专利名称：一种预防流感病毒dna疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于一种生物制品，具体涉及一种预防流感病毒疫苗。
背景技术：
现有流感生物预防制品及制备方法有如下种类(一)、流感病毒灭活疫苗。全病毒灭活疫苗是在完整病毒的基础上，将致病毒粒应用物理或化学的方法使之完全灭活(失去感染性)而制成的病毒疫苗。流感灭活疫苗相较其他疫苗有生产方法比较简单，生产过程容易控制等优势，但也有其明显的缺点。由于制备疫苗用的流感病毒需在鸡胚的尿囊腔中培养生长，制备周期长，免疫原性会被降低或改变。流感的灭活疫苗不具长效性。由它诱导的免疫应答甚至对同源病毒株的效果也很短暂，因此需要每年一次或一年两次接种。(二)、流感亚单位疫苗。流感亚单位疫苗是指由野生流感病毒株经培养、裂解、纯化后得到的有效的病毒表面抗原成分，主要是HA和NA疫苗。但亚单位疫苗的传统制备方法生产工艺相对繁琐，难以大量获取抗原，因此导致亚单位疫苗价格昂贵，难于推广应用。(三)、流感减毒活疫苗。在小鼠中已经证明，流感减毒活疫苗有更为广谱的免疫应答。作为一个有效的疫苗，基因重配的冷适应株必须拥有来源于野生株的编码HA和NA的2个RNA节段，而另外6个片断则必须来源于冷适应供体株。从获得野生病毒株的克隆到制备出减毒活疫苗株大约需要5周时间。在接种人群之前，还必须将疫苗株在特殊的无菌鸡蛋尿囊腔中培养，进一步检测其毒性。对流感减毒活疫苗的减毒处理只是经验性的，且其毒力依然存在回复突变的可能性。尤其对于冷适应疫苗株来说，由于需要多次传代，时间很长，当病毒流行时，将流行毒株进行冷适应性传代并不现实。(四)、流感合成肽疫苗。人工合成的与流感病毒保护性抗原(HA、NA等)决定簇的氨基酸序列相同的肽段，经制备成免疫原后对动物或人体进行接种，可以促使机体产生保护性抗体，这种多肽就是流感的合成肽疫苗。合成肽疫苗存在着一些理论和实际上的困难一是如何找到及构建最佳抗原决定簇的多肽；二是合成肽的免疫原性较弱，使用时必须配用佐剂。由于弗氏佐剂不能在人体使用，故合成肽的临床评价急需研制一种有效、可在人体使用的佐剂。(五)、流感基因工程亚单位疫苗。将编码诱导保护性免疫应答的流感抗原决定簇(HA、NA等)基因插入到表达载体DNA中，然后将载体导入酵母、昆虫或哺乳动物细胞，使之表达病毒抗原蛋白，产物纯化后即得流感的基因工程亚单位疫苗。基因工程亚单位疫苗的不足之处在于阳性表达克隆筛选的工作量大。表达的蛋白有时不能正确折叠或修饰，从而影响免疫原性。重组蛋白分离纯化的工艺有时相对复杂。(六)、流感病毒DNA疫苗。DNA疫苗(DNA Vaccine)是将编码某种抗原蛋白的外源基因直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。DNA疫苗由病原体(包括病毒和细菌等)的保护性抗原基因和载体质粒两部分组成。质粒DNA必须具备以下条件①带有细菌复制子(Ori)，保证质粒能在大肠杆菌中复制；②带有用于筛选的抗性基因，筛选基因可以选用卡那霉素，氨苄青霉素或新霉素等抗性基因；③真核生物的启动子(有的含有增强子)，如CMV、SV40启动子；④带有PolyA序列，能保证mRNA在体内的稳定性，这种稳定性因PolyA来源不同而异。目前认为较好的PolyA是来自牛生长激素基因(BGH)。DNA疫苗的导入方式多样，有肌肉注射、皮内注射、鼻内滴注或鼻腔喷雾、脂质体法以及新发展起来的基因枪免疫和活体电击免疫等。流感病毒至今仍是引起人类死亡的主要病因之一，因为流感病毒易突变，所以人类至今仍无法征服流感。疫苗接种是预防流感的一种有效方法，DNA疫苗(DNA vaccine)为我国提供了一种新的选择。1993年，UlmerJB等将编码流感病毒A/PR/8/34的NP基因的质粒注入BALB/c小鼠的股四头肌内，产生了强烈而特异的CTL应答，能够提供交叉保护作用，开创了核酸疫苗用于预防流感病毒的研究[Ulmer JB et al Science.1993 Mar 19；259(5102)1745-9.]；陈则等将HA编码基因克隆入小鸡的β肌动蛋白表达载体中，以3周间隔接种2次，采用基因枪或者活体电击免疫接种的方式，接种剂量为基因枪每只小鼠1μgDNA，活体电击免疫方法每只小鼠30μgDNA。加强免疫后的第七天，用同源病毒株攻击。结果显示，接种HA DNA疫苗的小鼠能有效抵抗病毒感染[Chen Z et al Vaccine.1998Oct；16(16)1544-9；Chen Z et al Vaccine.1999 Feb 26；17(7-8)653-9.]，因此HA基因应该作为流感DNA疫苗的重要组成部分。DNA疫苗在免疫应答中能诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，DNA疫苗应用于小鼠、绵羊、鸡、猫、牛、猪、马、猴和黑猩猩等动物身上均获得成功，但它在诱导免疫应答中的效率相对较低，影响了它的实际应用，因此寻找其它DNA分子以提高核酸疫苗的免疫效率则是需要解决的问题。
发明内容
本发明旨在研制一种预防流感病毒用高效DNA疫苗，以提高DNA疫苗的免疫效率。
上述发明目的是通过以下技术方案实现的。本发明疫苗是用CD40L作佐剂的预防流感病毒的DNA疫苗，HA DNA疫苗与CD40L以1∶1的质量比共同免疫。
下面进一步详述本发明。
图1为病毒攻击小鼠体重丢失(g)和感染后恢复结果图。
图2为病毒特异性的血清IgG滴定结果图。
图3为共同免疫HA和CD40L(加强免疫后)后小鼠中IgG抗体亚型的水平结果图。
CD40L是肿瘤坏死因子超家庭的成员之一，含有261个氨基酸，为II型跨膜糖蛋白，定位于Xq24上，其相对分子量(Mr)为39000。[Eur J Immunol.1992Dec；22(12)3191-4]本发明的预防流感用高效DNA疫苗是通过如下步骤制备的流感病毒抗原HA和CD40L基因的获得，HA和CD40L DNA疫苗的构建，HA和CD40L DNA疫苗的鉴定。
流感病毒抗原HA和CD40L基因的获得病毒RNA是从在10日龄鸡胚中增殖得到的病毒中提取。RNA经逆转录反应得到单链cDNA。以cDNA为模板，对HA基因进行PCR扩增。正向引物为5’AACCTC GAGAAT GAA GGC AAA CCT ACT GGT CC-3’，反向引物为5’AACCCC GGGTCT CAG ATG CATATT CTG CAC TGC A-3’。正向引物含有XhoI酶切位点，反向引物含有SmaI酶切位点。
以小鼠脾脏细胞的cDNA文库(Clontech公司)为模板，用PCR方法克隆出CD40L基因，正向引物为5’TTC CTC GAG CAT GAT AGA AAC ATA CAG-3’，反向引物为5’TGA CCC GGG GTA TAG GGA AGA CTG CCA-3’。正向引物含有Xho I酶切位点，反向引物含有Sma I酶切位点。
HA和CD40L DNA疫苗的构建低熔点琼脂糖凝胶回收PCR产物，连入pGEM-T载体，转化大肠杆菌，通过质粒提取和酶切鉴定来确定HA、CD40L基因是否已经连入T载体。然后大量扩增鉴定的重组子，纯化回收。带有HA、CD40L基因的T载体用Xho I-Sma I消化，低熔点回收从T载体上切下来的HA、CD40L片段，克隆入经同样酶切处理的表达载体pCAGGSP7中，获得重组质粒pCAGGSP7/HA、pCAGGSP7/CD40L。HA、CD40L基因核苷酸序列经377DNA测序仪(Applied Biosystem.U.S.A.)测序证实。
真核表达载体pCAGGSP7来源于由Niwa et al构建的pCAGGSP7[Niwa H et al.Gene 1991，108103-200.]，是将多克隆位点Kpn1，Xho1，Cla1，EcoRV，Sma1，Not1和Sac1插入pCAGGS的EcoR1位点得到pCAGGSP7。质粒pCAGGS含鸡的β-肌动蛋白启动子成分，SV40的复制起始部位(Ori)，氨苄青霉素抗性基因，CMV瞬时增强子，牛生长激素基因(BGH)多聚A。
HA和CD40L DNA疫苗的鉴定编码HA和CD40L的质粒分别在Escherichia coli XL1-blue中扩增，用QIAGEN纯化试剂盒(QIAGEN，Tip500)纯化。用紫外分光光度法测定质粒的浓度和纯度，DNA的浓度和纯度通过OD260、OD280确定，选取OD260/OD280比值在1.8～2.0的质粒DNA去免疫小鼠。
HA与CD40L质粒分别于-20℃低温冻存，免疫小鼠前解冻并根据用量将HA与CD40L质粒混合。
免疫实验步骤及实验结果免疫实验使用的HA是来自于H1N1亚型的流感病毒株(A/PR/8/34)，其全称是hemagglutinin。
A/PR/8/34 HA(hemagglutinin)的生理化学特性该病毒株的主要表面糖蛋白是血凝素(HA)。它具有凝集多种动物红细胞的性质。
HA由流感病毒RNA片段4编码，是典型的I型糖蛋白，它含有4个结构域信号肽(前导序列)、胞浆域、跨膜域和胞外域。HA大约由562-566个氨基酸组成，在HA的氨基端有一由16个疏水氨基酸组成的信号肽。紧接信号肽的是由328个氨基酸残基组成的HA1部分，羧基端由221个氨基酸残基构成HA2。在HA1和HA2之间有一精氨酸残基。HA2羧基端(185-211氨基酸区域)主要由疏水氨基酸残基组成。最末端的10个氨基酸残基大多是亲水性的。
HA的三维结构流感病毒的HA蛋白以三聚体(trimer)的形式存在于双层类脂膜上，即HA纤突由三个HA单体分子组成，单体全长13.4nm。它可分为两部分，一部分是呈球状的头部，由HA1组成，含有受体结合位点和抗原决定族；另一部分为柄，由HA2和部分HA1组成，与囊膜相连，长约7.6nm。HA2氨基末端与HA1羧基末端相距2.1nm。HA2氨基末端位于分子的三聚体交界面，与病毒膜相距3nm，它富含有甘氨酸残基，形成一个不同寻常的螺旋结构延伸出三聚体的交界面。
实验动物选取8周龄BALB/c雌性小鼠。
腹腔注射麻醉药(盐酸氯胺酮、盐酸洛贝林混合物)使小鼠全身麻醉，用酒精擦拭小鼠右后腿股四头肌，然后用一次性注射器吸取溶于TE(1M Tris，0.5M EDTA)的DNA溶液，将针垂直插入股四头肌，慢慢注入DNA。一组BALB/c小鼠混合免疫30μgHA(1μg/μl)和30μg CD40L(1μg/μl)，总体积30μl；一组BALB/c小鼠免疫30μgHA(1μg/μl)，总体积30μl；用未插入外源基因的空载体免疫小鼠作为阴性对照。在肌肉注射针孔的两侧插入电击仪的两根电极，相距0.5cm，然后电击(电压100v，电击时间50ms，电击正负各三次，间隔1s)，完成一次免疫。免疫后第3周用相同剂量和成分的DNA加强免疫。
用氯仿麻醉小鼠，从心脏采血。使小鼠背卧于实验桌面，在剑状软骨下方微偏左处以15～20度角插入注射器针头，缓慢的抽取心血直至血流停止。收集的血液置于室温1小时左右。凝固后析出血清。4000转/分离心10分钟。在无菌条件下吸出血清，-20度冰箱保存。
用酶联免疫吸附实验(ELISA)测HA特异性IgG抗体。用10μg/mL的灭活疫苗包被96孔酶标板，37℃2小时；PBS-T(1升溶液中含有NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO41.15g，KH2PO40.2g，Tween-20 0.454ml)洗三次后加入封闭液(1升溶液中含有NaCl8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO41.15g，KH2PO40.2g，10g牛血清白蛋白)，4℃过夜。用封闭液以2的倍数稀释抗血清后，加入酶标板，37℃温育1小时。PBS-T洗三次后，加入用生物素(Biotin)标记的山羊抗鼠IgG二抗，用于抗体分型的是山羊抗鼠IgG1、IgG2a二抗(γ-chain specific，Southern Biotechnology Associates，Inc.USA)，37℃温育1小时。PBS-T洗三次后，加入碱性磷酸酶标记的链菌蛋白(SouthernBiotechnology Associates，Inc.USA)，37℃温育1小时。最后，PBS-T洗三次后，加入10mg/ml PNPP(Southern Biotechnology Associates，Inc.USA)显色。在30分钟内，用酶标仪(Labsystems Multiskan Ascent芬兰产)利用双波长(414nm-405nm)测出OD值，最终确定抗体IgG的最高稀释度，以此来确定抗体量的高低。
取出小鼠的气管和肺，PBS(含0.1％BSA)注洗三次。漂洗液离心去细胞碎片用于测病毒滴度。将肺洗液作10倍系列稀释，取每个稀释度0.1ml与吸附在6孔板上的MDCK细胞共培养1小时，让细胞和病毒充分吸附，用2ml琼脂粉培养基覆盖6个孔，在CO2培养箱中培养两天，噬斑形成，计算噬斑的数目，以每ml病毒液中噬斑形成单位表示病毒量的多少。每个实验组病毒滴度是用每个实验组所有小鼠每毫升病毒滴度的mean±SD来表示。
小鼠加强免疫后1周用致死量流感病毒(40LD50)通过滴鼻法(17μl病毒悬液)攻击小鼠。在三周内用小鼠的存活率来判定新型DNA疫苗的保护效果。
混合免疫HA和CD40L能保护小鼠抗致死量流感病毒攻击小鼠用致死量流感病毒攻击，攻击后3周统计死亡小鼠和存活小鼠，以此确定小鼠的存活率。如表1所示，结果显示混合HA和CD40L免疫小鼠的存活率达到100％，只免疫HA DNA疫苗小鼠的存活率也能达到100％。
表1.致死量病毒攻击后小鼠的存活率保护效果免疫质粒存活数/攻击总数HA+CD40L5/5*HA 5/5*空载体 0/5*显著差异(P＜0.05)CD40L能够提高小鼠抗致死量流感病毒的攻击小鼠用致死量流感病毒攻击后，小鼠的保护率没有区别，然而小鼠攻击后体重变化有不同，如图1所示。供试小鼠共免疫两次，间隔三周。加强免疫后一周，用致死量流感病毒攻击。在0～14天监视小鼠的体重变化和死亡。图中体重丢失为小鼠的平均体重。其中对照组小鼠在第7天全部死亡，免疫HA组和HA+CD40L组小鼠全部存活。结果表明与单独免疫HA相比，共同免疫HA和CD40L组小鼠体重丢失明显减少且体重恢复加速。虽然在我们以前的实验中已得到证明，30μgHA已经能够完全提供保护，但是病毒攻击后，小鼠的体重下降较多，而共同免疫HA和CD40L后，小鼠的体重减轻很少，且体重恢复很快，而体重丢失是A型流感病毒感染小鼠后一个非常明显的临床症状。这说明共同免疫HA和CD40L DNA疫苗组小鼠体内的病毒量要低于只免疫了HA DNA疫苗的实验小鼠。
共同免疫HA和CD40L DNA疫苗提高了IgG抗体的滴度用ELISA法测血清中的IgG抗体。我们发现与单独免疫HA相比，无论是初免还是加强免疫后，共同免疫HA和CD40L明显的提高了抗HA的IgG抗体产生(图2)，且加强免疫后的抗体水平高于初免后的抗体水平。
(图2A)小鼠初免后三周通过断尾法从尾部取血，测血清中的抗HA的IgG抗体，血清以1∶200稀释；(图2B)加强免疫后通过心脏取血，测血清中的抗HA的IgG抗体，血清以1∶4096稀释。共同免疫HA和CD40L后增强了小鼠抗HA的特异性抗体。竖条和竖线分表代表同型抗原光吸收值的平均值和SD。
*显著差异p＜0.05，使用Student t test。
CD40L与HA共同免疫后IgG抗体亚型的变化为了检测CD40L质粒是否影响IgG抗体亚型的变化，加强免疫后我们检测了抗HA的特异性血清IgG中IgG1和IgG2a的相对数量，如图3所示，每组小鼠10只，免疫两次，间隔三周，每组剂量为30μg HA，30μg HA+30μg CD40L。加强免疫后一周用致死量流感病毒攻击，三天后，每组小鼠取五只从心脏取血。以1∶2048倍稀释时测光吸收值。竖条和竖线分表代表同型抗原光吸收值的平均值和SD。
*显著差异p＜0.05，使用Student t test。
结果表明共同免疫HA和CD40L后，稍微提高了抗HA特异性的IgG1抗体，但IgG2a抗体显著提高，表明CD40L偏向于Th1型免疫应答，Th1型免疫应答在抗病毒作用中扮演非常重要的角色。
本发明所采用流感病毒DNA疫苗佐剂与传统用于传染病预防的疫苗及其佐剂相比，有以下特点(1)、本发明使用免疫佐剂可减少核酸疫苗的使用量，减少核酸疫苗的安全性隐患。
(2)、本发明不仅增强了免疫动物的肌体体液应答反应，同时增强了细胞介导的免疫反应，而后者是提高DNA疫苗效率的重要前提条件。
(3)、本发明的DNA疫苗容易生产，稳定性强，较安全。干燥的DNA小粒在室温下相对稳定，不需要冷藏设备，因此对边远地区的使用也较为方便。DNA疫苗在接种前即刻加水就能简单地恢复原状，这在经济上和公共卫生方面都是有利的。
(4)本发明的制备方法简便，价格低廉。DNA疫苗仅需在细菌中生产，构建高效表达质粒，与普通疫苗相比，DNA疫苗的制作省去了抗原提取和纯化等繁琐耗时的过程，使得制备周期大大缩短。
(5)本发明免疫应答持久，由于外源基因可以在体内存在较长时间，并不断表达外源蛋白，它可以持续地给免疫系统提供刺激，因此，很微量的抗原即可刺激机体产生强而持久的免疫应答。
总的来说，CD40L与HA共同免疫能够增强流感病毒表面抗原HA基因的免疫应答，能够更有效的保护动物抗致死量流感病毒的攻击，是一种有广阔应用前景的流感病毒DNA疫苗。
权利要求
1.一种预防流感病毒的DNA疫苗，其特征在于该疫苗是用CD40L作佐剂的预防流感病毒的DNA疫苗，HA DNA疫苗与CD40L以1∶1的质量比共同免疫。
全文摘要
本发明涉及一种预防流感病毒DNA疫苗。本发明采用CD40L与流感病毒DNA共同免疫动物，诱导小鼠产生的免疫应答能很好的保护小鼠抗致死量流感病毒攻击，抗流感效果好于不加CD40L的DNA疫苗。本发明DNA疫苗免疫动物，制备方法简便、价格低廉，使用方便，免疫效果好，克服了已知流感预防制品的不足，提供了一种较为安全、有效的流感预防制品。
文档编号A61K48/00GK1544089SQ200310110549
公开日2004年11月10日 申请日期2003年11月21日 优先权日2003年11月21日
发明者陈则, 则 陈 申请人:湖南师范大学