专利名称：虎纹捕鸟蛛蛋白酶抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酶抑制剂，具体涉及一种从蜘蛛毒液中获得的蛋白酶抑制剂。
背景技术：
生物毒液中往往含有丰富的活性分子，包括蛋白酶抑制剂。它们能选择性地作用于一些蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、纤维蛋白溶酶、血浆激肽释放酶等。具有能被开发成有利于人类健康的新药应用前景。如，Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂BPTI(牛胰蛋白酶抑制剂)，它是到目前为止发现的世界上活性最强的蛋白酶抑制剂之一，它通过与酶的活性位点结合而抑制蛋白酶的活性，因而在治疗胰腺炎、烧伤后休克、产后大出血、急性循环衰竭、出血性脑水肿、手术中及创伤后出现的纤溶亢进性出血的防治等领域都表现出很好的疗效，在爱滋病的治疗方面也有一定的临床应用。目前在动植物中发现了多种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，它与胰蛋白酶1∶1结合，只有一个作用位点。蜘蛛毒液中含有大量具有致死或麻痹活性的神经毒素成分，在捕食时发挥着重要的作用；而蜘蛛唾液中含有大量的消化酶，有时会渗入到毒液中水解神经毒素成分从而降低其作用。因此如何从蜘蛛毒液中获得一种酶抑制剂是值得研究的问题。
发明内容
本发明旨在从蜘蛛毒液中获得一种抑制作用较强的蛋白酶抑制剂。
上述发明目的是通过以下方案实现的虎纹捕鸟蛛毒素-XI的cDNA序列为ccttgtggag gaagttttct tcagaccccg gtattgtctc gccaggaatc ttggcgcttg 60tctgtcctga gataccagcg gcggcccgac ttacgcatcc ttccccagga aacctttgaa 120ggactgaagg cggtgaaaca gcaagct atg gga ata gca aga att ctc agt gca gtg ttg 180
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图1是虎纹捕鸟蛛毒素-XI(HWTX-XI)的分离纯化图谱其中1-I是离子交换图谱，E表示目的峰、1-II是第一次反相HPLC图谱，12.5min表示出峰时间、1-III是目的毒素的第二次反相HPLC图谱、1-IV是虎纹捕鸟蛛毒素-XI(HWTX-XI)的质谱鉴定图2是虎纹捕鸟蛛毒素-XI(HWTX-XI)的一级化学结构图3是表达的虎纹捕鸟蛛毒素-XI(HWTX-XI)的Tricine SDS-PAGE图谱其中1为低分子量标准、2为天然的虎纹捕鸟蛛毒素-XI(HWTX-XI)、3为表达的虎纹捕鸟蛛毒素-XI(HWTX-XI)图4是虎纹捕鸟蛛毒素-XI(HWTX-XI)抑制胰蛋白酶的浓度依赖性图谱图5是虎纹捕鸟蛛毒素-XI(HWTX-XI)与胰蛋白酶的生物大分子相互作用图谱图6是虎纹捕鸟蛛毒素-XI(HWTX-XI)与胰凝乳蛋白酶的生物大分子相互作用图谱虎纹捕鸟蛛毒素-XI(HWTX-XI)可通过两种途径获得从虎纹捕鸟蛛粗毒中提取和通过基因表达的途径获得，具体操作如下1.毒液的采集和虎纹捕鸟蛛毒素-XI的分离纯化方法(1)毒液的采集方法将3-4根长为4cm、内径为1.5mm的透明塑料软管捆成一束作为诱物，用大镊子从侧面夹住虎纹捕鸟蛛的胸部，蜘蛛便张开螯瓜，这时将软管束诱物送入螯瓜下，它即用触肢抱住软管束，将螯瓜有力地刺入软管内并射出毒液。射毒后从螯瓜下慢慢抽出软管束，用微量注射器将其中的毒液抽出，经冰冻干燥后即可得到带浅金黄色的干粉，即为粗毒。
(2)虎纹捕鸟蛛毒素-XI的分离纯化方法根据蛋白质的带电荷性质和蛋白质的疏水性进行两次分离，结合阳离子交换和反相HPLC色谱法。将5毫克上述粗度溶于6毫升双蒸水中，上样到事先用0.1M磷酸盐缓冲液平衡好的Water Protein PakCM 8HR阳离子交换柱(5×50毫米)中，用0-81％氯化钠线性梯度洗脱，时间为60分钟，流速为3mL/min。收集最后一个峰进一步反相HPLC纯化。用C18反相分析柱在40min内以20-40％的乙腈(含0.1％三氟乙酸)线性梯度洗脱，收集保留时间为12.5min的峰进一步反相HPLC，得到单一目的峰(图1)，质谱仪检测为单一组分并测得准确分子量为6166.23(图1)。
虎纹捕鸟蛛毒素-XI经491-A测序仪得到其一级蛋白序列(图2)，由55个氨基酸残基组成，含6个半胱氨酸。根据理论分子量和质谱测定分子量的差值，可以推断6个半胱氨酸形成了三对二硫键。该毒素的物理化学性质为纯化冻干粉为白色或类白色疏松体，无气味，极易溶解于水，水溶液近于无色透明。该蛋白质的最大紫外吸收波长为280nm，等电点为9.45，为碱性蛋白。
从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离获得的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，它对胰蛋白酶有很强的抑制作用，抑制常数为5.54×10-13M，同时对别的一些丝氨酸蛋白酶也有一定的抑制作用。
2.基因工程克隆表达虎纹捕鸟蛛毒素-XI(HWTX-XI)(1)虎纹捕鸟蛛毒素-XI的全长cDNA序列的获得①3′RACE首先从虎纹捕鸟蛛毒腺中快速抽提总RNA，反转录总RNA得到总cDNA。根据已知虎纹捕鸟蛛毒素-XI的氨基酸序列设计基因特异性简并引物p1-a5′-TT(T/C)GA(A/G)(A/C)G(A/T/C/G)TGG TA(T/C)TT(T/C)AA(C/T)-3′和p1-b5′-TG(T/C)GC(A/T/C/G)AA(G/A)TT(T/C)AT(A/C/T)TA(T/C)GG-3′。用基因特异性引物和AUAP与少量cDNA链进行PCR扩增得到大小在300bp左右的一段cDNA链，纯化后克隆入pGEM Teasy载体(购自Promega公司)，进行测序。
②5′RACE根据已得到的3′RACE测序结果设计并合成5′RACE的反义引物p2-a5′-AATGCTCTGACTGTGTTCCG-3′和p2-b5′-TCTTTTCATGCAGGCCTCTTG-3′。用基因特异性引物和巢氏引物做PCR扩增，产物纯化后克隆入pGEM Teasy载体(购自Promega公司)进行测序。
③全长cDNA将3′RACE和5′RACE测序结果进行拼接，得到虎纹捕鸟蛛毒素-XI的全长cDNA序列。它包括3′非翻译序列、5′非翻译序列、编码分子前体的可读框、一个成熟的毒素序列和一个插入的pro序列。
(2)虎纹捕鸟蛛毒素-XI的表达根据虎纹捕鸟蛛毒素-XI的成熟蛋白序列设计引物p3-a5′-CGTCTAGATAAGAGAATAGATACATGC-3′和p3-d5′-CCGAAGC TTTATGCTTTTGCACATC-3′进行PCR，得到成熟蛋白的cDNA，克隆测序，准备HWTX-XI的表达。用pVT102U载体(中科院上海生物化学与细胞生物学研究所戚正武院士赠送)连接cDNA并转化DH5α，再转入宿主细胞S-78酵母中进行细胞培养。用硫酸铵沉淀proPVT表达500mL，离心后取上清与处理好的DE52纤维素共静置半小时，抽滤，滤出液即为去色素上清。将滤出液用醋酸调pH至4.2，然后上CM-Sepharose32柱，分级洗脱，取目标峰进一步反相HPLC纯化。用C18反相分析柱在40min内以20-40％的乙腈(含0.1％三氟乙酸)线性梯度洗脱，收集保留时间为13min的峰进一步反相HPLC。然后用MALDI-TOF质谱和Tricine SDS-PAGE进行鉴定。(图3)。
用这种方法可得到表达产量为12.5mg/L。
为了更好地说明和揭示该毒素分子的作用，我们利用分光光度计和生物大分子相互作用仪测定了天然虎纹捕鸟蛛毒素-XI和表达虎纹捕鸟蛛毒素-XI对胰蛋白酶的抑制活性，同时与牛胰蛋白酶抑制剂BPTI的活性大小进行了比较。
1.主要材料和仪器虎纹捕鸟蛛毒素-XI按上述两种方法得到，同时通过HPLC和MALDI-TOF质谱仪鉴定了其纯度在99％以上；胰蛋白酶(TPCK处理)为Sigma产品，苯甲酰-DL-精胺酰对硝基苯胺(BAPNA)、胰凝乳蛋白酶为上海伯奥生物公司产品，其他化学试剂均达到分析纯。
实验仪器U-2000型紫外-可见分光光度计(日本HITACHI产品)，表面等离子共振生物传感器(BIAcore X，瑞典Uppsala产品)。
2.实验方法和结果2.1用分光光度计测定虎纹捕鸟蛛毒素-XI对胰蛋白酶抑制活性以BAPNA(5×10-4M)为底物，加入一定量的胰蛋白酶，取不同量的虎纹捕鸟蛛毒素-XI与之反应，整个反应在pH8.0、浓度为0.05mol/L的Tris-HCL缓冲体系中进行，反应温度为25℃。在405nm测定光吸收值。结果表明虎纹捕鸟蛛毒素-XI对胰蛋白酶有很强的抑制作用，且呈现出浓度依赖性关系，当虎纹捕鸟蛛毒素-XI与胰蛋白酶的物质的量之比为1∶1时，胰蛋白酶被完全抑制，见图4。
2.2表面等离子共振测定生物大分子相互作用把虎纹捕鸟蛛毒素-XI偶连到CM5芯片上，用不同浓度的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶溶液流经芯片表面。结果发现，虎纹捕鸟蛛毒素-XI与胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶的结合呈现出非常明显的浓度依赖性关系。选用BIA数据处理软件自动处理所得数据，可得虎纹捕鸟蛛毒素-XI与胰蛋白酶在系统温度为25℃、缓冲液pH值为7.4的条件下结合非常强，解离常数为5.54×10-13M。虎纹捕鸟蛛毒素-XI与胰凝乳蛋白酶的解离常数为1.07×10-7M。(图5、图6)。
2.3虎纹捕鸟蛛毒素-XI与牛胰蛋白酶抑制剂BPTI的抑制活性大小比较以BAPNA(5×10-4M)为底物，加入一定量的胰蛋白酶，分别取不同量的天然虎纹捕鸟蛛毒素-XI、表达虎纹捕鸟蛛毒素-XI和牛胰蛋白酶抑制剂BPTI与之反应，整个反应在pH8.0、0.05mol/L的Tris-HCL缓冲体系中进行，反应温度为25℃。在405nm测定光吸收值。结果表明天然虎纹捕鸟蛛毒素-XI与胰蛋白酶结合的解离常数为3.07×10-8M，表达虎纹捕鸟蛛毒素-XI与胰蛋白酶结合的解离常数为2.91×10-8M，牛胰蛋白酶抑制剂BPTI与胰蛋白酶结合的解离常数为6.85×10-8M。
上述三个实验结果表明虎纹捕鸟蛛毒素-XI是一种很强的胰蛋白酶抑制剂，它的抑制活性高于BPTI。天然虎纹捕鸟蛛毒素-XI和表达虎纹捕鸟蛛毒素-XI的活性基本一致，表明这种表达系统能产生正确的分子折叠。
本发明的虎纹捕鸟蛛蛋白抑制剂即可从蜘蛛粗毒中分离纯化，也可克隆获得，而且抑制活性高于BPIT，是一种很强的胰蛋白酶抑制剂。
虎纹捕鸟蛛毒素-XI的cDNA序列为ccttgtggag gaagttttct tcagaccccg gtattgtctc gccaggaatc ttggcgcttg 60tctgtcctga gataccagcg gcggcccgac ttacgcatcc ttccccagga aacctttgaa 120ggactgaagg cggtgaaaca gcaagct atg gga ata gca aga att ctc agt gca gtg ttg 180Met Gly Ile Ala Arg Ile Leu Ser Ala Val Leu-33 -30tcc ctc agc gtt ctt ttc gtg gtg aca ttt cct gcc ctt ctc tca gcg gat cac cat gac 240Phe Leu Ser Val Leu Phe Val Val Thr Phe Pro Ala Leu Leu Ser Ala Asp His His Asp-20 -10gga agaata gat aca tgc cgtttg ccc tct gac cgt ggg aga tgcaag gca tcc ttt gaa300Gly Arg Ile Asp Thr Cys Arg Leu Pro Ser Asp Arg Gly Arg Cys Lys Ala Ser Phe Glu-1 1 10cgt tgg tac ttc aat ggc aga aca tgcgct aag ttt att tat gga ggc tgc ggt ggc aac360Arg Trp Tyr Phe Asn Gly Arg Thr Cys Ala Lys Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn20 30ggt aat aag ttc cca actcaa gag gcc tgc atg aaa aga tgt gca aaa gcataa 414Gly Asn Lys Phe Pro Thr Gln Glu Ala Cys Met Lys Arg Cys Ala Lys Ala End40 50 55cggaacacag acagagcatt atcgtcaaca cctacttgag cgcagccctg ttcaccaggg 474gtttcgatga agtttcgtca agacctcaac atggatgttt taaagtagtg ctctcaatgt 534aatgttaaat acatgtctca gcaataaaga tttatacaac gaaaaaaaaa aaaaaaaa 59权利要求
1.一种虎纹捕鸟蛛蛋白酶抑制剂，其特征在于从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离纯化的虎纹捕鸟蛛毒素-XI，该毒素的cDNA序列如下ccttgtggaggaagttttcttcagaccccggtattgtctcgccaggaatcttggcgcttg 60tctgtcctgagataccagcggcggcccgacttacgcatccttccccaggaaacctttgaa 120ggactgaaggcggtgaaacagcaagct atg gga ata gca aga att ctc agt gca gtg ttg 180Met Gly Ile Ala Arg Ile Leu Ser Ala Val Leu-33 -30tcc ctc agc gtt ctt ttc gtg gtg aca ttt cct gcc ctt ctc tca gcg gat cac cat gac 240Phe Leu Ser Val Leu Phe Val Val Thr Phe Pro Ala Leu Leu Ser Ala Asp His His Asp-20 -10gga agaata gat aca tgc cgt ttg ccc tct gac cgt ggg aga tgc aag gca tcc ttt gaa300Gly Arg Ile Asp Thr Cys Arg Leu Pro Ser Asp Arg Gly Arg Cys Lys Ala Ser Phe Glu-1 1 10cgt tgg tac ttc aat ggc aga aca tgc gct aag ttt att tat gga ggc tgc ggt ggc aac360Arg Trp Tyr Phe Asn Gly Arg Thr Cys Ala Lys Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn20 30ggt aat aag ttc cca act caa gag gcc tgc atg aaa aga tgt gca aaa gcataa 414Gly Asn Lys Phe Pro Thr Gln Glu Ala Cys Met Lys Arg Cys Ala Lys Ala End40 50 55cggaacacagacagagcattatcgtcaacacctacttgagcgcagccctgttcaccaggg 474gtttcgatgaagtttcgtcaagacctcaacatggatgttttaaagtagtgctctcaatgt 534aatgttaaatacatgtctcagcaataaagatttatacaacgaaaaaaaaaaaaaaaaa 59全文摘要
本发明涉及一种从蜘蛛毒液中获得的蛋白酶抑制剂，它的cDNA全长592bp，一级化学结构由55个氨基酸残基组成，该毒素的理化性状为纯化冻干粉为白色或类白色疏松体，无气味，极易溶解于水，水溶液近于无色透明，该蛋白质的最大紫外吸收波长为280nm，等电点为9.45；它对胰蛋白酶有很强的抑制作用，抑制常数为5.54×10
文档编号A61K38/57GK1546171SQ200310110608
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月5日 优先权日2003年12月5日
发明者梁宋平, 袁春华, 谢锦云 申请人:湖南师范大学