专利名称：降血脂药用2，3，5，4＇-四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有药用价值的天然化合物，特别是具有降血脂作用的二苯乙烯苷类化合物2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷。
背景技术：
大量的流行病学调查和研究资料表明，高脂血症是动脉粥样硬化、冠心病、高血压、糖尿病、胆石症等多种疾病的重要危险因素。高脂血症的预防与治疗是目前医药研究的热点。目前的降(调)血脂药物，主要有非诺贝特为代表的苯氧乙酸类、辛伐他汀为代表的他汀类合成药，也有月见草和特制红曲(血脂康)等中药复方制剂。而中国药典则收载了血脂宁等含有何首乌的降血脂中药成方。何首乌(蓼科蓼属植物Polygonummultiflorum Thunb.的块根)具有较为肯定的降血脂作用，所含的四羟基二苯乙烯-β-D-葡萄糖苷达1％以上；另外还含有蒽醌类物质如大黄酚、大黄素、大黄酸、大黄素甲醚等。前人已证实了二苯乙烯苷类物质在脂质代谢方面的作用。包括虎杖根中的二苯乙烯类成分白藜芦醇(resveratrol)与云杉新苷(piceid)能够抑制鼠肝中的甘油三脂和胆固醇的沉积与合成。何首乌的主要成分就是2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，现有技术中有用乙醇提取何首乌，醇提物用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯提取部分，以干柱层析法初步分离，洗脱剂为乙酸乙酯-甲醇(8∶2)，再用减压层析法精制，得到2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，工艺较为昂贵，不利于安全的批量生产。现有技术中尚未见有对该成分单体进行的与治疗高脂血症有关的药理实验和临床应用公开报道。
发明内容
本发明的目的旨在克服现有技术的不足而提供一种成本低廉、工艺简捷、生产更安全，并可作为活性单体医治高脂血症的降血脂药用2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷。
本发明的目的是这样实现的一种降血脂药用2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，它从何首乌水煎剂提取后经分离纯化得到，具有抑制血清总胆固醇升高、降低血清低密度脂蛋白胆固醇和提高肝脂酶活性的功用，可以此活性单体制成药物剂型。
——所述的何首乌水煎剂是指将何首乌切片水煎煮不少于3次后，过滤、合并滤液，浓缩后加乙醇量达50-70％，放置过夜后再过滤，沉淀再加60-80％乙醇于热水浴中加热洗涤，过滤后，滤液与前滤液合并，减压蒸除乙醇，加氯仿或二氯甲烷萃取1-3次除去脂溶性成份后的水层。
——所述的分离是指将上述水层用正丁醇萃取后，合并正丁醇层，减压蒸干后得的浸膏或将上述水层蒸除氯仿，加水稀释、过滤、滤液过大孔吸附树脂后，先后用水、含10-80％的乙醇水溶液淋洗后减压蒸干后的浸膏。
——所述的纯化是指将浸膏用适量的乙醇-水溶解，分散到4-8倍量的硅胶，室温干燥后，进行常压硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(95∶5-70∶30)系统进行梯度洗脱，收集相关洗脱液，减压回收溶剂后，重复柱层析1-2次后再以乙醇-水重结晶。
——所述的药物剂型包括片剂、针剂、胶囊、口服液和颗粒剂。
本发明用独特的方法进行提取和分离纯化，依据是该有效成分具有良好的水溶性，适合用热水提取。以水代醇降低了成本和提高了生产的安全性，另一明显的优点是减少了何首乌药材中蒽醌类脂溶性成分的溶出，利于目标成分的纯化。
本发明的突出进步和显著特征在于利用资源充足的常用中药何首乌，制造具有良好降血脂作用的2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷单体，用来作为降血脂药物或保健食品的活性成分。
具体实施例方式
下面以实施例介绍本发明所述2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的获得方法，特别是该化合物所表现出的良好降血脂药理活性。所涉及到的方法是本领域的技术人员能够掌握和运用的技术手段。但是，实施例的介绍不得理解为任何意义上的对本发明权利要求的限制。
实施例12，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的制备(方法一)取药材切片，加水煎煮3次(各2h，1h，1h)，过滤，合并滤液，浓缩，加95％乙醇使含醇量60％，放置过夜，过滤。沉淀再加70％乙醇于70℃水浴加热洗涤，过滤，滤液与前滤液合并，减压回收乙醇至无乙醇味，加氯仿萃取2次除去脂溶性杂质，取水层，用正丁醇萃取完全(以TLC检测，展开剂为氯仿-甲醇(80∶20)，10％硫酸乙醇显色，或254nm紫外光下检视)，合并正丁醇层，减压蒸干。得含有二苯乙烯苷为主成分的浸膏。得率3％-7％。
将浸膏用适量的乙醇-水溶解，分散到6倍量的硅胶，室温干燥，进行常压硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(80∶20)系统进行梯度洗脱，收集氯仿-甲醇的相关洗脱液，减压回收溶剂，得二苯乙烯苷粗品。重复柱层析2次，得二苯乙烯苷精品，以乙醇-水重结晶，得白色二苯乙烯苷结晶性粉末，按需要可制成不同的药物剂型。
TLC检测无杂质斑点，HPLC测定(面积归一化法，C18反相柱，5μm，4.6mm×250mm；25％-30％乙腈为流动相，于320nm检测)含量98.0％-99.6％。其IR、MS、1H NMR、13C NMR数据及TLC行为均与2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品一致。
经测定，该药品对昆明种小鼠口服的半数致死量LD50为(±)mg/kg，属于低毒性物质。
实施例22，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的制备(方法二)取药材切片，加水煎煮3次(各2h，1h，1h)，过滤，合并滤液，浓缩，加95％乙醇使含醇量60％，放置过夜，过滤。沉淀再加70％乙醇于70℃水浴加热洗涤，过滤，滤液与前滤液合并，减压回收乙醇至无乙醇味，加氯仿萃取2次除去脂溶性杂质，取水层，蒸除氯仿，加水稀释，过滤，滤液过已经处理过的D101大孔吸附树脂，先后用水、含30％乙醇的水溶液淋洗，直至目标成分洗脱完全(以TLC检测)，合并含有该成分的洗脱液(以30％-50％洗脱液为主)，减压蒸干。得含有二苯乙烯苷为主成分的浸膏。
将浸膏用适量的乙醇-水溶解，分散到6倍量的硅胶，室温干燥，进行常压硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(80∶20)系统进行梯度洗脱，收集氯仿-甲醇的相关洗脱液，减压回收溶剂，得二苯乙烯苷粗品。重复柱层析2次，得二苯乙烯苷精品，以乙醇-水重结晶，得白色二苯乙烯苷结晶性粉末，按需要可制成不同的药物剂型。TLC检测无杂质斑点，HPLC测定含量98.0％-99.6％。
实施例3对高胆固醇血症实验动物血清脂质的影响[1]雄性SD大鼠，随机分为正常组、模型组、阳性药物(非诺贝特)对照组，受试药物(2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷)小剂量组、受试药物(2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷)大剂量组(下同)。除正常组外，其余4组给予脂肪乳剂灌胃连续3周。从第2周起各组给予不同处理正常组、模型组给予生理盐水(2ml/day)灌胃，对照组给予非诺贝特(100mg/kg·day)灌胃，受试药物小剂量组给予80mg/kg·day灌胃，受试药物大剂量组给予160mg/kg·day灌胃，连续2周。
测定给药前后血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量。给药前后各组动物平均血清脂质水平见表1。
表1 高胆固醇血症动物实验前后血清脂质变化情况TC TG HDL-C LDL-C组别药前药后 药前 药后 药前 药后 药前药后正常组 1.65±0.33130±0.290.38±0.09 0.35±0.05 0.59±0.12 0.48±0.120.89±0.22 0.25±0.08模型组 2.86±0.52△4.45±0.98 0.73±0.42 0.24±0.02 0.61±0.10 0.63±0.091.92±0.34△1.89±0.60阳性药物2.32±0.22△4.11±0.46 0.62±0.18 0.45±0.17 0.62±0.09 0.58±0.101.42±0.20△1.62±0.43对照组受试药物2.54±0.44△2.68±0.62*0.53±0.22 0.32±0.09 0.64±0.07 0.57±0.071.65±0.39△0.95±0.46*小剂量组受试药物2.72±0.37△2.86±0.73*0.55±0.10 0.46±0.21 0.62±0.06 0.57±0.061.84±0.34△1.01±0.38*大剂量组△P＜0.05(与正常组比较)，*P＜0.01(与模型组比较)；下同。
由表1可见，受试药物两个剂量组均具有显著的降低血清总胆固醇和降低低密度脂蛋白胆固醇的作用，两项指标与给药前水平相当，与模型组相比具有显著性差异(P＜0.01)。但是在此动物模型中对甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇没有明显影响。
刘明，董超仁，苏静怡。一种简便实用的大鼠高脂血症模型。中国药理学通报，1989；5(2)119-121实施例4受试药物对高甘油三酯血症实验动物血清脂质的影响。
雄性SD大鼠，随机分为正常组，模型组，对照组，受试药物大剂量组，受试药物小剂量组。除正常组外，其余4组给予25％果糖饮水连续3周。从第2周起各组给予不同处理正常组、模型组给予生理盐水(2ml/day)灌胃，对照组给予非诺贝特(100mg/kg·day)灌胃，受试药物小剂量组给予80mg/kg·day灌胃，受试药物大剂量组给予160mg/kg·day灌胃，连续2周。
测定给药前后血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量。给药前后各组动物平均血清脂质水平见表2。
表2 高甘油三酯血症动物实验前后血清脂质变化情况TC TG HDL-C LDL-CGroup药前 药后 药前 药后 药前 药后 药前 药后正常组1.65±0.331.30±0.290.38±0.090.35±0.050.59±0.120.48±0.120.89±0.220.25±0.08模型组1.48±0.260.93±0.140.72±0.13△0.72±0.2 0.54±0.080.50±0.080.61±0.230.15±0.02阳性药物1.58±0.401.65±0.180.74±0.23△0.74±0.280.58±0.090.36±0.090.66±0.250.48±0.11对照组受试药物1.44±0.280.88±0.280.52±0.200.58±0.170.55±0.090.55±0.090.66±0.160.15±0.02小剂量组受试药物1.40±0.191.06±0.250.77±0.19△0.78±0.230.55±0.060.50±0.060.50±0.130.16±0.04大剂量组△P＜0.05由表2可见，受试药物对由于大量摄入果糖所导致的高甘油三酯血症动物模型的甘油三酯水平无显著性影响。
实施例5受试药物对肝脂酶活性的影响取高甘油三酯血症大鼠肝组织，制备肝组织匀浆，按照肝脂酶(HL)活性测定试剂盒(南京建成生物工程研究所产品)说明书进行操作，结果见表3。
表3肝脂酶活性测定Group HL正常组0.166±0.034模型组0.086±0.019△阳性药物0.110±0.017△对照组受试药物0.130±0.036*小剂量组受试药物0.109±0.019△大剂量组△P＜0.05，*P＜0.01。
由表3可见，受试药物小剂量组动物平均肝脂酶活性显著高于模型组(P＜0.05)，与正常组相比，已无显著性差异。
综上所述，受试药物2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷具有良好的调节血脂作用，可以显著抑制血清总胆固醇升高，降低低密度脂蛋白胆固醇含量，提高肝脏中肝脂酶的活性，达到促进胆固醇和甘油三酯代谢的目的。在试验的两种药物剂量中，可看出80mg/kg剂量对大鼠的降血脂效果更明显。因此，2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷作为活性成分，在开发新的调节血脂药物或保健食品方面极具价值。
权利要求
1.一种降血脂药用2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，其特征在于它从何首乌水煎剂提取后经分离纯化得到，具有抑制血清总胆固醇升高、降低血清低密度脂蛋白胆固醇和提高肝脂酶活性的功用，可以此活性单体制成药物剂型。
2.根据权利要求1所述的降血脂药用2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，其特征在于何首乌水煎剂是指将何首乌切片水煎煮不少于3次后，过滤、合并滤液，浓缩后加乙醇量达50-70％，放置过夜后再过滤，沉淀再加60-80％7醇于热水浴中加热洗涤，过滤后，滤液与前滤液合并，减压蒸除乙醇，加氯仿或二氯甲烷萃取1-3次除去脂溶性成份后的水层。
3.根据权利要求1所述的降血脂药用2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，其特征在于分离是指将上述水层用正丁醇萃取后，合并正丁醇层，减压蒸干后得的浸膏或将上述水层蒸除氯仿，加水稀释、过滤、滤液过大孔吸附树脂后，先后用水、含10-80％的乙醇水溶液淋洗后减压蒸干后的浸膏。
4.根据权利要求1所述的降血脂药用2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，其特征在于纯化是指将浸膏用适量的乙醇—水溶解，分散到4-8倍量的硅胶，室温干燥后，进行常压硅胶柱层析，以氯仿—甲醇(95∶5-70∶30)系统进行梯度洗脱，收集相关的洗脱液，减压回收溶剂后，重复柱层析1-2次后再以乙醇—水重结晶。
5.根据权利要求1所述的降血脂药用2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，其特征在于药物剂型包括片剂、针剂、胶囊、口服液和颗粒剂。
全文摘要
本发明涉及一种降血脂药用2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷，其特征在于它从何首乌水煎剂提取后经分离纯化得到，具有抑制血清总胆固醇升高、降低血清低密度脂蛋白胆固醇和提高肝脂酶活性的功用，可以此活性单体制成药物剂型；本发明用独特的方法进行提取和分离纯化，依据是该有效成分具有良好的水溶性，适合用热水提取，以水代醇降低了成本和提高了生产的安全性，另一明显的优点是减少了何首乌药材中蒽醌类脂溶性成分的溶出，利于目标成分的纯化。
文档编号A61P3/00GK1539844SQ200310111890
公开日2004年10月27日 申请日期2003年10月24日 优先权日2003年10月24日
发明者胡英杰, 符林春, 高瑄, 卢元嫒 申请人:广州中医药大学热带医学研究所