也就是，本发明的药物具有防止炎症性肠病的预防剂的作用和/或使炎症性肠病回复正常状态的治疗剂的作用。另外，本发明的药物因为有效地减少由糖酐酯诱发大肠引起的作为人溃疡性结肠炎模型的结肠炎所产生的粘膜受损面积，故可以用作肠粘膜保护剂。而且，本发明的药物可以抑制作为肠粘膜炎症指标的髓过氧化物酶活性，故可以用作髓过氧化物酶活性抑制剂。而且髓过氧化物酶已知用作嗜中性白细胞的活化标志物(Med Sci Sports Exerc.2003 Feb；35(2)348-55)，故抑制髓过氧化物酶活化的本发明的药物可以用作嗜中性白细胞的活化抑制剂。
本说明书中所述的炎症性肠病是指大肠或小肠等消化道粘膜的表层细胞发生炎症，粘膜受损，产生溃疡及糜烂的原因不明的疾病，具体例如有溃疡性结肠炎、克隆氏病等。另外，本说明书中的溃疡性结肠炎例如有难治性溃疡性结肠炎、重症溃疡性结肠炎。
另外，本发明说明书中，所述对嗜中性白细胞的活化抑制包括对嗜中性白细胞的浸润抑制。
对本发明药物的给药方法没有特别限定，可以口服或非口服给药。例如，在治疗上述各疾病之前，可以预先预防性地口服本发明的药物，利用注射或点滴等的非口服的方式给药，可以在手术中或手术前后预防性地给药。另外，对于上述各疾病的患者，为了防止病症的恶化或为了病症的减轻等，也可以通过在静脉内、动脉内注射给药。
实施例下面，通过实施例更具体地说明本发明，本发明不限于下述的合成例3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(下面称作依达拉奉)的合成在乙醇50ml中加入乙酰乙酸乙酯13.0g及苯肼10.8g，回流搅拌3小时。放置冷却反应液之后，过滤手机析出的结晶，利用乙醇再结晶，得到无色结晶的标题化合物1.3g。
收率67％熔点127.5～128.5℃实施例1(1)实验方法
1材料将如上所述合成的依达拉奉溶解在少量的1N氢氧化钠溶液中，pH调整至中性附近。
2糖酐酯(DSS)诱发结肠炎的方法使用6周Sprague-Dawley系雄性大白鼠(日本クレア株式会社，根据已有的方法(Araki，Y.，et al.，Scand J Gastroentero，35，1060-1067，2000)，如下在大鼠中引起结肠炎。也就是，在粉形食物MF(オリエンタル酵母工业株式会社)中添加4％(w/w)的糖酐酯(DSS分子量5000、和光纯药工业株式会社，大阪)，以30g/日/只的量饲喂大鼠。自DSS给药开始之后，依达拉奉给药组分别早晚将1mg/kg/日、5mg/kg/日、20mg/kg/日的依达拉奉注射在背部皮下。对照组同样将生理盐水注射在背部皮下。
3肉眼评价结肠炎的方法8天后解剖。心腔采血之后，摘出大肠(结肠和直肠)，测定湿重量。利用先前已报道的方法肉眼评价大肠粘膜的损害程度(Araki，Y.，et al.，Scand J Gastroentero，35，1060-1067，2000)。也就是，测定粘膜的色调变化(发红)、血块附着、粘膜壁的崩溃、水肿、糜烂部分的面积。
4组织学结肠炎评价法用卡诺氏液将距肛门侧5mm的部位的粘膜固定3小时后，进行石蜡包埋。其后制作5μm厚的组织切片，进行苏木精-曙红染色。根据已报道的方法(Araki，Y.，et al.，Scand J Gastroentero，35，1060-1067，2000)，对结肠炎进行评分。也就是对(i)粘膜上皮的受损、(ii)隐窝的变形、(iii)炎症细胞浸润的程度对结肠炎进行评分，以上三项中分别以各项的程度及范围记分无，0；轻度而且局限，1；中度且局限，2；中度且范围广，3；重度且范围广，4。总计以上3项的分数，作为其大白鼠的组织学结肠炎分数(受损分数)。
5大肠粘膜髓过氧化物酶活性作为大肠粘膜内的炎症指标，利用已报道的方法测定髓过氧物酶活性(Araki，Y.，et al.，Clin Exp Immunol，119，264-269，2000)，也就是，将肛门侧10mm的部位的粘膜匀浆，测定利用H2O2和o-dianisidin的反应在460nm的吸光度的变化，观察其活性。
6大肠粘膜丙二醛(MDA)、4-羟基-2(E)-壬醛(4-HNE)浓度脂质过氧化是组织损害的重要机理之一。MDA以及4-HNA通过组织内的多元不饱和脂肪酸的过氧化产生。因此，测定大肠粘膜内的MDA及4-HNE浓度，作为组织内活性样物质(ROS)的状态的指标(Matsumura，N.，et al.，Pancreas，22，53-7，2001)。也就是，将大肠粘膜使用9倍量的含有0.5％的TritonX-100的50mmol/l的Tris缓冲液(pH8.0)进行匀浆，使用化验试剂盒(脂质过氧化分析试剂盒)(Calbiochem，La Jolla，CA，U.S.A)进行测定。另外，髓过氧物酶活性以及测定MDA及4-HNE浓度使用的匀浆中的蛋白量，利用Bio-RadProtein Assay(Bio-Radlaboratories，CA)进行测定。
7血浆中白介素-6(IL-6)浓度的测定方法作为全身炎症反应的指标测定血浆中的白介素-6的浓度。也就是，以10000rpm使血液离心后，利用ELISA法测定其血浆中的白介素-6浓度(Rat IL-6 ELISA KIT，BioSource Europe，S.A.，Belgium)。
8统计处理结果用平均值±SEM表示。组间比较用Fisher的PLSD测试。非参数的数据比较在Kruskal-Wallis测试和Dunn的多重对照程序下进行。p值不足0.05设定为有显著差别。
实验结果1肉眼评价结肠炎的方法通过给药DSS 8天，依达拉奉给药组、对照组都产生结肠炎。但是，依达拉奉给药组(1mg/kg给药组、5mg/kg给药组、20mg/kg给药组)都比对照组的大肠湿重量明显减低(图1(A))。同样，在依达拉奉给药组中，受损粘膜面积都比对照组的明显减小(图1(B))。
2组织学结肠炎评价法图2显示大肠组织的图像。(A)对照组(×40)、(B)依达拉奉1mg/kg给药组(×40)、(C)依达拉奉给药5mg/kg组(×40)、(D)依达拉奉给药20mg/kg组。对照组中，显示粘膜下层有明显的水肿和炎症细胞浸润。但是，依达拉奉给药1mg/kg、5mg/kg、20mg/kg组中，上述变化都得到了抑制。
将损害程度计分，依达拉奉给药组的受损分数都比对照组的受损分数降低(图3(A))。
3大肠粘膜髓过氧物酶活性依达拉奉给药组的大肠粘膜内的髓过氧物酶活性都比对照组的髓过氧物酶活性减低。特别是给药20mg/kg组的髓过氧物酶活性比对照组显示明显地减低(图3(B))。
4大肠粘膜(MDA)、4-HNE浓度依达拉奉给药组的大肠粘膜内MDA、4-HNE浓度都比对照组的MDA/4-HNE浓度减低。但是给药组间没有明显的差别(图4(A))。
5血浆中IL-6浓度依达拉奉给药组的血浆中的IL-6浓度都比对照组的IL-6活性减低。特别是给药20mg/kg组的IL-6浓度比对照组显示明显的减低(图4(B))。
产业上利用的可能性本发明的药物可用于炎症性肠病的预防及/或治疗。本发明的药物因为可以明显减少由作为人溃疡性结肠炎模型的由糖酐酯诱发的结肠炎导致的粘膜受损面积，故对患有溃疡性结肠炎的普通患者、特别是对现有的药物无效的难治性及重症溃疡性结肠炎患者有效。
作为本发明优先权的基础的日本专利申请No.2002-262324说明书中记载的内容，全部作为本说明书公开的一部分。
权利要求
1.一种用于预防和/或治疗炎症性肠病的药物，其包含作为有效成分的由下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理学允许的盐、或其水合物或溶剂化物 式(I)中，R1表示氢原子、芳基、碳数为1～5的烷基或总碳数为3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氢原子、芳氧基、芳巯基、碳数为1～5的烷基或碳数为1～3的羟基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳数为3～5的亚烷基，R3表示氢原子、碳数为1～5的烷基、碳数为5～7的环烷基、碳数为1～3的羟基烷基、苄基、萘基、苯基或由1～3个相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基选自由碳数为1～5的烷基、碳数为1～5的烷氧基、碳数为1～3的羟基烷基、总碳数为2～5的烷氧基羰基、碳数为1～3的烷基巯基、碳数为1～4的烷基氨基、总碳数为2～8的二烷基氨基、卤原子、三氟甲基、羧基、氰基、羟基、硝基、氨基及乙酰胺基组成的组。
2.如权利要求1所述的药物，其中由式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。
3.如权利要求1或2所述的药物，其中，所述炎症性肠病是溃疡性结肠炎或克隆氏病。
4.如权利要求3所述的药物，其中，所述溃疡性结肠炎是难治性结肠炎或重症溃疡性结肠炎。
5.一种肠粘膜保护剂，其含有作为有效成分的由下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理学允许的盐、或其水合物或溶剂化物 式(I)中，R1表示氢原子、芳基、碳数为1～5的烷基或总碳数为3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氢原子、芳氧基、芳巯基、碳数为1～5的烷基或碳数为1～3的羟基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳数为3～5的亚烷基，R3表示氢原子、碳数为1～5的烷基、碳数为5～7的环烷基、碳数为1～3的羟基烷基、苄基、萘基、苯基或由1～3个相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基选自由碳数为1～5的烷基、碳数为1～5的烷氧基、碳数为1～3的羟基烷基、总碳数为2～5的烷氧基羰基、碳数为1～3的烷基巯基、碳数为1～4的烷基氨基、总碳数为2～8的二烷基氨基、卤原子、三氟甲基、羧基、氰基、羟基、硝基、氨基及乙酰胺基组成的组。
6.如权利要求5所述的肠粘膜保护剂，其中，由式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。
7.一种嗜中性白细胞的活化抑制剂，其含有作为有效成分的由下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理学允许的盐、或其水合物或溶剂化物 式(I)中，R1表示氢原子、芳基、碳数为1～5的烷基或总碳数为3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氢原子、芳氧基、芳巯基、碳数为1～5的烷基或碳数为1～3的羟基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳数为3～5的亚烷基，R3表示氢原子、碳数为1～5的烷基、碳数为5～7的环烷基、碳数为1～3的羟基烷基、苄基、萘基、苯基或由1～3个相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基选自由碳数为1～5的烷基、碳数为1～5的烷氧基、碳数为1～3的羟基烷基、总碳数为2～5的烷氧基羰基、碳数为1～3的烷基巯基、碳数为1～4的烷基氨基、总碳数为2～8的二烷基氨基、卤原子、三氟甲基、羧基、氰基、羟基、硝基、氨基及乙酰胺基组成的组。
8.如权利要求7所述的嗜中性白细胞的活化抑制剂，其中以式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。
9.一种髓过氧化物酶活性抑制剂，其含有作为有效成分的由下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理学允许的盐、或其水合物或溶剂化物 式(I)中，R1表示氢原子、芳基、碳数为1～5的烷基或总碳数为3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氢原子、芳氧基、芳巯基、碳数为1～5的烷基或碳数为1～3的羟基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳数为3～5的亚烷基，R3表示氢原子、碳数为1～5的烷基、碳数为5～7的环烷基、碳数为1～3的羟基烷基、苄基、萘基、苯基或由1～3个相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基选自由碳数为1～5的烷基、碳数为1～5的烷氧基、碳数为1～3的羟基烷基、总碳数为2～5的烷氧基羰基、碳数为1～3的烷基巯基、碳数为1～4的烷基氨基、总碳数为2～8的二烷基氨基、卤原子、三氟甲基、羧基、氰基、羟基、硝基、氨基及乙酰胺基组成的组。
10.如权利要求9所述的髓过氧化物酶活性抑制剂，其中以式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。
11.如权利要求9或10所述的髓过氧化物酶活性抑制剂，其中所述髓过氧化物酶是大肠粘膜的髓过氧化物酶。
12.一种炎症性肠病的预防及/或治疗方法，其包含对包括人在内的哺乳动物给予预防和/或治疗所述病有效量的由下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理学允许的盐、或其水合物或溶剂化物的给药步骤 式(I)中，R1表示氢原子、芳基、碳数为1～5的烷基或总碳数为3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氢原子、芳氧基、芳巯基、碳数为1～5的烷基或碳数为1～3的羟基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳数为3～5的亚烷基，R3表示氢原子、碳数为1～5的烷基、碳数为5～7的环烷基、碳数为1～3的羟基烷基、苄基、萘基、苯基或由1～3个相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基选自由碳数为1～5的烷基、碳数为1～5的烷氧基、碳数为1～3的羟基烷基、总碳数为2～5的烷氧基羰基、碳数为1～3的烷基巯基、碳数为1～4的烷基氨基、总碳数为2～8的二烷基氨基、卤原子、三氟甲基、羧基、氰基、羟基、硝基、氨基及乙酰胺基组成的组。
13.如权利要求12所述的方法，其中，通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中，所述炎症性肠病是溃疡性结肠炎或克隆氏病。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述溃疡性结肠炎是难治性溃疡性结肠炎或重症溃疡性结肠炎。
16.一种肠粘膜的保护方法，其包含对包括人在内的哺乳动物给予有效量的由下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理学允许的盐、或其水合物或溶剂化物的给药步骤 式(I)中，R1表示氢原子、芳基、碳数为1～5的烷基或总碳数为3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氢原子、芳氧基、芳巯基、碳数为1～5的烷基或碳数为1～3的羟基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳数为3～5的亚烷基，R3表示氢原子、碳数为1～5的烷基、碳数为5～7的环烷基、碳数为1～3的羟基烷基、苄基、萘基、苯基或由1～3个相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基选自由碳数为1～5的烷基、碳数为1～5的烷氧基、碳数为1～3的羟基烷基、总碳数为2～5的烷氧基羰基、碳数为1～3的烷基巯基、碳数为1～4的烷基氨基、总碳数为2～8的二烷基氨基、卤原子、三氟甲基、羧基、氰基、羟基、硝基、氨基及乙酰胺基组成的组。
17.如权利要求16所述的方法，其中，通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。
18.一种抑制嗜中性白细胞活化的方法，其包含对包括人在内的哺乳动物给予有效量的由下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理学允许的盐、或其水合物或溶剂化物的给药步骤 式(I)中，R1表示氢原子、芳基、碳数为1～5的烷基或总碳数为3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氢原子、芳氧基、芳巯基、碳数为1～5的烷基或碳数为1～3的羟基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳数为3～5的亚烷基，R3表示氢原子、碳数为1～5的烷基、碳数为5～7的环烷基、碳数为1～3的羟基烷基、苄基、萘基、苯基或由1～3个相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基选自由碳数为1～5的烷基、碳数为1～5的烷氧基、碳数为1～3的羟基烷基、总碳数为2～5的烷氧基羰基、碳数为1～3的烷基巯基、碳数为1～4的烷基氨基、总碳数为2～8的二烷基氨基、卤原子、三氟甲基、羧基、氰基、羟基、硝基、氨基及乙酰胺基组成的组。
19.如权利要求18所述的方法，其中，通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。
20.一种抑制髓过氧化物酶活性的方法，其包含对包括人在内的哺乳动物给予有效量的由下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理学允许的盐、或其水合物或溶剂化物的给药步骤 式(I)中，R1表示氢原子、芳基、碳数为1～5的烷基或总碳数为3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氢原子、芳氧基、芳巯基、碳数为1～5的烷基或碳数为1～3的羟基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳数为3～5的亚烷基，R3表示氢原子、碳数为1～5的烷基、碳数为5～7的环烷基、碳数为1～3的羟基烷基、苄基、萘基、苯基或由1～3个相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基选自由碳数为1～5的烷基、碳数为1～5的烷氧基、碳数为1～3的羟基烷基、总碳数为2～5的烷氧基羰基、碳数为1～3的烷基巯基、碳数为1～4的烷基氨基、总碳数为2～8的二烷基氨基、卤原子、三氟甲基、羧基、氰基、羟基、硝基、氨基及乙酰胺基组成的组。
21.如权利要求20所述的方法，其中，通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中，所述髓过氧化物酶是大肠粘膜的髓过氧化物酶。
23.下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理学允许的盐、或其水合物或溶剂化物的应用，其用于制备用来预防和/或治疗炎症性肠病的药物 式(I)中，R1表示氢原子、芳基、碳数为1～5的烷基或总碳数为3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氢原子、芳氧基、芳巯基、碳数为1～5的烷基或碳数为1～3的羟基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳数为3～5的亚烷基，R3表示氢原子、碳数为1～5的烷基、碳数为5～7的环烷基、碳数为1～3的羟基烷基、苄基、萘基、苯基或由1～3个相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基选自由碳数为1～5的烷基、碳数为1～5的烷氧基、碳数为1～3的羟基烷基、总碳数为2～5的烷氧基羰基、碳数为1～3的烷基巯基、碳数为1～4的烷基氨基、总碳数为2～8的二烷基氨基、卤原子、三氟甲基、羧基、氰基、羟基、硝基、氨基及乙酰胺基组成的组。
24.如权利要求23所述的应用，其中，通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。
25.如权利要求23或24所述的应用，其中，所述炎症性肠病是溃疡性结肠炎或克隆氏病。
26.如权利要求25所述的应用，其中，所述溃疡性结肠炎是难治性溃疡性结肠炎或重症溃疡性结肠炎。
27.下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理学允许的盐、或其水合物或溶剂化物的应用，其用于制备肠粘膜保护剂 式(I)中，R1表示氢原子、芳基、碳数为1～5的烷基或总碳数为3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氢原子、芳氧基、芳巯基、碳数为1～5的烷基或碳数为1～3的羟基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳数为3～5的亚烷基，R3表示氢原子、碳数为1～5的烷基、碳数为5～7的环烷基、碳数为1～3的羟基烷基、苄基、萘基、苯基或由1～3个相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基选自由碳数为1～5的烷基、碳数为1～5的烷氧基、碳数为1～3的羟基烷基、总碳数为2～5的烷氧基羰基、碳数为1～3的烷基巯基、碳数为1～4的烷基氨基、总碳数为2～8的二烷基氨基、卤原子、三氟甲基、羧基、氰基、羟基、硝基、氨基及乙酰胺基组成的组。
28.如权利要求27所述的应用，其中，通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。
29.下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理学允许的盐、或其水合物或溶剂化物的应用，其用于制备嗜中性白细胞的活化抑制剂 式(I)中，R1表示氢原子、芳基、碳数为1～5的烷基或总碳数为3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氢原子、芳氧基、芳巯基、碳数为1～5的烷基或碳数为1～3的羟基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳数为3～5的亚烷基，R3表示氢原子、碳数为1～5的烷基、碳数为5～7的环烷基、碳数为1～3的羟基烷基、苄基、萘基、苯基或由1～3个相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基选自由碳数为1～5的烷基、碳数为1～5的烷氧基、碳数为1～3的羟基烷基、总碳数为2～5的烷氧基羰基、碳数为1～3的烷基巯基、碳数为1～4的烷基氨基、总碳数为2～8的二烷基氨基、卤原子、三氟甲基、羧基、氰基、羟基、硝基、氨基及乙酰胺基组成的组。
30.如权利要求29所述的应用，其中，通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。
31.下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理学允许的盐、或其水合物或溶剂化物的应用，其用于制备髓过氧化物酶的活性抑制剂 式(I)中，R1表示氢原子、芳基、碳数为1～5的烷基或总碳数为3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氢原子、芳氧基、芳巯基、碳数为1～5的烷基或碳数为1～3的羟基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳数为3～5的亚烷基，R3表示氢原子、碳数为1～5的烷基、碳数为5～7的环烷基、碳数为1～3的羟基烷基、苄基、萘基、苯基或由1～3个相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基选自由碳数为1～5的烷基、碳数为1～5的烷氧基、碳数为1～3的羟基烷基、总碳数为2～5的烷氧基羰基、碳数为1～3的烷基巯基、碳数为1～4的烷基氨基、总碳数为2～8的二烷基氨基、卤原子、三氟甲基、羧基、氰基、羟基、硝基、氨基及乙酰胺基组成的组。
32.如权利要求31所述的应用，其中，通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。
33.如权利要求31或32所述的应用，其中，所述髓过氧化物酶是大肠粘膜的髓过氧化物酶。
全文摘要
本发明的课题在于提供一种用于预防和/或治疗炎症性肠病的有效药物。本发明提供一种用于预防和/或治疗炎症性肠病的药物，其包含作为有效成分的由下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理学允许的盐、或其水合物或溶剂化物式(I)中，R
文档编号A61P43/00GK1681794SQ0382138
公开日2005年10月12日 申请日期2003年9月9日 优先权日2002年9月9日
发明者荒木克夫, 安藤朗, 藤山佳秀 申请人:三菱制药株式会社