广泛防御高毒性脑膜炎球菌谱系的多肽－疫苗的制作方法

专利名称：广泛防御高毒性脑膜炎球菌谱系的多肽－疫苗的制作方法
技术领域：
本发明在免疫学和疫苗学领域中。特别是它涉及来自脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)的抗原和它们在免疫中的用途。
背景领域脑膜炎奈瑟球菌是无活动、革兰氏阴性人病原体，定居于咽并导致脑膜炎(偶而在没有脑膜炎时引起败血病)。它导致地方病和流行病。引入抗流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的缀合疫苗后，脑膜炎奈瑟球菌是在美国引起细菌性脑膜炎的主要原因。
在生物体荚膜多糖的基础上，鉴定了多种脑膜炎奈瑟球菌的血清组。血清组A是最常涉及撒哈拉以南非洲流行病的病原体。血清组B和C引起美国和最发达国家的绝大部分病例。血清组W135和Y引起美国和发达国家的其余病例。血清组之后，分类包括血清型、血清亚型和然后的免疫型，标准命名列出血清组、血清型、血清亚型和免疫型，各由冒号隔开，如B4P1.15L3，7，9。在血清组B内，一些谱系导致疾病频繁(高侵入性)，一些谱系引起比其它谱系更严重的疾病形式(高毒性)，其它的根本不导致疾病。识别了7个高毒性谱系，即亚群I、III和IV-1、ET-5复合体、ET-37复合体、A4簇和谱系3。它们通过多位点酶电泳(MLEE)确定，但多位点序列分型(MLST)也用于分类脑膜炎球菌[参考文献1]。
抗血清组A、C、W135和Y的多糖疫苗已知多年[2，3]，但抗血清组B的疫苗难以证明。测试了以外膜囊泡为基础的疫苗[例如参见参考文献4]，但这些疫苗提供的保护通常限于用来制成疫苗的菌株。因此，仍需要广泛有效的血清组B疫苗。
报导了脑膜炎球菌血清组A[5]和B[6，7]的基因组序列，研究了血清组B序列以鉴定疫苗抗原[例如参考文献8到13]。操作候选抗原以改善异源表达[参考文献14到16]。
发明的一个目标是提供更多和改善的组合物，用于提供抗脑膜炎球菌病和/或感染的免疫，特别是用于提供抗血清组B脑膜炎球菌的广泛免疫。
发明的描述抗病原体如乙肝病毒、白喉和破伤风的疫苗一般包含单一蛋白抗原(如HBV表面抗原或破伤风类毒素)。相反，非细胞性百日咳疫苗典型包含至少3种百日咳博德特氏菌(B.pertussis)蛋白且PrevenarTM肺炎球菌疫苗包含7种单独的缀合糖抗原。其它疫苗如细胞性百日咳疫苗、麻疹疫苗、灭活的脊髓灰质炎疫苗(IPV)和脑膜炎球菌OMV疫苗本质是大量抗原的复杂混合物。
防御是否可由单一抗原、少量确定抗原或未确定抗原的复杂混合物引起，因此取决于所讨论的病原体。发明的基础是发现少量确定抗原能提供广泛防御脑膜炎球菌感染，发明提供的组合物在施用给受试者后能在该受试者中诱导抗体反应，其中抗体反应是杀菌性的，抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B的高毒性谱系A4、ET-5和谱系3中的2个或多个(如2或3)。
发明的组合物优选包括10个或更少(如9、8、7、6、5、4、3、2)纯化抗原的混合物，而不是由单一抗原组成，且特定优选组合物不应包括复杂或未确定抗原的混合物，如优选组合物中不包括外膜囊泡。
对于血清组B脑膜炎球菌，发现5种确定蛋白抗原的混合物引起良好的保护性免疫反应。因此，发明提供的组合物包括下列5种脑膜炎球菌蛋白抗原(1)‘NadA’蛋白；(2)‘741’蛋白；(3)‘936’蛋白；(4)‘953’蛋白和(5)‘287’蛋白。这些抗原在本文称为“5种基本抗原”。
NadA蛋白来自脑膜炎奈瑟球菌血清组B的‘NadA’(奈瑟球菌粘附素A)在参考文献10中示为蛋白‘961’(SEQ ID 2943和2944)且在参考文献6中示为‘NMB1994’(也参见GenBank登录号11352904和7227256)。蛋白的详细描述可发现于参考文献17。血清组A中没有对应蛋白[5，17]。
当根据本发明使用时，NadA可采用多种形式。优选的NadA形式是截断或缺失变体，如参考文献14到16中所示。特别是优选没有其C末端膜锚的NadA(如对于菌株2996，缺失残基351-405[SEQ ID 1])，在本文中有时用‘C’上标区分，例如NadA(C)。在大肠杆菌(E.coli)中表达无其膜锚结构域的NadA(如SEQ ID 1)使蛋白分泌到培养物上清中，伴随去除其23聚体的前导肽(如对于菌株2996，留下327聚体[SEQ ID 2])。无前导肽的多肽在本文中有时用‘NL’上标区分，例如NadA(NL)或NadA(C)(NL)。
优选的NadA序列与SEQ ID 2有50％或更多同一性(例如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多)。这包括NadA变体(如等位基因变体、同源物、直系同源物、侧向同源物、突变体等)。NadA的等位基因形式示于参考文献18的图9。
其它优选的NadA序列包括至少n个来自SEQ ID 1的连续氨基酸，其中n为7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。优选的片段包括来自NadA的抗原表位。其它优选的片段缺乏1个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)来自SEQ ID 1C末端和/或N末端的氨基酸(如NadA(C)、NadA(NL)、NadA(C)(NL)。当缺失N末端残基时，优选缺失不应去除NadA附于人上皮细胞的能力。SEQ ID 1的优选片段是SEQ ID 2。
易从培养物上清中制备高纯化形式的分泌性NadA，所用方法包括步骤通过超滤浓缩和相对缓冲液渗滤；阴离子柱层析；疏水柱层析；羟磷灰石陶瓷柱层析；相对缓冲液渗滤；滤器消毒。此方法的进一步细节在例子中给出。
NadA优选以寡聚形式使用(如三聚形式)。
741蛋白来自血清组B的‘741’蛋白示于参考文献10(SEQ IDs 2535和2536)且在参考文献6中示为‘NMB1870’(也参见GenBank登录号GI7227128)。血清组A中的对应蛋白[5]具有GenBank登录号7379322。741是天然脂蛋白。
当根据本发明使用时，741蛋白可采用多种形式。优选的741形式是截断或缺失变体，如参考文献14到16所示。特别741的N末端可缺失到和包括其聚甘氨酸序列(即对于菌株MC58，缺失残基1到72[SEQ ID 3])，在本文中有时用‘ΔG’前缀区分。此缺失能提高表达。缺失也去除741的脂化位点。
优选的741序列与SEQ ID 3有50％或更多同一性(例如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多)。这包括741变体(如等位基因变体、同源物、直系同源物、侧向同源物、突变体等)。741的等位基因形式可发现于参考文献16的SEQ IDs 1到22和参考文献19的SEQ IDs 1到23。参考文献20的SEQ IDs 1-299给出更多的741序列。
其它优选的741序列包括至少n个来自SEQ ID 3的连续氨基酸，其中n为7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。优选的片段包括来自741的抗原表位。其它优选的片段缺乏1个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)来自SEQ ID 3C末端和/或N末端的氨基酸。
蛋白741是引起抗脑膜炎球菌抗体反应的极有效抗原，它在所有脑膜炎球菌血清组中表达。系统发育分析显示蛋白分裂成2组，这些分裂中之一再次分裂，产生总共3个变体[21]，尽管抗特定变体培养的血清在相同变体组中是杀菌性的，它对表达另2个变体之一的菌株无活性，即有变体内交叉保护，但没有变体间交叉保护。因此，为了最大交叉菌株效率，组合物优选应包括大于1个蛋白741变体。来自各变体的示范序列在本文的SEQ ID 10、11和12中给出，起始是741脂蛋白形式中脂类共价附着的N末端半胱氨酸残基。
因而，组合物优选应包括下列至少两种(1)第1种蛋白，所含氨基酸序列与SEQ ID 10有至少a％序列同一性和/或所含氨基酸序列由来自SEQ ID 10的至少x个连续氨基酸片段组成；(2)第2种蛋白，所含氨基酸序列与SEQ ID 11有至少b％序列同一性和/或所含氨基酸序列由来自SEQ ID 11的至少y个连续氨基酸片段组成；(3)第3种蛋白，所含氨基酸序列与SEQ ID 12有至少c％序列同一性和/或所含氨基酸序列由来自SEQ ID 12的至少z个连续氨基酸片段组成。
a值至少是85，例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5或更多。b值至少是85，例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5或更多。c值至少是85，例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5或更多。a、b和c值彼此内在不相关。
x值至少是7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。y值至少是7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。z值至少是7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。x、y和z值彼此内在不相关。
任何特定741氨基酸序列优选不属于大于一种类别(1)、(2)和(3)。因此，任何特定741序列仅属于类别(1)、(2)和(3)之一。因而优选蛋白(1)与蛋白(2)有小于i％的序列同一性；蛋白(1)与蛋白(3)有小于j％的序列同一性；蛋白(2)与蛋白(3)有小于k％的序列同一性。i值是60或更多(例如61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90等)且至多是a。j值是60或更多(例如61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90等)且至多是b。k值是60或更多(例如61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90等)且至多是c。i、j、k值彼此内在不相关。
936蛋白来自血清组B的‘936’蛋白示于参考文献10(SEQ IDs 2883和2884)且在参考文献6中示为‘NMB2091’(也参见GenBank登录号GI7227353)。血清组A中的对应基因[5]具有GenBank登录号7379093。
当根据本发明使用时，936蛋白可采用多种形式。优选的936形式是截断或缺失变体，如参考文献14到16中所示。特别是936的N末端前导肽可缺失(即对于菌株MC58，缺失残基1到23[SEQ ID 4])以产生936(NL)。
优选的936序列与SEQ ID 4有50％或更多同一性(例如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多)。这包括变体(如等位基因变体、同源物、直系同源物、侧向同源物、突变体等)。
其它优选的936序列包括至少n个来自SEQ ID 4的连续氨基酸，其中n为7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。优选的片段包括来自936的抗原表位。其它优选的片段缺乏1个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)来自SEQ ID 4C末端和/或N末端的氨基酸。
953蛋白来自血清组B的‘953’蛋白示于参考文献10(SEQ IDs 2917和2918)且在参考文献6中示为‘NMB 1030’(也参见GenBank登录号GI7226269)。血清组A中的对应蛋白[5]具有GenBank登录号7380108。
当根据本发明使用时，953蛋白可采用多种形式。优选的953形式是截断或缺失变体，如参考文献14到16中所示。特别是953的N末端前导肽可缺失(即对于菌株MC58，缺失残基1到19[SEQ ID 5])以产生953(NL)。
优选的953序列与SEQ ID 5有50％或更多同一性(例如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多)。这包括953变体(如等位基因变体、同源物、直系同源物、侧向同源物、突变体等)。953的等位基因形式可见于参考文献12的

图19。
其它优选的953序列包括至少n个来自SEQ ID 5的连续氨基酸，其中n为7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。优选的片段包括来自953的抗原表位。其它优选的片段缺乏1个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)来自SEQ ID 5C末端和/或N末端的氨基酸。
287蛋白来自血清组B的‘287’蛋白示于参考文献10(SEQ IDs 3103和3104)且在参考文献6中示为‘NMB2132’，在参考文献13中示为‘GNA2132’(也参见GenBank登录号GI7227388)。血清组A中的对应蛋白[5]具有GenBank登录号7379057。
当根据本发明使用时，287蛋白可采用多种形式。优选的287形式是截断或缺失变体，如参考文献14到16中所示。287的N末端可缺失到和包括其聚甘氨酸序列(即对于菌株MC58，缺失残基1到24[SEQ ID 6])，在本文中有时用‘ΔG’前缀区分。此缺失能提高表达。
优选的287序列与SEQ ID 6有50％或更多同一性(例如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多)。这包括287变体(如等位基因变体、同源物、直系同源物、侧向同源物、突变体等)。287的等位基因形式可见于参考文献12的图5和15、参考文献10的例子13和图21(SEQ IDs 3179到3184)。
其它优选的287序列包括至少n个来自SEQ ID 6的连续氨基酸，其中n为7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。优选的片段包括来自287的抗原表位。其它优选的片段缺乏1个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)来自SEQ ID 6C末端和/或N末端的氨基酸。
融合蛋白5种抗原作为5种单独蛋白存在于组合物中，但优选至少2种抗原表达为单一多肽链(‘杂合’蛋白[参考文献14到16])，例如5种抗原形成少于5种多肽。杂合蛋白提供2个主要优点首先，通过加入克服问题的合适杂合伴侣来协助本身不稳定或表达差的蛋白；第二，简化商业生产，因为仅需使用1种表达和纯化便于生成2个单独有用的蛋白。
发明组合物中包括的杂合蛋白可包含2种或更多(即2、3、4或5)的5个基本抗原。优选由5个基本抗原中的2种所组成的杂合体。
在5个基本抗原的组合内，抗原可存在于大于1种杂合蛋白和/或作为非杂合蛋白。然而，抗原优选作为杂合体或非杂合体存在，但不是两者，尽管包括蛋白741作为杂合和非杂合(优选脂蛋白)抗原可能有用，特定是当使用超过1种741变体时。
用于发明的二抗原杂合体包括NadA和741；NadA和936；NadA和953；NadA和287；741和936；741和953；741和287；936和953；936和287；953和287。优选的二抗原杂合物包括741和936；953和287。
杂合蛋白可由公式NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH表示，其中X是5个基本抗原之一的氨基酸序列；L是任选的接头氨基酸序列；A是任选的N末端氨基酸序列；B是任选的C末端氨基酸序列；n是2、3、4或5。
如果-X-部分在其野生型形式中有前导肽序列，它可包括或省略于杂合蛋白。在一些实施方案中，将缺失前导肽，除了位于杂合蛋白N末端的-X-部分，即保留X1的前导肽，但省略X2…Xn的前导肽。这相等于缺失所有前导肽并使用X1的前导肽作为-A-部分。
对于各[-X-L-]例子，接头氨基酸序列-L-可存在或缺乏。例如，当n＝2时，杂合体可以是NH2-X1-L1-X2-L2-COOH、NH2-X1-X2-COOH、NH2-X1-L1-X2-COOH、NH2-X1-X2-L2-COOH等。接头氨基酸序列-L-通常短(例如20个或更少氨基酸，即19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括促进克隆的短肽序列、聚甘氨酸接头(即包括Glyn，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)、和组氨酸标志(即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。其它合适接头氨基酸序列对本领域技术人员是显而易见的。有用的接头是GSGGGG(SEQ ID 9)，Gly-Ser二肽从BamHI限制性位点形成，从而协助克隆和操作，(Gly4)四肽是典型的聚甘氨酸接头。如果Xn+1是ΔG蛋白且Ln是甘氨酸接头，这可相等于Xn+1不是ΔG蛋白且缺乏Ln。
-A-是任选的N末端氨基酸序列。它通常短(例如40个或更少氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指导蛋白运输的前导序列或者促进克隆或纯化的短肽序列(如组氨酸标志，即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。其它合适的N末端氨基酸序列对本领域技术人员是显而易见的。如果X1缺乏其自身的N末端甲硫氨酸，-A-优选是提供N末端甲硫氨酸的寡肽(例如有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸)。
-B-是任选的C末端氨基酸序列。它通常短(例如40个或更少氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指导蛋白运输的前导序列、促进克隆或纯化的短肽序列(如包括组氨酸标志，即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)、或提高蛋白稳定性的序列。其它合适的C末端氨基酸序列对本领域技术人员是显而易见的。
最优选n为2。此类型的2种优选蛋白是X1是936且X2是741；X1是287且X2是953。
发明的2种特定优选杂合蛋白如下

这2种蛋白可组合NadA(特定有SEQ ID 2)使用。
易从大肠杆菌表达中制备高纯化形式的936-ΔG741杂合体，所用方法包括步骤匀浆；离心、阳离子柱层析；阴离子柱层析；疏水柱层析；相对缓冲液渗滤和滤器消毒。此方法的进一步细节在例子中给出。
序列发明提供氨基酸序列选自SEQ IDs 1到8的多肽。它也提供氨基酸序列与选自SEQ IDs 1到8的氨基酸序列有序列同一性的多肽。如上所述，序列同一性程度优选超过50％(例如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多)。
发明还提供含脑膜炎奈瑟球菌NadA序列片段的多肽，其中所述片段保留NadA粘附人上皮细胞的能力。因此优选保留全长NadA氨基酸24-87的片段。优选的片段缺乏所述NadA的N末端前导肽和/或所述NadA的C末端膜锚结构域。本发明范围不包括现有技术所示的任何NadA片段，如参考文献16到18所示。参考全长NadA[17]，SEQ ID 1缺乏膜锚结构域，SEQ ID 2缺乏前导肽。
发明也提供编码这种多肽的核酸。此外，发明提供能与此核酸杂交的核酸，优选在“高严格”条件下(如65℃，在0.1xSSC、0.5％SDS溶液中)。
发明的多肽能通过多种方法(如重组表达、从细胞培养物中纯化、化学合成(至少部分)等)和以多种形式(如天然、融合、非糖基化、脂化等)制备。它们优选制成基本纯化的形式(即基本没有其它脑膜炎奈瑟球菌或宿主细胞蛋白)。
根据发明的核酸能以许多方式制备(如通过化学合成(至少部分)、来自基因组或cDNA文库、来自生物体本身等)且可采用多种形式(如单链、双链、载体、探针等)。它们优选制成充分纯化的形式(即几乎没有其它脑膜炎奈瑟球菌或宿主细胞核酸)。
术语“核酸”包括DNA和RNA以及它们的类似物，如含修饰主链(例如硫代磷酸等)以及肽核酸(PNA)等。发明包括所含序列与上述互补的核酸(例如用于反义或探测目的)。
发明也提供生成发明多肽的方法，包括在诱导多肽表达的条件下用发明核酸培养转化的宿主细胞的步骤。
发明提供生成发明多肽的方法，包括通过化学方法合成至少部分多肽的步骤。
发明提供生成发明核酸的方法，包括用基于引物的扩增方法(如PCR)扩增核酸的步骤。
发明提供生成发明核酸的方法，包括通过化学方法合成至少部分核酸的步骤。
菌株发明的优选蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌血清组B中发现的氨基酸序列。在血清组b内，优选的菌株是2996、MC58、95N477和394/98。菌株394/98在本文中有时称为“NZ”，因为它是新西兰菌株。
蛋白287优选来自菌株2996，或更优选来自菌株394/98。
蛋白741优选来自血清组B菌株MC58、2996、394/98或95N477，或来自血清组C菌株90/18311。更优选菌株MC58。
蛋白936、953和NadA优选来自菌株2996。
菌株可作为下标表示，例如741MC58是来自菌株MC58的蛋白741。除非另有说明，本文所示蛋白(例如没有下标)来自脑膜炎奈瑟球菌菌株2996，此菌株可作为‘参考’菌株。然而，要理解发明一般不受菌株限制。如上所示，一般参考蛋白(例如‘287’、‘919’等)可包括来自任何菌株的蛋白。通常，它与2996的序列同一性为90％或更多(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)。
当组合物包括特定蛋白抗原(如741或287)时，组合物能包括大于1种变体形式的抗原，例如来自相同蛋白，但来自超过1种菌株。这些蛋白可作为串联或单独蛋白包括。
当使用杂合蛋白时，杂合体(即个别的-X-部分)内的单独个原可来自1个或多个菌株。例如当n＝2时，X2可来自与X1相同的菌株或来自不同菌株。当n＝3时，菌株可以是(i)X1＝X2＝X3(ii)X1＝X2≠X3(iii)X1≠X2＝X3(iv)X1≠X2≠X3或(v)X1＝X2≠X3等。
高毒性谱系和杀菌抗体反应一般，发明的组合物在施用给受试者后能诱导血清杀菌抗体反应。这些反应易在小鼠中测量且是疫苗功效的标准指示[例如参见参考文献13的尾注14]。血清杀菌活性(SBA)测量补体介导的细菌杀死，能用人或幼兔补体测定。WHO标准要求疫苗在超过90％受体中诱导SBA上升至少4倍。
发明的组合物可诱导抗大于1种血清组B的高毒性谱系的杀菌抗体反应，而不是提供狭窄保护。特别是它们能诱导抗下列3种高毒性谱系中2或3种的杀菌反应(i)簇A4；(ii)ET5复合体和(iii)谱系3。它们可另外诱导杀菌抗体反应，抗1种或多种高毒性谱系亚组I、亚组III、亚组IV-1或ET-37复合体和抗其它谱系如高侵入性谱系。
这不一定意味着组合物能诱导杀菌抗体抗这些高毒性谱系内各个和每一个血清组B脑膜炎奈瑟球菌菌株，而是特定高毒性谱系内4种或更多血清组B脑膜炎奈瑟球菌菌株的任何特定组，组合物诱导的抗体是杀菌性的，抗至少50％(例如60％、70％、80％、90％或更多)组。优选的菌株组包括在至少4个下列国家中分离的菌株大不列颠、澳大利亚、加拿大、挪威、意大利、美国、新西兰、荷兰、比利时和古巴。血清优选具有至少1024的杀菌效价(例如210、211、212、213、214、215、216、217、218或更多，优选至少214)，即当稀释1/1024时，血清能杀死至少50％的特定菌株的测试细菌，如参考文献13所述。
优选的组合物可诱导抗下列血清组B脑膜炎奈瑟球菌菌株的杀菌反应(i)来自簇A4，菌株961-5945(B2bP1.21，16)和/或菌株G2136(B-)；(ii)来自ET-5复合体，菌株MC58(B15P1.7，16b)和/或菌株44/76(B15P1.7，16)；(iii)来自谱系3，菌株394/98(B4P1.4)和/或菌株BZ198(BNT-)。更优选的组合物可诱导抗菌株961-5945、44/76和394/98的杀菌反应。
菌株961-5945和G2136都是奈瑟球菌MLST参考菌株[参考文献22中的ids 638和1002]。菌株MC58广泛可用(例如ATCC BAA-335)且是参考文献6中测序的菌株。菌株44/76广泛使用并鉴定的(例如参考文献23)且是奈瑟球菌MLST参考菌株之一[参考文献22中的id 237；参考文献1中表2的第32行]。菌株394/98最初于1998年在新西兰分离，有一些使用此菌株的发表研究(例如参考文献24和25)。菌株BZ198是另一种奈瑟球菌MLST参考菌株[参考文献22中的id 409；参考文献1中表2的第41行]。
组合物可另外诱导杀菌反应抗血清组W135菌株LNP17592(W1352aP1.5，2)，来自ET-37复合体。这是2000年在法国分离的Haji菌株。
异源宿主尽管发明蛋白的表达可在奈瑟球菌中发生，本发明优选使用异源宿主。异源宿主可以是原核(如细菌)或真核生物。它优选是大肠杆菌，但其它合适的宿主包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)、乳酰胺奈瑟球菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)、分枝杆菌(Mycobacteris)(例如结核分枝杆菌)、酵母等。
因此，发明提供的组合物在施用给受试者后能在该受试者中诱导抗体反应，其中抗体反应杀菌，抗脑膜炎奈瑟球菌血清组B的高毒性谱系A4、ET5和谱系3中的2种或多种(如2或3)，其中产生抗体反应的组合物中的免疫原通过在非奈瑟球菌宿主中重组表达获得。因此，发明组合物中的免疫原优选是重组免疫原。因而优选不包括OMV制品的组合物。
免疫原性组合物和药物发明组合物是免疫原性，更优选是疫苗组合物。根据发明的疫苗可以是预防(即防止感染)或治疗性(即治疗感染)，但通常是预防性。
组合物pH优选在6和8间，优选约7。稳定pH可用缓冲液维持。当组合物包含氢氧化铝盐时，优选使用组氨酸缓冲液[26]。组合物可以是无菌和/或无热原。发明组合物可相对人等渗。
组合物可存在于小瓶中，或它们可存在于易充满的注射器中。提供的注射器可有或没有针。注射器包括单剂量组合物，而小瓶包括单剂量或多剂量。可注射组合物通常是液体溶液或悬浮液。另外，它们可以固体形式存在(例如冷冻干燥)用于液体载体中的溶液或悬浮液，然后注射。
发明的组合物可以单位剂型或多剂型包装。对于多剂型，小瓶优选是预充满的注射器。有效剂量体积能常规确定，但用于注射的典型人剂量的组合物体积为0.5ml。
当发明的组合物在使用前临时制备(如组分以冻干形式存在)和作为试剂盒存在时，试剂盒可包括2个小瓶，或可包括1个易充满的注射器和1个小瓶，注射器的内含物用于在注射前再活化小瓶的内含物。
发明也提供发明组合物用作药物。药物优选能在哺乳动物中产生免疫反应(即它是免疫原性组合物)且更优选是疫苗。
发明同样提供使用发明组合物生产药物，用于在哺乳动物中产生免疫反应。它也提供使用‘NadA’蛋白、‘741’蛋白、‘936’蛋白、‘953’蛋白和‘287’蛋白(和其它任选抗原)生产药物，用于在哺乳动物中产生免疫反应。药物优选是疫苗。
发明也提供在哺乳动物中产生免疫反应的方法，包括施用有效量发明组合物的步骤。免疫反应优选是保护性且优选包括抗体。此方法可引起加强反应。
哺乳动物优选是人。当疫苗用于预防用途时，人优选是儿童(例如学步的小孩或婴儿)；当疫苗用于治疗用途时，人优选是成人。用于儿童的疫苗也可施用给成人，如用于评估安全性、剂量、免疫原性等。
这些使用和方法优选用于预防和治疗奈瑟球菌导致的疾病(例如脑膜炎、败血病、菌血症、淋病等)。优选预防和/或治疗细菌性或脑膜炎球菌性脑膜炎。
一种检查治疗性处理功效的方法包括监控施用发明组合物后的奈瑟球菌感染。一种检查预防性处理功效的方法包括监控施用发明组合物后抗5个基本抗原的免疫反应。能确定发明组合物的免疫原性，通过将它们施用给测试受试者(如12-16个月龄的儿童或动物模型[27])并然后确定标准参数，包括总和高亲合力抗荚膜IgG的血清杀菌抗体(SBA)和ELISA效价(GMT)。这些免疫反应一般在组合物施用后约4周确定，与组合物施用前确定的值相比较。优选SBA增加至少4倍或8倍。当施用超过1个剂量组合物时，可进行大于1次的施用后确定。
优选的发明组合物能赋予病人的抗体效价，效价高于可接受百分比人受试者各抗原成分的血清保护的标准。熟知有相关抗体效价的抗原，在其之上认为宿主是对抗原血清转换的，这种效价由组织如世界卫生组织(WHO)公布。优选大于80％的统计显著性受试者样品发生血清转换，更优选大于90％，更加优选大于93％且最优选96-100％。
发明的组合物一般直接施用给病人。直接传递可伴随肠胃外注射(如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或到组织的间质间隙)，或伴随直肠、口腔、阴道、局部、经皮肤、鼻内、眼睛、耳、肺或其它粘膜施用。优选肌肉内施用到大腿或上臂。注射可经针(例如皮下注射针)，但可另外使用无针的注射。典型的肌肉内剂量是0.5ml。
发明能用于引起全身和/或粘膜免疫。
剂量处理可以是单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初步的免疫方案和/或加强的免疫方案。初步的剂量方案可接着加强的免疫方案。致敏剂量间(例如4-16周间)和致敏与加强间的合适时间选择可常规确定。
奈瑟球菌感染影响身体的多个区域，因此发明的组合物可制成多种形式。例如，组合物可制成注射剂，作为液体溶液或悬浮液。也可制备固体形式，它们适用于注射前液体载体中的溶液或悬浮液(例如冻干的组合物)。可制备组合物用于局部施用，如作为油膏、乳膏或粉末。可制备组合物用于口服施用，如作为片剂或胶囊或作为糖浆(任选调味)。可制备组合物用于肺部施用，如作为吸入剂，使用精细粉末或喷雾。组合物可制成栓剂或阴道栓剂。可制备组合物用于鼻、耳或眼睛施用，如作为喷雾、滴剂、凝胶或粉末[例如参考文献28和29]。已报导成功进行鼻施用肺炎球菌糖[30，31]、肺炎球菌多肽[32]、Hib糖[33]、MenC糖[34]、Hib和MenC糖缀合物的混合物。
用作疫苗的免疫原性组合物包括免疫上有效量的抗原以及所需任何其它成分。‘免疫上有效量’指以单剂量或作为一系列的部分施用给个体的量对治疗或预防有效。此量可变化，取决于待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类组(例如非人的灵长类动物、灵长类动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需保护程度、疫苗制剂、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素。预期量在相对广泛的范围内，范围能通过常规试验确定，每剂量各脑膜炎球菌糖抗原的典型量在1μg和200μg间，例如约1μg、约2.5μg、约4μg、约5μg或约10μg(表示为糖)。
更多的组合物非抗原成分除了以上提到的成分外，发明的组合物通常包括1种或多种‘药学上可接受载体’，药学上可接受载体所包括的载体本身不诱导对接受组合物个体有害的抗体生成。合适的载体一般是大、缓慢代谢的大分子，如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖[36]、海藻糖[37]、乳糖和脂质聚集物(例如油滴或脂质体)。这种载体对本领域普通技术人员熟知。疫苗也可包含稀释剂，如水、盐水、甘油等。另外，可存在辅助物质如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。无菌、无热原的磷酸缓冲生理盐水是典型的载体。关于药学上可接受赋形剂的详尽讨论可获得自参考文献38。
发明的组合物可包括抗菌剂，特别是当以多剂量形式包装时。
发明的组合物可包括去垢剂，例如吐温(聚山梨醇酯)，如吐温80。去垢剂一般以低水平存在，如＜0.01％。
发明的组合物可包括钠盐(例如氯化钠)以产生渗透性。典型浓度为10±2mg/mlNaCl。
发明的组合物一般包括缓冲液。典型是磷酸缓冲液。
发明的组合物可包括糖醇(如甘露醇)或二糖(如蔗糖或海藻糖)，例如约15-30mg/ml(如25mg/ml)，特别是如果它们要冻干或如果它们包括从冻干物质再复原的物质。用于冻干的组合物pH可调至约6.1，然后冻干。
发明的疫苗可结合免疫调节剂施用。尤其是，组合物通常包括佐剂。可用于发明组合物的佐剂包括但不限于A.含矿物质的组合物含矿物质的组合物适合用作发明佐剂，包括无机盐，如铝盐和钙盐。发明包括无机盐如氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如羟磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[例如参见参考文献39的第8和9章]或不同无机化合物的混合物，化合物采用任何合适的形式(例如凝胶、晶体、无定形等)，优选吸收。含矿物质的组合物可制成金属盐的颗粒[40]。
特别优选磷酸铝，特别在包括流感嗜血杆菌糖抗原的组合物中，典型佐剂是无定形羟磷酸铝，PO4/Al摩尔比在0.84和0.92间，包括0.63mg Al3+/ml。可使用低剂量磷酸铝的吸收，例如50到100μg Al3+每缀合物每剂量。当组合物中有大于1种缀合物时，不是所有缀合物都需吸收。
B.油乳剂适合用作发明佐剂的油乳剂组合物包括鲨烯-水乳剂，如MF59[参考文献39的第10章；也参见参考文献41](5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％Span 85，用微流化机制成亚微米颗粒)。也可使用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。
C.皂苷制剂[参考文献39的第22章]皂苷制剂也能用作发明的佐剂。皂苷是甾醇糖苷和三萜糖苷的异种组，在广范围的植物种类的树皮、叶、茎干、根和甚至花中发现。来自皂树(Quillaiasaponaria)Molina树皮的皂苷作为佐剂已广泛研究。皂苷也能商业获得自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(brides veil)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21以及脂质制剂如ISCOMs。QS21以StimulonTM出售。
皂苷制剂用HPLC和RP-HPLC纯化。鉴定了使用这些技术的特定纯化部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选是QS21。生成QS21的方法示于参考文献42。皂苷制剂也可包括甾醇，如胆固醇[43]。
皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合体(ISCOMs)的独特颗粒[参考文献39的第23章]。ISCOMs通常也包括磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷可用于ISCOMs。ISCOM优选包括1种或多种QuilA、QHA和QHC。ISCOMs进一步描述于参考文献43-45。ISCOMs任选可缺乏另外的去垢剂[46]。
开发以皂苷为基础的佐剂的综述可发现于参考文献47和48。
D.病毒体和病毒样颗粒病毒体和病毒样颗粒(VLPs)也可用作发明的佐剂。这些结构一般包含1种或多种来自病毒的蛋白，病毒任选结合磷脂或用磷脂制成。它们通常不致病、不复制且一般不包含任何天然病毒基因组。病毒蛋白可从完整病毒中重组生成或分离。这些适用于病毒体或VLPs的病毒蛋白包括获得自流感病毒(如HA或NA)、乙肝病毒(如核心或衣壳蛋白)、戊型肝炎病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺沃克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体(如外被蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(如反转录转座子Ty蛋白p1)的蛋白。VLPs进一步讨论于参考文献49-54。病毒体进一步讨论于例如参考文献55。
E.细菌或微生物衍生物适合用于发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，如肠细菌脂多糖(LPS)的非毒性衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素和其去毒衍生物。
LPS的非毒性衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰MPL(3d MPL)。3dMPL是3-O-脱酰单磷酰脂质A与4、5或6条酰化链的混合物。3-O-脱酰单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式示于参考文献56。这种“小颗粒”3d MPL小到足以经0.22μm膜无菌过滤[56]。其它非毒性LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，如氨烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物，例如RC-529[57，58]。
脂质A衍生物包括来自大肠杆菌的脂质A衍生物，如OM-174。OM-174描述于例如参考文献59和60。
适合用作发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序(二核苷酸序列，含通过磷酸键连接鸟苷的未甲基化胞嘧啶)的核苷酸序列。含回文或聚(dG)序列的双链RNAs和寡核苷酸也显示是免疫刺激性的。
CpG可包括核苷酸修饰/类似物如硫代磷酸修饰且可以是双链或单链。参考文献61、62和63揭示可能的类似物取代，如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。CpG寡核苷酸的佐剂效果进一步讨论于参考文献64-69。
CpG序列可引向TLR9，如基序GTCGTT或TTCGTT[70]。CpG序列可对诱导Th1免疫反应特异，如CpG-A ODN，或它可对诱导B细胞反应更特异，如CpG-BODN。CpG-A和CpG-B ODN讨论于参考文献71-73。CpG优选是CpG-A ODN。
优选构成CpG寡核苷酸，使5’末端易接受受体识别。2种CpG寡核苷酸序列可任选在其3’末端附着以形成“免疫聚体”(immunomers)。参见例如参考文献70和74-76。
细菌ADP-核糖基化毒素和其去毒衍生物可用作发明的佐剂。蛋白优选获得自大肠杆菌(大肠杆菌热不稳定性肠毒素“LT”)、霍乱(“CT”)或百日咳(“PT”)。使用去毒ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂描述于参考文献77且用作肠胃外佐剂描述于参考文献78。毒素或类毒素优选以全毒素形式，包括A和B亚基。A亚基优选包含去毒突变；B亚基优选不突变。佐剂优选是去毒LT突变体，如LT-K63、LT-R72和LT-G192。使用ADP-核糖基化毒素和其去毒衍生物特定是LT-K63和LT-R72作为佐剂可发现于参考文献79-86。关于氨基酸取代的数字参考优选基于参考文献87所列ADP-核糖基化毒素的A和B亚基排列，参考文献87特别地全部纳入本文供参考。
F.人免疫调节剂适合用作发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[88]等)[89]、干扰素(例如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。
G.生物粘合剂和粘膜粘合剂生物粘合剂和粘膜粘合剂也可用作发明的佐剂。合适的生物粘合剂包括酯化透明质酸微球体[90]或粘膜粘合剂如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。壳聚糖和其衍生物也可用作发明的佐剂[91]。
H.微粒微粒也可用作发明的佐剂。优选从可生物降解和非毒性物质(如聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等)材料形成的微粒(即～100nm到～150nm直径的颗粒，更优选～200nm到～30μm直径，最优选～500nm到～10μm直径)，优选具有聚交酯聚乙交酯共聚物，任选处理的以具有带负电的表面(例如用SDS)或带正电的表面(例如用阳离子去垢剂，如CTAB)。
I.脂质体(参考文献39的第13和14章)适合用作佐剂的脂质体制剂的例子描述于参考文献92-94。
J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂适用于发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[95]。这种制剂进一步包括组合辛苯昔醇的聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性剂[96]以及组合至少1种另外非离子表面活性剂如辛苯昔醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂[97]。优选的聚氧乙烯醚选自下列组聚氧乙烯-9-月桂醚(laureth9)、聚氧乙烯-9-硬脂基醚、聚氧乙烯-8-硬脂基醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。
K.聚磷腈(PCPP)PCPP制剂描述于例如参考文献98和99。
L.胞壁酰肽适合用作发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。
M.咪唑喹诺酮(imidazoquinolone)化合物适合用作发明佐剂的咪唑酮化合物的例子包括咪喹莫特和其同源物(例如“瑞喹莫德3M”)，它们进一步描述于参考文献100和101。
发明也可包括1种或多种上面鉴定的佐剂的组合。例如，下列佐剂组合物能用于发明(1)皂苷和水包油乳剂[102]；(2)皂苷(例如QS21)+非毒性LPS衍生物(例如3dMPL)[103]；(3)皂苷(例如QS21)+非毒性LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+甾醇)[104]；(5)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂的组合[105]；(6)SAF，含10％鲨烯、0.4％吐温80TM、5％pluronic-嵌段共聚物L121和thr-MDP，微流化成亚微米乳剂或涡旋产生较大粒度乳剂；(7)RibiTM佐剂体系(RAS)(Ribi Immunochem)，含2％鲨烯、0.2％吐温80和1种或多种来自单磷酰脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸(TDM)和细胞壁骨架(CWS)的细菌细胞壁成分，优选MPL+CWS(DetoxTM)；(8)1种或多种无机盐(如铝盐)+非毒性LPS衍生物(如3dMPL)。
其它用作免疫刺激剂的物质示于参考文献39的第7章。
特别优选使用氢氧化铝或磷酸铝佐剂，抗原一般吸附于这些盐。如果组合物包括Hib抗原，优选避免氢氧化铝作为佐剂。当使用氢氧化铝且不需要抗原吸附于佐剂上时，这通过溶液中包含游离磷酸离子来促进(例如用磷酸缓冲液)。防止吸收也能通过选择抗原/佐剂混合期间的正确pH、具有合适零电荷点的佐剂、组合物中混合不同抗原的适当顺序来获得[106]。
磷酸钙是另一种优选佐剂。
更多的抗原发明的组合物包含5个基本脑膜炎球菌蛋白抗原。它们也能进一步包括更多的抗原，尽管它可不包含除了5个基本抗原的脑膜炎球菌蛋白抗原。包括的更多抗原可以是例如-来自流感嗜血杆菌B的糖抗原。
-来自脑膜炎奈瑟球菌血清组A、C、W135和/或Y的糖抗原，如参考文献107所示来自血清组C的寡糖或参考文献108的寡糖。
-来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖抗原[例如155，156，157]。
-来自甲肝病毒的抗原，如灭活病毒[例如109，110]。
-来自乙肝病毒的抗原，如表面和/或核心抗原[例如110，111]。
-白喉抗原，如白喉类毒素[例如参考文献112的第3章]，例如CRM197突变体[如113]。
-破伤风抗原，如破伤风类毒素[例如参考文献112的第4章]。
-来自百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的抗原，如来自百日咳博德特氏菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，任选也组合百日咳粘附素(pertactin)和/或凝集原2和3[例如参考文献114和115]。可使用细胞百日咳抗原。
-来自脑膜炎奈瑟球菌血清组B的外膜囊泡(OMV)制品，如参考文献4、116、117、118等所示。
-脊髓灰质炎抗原[例如119，120]，如OPV或优选IPV。
组合物可包括1种或多种这些更多的抗原。抗原通常各以至少1μg/ml的浓度存在。一般，任何特定抗原的浓度足以引起抗该抗原的免疫反应。单独糖抗原的保护功效优选不被结合它们而去除，尽管实际免疫原性(如ELISA效价)可能降低。
当组合物中包括白喉抗原时，优选也包括破伤风抗原和百日咳抗原。类似地，当包括破伤风抗原时，优选也包括白喉和百日咳抗原。类似地，当包括百日咳抗原时，优选也包括白喉和破伤风抗原。这种DTP组合可用于重建冻于缀合物。
当使用糖或碳水化合物抗原时，它优选缀合载体蛋白以提高免疫原性(见下)。
有毒蛋白抗原必要时可去毒(例如通过化学和/或遗传学方法使百日咳毒素去毒[115])。
除了在发明组合物中使用蛋白抗原外，可使用编码抗原的核酸[例如参考文献121到129]。因此，发明组合物的蛋白成分能用编码蛋白的核酸(优选DNA，如以质粒的形式)取代。类似地，发明组合物可包括模拟糖抗原如模拟表位[130]或抗独特型抗体。它们可取代单独糖成分，或能补充它们。例如，疫苗可包括MenC[131]或MenA[132]荚膜多糖的肽模拟物取代糖本身。
特别优选的发明组合物包括1、2或3种(a)来自脑膜炎球菌血清组Y、W135、C和(任选)A的糖抗原；(b)来自流感嗜血杆菌B型的糖抗原；和/或(c)来自肺炎链球菌的抗原。特别优选含血清组B抗原和Hib缀合物的组合物。
脑膜炎球菌血清组Y、W135、C和(任选)A如上所示，抗血清组A、C、W135和Y的多糖疫苗已知多年。这些疫苗(MENCEVAX ACWYTM和MENOMUNETM)以生物体荚膜多糖为基础，尽管它们在青少年和成人中有效，它们的免疫反应差且保护持续时间短，它们不能用于婴儿。
与这些疫苗中的未缀合多糖抗原相反，最近批准的血清组C疫苗(MenjugateTM[133，107]、MeningitecTM和NeisVac-CTM)包括缀合糖。MenjugateTM和MeningitecTM有缀合CRM197载体的寡糖抗原，而NeisVac-CTM使用缀合破伤风类毒素载体的完整多糖(O-脱酰的)。
本发明组合物优选包括来自1种或多种脑膜炎球菌血清组Y、W135、C和(任选)A的荚膜糖抗原，其中抗原缀合载体蛋白和/或抗原是寡糖。
每剂量各脑膜炎球菌糖抗原的典型量在1μg和200μg间，例如约1μg、约2.5μg、约4μg、约5μg或约10μg(表示为糖)。
当混合物包括来自血清组A和C的荚膜糖时，MenA糖∶MenC糖的比例(w/w)可大于1(例如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1、或更多)。当混合物包括来自血清组Y以及血清组C和W135之一或两者的荚膜糖时，MenY糖∶MenW135糖的比例(w/w)可大于1(例如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1、或更多)和/或MenY糖∶MenC糖的比例(w/w)可小于1(例如1∶2、1∶3、1∶4、1∶5或更低)。来自血清组A∶C∶W135∶Y的糖的优选比例(w/w)是1∶1∶1∶1；1∶1∶1∶2；2∶1∶1∶1；4∶2∶1∶1；8∶4∶2∶1；4∶2∶1∶2；8∶4∶1∶2；4∶2∶2∶1；2∶2∶1∶1；4∶4∶2∶1；2∶2∶1∶2；4∶4∶1∶2和2∶2∶2∶1。来自血清组C∶W135∶Y的糖的优选比例(w/w)是1∶1∶1；1∶1∶2；1∶1∶1；2∶1∶1；4∶2∶1；2∶1∶2；4∶1∶2；2∶2∶1和2∶1∶1。优选使用基本等质量的各糖。
荚膜糖一般用于寡糖形式。它们易形成，通过断裂纯化的荚膜多糖(如水解)，通常接着是纯化所需大小的片段。
优选进行多糖断裂以产生小于30的寡糖中最终平均聚合度(DP)(如对于血清组A在10和20间，优选约10；对于血清组W135和Y在15和25间，优选约15-20；对于血清组C在12和22间；等等)。DP易通过离子交换层析或比色测定来测量。
如果进行水解，水解产物一般是尺寸以取出长度短的寡糖[135]。这能用多种方式完成，如超滤，接着是离子交换层析。对于血清组A，优选取出聚合度小于或等于约6的寡糖，对于血清组W135和Y，优选取出小于约4的寡糖。
优选的MenC糖抗原示于参考文献133，如MenjugateTM所用。
糖抗原可化学修饰。这特定用于减少血清组A的水解[136；见下]。可进行脑膜炎球菌糖的O-脱酰。对于寡糖，修饰可在解聚之前或之后发生。
当发明的组合物包括MenA糖抗原时，抗原优选是修饰糖，其中天然糖上的1个或多个羟基由阻断基团取代[136]。此修饰改善对水解的抗性，意味着血清组A抗原可保存于和用于液体制剂，而不需要冻干。
有阻断基团的单糖单位数可变化。例如，所有或大体所有单糖单位可具有阻断基团。另外，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％单糖单位可具有阻断基团。至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个单糖单位可具有阻断基团。
同样，单糖单位上的阻断基团数可变化。例如，单糖单位上的阻断基团数可以是1或2。阻断基团一般是在单糖单位的4位置和/或3位置。
末端单糖单位可以或可没有阻断基团来取代其天然羟基。优选在末端单糖单位上保留游离异头羟基以提供进一步反应(例如缀合)的柄。异头羟基可通过还原胺化(使用例如NaBH3CN/NH4Cl)转变成氨基(-NH2-或-NH-E，其中E是氮保护基团)，然后可在其它羟基转变成阻断基团后再生。
取代羟基的阻断基团可直接接近，通过羟基的衍化反应，即羟基的氢原子由另一基团取代。作为阻断基团的合适羟基衍生物是例如氨基甲酸盐、磺酸盐、碳酸盐、酯、醚(例如硅烷基醚或烷基醚)和缩醛。这种阻断基团的一些特定例子是烯丙基、Aloc、苄基、BOM、t-丁基、三苯甲基、TBS、TBDPS、TES、TMS、TIPS、PMB、MEM、MOM、MTM、THP等。其它不能直接接近以及完全取代羟基的阻断基团包括C1-12烷基、C3-12烷基、C5-12芳基、C5-12芳基-C1-6烷基、NR1R2(R1和R2在下列段落中定义)、H、F、Cl、Br、CO2H、CO2(C1-6烷基)、CN、CF3、CCl3等。优选的阻断基团是吸电子基团。
优选的阻断基团具有公式-O-X-Y或-OR3，其中X是C(O)、S(O)或SO2；Y是C1-12烷基、C1-12烷氧基、C3-12环烷基、C5-12芳基或C5-12芳基-C1-6烷基，各自可任选用1、2或3个独立选自F、Cl、Br、CO2H、CO2(C1-6烷基)、CN、CF3或Cl3的基团取代；或Y是NR1R2；R1和R2独立选自H、C1-12烷基、C3-12环烷基、C5-12芳基、C5-12芳基-C1-6烷基；或R1和R2可连接以形成C3-12饱和杂环基团；R3是C1-12烷基或C3-12环烷基，各自可任选用1、2或3个独立选自F、Cl、Br、CO2(C1-6烷基)、CN、CF3或CCl3的基团取代；或R3是C5-12芳基或C5-12芳基-C1-6烷基，各自可任选用1、2、3、4或5个选自F、Cl、Br、CO2H、CO2(C1-6烷基)、CN、CF3或Cl3的基团取代。当R3是C1-12烷基或C3-12环烷基时，它通常用1、2或3个上面定义的基团取代。当R1和R2连接以形成C3-12饱和杂环基团时，意味着R1和R2与氮原子一起形成饱和杂环基团，含3到12间任意数量的碳原子(例如C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12)。除了氮原子，杂环基团可包含1或2个杂原子(如N、O或S)。C3-12饱和杂环基团的例子是吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、咪唑烷基、氮杂环丁烷基和吖丙啶基。
阻断基团-O-X-Y和-OR3能制备自-OH基团，通过标准衍生程序如羟基与酰基卤、烷基卤、磺酰卤等反应。因此，-O-X-Y中的氧原子优选是羟基的氧原子，而-O-X-Y中的-X-Y基团优选取代羟基的氢原子。
另外，阻断基团可经取代反应接近，如Mitsonobu-型取代。这些和其它从羟基制备阻断基团的方法是熟知的。
阻断基团更优选是-OC(O)CF3[137]，或是氨基甲酸盐基团-OC(O)NR1R2，其中R1和R2独立选自C1-6烷基。R1和R2更优选都是甲基，即阻断基团是-OC(O)NMe2。氨基甲酸盐阻断基团对糖苷键有稳定作用且能在温和条件下制备。
优选的修饰MenA糖包含n个单糖单位，其中至少h％单糖单位在3位和4位都没有-OH基团。h值是24或更多(例如25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、98、99或100)且优选是50或更多。缺乏的-OH基团优选是上面定义的阻断基团。
其它优选的修饰MenA糖包括单糖单位，其中至少s单糖单位在3位没有-OH和在4位没有-OH。s值至少为1(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90)。缺乏的-OH基团优选是上面定义的阻断基团。
用于发明的合适修饰MenA糖具有公式 其中n是1到100的整数(优选15到25的整数)；T具有公式(A)或(B) 各Z基团独立选自OH或上面定义的阻断基团；和各Q基团独立选自OH或上面定义的阻断基团；
Y选自OH或上面定义的阻断基团；E是H或氮保护基团；其中大于约7％(例如8％、9％、10％或更多)的Q基团是阻断基团。
各n+2Z基团彼此可相同或不同。同样，各n+2Q基团彼此可相同或不同。所有Z基团可以是OH。另外，至少10％、20％、30％、40％、50％或60％Z基团可以是OAc。优选约70％Z基团是OAc，剩余Z基团是OH或上面定义的阻断基团。至少约7％Q基团是阻断基团。优选至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至100％Q基团是阻断基团。
优选的发明组合物可在37℃保存28天，此阶段后，小于f％初始总量的缀合MenA糖将非缀合，其中f是20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或更低。
通常制备脑膜炎球菌荚膜多糖的方法包括步骤多糖沉淀(例如用阳离子去垢剂)、乙醇分级分离、冷酚抽提(以去除蛋白)和超离心(以去除LPS)[例如参考文献138]。然而，更优选的方法包括多糖沉淀，接着用低级醇溶解沉淀的多糖。沉淀可用阳离子去垢剂完成，如四丁基铵和鲸蜡基三甲基铵盐(例如溴盐)或海美溴铵和豆蔻基三甲基铵盐。特别优选鲸蜡基三甲基溴化铵(‘CTAB’)[139]。溶解沉淀物质用低级醇完成，如甲醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-2-丙醇、二醇等，但乙醇特别适合溶解CTAB-多糖复合体。优选加入乙醇到沉淀的多糖以使终浓度(以乙醇和水的总含量为基础)在50％和95％间。
再溶解后，可进一步处理多糖以去除污染物。这在即使较少污染物也不能接受的情况(如用于人疫苗生产)中特别重要。它通常包括1个或多个过滤步骤，例如可使用深度过滤、经活性炭过滤、大小过滤和/或超滤。一旦过滤到去除污染物时，可沉淀多糖用于进一步处理和/或加工。这易通过阳离子交换完成(例如通过加入钙或钠盐)。
除了纯化外，本发明的荚膜糖可通过全或部分合成获得，例如示于参考文献140的Hib合成和示于参考文献141的MenA合成。
发明的组合物包括来自至少2个脑膜炎奈瑟球菌血清组的荚膜糖。糖优选单独制备(包括任何断裂、缀合、修饰等)并然后混合以产生发明的组合物。
然而，当组合物包括来自血清组A的荚膜糖时，血清组A糖优选不结合其它糖直到使用之前不久，用于将水解可能降到最低。这易完成，通过使血清组A成分(通常与适当赋形剂一起)处于冻干形式和使其它血清组成分处于液体形式(也有适当赋形剂)，准备使用时液体成分用于重建MenA成分。当使用铝盐佐剂时，优选包括佐剂于含液体疫苗的小瓶中并冻干无佐剂的MenA成分。
因此，发明的组合物可从试剂盒制备，试剂盒包括(a)来自脑膜炎奈瑟球菌血清组A的荚膜糖，以冻干形式；(b)更多来自组合物的抗原，以液体形式。发明也提供制备发明组合物的方法，包括混合来自脑膜炎奈瑟球菌血清组A的荚膜糖与更多抗原，其中所述更多抗原是以液体形式。
发明也提供一种试剂盒，试剂盒包括(a)第1个容器，含来自2个或多个脑膜炎奈瑟球菌血清组C、W135和Y的荚膜糖，都以冻干形式；(b)第2个容器，含液体形式的(i)组合物，施用给受试者后能在该受试者中诱导抗体反应，其中抗体反应杀菌，抗脑膜炎奈瑟球菌血清组B的高毒性谱系A4、ET-5和谱系3中的2个或多个(如2或3)，(ii)来自非或1个脑膜炎奈瑟球菌血清组C、W135和Y的荚膜糖，任选(iii)更多不包括脑膜炎奈瑟球菌荚膜糖的抗原(见下)，其中通过容器(b)的内含物重建容器(a)的内含物来提供发明组合物。
在各剂量内，单独糖抗原量一般在1-50μg间(作为糖质量测量)，各优选约为2.5μg、5μg或10μg。A∶C∶W135∶Y重量比例为1∶1∶1∶1；1∶1∶1∶2；2∶1∶1∶1；4∶2∶1∶1；8∶4∶2∶1；4∶2∶1∶2；8∶4∶1∶2；4∶2∶2∶1；2∶2∶1∶1；4∶4∶2∶1；2∶2∶1∶2；4∶4∶1∶2和2∶2∶2∶1，因此，图1所示量优选约为2.5μg、5μg或10μg。因而，对于1∶1∶1∶1比例的A∶C∶W∶Y组合物和10μg每糖，施用40μg糖每剂量。优选的组合物具有大约下列μg糖每剂量

优选的发明组合物包括小于50μg的脑膜炎球菌糖每剂量。其它优选组合物包括≤40μg脑膜炎球菌糖每剂量。另外的优选组合物包括≤30μg脑膜炎球菌糖每剂量。其它优选组合物包括≤25μg脑膜炎球菌糖每剂量。另外的优选组合物包括≤20μg脑膜炎球菌糖每剂量。其它优选组合物包括≤10μg脑膜炎球菌糖每剂量，但发明的组合物理想上包括至少10μg脑膜炎球菌糖每剂量。
MenjugateTM和NeisVacTMMenC缀合物使用氢氧化物佐剂，而MeningitecTM使用磷酸盐。在发明的组合物中，可能一些抗原吸附于氢氧化铝，但其它抗原与磷酸铝相联。对于例如四价血清组组合，可得到下列排列

对于三价脑膜炎奈瑟球菌血清组组合，可得到下列排列

流感嗜血杆菌b型当组合物包括流感嗜血杆菌B型抗原时，它通常是Hib荚膜糖抗原。来自流感嗜血杆菌的糖抗原是熟知的。
有利的是，Hib糖与载体蛋白共价缀合以提高其免疫原性，尤其是在儿童中的免疫原性。一般多糖缀合物制备和特定Hib荚膜多糖制备在文献中详细记载[例如参考文献142到150等]。发明可使用任何合适的Hib缀合物。合适载体蛋白描述于下，用于Hib糖的优选载体是CRM197(‘HbOC’)、破伤风类毒素(‘PRP-T’)和脑膜炎奈瑟球菌的外膜复合体(‘PRP-OMP’)。
缀合物的糖部分可以是多糖(例如全长磷酸多核糖基核糖醇(PRP))，但优选水解多糖以形成寡糖(例如MW从～1到～5kDa)。
优选的缀合物包括Hib寡糖，经己二酸接头共价连接CRM197[151，152]。破伤风类毒素也是优选载体。
施用Hib抗原优选使抗PRP抗体浓度≥0.15μg/ml，更优选≥1μg/ml。
发明的组合物可包括大于1个Hib抗原。
当组合物包括Hib糖抗原时，它优选也不包括氢氧化铝佐剂。如果组合物包括磷酸铝佐剂，则Hib糖抗原可吸附于佐剂[153]或可以不吸收[154]。
Hib抗原能冻干，例如与脑膜炎球菌抗原一起。
肺炎链球菌当组合物包括肺炎链球菌抗原时，它通常是荚膜糖抗原，此抗原优选与载体蛋白缀合[例如参考文献155到157]。优选包括来自多于1种肺炎链球菌血清型的糖。例如，广泛使用来自23种不同血清型的多糖混合物，有来自5到11种不同血清型的多糖的缀合疫苗也广泛使用[158]。例如，PrevNarTM[159]包含来自7种血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)的抗原，各糖通过还原胺化单独缀合CRM197，用2μg各糖每0.5ml剂量(4μg血清型6B)，缀合物吸附于磷酸铝佐剂上。发明的组合物优选包括至少血清型6B、14、19F和23F。缀合物可吸附于磷酸铝上。
除了使用来自肺炎球菌的糖抗原外，组合物可包括1种或多种多肽抗原。一些肺炎球菌菌株的基因组序列是有用的[160，161]并能经受反向疫苗学[162-165]以鉴定合适的多肽抗原[166，167]。例如，组合物可包括1种或多种下列抗原PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130和Sp130，如参考文献168所定义。组合物可包括多于1种(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14)的这些抗原。
在一些实施方案中，组合物可包括来自肺炎球菌的糖和多肽抗原。这些能用于简单混合物，或肺炎球菌糖抗原可缀合肺炎球菌蛋白。这些实施方案的合适载体蛋白包括前面段落中所列抗原[168]。
肺炎球菌抗原可冻干，例如与脑膜炎球菌和/或Hib抗原一起。
共价缀合发明组合物中的荚膜糖通常缀合载体蛋白。一般，缀合提高糖的免疫原性，因为它使它们从T-不依赖性抗原转变成T-依赖性抗原，因而能刺激免疫记忆。缀合特定用于儿科疫苗且是熟知的技术[如参考文献169和142-150所综述]。
优选的载体蛋白是细菌毒素或类毒素，如白喉类毒素或破伤风类毒素。特别优选CRM197白喉类毒素[170-172]。其它合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[173]、合成肽[174，175]、热激蛋白[176，177]、百日咳蛋白[178，179]、细胞因子[180]、淋巴因子[180]、激素[180]、生长因子[180]、人工蛋白，含多个来自不同病原体衍生抗原的人CD4+T细胞抗原表位[181]、来自流感嗜血杆菌的蛋白D[182，183]、肺炎球菌表面蛋白PspA[184]、铁吸收蛋白[185]、来自艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[186]等。优选的载体是白喉类毒素、破伤风类毒素、流感嗜血杆菌蛋白D和CRM197。
在发明的组合物内，可能使用多于1种的载体蛋白，例如用于降低载体抑制风险。因此，不同载体蛋白可用于不同血清组，例如血清组A糖可能缀合CRM197，而血清组C糖可能缀合破伤风类毒素。也可能使用多于1种的载体蛋白用于特定糖抗原，例如血清组A糖可能在2组中，一些缀合CRM197，其它的缀合破伤风类毒素。然而，一般优选对所有糖使用相同载体蛋白。
单一载体蛋白可携带多于1种的糖抗原[187]。例如，单一载体蛋白可缀合其来自血清组A和C的糖。为达到此目标，糖能在缀合反应前混合。然而，一般优选各血清组有单独缀合物。
优选糖∶蛋白比例(w/w)在1∶5(即过量蛋白)和5∶1(即过量糖)间的缀合物。优选1∶2和5∶1间的比例，更优选1∶1.25和1∶2.5间的比例。过量载体蛋白优选用于MenA和MenC。
缀合物可用于缀合游离载体蛋白[188]。当特定载体蛋白在游离和缀合形式的发明组合物中都存在时，未缀合形式优选大体上不超过5％的组合物中载体蛋白总量，更优选以小于2％重量存在。
可使用任何合适的缀合反应，必要时可有任意合适的接头。
糖一般在缀合前活化或功能化。活化可包括例如氰化剂(cyanylating)如CDAP(如1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐[189，190等])。其它合适技术使用碳化二亚胺、酰肼、活性酯、去甲硼烷(norborane)、p-硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU；也参见参考文献148的导言)。
经接头基团连接可用任何已知方法进行，例如参见参考文献191和192所述方法。一类连接包括还原胺化多肽，偶联所得氨基与己二酸接头基团的一末端，然后偶联蛋白到己二酸接头基团的另一末端[146，193，194]。其它接头包括B-丙酰胺基[195]、硝基苯基-乙胺[196]、卤酰基卤化物(haloacyl halides)[197]、糖苷键[198]、6-氨基己酸[199]、ADH[200]、C4到C12部分[20]等。除了使用接头外，可使用直接连接。直接连接蛋白可包括氧化多糖，接着与蛋白还原胺化，如参考文献202和203所述。
优选的方法包括引入氨基到糖(如通过用-NH2取代末端＝O基团)中，接着用己二酸二酯(例如己二酸N-羟基琥珀酰亚胺基二酯)衍生。优选与载体蛋白反应。另一种优选反应使用具有蛋白D载体的CDAP活化，例如用于MenA或MenC。
缀合后，可分离游离和缀合的糖。有许多合适的方法，包括疏水层析、切向超滤、渗滤等[也参见参考文献204和205等]。
当发明的组合物包括缀合寡糖时，优选寡糖制备先于缀合。
更多和另外的血清组B多肽抗原发明提供的组合物在施用给受试者后能在该受试者中诱导抗体反应，其中抗体反应杀菌，抗脑膜炎奈瑟球菌血清组B的高毒性谱系A4、ET-5和谱系3中的2个或多个。
尽管NadA、741、936、953和287是获得此广泛保护的优选抗原，发明组合物中可包括的其它MenB多肽抗原(任选组合1种或多种5个基本抗原)包含具有下列氨基酸序列的抗原来自参考文献8的SEQ ID NO650；来自参考文献8的SEQID NO878；来自参考文献8的SEQ ID NO884；来自参考文献9的SEQ ID NO4；来自参考文献10的SEQ ID NO598；来自参考文献10的SEQ ID NO818；来自参考文献10的SEQ ID NO864；来自参考文献10的SEQ ID NO866；来自参考文献10的SEQ ID NO1196；来自参考文献10的SEQ ID NO1272；来自参考文献10的SEQ ID NO1274；来自参考文献10的SEQ ID NO1640；来自参考文献10的SEQ ID NO1788；来自参考文献10的SEQ ID NO2288；来自参考文献10的SEQ ID NO2466；来自参考文献10的SEQ ID NO2554；来自参考文献10的SEQ ID NO2576；来自参考文献10的SEQ ID NO2606；来自参考文献10的SEQID NO2608；来自参考文献10的SEQ ID NO2616；来自参考文献10的SEQ IDNO2668；来自参考文献10的SEQ ID NO2780；来自参考文献10的SEQ IDNO2932；来自参考文献10的SEQ ID NO2958；来自参考文献10的SEQ IDNO2970；来自参考文献10的SEQ ID NO2988，或多肽，多肽包括的氨基酸序列(a)与所述序列有50％或更多同一性(例如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多)和/或(b)包括来自所述序列至少n个连续氨基酸的片段，其中n为7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。用于(b)的优选片段包括来自相关序列的抗原表位。可包括大于1种(例如2、3、4、5、6)的这些多肽。
综合术语“包含”指“包含”以及“由…组成”，例如“包含”X的组合物可由X唯一组成或包括另外成分，例如X+Y。
涉及数值x的术语“约”指例如x±10％。
单词“基本上”不排除“完全”，例如，“基本没有”Y的组合物可完全没有Y。必要时，单词“基本上”可从发明定义中省略。
关于2种氨基酸序列间的百分比序列同一性，是指排列时，比较2种序列中氨基酸百分比是相同的。此排列和百分比同源性或序列同一性可用本领域已知软件程序确定，如参考文献206的7.7.18部分所述。优选的排列通过Smith-Waterman同源性搜索算法确定，使用仿射间隙搜索，间隙开放罚分为12且间隙延伸罚分为2，BLOSUM矩阵为62。Smith-Waterman同源性搜索算法教授于参考文献207。
术语“烷基”指直和分支形式的烷基。烷基能用1、2或3个杂原子间断，杂原子选自-O-、-NH-或-S-。烷基也能用1、2或3个双和/或三键间断。然而，术语“烷基”通常指没有杂原子间断或双或三键间断的烷基。当提及C1-12烷基时，烷基可包含1到12间任意数量的碳原子(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12)。类似地，当提及C1-6烷基时，烷基可包含1到6间任意数量的碳原子(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6)。
术语“环烷基”包括环烷基、聚环烷基和环链烯基以及这些与烷基的组合，如环烷基烷基。环烷基能用1、2或3个杂原子间断，杂原子选自-O-、-NH-或-S-。然而，术语“环烷基”通常指没有杂原子间断的环烷基。环烷基的例子包括环戊基、环己基、环己烯基、环己基甲基和金刚烷基。当提及C3-12环烷基时，环烷基可包含3到12间任意数量的碳原子(例如C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12)。
术语“芳基”指芳族基，如苯基或萘基。当提及C5-12芳基时，芳基可包含5到12间任意数量的碳原子(例如C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12)。
术语“C5-12芳基-C1-6烷基”指基团如苄基、苯乙基和萘甲基。
氮保护基团包括甲硅烷基(如TMS、TES、TBS、TIPS)、酰基衍生物(如邻苯二甲酰亚胺、三氟乙酰胺、甲氧基羰基、乙氧基羰基、t-丁氧基羰基(Boc)、苄氧基羰基(Z或Cbz)、9-芴甲氧基羰基(Fmoc)、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、2，2，2-三氯乙氧基羰基(Troc))、磺酰衍生物(如β-三甲基甲硅烷基乙磺酰(SES))、亚磺酰衍生物、C1-12烷基、苄基、二苯甲基、三苯甲基、9-苯基芴等。优选的氮保护基团是Fmoc。
包括用于促进克隆或纯化等的序列不一定有助于发明且可省略或去除。
应理解糖环能以开放或闭合形式存在，尽管本文的结构式中显示闭合形式，发明也包括开放形式。
完成发明的模式ΔG287-953杂合蛋白消化DNA，DNA编码来自脑膜炎球菌血清组B菌株394/98的蛋白287和来自脑膜炎球菌血清组B菌株2996的蛋白953，消化的DNA与短接头序列一起连接以产生编码氨基酸序列SEQ ID 7的质粒。质粒转染到大肠杆菌中，细菌生长以表达蛋白。
适当生长后，收集细菌并纯化蛋白。从培养物中离心细菌，沉淀在50mM乙酸缓冲液(pH5)存在时匀浆，沉淀∶缓冲液体积比例为1∶8。用高压均浆器(Avestin，于14000psi 4个循环)进行裂解。裂解后，加入尿素到5M的终浓度，接着室温搅拌1小时。pH从6降到5，使用200mM乙酸缓冲液(pH4)+5M尿素。混合物以16800g在2-8℃离心60分钟。收集上清并通过SARTOBRAN P(0.45-0.22μm SARTORIUS)过滤。
过滤上清中的蛋白在-20℃稳定≥30天且在2-8℃稳定≥15天。
蛋白在阳离子交换柱(SPFF，Amersham Biosciences)上进一步纯化，用350mMNaCl+50mM乙酸盐+5M尿素pH5.00洗脱。大部分杂质存在于流动中。用较低NaCl浓度(180mM)预洗脱洗涤有利去除2种污染的大肠杆菌蛋白。
洗脱物质调至pH8(用200mM TRIS/HCl+5M尿素pH9)并在Q Sepharose HP柱(Amersham)上进一步纯化，用5M尿素中的150mM NaCl+20mM TRIS/HCl pH8.00洗脱。此外，用减少的盐(90mM)预洗脱洗涤对去除杂质有用。
来自Q HP柱的过滤洗脱物质用PBS pH7.00(150mM NaCl+10mM磷酸钾，pH7.00)1∶2稀释，然后通过切向超滤相对10体积PBS pH7.00渗滤。渗滤结束时，物质浓缩1.6倍到约1.2mg/ml总蛋白。使用30,000Da截留膜(再生纤维素膜50cm2，Millipore PLCTK 30)能透析物质，产量约为90％。
936-ΔG741杂合蛋白消化DNA，DNA编码来自脑膜炎球菌血清组B菌株2996的蛋白936和来自脑膜炎球菌血清组B菌株MC58的蛋白741，消化的DNA与短接头序列一起连接以产生编码氨基酸序列SEQ ID 8的质粒。质粒转染到大肠杆菌中，细菌生长以表达蛋白。重组蛋白不分泌，但保持溶于细菌内。
适当生长后，离心细菌以产生湿糊状物并如下处理-存在20mM磷酸钠pH7.00的情况下通过高压系统匀浆。
-离心和通过正交过滤来澄清。
-阳离子柱层析(SP Sepharose Fast Flow)，用20mM磷酸钠pH7.00中的150mMNaCl洗脱。
-阴离子柱层析(Q Sepharose XL)，流通收集。
-疏水柱层析(Phenyl Sepharose 6Fast Flow High Sub)，用20mM磷酸钠pH7.00洗脱。
-相对PBS pH7.4渗滤，10Kd截留。
-终无菌过滤和-20℃贮存。
NadA(NL)(C)蛋白消化DNA以去除编码其C末端的序列，DNA编码来自脑膜炎球菌血清组B菌株2996的NadA蛋白，以产生编码氨基酸序列SEQ ID 1的质粒。质粒转染到大肠杆菌中，细菌生长以表达蛋白。重组蛋白分泌到培养基中，分泌蛋白(SEQ ID2)中缺乏前导肽。上清处理如下-浓缩7X和通过交叉流动UF(截留30Kd)相对缓冲液20mM TRIS/HCl pH7.6渗滤。
-阴离子柱层析(Q Sepharose XL)，用20mM TRIS/HCl pH7.6中的400mM NaCl洗脱。
-疏水柱层析步骤(Phenyl Sepharose 6Fast Flow High Sub)，用TRIS/HCl pH7.6中的50mM NaCl洗脱。
-羟磷灰石陶瓷柱层析(HA Macro.Prep)，用200mM磷酸钠pH7.4洗脱。
-相对PBS pH7.4渗滤(截留30Kd)。
-终无菌过滤和-20℃保贮。
终物质中的蛋白在-20℃和2-8℃稳定至少6个月。
NadA蛋白对降解敏感，NadA的截断形式可通过蛋白质印迹或质谱(如MALDI-TOF)检测，表明多至10kDa MW损失。降解产物可通过凝胶过滤从天然NadA中分离(例如用柱TSK 300SWXL、预柱TSKSWXL、TOSOHAAS)。这种过滤产生3个峰(i)第1个峰的保留时间为12.637分钟且表观MW为885.036Da；(ii)保留时间为13.871分钟且表观MW为530.388Da；(iii)保留时间为13.871分钟且表观MW为530.388Da。3个峰的光散射分析显示实际MW值为(i)208500Da，(ii)98460Da，(iii)78760Da。因此，第1个峰包含NadA聚集物，第3个峰包含降解产物。
由于NadA(NL)(C)的预测分子量是34.113Da，峰(ii)包含三聚蛋白，它就是所需抗原。
抗原组合小鼠用组合物免疫，组合物包括3种蛋白和氢氧化铝佐剂。为了比较目的，也逐一地测试3种蛋白。每组使用10只小鼠。混合物能诱导抗多种菌株的高杀菌效价

‘-’表明此菌株不包含NadA基因观察个体小鼠，发现三倍混合物诱导高和一致的杀菌效价，抗3种获得单独抗原的血清组B菌株

与OMVs的组合和比较在进一步的实验中，佐剂抗原(20μg各抗原每剂量)与10μg OMVs联合施用，OMVs制备自菌株H44/76(挪威)或菌株394/98(新西兰)。对于血清组B，正对照是抗荚膜SEAM-3mAb，或对于其它菌株是CRM197-缀合荚膜糖。结果(杀菌效价)示于表1。混合物几乎总是产生好于简单OMVs的效价，此外，加入混合物到OMVs几乎总是显著提高OMVs的功效。另外，在许多情况中，抗原混合物与正对照所见反应匹配或超出。
高毒性谱系测试测试下列抗原抗来自多种高毒性谱系的各种血清组B菌株(a)NadA(NL)(C)(b)ΔG287-953(c)936-ΔG741(d)(a)、(b)和(c)的混合物(e)制备自菌株H44/76(挪威)的OMVs(f)制备自菌株394/98(新西兰)的OMVs(g)ΔG287和(e)的混合物(h)(d)和(e)的混合物(i)(d)和(f)的混合物SEAM-3用作正对照。
结果如下，表示为血清杀菌效价超过1024时所示高毒性谱系中的菌株百分比

抗特定参考菌株，杀菌效价如下

因此，组合物(d)、(h)和(i)包括杀菌抗体反应，抗来自高毒性谱系A4、ET-5和谱系3的多种血清组B脑膜炎球菌菌株。用组合物(h)和(i)的效价一般高于用(d)，但在高毒性谱系A4、ET-5和谱系3内的菌株覆盖不佳。
未分类菌株的覆盖用组合物(d)、(h)和(i)也高。
分析NadA N末端结构域已知纯化的脑膜炎奈瑟球菌NadA蛋白结合人上皮细胞[17](例如Chang细胞、HeLa细胞、Hep-2细胞)，表达NadA的重组大肠杆菌显示粘附表型[18]。这些大肠杆菌也能侵入上皮细胞，胞内NadA+ve大肠杆菌能通过免疫荧光(膜渗透后)和电子显微镜在Chang细胞中检测。因此，认为NadA功能是作为粘附素和侵入上皮细胞。
在二级结构分析的基础上，成熟NadA再分成3个推定结构域N末端球状结构域(aa 24-87)、具有高卷曲螺旋倾向的α-螺旋内部区(aa 88-350)和C末端膜锚(aa351-405)。研究了N末端球状结构域在宿主-细胞相互作用中的功能。
截断的nadA基因编码缺乏氨基酸30-87的蛋白，此基因克隆到pET-21载体(pET-NadAΔ30-87)中并在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达。保留氨基酸24-29以允许加工前导肽和纠正蛋白成熟。蛋白质印迹和FACS分析确认NadAΔ30-87在大肠杆菌细胞表面上表达并形成寡聚体，即缺失N末端结构域不干扰NadA的表达、输出和膜定位。然而，重组大肠杆菌菌株完全失去粘附Chang上皮细胞的能力。因此，N末端结构域和粘附素活性有连带关系。
为进一步研究哪部分N末端结构域参与相互作用，此区域另外分成3个推定亚域氨基酸24-42，含有疏水残基的预测α-螺旋区；氨基酸43-70，无预测确定二级结构的内部部分；氨基酸71-87，含其它预测α-螺旋结构。产生3个构建物，各编码缺失单个亚域的蛋白，然后引入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得下列菌株；BL21(DE3)/pET-NadAΔ24-42、BL21(DE3)/pET-NadAΔ43-70和BL21(DE3)/pET-NadAΔ71-87。寡聚体的表面定位通过蛋白质印迹和FACS分析确认，但粘附Chang上皮细胞不好于对照BL21(DE3)/pET大肠杆菌菌株。这些结果也用免疫荧光显微镜分析确认，表明NadA的完整球状N末端结构域对与人细胞相互作用是重要的。
与脑膜炎球菌和/或Hib缀合物的组合三重MenB组合物结合血清组C、W135和Y的寡糖缀合物混合物，产生含下列抗原的疫苗

制备类似地疫苗，包括MenA缀合物(10μg糖+12.5-33μg CRM197)和/或HbOCHib缀合物(10μg糖+2-5μg CRM197)。
使用修饰的MenA糖从MenA中纯化荚膜多糖，水解以产生MenA寡糖。多糖(2g)在50mM乙酸钠缓冲液pH4.75中50℃水解约4小时，多糖浓度为10mg/mL[135]。水解后，溶液通过旋转蒸发来干燥。
寡糖用下列反应流程活化

寡糖溶解于DMSO以产生10mg/mL的糖浓度。根据1∶20的寡糖∶CDI摩尔比，然后加入21.262g CDI且反应混合物室温搅拌16小时。通过在80∶20(v/v)丙酮∶DMSO混合物中选择性沉淀，接着离心纯化所得MenA-CDI化合物。通过确定游离咪唑与结合咪唑的比例计算活化反应效率约为67.9％。
在第2个反应步骤中，MenA-CDI寡糖溶解于DMSO，糖浓度约为10mg/mL。根据1∶100的MenA-CDI单位∶DMA摩尔比，加入36.288g 99％盐酸二甲胺(即R1和R2＝Me)且反应混合物室温搅拌16小时。反应产物冷冻干燥并再溶解于10mg/mL水溶液。
为从寡糖制品中去除低分子量反应试剂(特别是二甲胺(DMA))，经3.5kDaMWCO膜(Spectra/PorTM)进行透析步骤。完成4个透析步骤(i)相对2L 1M氯化钠透析16小时(透析因子1∶20)，(ii)相对2L 0.5M氯化钠透析16小时(透析因子1∶20)，(iii)和(iv)相对2L WFI透析16小时(透析因子1∶20)。为改善纯化，也经1kDaMWCO膜(CentriconTM)进行透析步骤。
纯化的MenA-CDI-DMA产物在25mM L-组氨酸(FlukaTM)中缓冲于pH6.5。
为制备修饰的MenA糖缀合物(MenA-CDI-DMA)，总方法如下-水解多糖以产生寡糖片段-寡糖片段的尺寸定位-还原胺化依大小排列的寡糖上的末端醛基-在CDI反应前通过Fmoc基团保护末端-NH2基团-在DMA反应期间内部去保护-NH2基团-通过SIDEA(N-羟基琥珀酰亚胺己二酸)活化末端-NH2基团-共价附着于CRM197蛋白修饰的MenA寡糖缀合物在升高温时对水解的抗性比其天然对应物大许多。例如，37℃28天后，修饰寡糖的释放糖百分比为6.4％，相比之下，天然抗原为23.5％。此外，修饰寡糖诱导的效价不显著低于用天然糖结构获得的效价。
修饰的MenA缀合物结合MenC、MenW135和MenY缀合物，作为替代未修饰寡糖的缀合物。此四价混合物与3种MenB多肽混合以产生单剂量有效抗脑膜炎奈瑟球菌血清组A、B、C、W135和Y的疫苗。
肺炎球菌组合3种组合的MenB蛋白与肺炎球菌糖缀合物混合以产生终浓度为2μg/剂量的各肺炎球菌血清型(血清型6B双倍)。因此，重建的疫苗包含下列抗原

应理解发明仅通过例子描述，可进行修改而仍在发明的范围和精神内。
表1

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序列表SEQ ID 1-来自菌株2996的NadA，有C末端缺失MKHFPSKVLTTAILATFCSGALAATNDDDVKKAATVAIAAAYNNGQEINGFKAGETIYDIDEDGTITKKDATAADVEADDFKGLGLKKVVTNLTKTVNENKQNVDAKVKAAESEIEKLTTKLADTDAALADTDAALDATTNALNKLGENITTFAEETKTNIVKIDEKLEAVADTVDKHAEAFNDIADSLDETNTKADEAVKTANEAKQTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAEAAAGTANTAADKAEAVAAKVTDIKADIATNKDNIAKKANSADVYTREESDSKFVRIDGLNATTEKLDTRLASAEKSIADHDTRLNGLDKTVSDLRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVGSEQ ID 2-来自菌株2996的NadA，有C末端缺失且前导肽加工ATNDDDVKKAATVAIAAAYNNGQEINGFKAGETIYDIDEDGTITKKDATAADVFADDFKGLGLKKVVTNLTKTVNENKQNVDAKVKAAESEIEKLTTKLADTDAALADTDAALDATTNALNKLGENITTFAEETKTNIVKIDEKLEAVADTVDKHAEAFNDIADSLDETNTKADEAVKTANEAKQTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAEAAAGTANTAADKAEAVAAKVTDIKADIATNKDNIAKKANSADVYTREESDSKFVRIDGLNATTEKLDTRLASAEKSIADHDTRLNGLDKTVSDLRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVGSEQ ID 3-来自MC58菌株的ΔG741VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQSEQ ID 4-来自MC58菌株的936，有前导肽加工VSAVIGSAAVGAKSAVDRRTTGAQTDDNVMALRIETTARSYLRQNNQTKGYTPQISVVGYNRHLLLLGQVATEGEKQFVGQIARSEQAAEGVYNYITVASLPRTAGDIAGDTWNTSKVRATLLGISPATQARVKIVTYGNVTYVMGILTPEEQAQITQKVSTTVGVQKVITLYQNYVQRSEQ ID 5-来自MC58菌株的953，有前导肽加工ATYKVDEYHANARFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIPIANLQSGSQHFTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKFNCYQSPMEKTEVCGGDFSTTIDRTKWGMDYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQSEQ ID 6-来自MC58菌株的ΔG287SPDVKSADTLSKPAAPVVSEKETEAKEDAPQAGSQGQGAPSAQGSQDMAAVSEENTGNGGAVTADNPKNEDEVAQNDMPQNAAGTDSSTPNHTPDPNMLAGNMENQATDAGESSQPANQPDMANAADGMQGDDPSAGGQNAGNTAAQGANQAGNNQAAGSSDPIPASNPAPANGGSNFGRVDLANGVLIDGPSQNITLTHCKGDSCSGNNFLDEEVQLKSEFEKLSDADKISNYKKDGKNDKFVGLVADSVQMKGINQYIIFYKPKPTSFARFRRSARSRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEGNYRYLTYGAEKLPGGSYALRVQGEPAKGEMLAGAAVYNGEVLHFHTENGRPYPTRGRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDDLHMGTQKFKAAIDGNGFKGTWTENGSGDVSGKFYGPAGEEVAGKYSYRPTDAEKGGFGVFAGKKEQDSEQ ID 7-287-953杂合体MASPDVKSADTLSKPAAPVVSEKETEAKEDAPQAGSQGQGAPSAQGGQDMAAVSEENTGNGGAAATDKPKNEDEGAQNDMPQNAADTDSLTPNHTPASNMPAGNMENQAPDAGESEQPANQPDMANTADGMQGDDPSAGGENAGNTAAQGTNQAENNQTAGSQNPASSTNPSATNSGGDFGRTNVGNSVVIDGPSQNITLTHCKGDSCSGNNFLDEEVQLKSEFEKLSDADKISNYKKDGKNDGKNDKFVGLVADSVQMKGINQYIIFYKPKPTSFARFRRSARSRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEGNYRYLTYGAEKLPGGSYALRVQGEPSKGEMLAGTAVYNGEVLHFHTENGRPSPSRGRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDGLHMGTQKFKAAIDGNGFKGTWTENGGGDVSGKFYGPAGEEVAGKYSYRPTDAEKGGFGVFAGKKEQDGSGGGGATYKVDEYHANARFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIPVANLQSGSQHFTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKFNCYQSPMAKTEVCGGDFSTTIDRTKWGVDYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ*SEQ ID 8-936-741杂合体MVSAVIGSAAVGAKSAVDRRTTGAQTDDNVMALRIETTARSYLRQNNQTKGYTPQISVVGYNRHLLLLGQVATEGEKQFVGQIARSEQAAEGVYNYITVASLPRTAGDIAGDTWNTSKVRATLLGISPATQARVKIVTYGNVTYVMGILTPEEQAQITQKVS
TTVGVQKVITLYQNYVQRGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ*SEQ ID 9-接头GSGGGGSEQ ID 10-741序列CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQSEQ ID 11-741序列CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQSEQ ID 12-741序列CSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
权利要求
1.一种组合物，施用给受试者后能在该受试者中诱导抗体反应，其特征在于，抗体反应是抗脑膜炎奈瑟球菌血清组B的高毒性谱系A4、ET-5和谱系3中的2个或多个的杀菌性。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括2到10种多肽，各具有不同的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，产生杀菌性抗体的成分通过重组表达获得。
4.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括5个脑膜炎球菌抗原(1)‘NadA’蛋白；(2)‘741’蛋白；(3)‘936’蛋白；(4)‘953’蛋白和(5)‘287’蛋白。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，NadA蛋白与SEQ ID 2有85％或更多同一性。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，NadA蛋白包括SEQ ID 2。
7.如权利要求4到6中任一项所述的组合物，其特征在于，741蛋白与SEQ ID3有85％或更多同一性。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，741蛋白包括SEQ ID 3。
9.如权利要求4到8中任一项所述的组合物，其特征在于，936蛋白与SEQ ID4有85％或更多同一性。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，936蛋白包括SEQ ID 4。
11.如权利要求4到10中任一项所述的组合物，其特征在于，953蛋白与SEQ ID 5有85％或更多同一性。
12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，953蛋白包括SEQ ID 5。
13.如权利要求4到12中任一项所述的组合物，其特征在于，287蛋白与SEQ ID 6有85％或更多同一性。
14.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，287蛋白包括SEQ ID 6。
15.如权利要求4到14中任一项所述的组合物，其特征在于，抗原(1)到(5)中至少2种表达为单多肽链。
16.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括多肽，多肽在单多肽链内包含一对抗原，抗原对选自NadA和741；NadA和936；NadA和953；NadA和287；741和936；741和953；741和287；936和953；936和287；953和287。
17.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括公式NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH的多肽，其中X是5个抗原(1)到(5)之一的氨基酸序列；L是任选的接头氨基酸序列；A是任选的N末端氨基酸序列；B是任选的C末端氨基酸序列；n是2、3、4或5。
18.如权利要求17所述的组合物，其特征在于，n是2，X1是936蛋白且X2是741蛋白。
19.如权利要求17所述的组合物，其特征在于，n是2，X1是287蛋白且X2是953蛋白。
20.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括含SEQ ID 7的蛋白。
21.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括含SEQ ID 8的蛋白。
22.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物进一步包括来自脑膜炎球菌血清组Y、W135、C和(任选)A的糖抗原。
23.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物进一步包括来自流感嗜血杆菌b型的糖抗原。
24.如权利要求22或23所述的组合物，其特征在于，糖抗原缀合载体，载体选自白喉类毒素、破伤风类毒素、CRM197或流感嗜血杆菌蛋白D。
25.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物进一步包括来自肺炎链球菌的抗原。
26.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物用作药物。
27.使用上述权利要求中任一项所述的组合物生产药物，其特征在于，用于预防和治疗奈瑟球菌导致的疾病。
28.一种在哺乳动物中产生免疫反应的方法，其特征在于，所述方法包括施用有效量的权利要求1到26中任一项所述组合物的步骤。
29.一种多肽，其特征在于，所述多肽具有的氨基酸序列选自SEQ IDs 1到8。
30.一种从培养基中纯化可溶性NadA的方法，其特征在于，所述方法包括步骤通过超滤浓缩和相对缓冲液渗滤；阴离子柱层析；疏水柱层析；羟磷灰石陶瓷柱层析；相对缓冲液渗滤和滤器消毒。
31.一种从细菌中纯化936-ΔG741杂合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括步骤匀浆；离心、阳离子柱层析；阴离子柱层析；疏水柱层析；相对缓冲液渗滤和滤器消毒。
全文摘要
少量确定的抗原能提供抗脑膜炎球菌感染的广泛保护，发明提供的组合物在施用给受试者后能在该受试者中诱导抗体反应，其中抗体反应杀菌地抗脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)血清组B的高毒性谱系A4、ET5和谱系3中的2或3个。组合物包括10个或更少纯化抗原的混合物，而不是由单一抗原组成，且不应包括复杂或未确定的抗原混合物如外膜囊泡。特定使用5个蛋白抗原(1)“NadA”蛋白；(2)“741”蛋白；(3)“936”蛋白；(4)“953”蛋白和(5)“287”蛋白。
文档编号A61P31/04GK1809380SQ200380105896
公开日2006年7月26日 申请日期2003年10月2日 优先权日2002年10月11日
发明者M·皮扎 申请人:启龙有限公司