专利名称：分析仪器及方法
技术领域：
本发明涉及一种分析仪器，特别是涉及一种用于分析一个对象，例如患者血液的光谱分析仪器，以及相应的分析方法。
通常，分析仪器，例如光谱分析仪器用于研究待检查对象的成分。特别地，分析仪器采用一种分析方法，例如基于对象物质与入射电磁辐射的相互作用的光谱分解方法，该电磁辐射例如可见光、红外或紫外辐射。
可从WO 02/057759A2获知一种包含激发系统和监视系统的光谱分析仪器，其在此引入作为参考。该激发系统发射激发光束，以在激发周期中激发目标区域。该监视系统发射监视光束，以在监视周期中对目标区域成像。该激发周期与该监视周期基本上重叠。这样目标区域与激发区域一起被成像，并且形成既显示目标区域又显示激发区域的图像。根据该图像，激发光束可非常精确地瞄准目标区域。
WO 96/29571A1公开了一种在荧光探测应用中，通过利用毛细管内物质中的喇曼散射信号，用以光学对准毛细管与激发激光束的系统和方法。例如，来自电泳分离基体的喇曼散射可用于毛细电泳系统中的对准。可以存在荧光物质，其也可用于对准目的，但不是必需的。本发明采用有孔的抛物面反射器，毛细管和激光束通过这些孔被引导，以使它们优先地以直角在反射器焦点处相交。毛细管内物质的喇曼散射信号由一系列过滤器收集，并且此信息用于在需要的情况下再定位聚焦透镜，该聚焦透镜将激发光束导入反射器和毛细管，以使喇曼散射信号最大化。最大喇曼散射信号表明毛细管和激发光束的正确对准。之后可以收集其它信号，比如来自样本的荧光发射。聚焦透镜的调整可以是自动的，以使在对管内物质的整个分析过程中保持毛细管和光束的对准。还公开了毛细管阵列与激发光束的连续对准。
从WO 02/057759A2得知的用于对局部成分进行同步成像和光谱分析的分析方法是通过用于共焦视频成像和喇曼激发的独立激光器来实现的。在非侵入式血液分析的用途中，将激光器瞄准特定的血管。其缺点是对于独立共焦视频显微镜和喇曼系统使用了两个独立的激光器。而且，需要图像处理软件方法以跟踪血管。还公开了有关利用单一激光器进行组合成像和喇曼分析的实施例。然而，在成像与喇曼光谱分析基本上重叠的时间内，在图像中找到血管并以高信噪比记录血管的喇曼光谱的问题尚未解决。
因而本发明的目的是提供一种优化的分析仪器和相应的分析方法，用于对一个对象进行成像和光谱分析，该仪器和方法提供分析和具有高信噪比的喇曼光谱，并允许使用单一激光器来成像和喇曼激发。
根据本发明，该目的是通过一种如权利要求1所述的分析仪器来实现的。该仪器包括——激发系统，用于发射激发光束以激发目标区域，——光束分离单元，用于将至少部分弹性散射辐射从非弹性散射辐射中分离出来，所述散射辐射是由激发光束在目标区域处产生的。
——监视系统，用于利用弹性散射或非弹性散射辐射来产生目标区域的图像，并用于在所述图像中限定感兴趣的区域，——控制单元，用于控制激发系统，从而激发目标区域中所限定的感兴趣的区域，和/或用于控制探测系统(dsy)，从而只探测来自所限定的感兴趣区域的信号，以及——探测系统，用于探测来自所限定的感兴趣区域的、由激发光束产生的散射辐射。
该目的还通过一种如权利要求10所述的相应的分析方法来实现。
本发明基于利用激发系统产生目标区域的图像的思想。在目标区域处响应激发光束而产生的弹性或非弹性散射光用于提供例如患者带有血管的皮肤的图像。根据该图像信息，可将镜头缩放到感兴趣区域上的特定血管，并可记录来自所感兴趣区域中每个象素的喇曼光谱。该思想是所感兴趣的区域完全或几乎完全覆盖了血管的一个部分。
还可能在目标区域的整个图像中探测每个象素的喇曼光谱。接着，基于该光谱信息，选择带有血管的感兴趣的最佳区域，然后将镜头缩放至感兴趣区域，以达到更快的喇曼信号采集时间。
本发明具有使用单一激光器进行成像和喇曼光谱探测的优点，即，喇曼激发光束既用于激发目标区域，又用于成像。并且，与固定点记录相比，可以获得较大的积分血液喇曼信号。更进一步，利用分离的图像处理方法，喇曼光谱信息可用于对血管进行目标跟踪。
本发明的优选实施例在从属权利要求中进行限定。监视系统的不同实施例在权利要求2和3中进行限定。为了区分不同的图像区域，例如为了在图像中区别血液和皮肤的象素，既可利用图像中的对比度信息，又可利用探测到的散射辐射中的光谱信息。
当在图像分析中利用对比度信息时，不必分析喇曼信号。可利用强度对比度或强度波动对比度在图像中识别血管。其优点在于图像帧速率通常高于喇曼信号采集时间，这意味着图像分析比光谱分析更快，并且是以所需的图像处理为代价的。当利用光谱分析时，可识别血液或皮肤，这是因为它们在特性上具有不同的光谱特征。其优点是精确的局部分子识别；然而，光谱分析与图像分析相比更慢。
血液与皮肤之间的辩别可通过监视感兴趣区域(ROI)中水与蛋白质的信号成分之比来进行。由于相当大含量的胶原蛋白的存在，血液中水/蛋白质比值(WPR)显著高于血管周围的皮肤中的WPR。为了确定水与蛋白质之比，可利用滤光器，将喇曼信号中的高频光谱部分，特别是包含蛋白质和水的成分的部分，从低频光谱部分，特别是指纹光谱区域中分离出来。
根据本发明的分析仪器可为双激光器或单激光器仪器。在双激光器仪器中，一个激光器用于产生激发光束，而另一激光器用于发射监视光束。例如，激发光束可为用于对单光点进行分析的静态光束或为扫描光束，而监视光束优选为扫描光束，以形成图像。在单激光器实施例中，由辐射源，即激光器产生的原始输出光束优选通过合适的光学分离方法分成监视光束和激发光束。
根据其它优选实施例，监视系统可包括共焦视频显微镜，其中探测系统与共焦视频显微镜具有共焦关系。作为选择，监视系统也可包括正交偏振化的光谱成像装置。这些监视系统的详细情况公开于上述WO 02/057759A1中。
通过将激发激光器的激光功率分布在所限定的感兴趣的区域上，将来自所限定的感兴趣区域的信号平均化将会更有利，这对于最大入射功率的限制来说也是重要的。
控制系统的不同实施例包括一种实施例，该实施例适于控制所述激发系统，以将激光功率分布在所限定的感兴趣的区域上，而不是分布在整个(原始)感兴趣的区域上。控制系统的另一实施例适于控制所述探测系统，以阻挡来自部分所限定的感兴趣区域的不需要的信号(如周围皮肤)，而仅探测来自所限定的感兴趣区域的需要的信号(如血液)。
现以附图为参考更详细地说明本发明，其中，
图1表示了根据本发明的分析系统的第一实施例的图示，图2示出了视野以及图像中不同的感兴趣区域，图3表示了组织的高频成分的喇曼信号强度，图4表示了根据本发明的方法的方块图，图5表示了根据本发明的分析系统的第二实施例的图示，以及图6表示了根据本发明的分析系统的第三实施例的图示。
图1表示了根据本发明的分析系统的图示。该分析系统包括光学成像系统(Iso)，用于形成待检查对象(obj)的光学图像。该光学成像系统(Iso)形成了共焦视频显微镜。在本例中，该对象为待检查患者前臂的一块皮肤。该分析系统还包括多光子、非线性或者弹性或非弹性散射光学探测系统(ods)，用于对通过多光子或非线性光学工艺在对象(obj)中产生的光进行光谱分析。图1所示的例子特别地利用了具有喇曼光谱装置形式的非弹性喇曼散射探测系统(dsy)。术语“光学”不仅包括可见光，而且还包括紫外辐射和红外辐射，特别是近红外辐射。
光源(1s)由例如氩离子/钛蓝宝石激光器构成，该激光器产生具有850nm红外光束形式的激发光束(exb)。钛蓝宝石激光器例如利用氩离子激光器进行光学泵浦。激光器的红外激发光束(exb)由出射焦点处的光学成像系统聚集于对象(obj)内或对象(obj)上的焦平面内。该光学成像系统包括偏振分束器(pbs)、旋转反射多面棱镜(pgn)、透镜(11，12)、扫描反射镜(sm)和显微物镜(mo)。通过旋转多面棱镜(pgn)和移动扫描反射镜(sm)而在焦平面上移动聚焦激发光束(exb)。半导体激光器(1s)的出射面位于入射焦点上。半导体激光器(1s)还能够照亮位于入射焦点上的入射针孔。光学成像系统将作为返回光束从焦平面反射的光经由偏振分束器(pbs)传导至雪崩光电二极管(apd)。而且，在显微镜物镜(mo)之前设有λ/4板，以使返回光束的偏振方向垂直于激发光束的偏振方向。偏振分束器(pbs)因此将返回光束从激发光束中分离出来。
光学显示单元(opd)利用雪崩光电二极管(apd)的输出信号形成待检查对象中或其上的焦平面的图像(img)，所述图像显示在监视器上。实际上，光学显示单元为工作站，图像是利用工作站的处理器通过根据雪崩光电二极管(apd)的输出信号取得电子视频信号来实现的。该图像用于监视光谱检定，特别是激发目标区域，以使激发区域落在目标区域上并接收来自目标区域的散射辐射。
喇曼光谱装置(ods)包括在成像系统(Iso)中使用的相同激光器(1s)作为激发系统(exs)。喇曼散射沿着与激发光束相同的光路通过扫描镜(sm)、透镜(11，12)和旋转多面棱镜(pgn)反射回来。在多面棱镜(pgn)之后，沿反射的散射光方向观察，热镜(hm)位于光路中，以在反射光束中将喇曼散射光，即波长与激发光束不同的非弹性散射光，从弹性散射光中分离出来。
由另一反射镜(m)将喇曼散射光导向光纤(fbr)入射端，并再经由光纤入射端(fbr-i)之前的陷波滤光器(notch filter)和透镜(13)聚焦到探测器针孔的光纤入射端上。光纤入射端本身充当探测器针孔。光学成像系统(Iso)在入射焦点、出射焦点和检测焦点之间建立了共焦关系，在入射焦点处存在半导体激光器(1s)，出射焦点位于待检查对象(obj)局部细节区域处，检测焦点位于光纤入射端(fbr-i)处。光纤(fbr)连接到带有CCD探测器(CCD)的光谱仪(spm)的输入端。带有CCD探测器的光谱仪包含在探测器系统(dsy)中，其记录波长小于大约1050nm的喇曼光谱。带有CCD探测器的光谱仪的输出信号代表了喇曼散射红外光的喇曼光谱。事实上，该喇曼光谱出现在860nm之外的波长范围内，依激发波长而定。CCD探测器的信号输出端连接到光谱显示单元(spd)，例如在监视器上显示所记录的喇曼光谱(spct)的工作站。
事实上，光学显示单元和光谱显示单元的功能可利用同一工作站来完成。例如，监视器显示屏的独立部分(窗口)用于同时显示光学图像和喇曼光谱。关于普遍的分析仪器的更多详细情况及其功能，可参考上述WO 02/057759A1。
根据本发明，提供了控制单元(ctrl)，其控制激发系统(exs)，从而激发对象(obj)的目标区域中特定的所限定的感兴趣区域，和/或控制探测系统(dsy)，从而阻挡来自部分所限定的感兴趣区域的不需要的信号(如周围皮肤)，而仅探测来自所限定的感兴趣区域的需要的信号(如血液)。
因而，在从探测系统(ods)接收的、探测到的散射辐射中，利用对比度信息或光谱信息，由监视系统(opd)产生所限定区域。这样，根据本发明，在本具体实施例中，利用激发光束的弹性散射光，使如图2a和2b所示的完全视野(FOV)成像。然后，在该图像中，确定具有较小视野的感兴趣区域(ROI)，该感兴趣区域(ROI)包括例如如图2a和2b所示的血管V。因而，感兴趣区域可采用如图2b所示的对象(V)的尺寸和形状，或者可为一个如图2a所示的矩形。
然后，利用控制单元(ctrl)，将激发光束的扫描设定为尺寸受限的感兴趣区域(ROI)，并仅收集来自该感兴趣区域(ROI)的散射辐射。在本特定实施例中，喇曼探测系统(dsy)仅探测到非弹性散射辐射。这样，对于感兴趣区域(ROI)中的所有象素而言，从血液中收集喇曼信号，形成与已知分析方法相比更大的喇曼信号。
当在ROI上移动，以几乎完全覆盖如图2a所示的血管或血管之若干部分时，意在区分血液和皮肤，并仅探测来自血液区域的信号。也就是说，在ROI内非血液的象素中，激发或探测被阻止。血液和皮肤之间的区分可通过监视ROI中水与蛋白质的信号成分比来实现。由于存在相当大含量的胶原蛋白，血液中水/蛋白质比值(WPR)显著高于血管周围的皮肤中的WPR。
通常组织或血液的特征是根据指纹光谱区域(0-2000cm-1)确定的。高频光谱区域2000-4000cm-1既包含蛋白质的频带又包含水的频带。这些频带中的喇曼强度可以轻易确定，以在ROI中的每个象素中进行监视。
分离低频和高频光谱区域的滤光器可用于产生指纹和水/蛋白质光谱区域。可通过对蛋白质频带中和水频带中的积分信号来确定WPR，以传递这两种信号。这可通过利用滤光器将如图3所示的高频光谱部分从低频光谱部分分离出来，或通过从CCD相机读出相应象素来实现。
显示根据本发明分析方法的实施例的主要步骤的方块图示于图4中。当利用图像分析时，在皮肤中发现血管是通过选择例如在正交偏振光谱成像(OPSI)中的象素强度对比度，或在共焦扫描激光显微(CSLM)中的象素强度波动来实现的。当利用光谱分析时，通过选择血液的光谱特性来找到血管。可使用两方法之一或其组合来为喇曼检测定位和选择最佳目标血管(步骤S1)。
在选择了血管之后，实施变焦(S2)，以选择带有(部分)血管的较小FOV，如图2a、b所示。这可通过不同方法来完成利用两束激光图像扫描光束(监视光束，irb)被缩放到所限定ROI，而固定的静态喇曼光束(激发光束，exb)被缩放到血管中的固定点上(S2)。
利用两束激光图像扫描光束(irb)和喇曼激发扫描光束(exb)均被缩放到所限定ROI区域。在ROI中的所有象素上，收集并平均喇曼信号，这是由于喇曼激发激光功率分布在整个ROI区域，而非仅指向固定点。滤光器用于低频区域和高频区域(S3)。从高频区域中，利用滤波(S4)确定并监视WPR(S5)。由此可探测到皮肤或血液象素(S6)。当利用WPR监视以探测被瞄准的是皮肤还是血液象素时，皮肤与血液之比可通过仅从血液象素中收集喇曼信号，而阻止皮肤象素的激发或探测来改善。
利用一束激光喇曼激发光束(exb)被缩放到所限定的ROI。部分激发光束用于产生弹性光散射，以用于对所限定的ROI进行图像分析，并用于探测皮肤和血液；另一部分用于来自所限定的ROI的非弹性光散射(喇曼信号)。在此方法中，如果阻止激发，将不再有用于分析图像或信号的输入。因而阻止了探测。在所限定的RO I中的所有血液象素上，通过将喇曼激发激光功率分布在所限定的ROI区域，而非将其指向固定点，而收集并平均喇曼信号。
利用一束激光喇曼激发光束(exb)被缩放到所限定的ROI。部分激发光束用于产生弹性光散射，以用于对所限定的ROI进行图像分析，并用于探测皮肤和血液；另一部分用于来自所限定的ROI的非弹性光散射(喇曼信号)。对低频区域和高频区域进行滤波(S3)。从高频区域中，利用滤波(S4)确定并监视WPR(S5)。由此可探测到皮肤或血液象素(S6)，以触发探测。在ROI中所有血液象素上，通过将喇曼激发激光功率分布在所限定的ROI区域，而非将其指向固定点，而收集并平均喇曼信号。
WPR的确定可通过读出相应CCD象素或光谱滤波来实现(S3)。进而，从低频区域(所谓指纹)可进行PLS分析(S7)，它允许确定所限定的ROI中的血液成分(S8)。
图5示意性地示出了根据本发明的分析仪器的实施例，其包括光学分离系统。波长为λ1的激光器形成了辐射源，以用于共焦成像，并同时用于喇曼激发。光束被由(例如20-80％)分束器(BS1)构成的光学分离系统(sep)一分为二。部分用于共焦成像，另一部分用于喇曼激发。监视光束(irb)通过偏振分束器(PBS)而线偏振。θ-φ反射镜将共焦视频显微镜中的扫描光束路径在x-y平面内偏转，以形成图像。透镜L1和L2用于光束扩展，L2用于将θ-φ镜的中心部分成像到显微镜物镜(mo)的入射光瞳上。以这种方式，由θ-φ镜反射的激光总是在同一位置入射到物镜，无论θ-φ镜的实际θ-φ位置如何。
四分之一波片λ/4将线偏振监视光束(λ1；irb)转换成圆偏振光。喇曼激发光束在高通滤光器(HPF)处反射，并经由反射镜(M1，M2)和反射分束器(BS2)引向物镜。在返回光路中，来自对象的反射光又被转换为线偏振光，但相对于入射光束偏振方向，偏转了90°。通过反射分束器(BS2)的透射光(部分为监视光束，部分为弹性散射喇曼光)接着被偏振分束器(PBS)偏转，并引向APD探测器，以形成图像及图像中的喇曼光斑。来自对象的弹性和非弹性散射喇曼光在BS2处反射。非弹性散射喇曼光(λR)透过高通滤光器(HPF)并引向喇曼探测光路。分束器(BS2)可用光点反射器来替换。
如上所述，关于如图1所示的第一实施例，提供了控制单元(ctr1)来根据从成像系统(opd)接收的信息，以上述方式控制激发系统(exs)和/或探测系统(dsy)。
图6示意性地表示了依据本发明的分析仪器的又一实施例，其中监视系统为正交偏振光谱成像装置。该实施例结合了由OPSI的成像和喇曼光谱学。至于正交偏振光谱成像(OPSI)，使用了特定波长带的光源(1s)。为达到此目的，用带通滤波器(λ-Ftr)过滤白色光源。光被偏振器(P)线偏振，然后被物镜(Obj)聚焦在对象上。通过正交偏振方向的分析器探测反射光。这意味着只探测到去偏振光，该去偏振光来源于混浊对象(组织)深处多次散射光(漫反射光)。这些光子的后向散射产生了一种“背光照明”，其在CCD探测器(CCD)处的图像中提供更为均匀或均匀度稍差亮度。通过正确选择与微小对象(例如皮肤中的毛细管)中的吸收性(部分地)相对应的波长(λ-Ftr)，这些对象在亮背景上相反地呈现黑色(通过吸收)。利用滤光器或其它光束组合单元，按照与共焦成像相似的方式，可以将喇曼激发光束耦合在OPSI图像中。OPSI的优点特别在于其紧凑性和低成本。
而且，如上所述，关于如图1所示的第一实施例，提供了控制单元(ctr1)，用于根据从成像系统(opd)接收的信息，以上述方式控制激发系统(exs)，和/或控制探测系统(dsy)，该激发系统在本实施例中是与用于产生监视光束(irb)的光源(1s)相分离的。
本发明允许以高信噪比在图像中发现血管并记录血管的喇曼光谱。本发明可能的应用领域为局部成分分析，例如用于片状材料的远程分析、非侵入式血液分析或在生产环境中的快速在线分析过程。
权利要求
1.一种分析仪器，特别是一种用于分析对象的光谱分析仪器，包括激发系统，用于发射激发光束以激发目标区域，光束分离单元，用于将至少部分弹性散射辐射从非弹性散射辐射中分离出来，所述散射辐射是由激发光束在目标区域处产生的，监视系统，用于利用弹性散射或非弹性散射辐射来产生目标区域的图像，并用于在所述图像中限定感兴趣的区域，探测系统，用于探测来自所限定的感兴趣区域的、由激发光束产生的散射辐射；以及控制单元，用于控制激发系统，从而激发目标区域中所限定的感兴趣的区域，和/或用于控制探测系统，从而仅探测来自所限定的感兴趣区域的信号。
2.一种如权利要求1所述的分析仪器，其中所述监视系统适于利用图像中的对比度信息区分不同的图像部分。
3.一种如权利要求1所述的分析仪器，其中所述监视系统适于利用探测到的散射辐射中的光谱信息区分不同的图像部分。
4.一种如权利要求1所述的分析仪器，其中所述探测系统包括滤光器，用于将喇曼信号中的高频光谱部分，特别是包含来自蛋白质和水的成分的部分，从低频光谱部分，特别是指纹光谱区域中分离出来。
5.一种如权利要求1所述的分析仪器，其中所述监视系统适于发射监视光束，以对目标区域成像。
6.一种如权利要求5所述的分析仪器，还包括辐射源，以发射输出光束，以及光学分离系统，以从输出光束中将监视光束和激发光束分开。
7.一种如权利要求1所述的分析仪器，其中所述监视系统包括共焦扫描激光显微镜，并且所述探测系统与共焦扫描激光显微镜具有共焦关系。
8.一种如权利要求1所述的分析仪器，其中所述监视系统包括正交偏振的光谱成像装置。
9.一种如权利要求1所述的分析仪器，其中所述控制系统适于控制所述激发系统，以将激光功率分布在所限定的感兴趣区域上。
10.一种如权利要求1所述的分析仪器，其中所述控制系统适于控制所述探测系统，以阻挡来自部分所限定的感兴趣区域的不需要的信号，而仅探测来自所限定的感兴趣区域的需要的信号。
11.一种分析方法，特别是一种用于分析对象的光谱分析方法，包含以下步骤发射激发光束，以激发目标区域，将至少部分弹性散射辐射从非弹性散射辐射中分离出来，所述散射辐射是由激发光束在目标区域处产生的，利用弹性散射或非弹性散射辐射产生目标区域的图像，在所述图像中限定感兴趣的区域，控制激发系统，从而激发目标区域中所限定的感兴趣的区域，和/或控制探测系统，从而探测来自目标区域中所限定的感兴趣区域的信号，以及探测来自所限定的感兴趣区域的、由激发光束产生的散射辐射。
全文摘要
本发明涉及一种分析仪器，具体地说是一种用于分析对象，例如患者血液的光谱分析仪器，以及相应的分析方法。激发系统(exs)发射激发光束(exb)以激发目标区域，光束分离单元(hm)将至少部分弹性散射辐射从非弹性散射辐射中分离出来，所述散射辐射是由激发光束(exb)在目标区域处产生的。监视系统(Iso)利用弹性散射或非弹性散射辐射来产生目标区域的图像，并在所述图像中限定感兴趣的区域。为增加喇曼光谱的记录效率，提供控制单元(ctrl)，用于控制激发系统(exs)，从而激发目标区域中所限定的感兴趣的区域，和/或用于控制探测系统(dsy)，从而仅探测来自所限定的感兴趣区域的信号，并提供探测系统(dsy)，用于探测来自所限定的感兴趣区域的、由激发光束产生的散射辐射。优先地，通过将激光激发功率分布在所限定的感兴趣区域上，而平均来自所限定的感兴趣区域的信号。
文档编号A61B5/145GK1731952SQ200380107906
公开日2006年2月8日 申请日期2003年12月4日 优先权日2002年12月30日
发明者G·W·鲁卡斯森, G·J·普佩斯, M·范德沃特 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司