专利名称：Exendin 4的类似物的制作方法
技术领域：
本发明涉及Exendin4类似物的多肽，该多肽具有降低血糖作用，可用于治疗II型糖尿病。本发明还提供了通过化学合成和重组DNA生产工艺生产这些多肽的方法。
背景技术：
世界各国糖尿病患者人数逐年增多，现在中国有4000万，印度6000万，美国1800万，日本600万，糖尿病患者分为两种，一是胰岛素依赖型糖尿病(I型糖尿病)和非胰岛素依赖型糖尿病(II糖尿病)。其中，II型糖尿病占糖尿病患者的90％以上。
II型糖尿病患者表现了许多特征，如餐后胰岛素分泌量不足，胰岛素分泌时间滞后，高血糖等。肥胖II型糖尿病患者周边细胞胰岛素受体敏感性降低，因而产生血糖高，血液中胰岛素水平也高的情况，糖化血红蛋白，HbAlc在8％以上(正常为4-6％)。接着就会产生糖尿病并发症，如心脏病及肾功能衰竭等。
如今，控制糖尿病的有6类药物●促胰岛素分泌类磺酰脲类，melitioneds类●非胰岛素促分泌药物胰岛素，α-葡萄糖苷酶抑制剂，双胍类及Thioagolinediones。
根据英国UKPDS对数千名II型糖尿病患者的6年跟踪研究报告指出上述6类药物对II型糖尿病患者皆无能为力，不能遏制胰脏β-细胞的不断进行性的恶化，不能降低HbAlc水平，也不能阻止糖尿病的并发症如心脏病、肾衰竭。因此需要研究新的II型糖尿病治疗药物。
Exendin4和Exendin3是南美产巨蜥蜴(Gila monster，HelodermeSuspectum)的唾液中分泌的两种多肽，其中Exendin 4由39个氨基酸残基组成，其结构与GLP-1在氨基酸序列上有50％的同源性。
研究表明Ex4作为GLP-1的类似物与GLP-1的受体相结合。动物及II型糖尿病患者的临床1、2、3期试验证明，Ex4能促进胰岛素原的合成，促胰岛素分泌，降低血糖，当血糖正常之后不再继续作用，因而不产生低血糖昏迷、休克，十分安全。它能降低HbAlc，增加β-细胞量，增加II型糖尿病患者胰岛素受体的敏感性，抑制胰高血糖素分泌等作用。
与GLP-1相比，Ex4的临床应用，剂量为每日2次，每次5-10μg，而GLP-1则为200μg左右，且Ex4在血液中不受DPPIV二肽酶作用，半衰期比GLP-1长，但也存在不足之处，Ex4来源于巨蜥蜴，而GLP-1是人的内源物质，临床试验报告Ex4有52％的患者产生抗体(Diabetes(1997)46，433-439；Diabetes Care(2002)25，330-336；JAMA(2002)287，373-379；Diabetes(1995)44，1249-1258；Diabetes(2002)512796-2803；Diabetes Care(2000)2364-69，N.Engl.J.Med(2002)346，393-463，Lancet(1998)352，837-853)。
关于Ex4改构的研究从C-端开始缩短肽链，结果表明Ex4的C-端9个氨基酸残基是活性所必需的，从N-端开始不断缩短肽链结果表明除掉一个氨基酸His，活性影响不大。然而，这些结果都是离体实验得到的，以GLP-1受体结合能力的大小，促胰岛瘤细胞分泌胰岛素的多少和cAMP的形成量来进行评价带有局限性(J.Biol.Chem.(1997)272，21201-21206；Regulatory Peptides(2003)114，153-158；Trend inpharmacological Sci.(2003)24，377-383；PCT，WO03/011892，A2)。
本发明目的在于改变Exendin4的化学结构，从C端缩短其肽链长度并改变氨基酸结构，保持其降血糖活性，从而提高与Exendin 4的氨基酸序列的同源性，同时在结构上满足化学合成和基因工程方法生产的要求，适宜大量制造，降低成本，适应广大II型糖尿病患者的需要。本发明不采用离体的cAMP生成，胰岛素的分泌及GLP-1受体结合能力方法，而直接采用降低血糖方法对Exendin4类似物进行评价，有利于指导临床的应用。
发明概述本发明提供了下列Exendin4类似物HGEGTFTSDLSKQX1EEEAVX2LFIEWLKN28PPSX3Em32HGEGTFTSDLSKQX1EEEAVX2LFIEWLKNG29PPSX3Em33HGEGTFTSDLSKQX1EEEAVX2LFIEWLKNGG30PPSX3Em34HGEGTFTSDLSKQX1EEEAVX2LFIEWLKNGGP31PPSX3Em35HGEGTFTSDLSKQX1EEEAVX2LFIEWLKNGGPSPPSX3 Em36
HGEGTFTSDLSKQX1EEEAVX2LFIEWLKNGGPSSPPSX3 Em37HGEGTFTSDLSKQX1EEEAVX2LFIEWLKNGGPSSGPPSX3Em38X1＝Met、Leu或Ile；X2＝Lys；X3＝Arg、OH或NH2。
另外本发明还提供了含有上述类似物的药物组合及制备上述Exendin4类似物的方法，使向广大的II型糖尿病患者大量提供Exendin4治疗药物成为可能。
图1是合成的Exendin4类似物基因片断序列图；图2是基因工程法生产Exendin4类似物的流程图；图3是含多拷贝Exendin4基因的质粒的构建示意图；图4是用固相合成法合成Em32的示意图；图5是本发明Exendin4类似物的HPLC分析结构；图6A-B本发明Exendin4类似物的降血糖效果图；图7是本发明Exendin4类似物的促胰岛素分泌效果图。
发明详述本发明的一个方面提供了结构发生改变，而仍具有降糖活性的Exendin4类似物，其具有如上所述的结构式。优选地，X1为Met或Leu，X2为Lys。更优选地，X1为Met，X3为Arg。
本发明的另一方面提供了含有上述Exendin4类似物的药物组合物，该组合物含有一种或多种具有上述结构式的化合物和一种药学上可接受的稀释剂或赋形剂，优选地该组合物为单位剂量形式，如片剂、丸剂、胶囊(包括持续释放或延迟释放形式)、粉剂、颗粒、酏剂、酊剂、糖浆和乳液，消毒的注射用溶液或悬液，气雾剂或液体喷剂，滴剂、针剂、自动注射装置或栓剂。例如，以片剂或胶囊地形式口服给药，上述活性药物组分可以与一种口服的无毒的药学可接受的惰性载体，如乙醇、甘油、水及其类似物结合。另外，本发明还提供了上述化合物及药物组合物的在制备治疗疾病中的用途，优选地该疾病是糖尿病。
本发明的又一个方面提供了制备上述Exendin4类似物的方法，包括化学合成方法和基因工程方法。对于X3为Arg的上述化合物，可以用基因工程方法来合成，还可以通过化学方法来合成，但优选用基因工程方法来合成。对于X3为OH或NH2的上述化合物，可以通过化学方法来合成。优选的化学方法为固相合成法。
实施例1用基因工程方法生产HGEGTFTSDLSKQMEEEAVKLFI EWLKNPPSR32材料克隆载体含lac启动子质粒；宿主菌JM103Promega公司；T4多核苷酸激酶试剂盒Promega公司；T4连接酶试剂盒Promega公司；限制性内切酶EcoRI、Sal I、Bgl II、BamH I试剂盒Promega公司；分子量标准λDNA、φ×174DNAPromega公司；低分子量标准蛋白质上海思吉生物制品有限公司；ATP(Adenosine-5’-triphosphate，腺苷-5’-三磷酸)Boehringer Mannheim公司；丙烯酸胺E.Merck；甲叉双丙烯酰胺Fluka；溴乙锭(Ethidum bromid)Serva；TrisA.R上海思吉生物制品有限公司(进口分装)；SDSA.R上海思吉生物制品有限公司(进口分装)。
LB培养液胰胨(Tryptone)Oxoid，酵母浸出粉Oxoid，氯化钠(A.R)中国医药集团上海化学试剂站。
其他化学试剂均为AR级，中国医药集团上海化学试剂站提供。
基因片段的连接(1)5’-AAT TCC ATG AGA TCT CGT CAC GGT GAA GGT ACC TTCACC AGC GAT CTG AGC AAA CAG CTG GAA G(2)5’-AA GAA GCG GTT AAA CTG TTC ATC GAA TGG CTG AAAAAC CCG CCG AGC CGT GGA TCC TAG G’(3)5’-TTC TTC TTC CAG CTG TTT GCT CAG ATC GCT GGT GAAGGT ACC TTC ACC GTG ACG AGA TCT CAT GG(4)5’-TC GAC CTA GGA TCC ACG GCT CGG CGG GTT TTT CAGCCA TTC GAT GAA CAG TTT AAC CGC将以上四个基因片段(含量均为A260nm＝3(0.D.))各加双蒸水30μl。取正负链DNA片段各2μl分别混合于两个塑料管中(即(1)+(3)和(2)+(4))，并加入下列试剂进行5’端磷酸化反应
混合后于37℃保温30分钟，然后于水浴中加热至95℃，维持3分钟后徐徐退火，自然冷却至室温。再将退火后的二个双股DNA片段混合(即(1+3)+(2+4))，并加入下列试剂
混匀后，于16℃维持过夜使之连接。然后经过12％PAGE或1％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，以λDNA/EcoR I，Sal I双酶切DNA片段或φ×174DNA/Sal I酶切片段为分子量标准参照物，分取连接的基因片段经过抽提、回收、干燥，溶解备用。
如图1所示，将获得的基因片断用EcoR I/Sal I双酶切，从而获得粘性末端。
Exendin4类似物基因的克隆取含有Lac启动子的质粒1μg(1μg/ml)，加1×10中盐缓冲液1μl，新制备的双蒸水6μl，然后加入限制性内切酶EcoRI、Sal I各1μl，于37℃保温30分钟，经氯仿-酚试剂抽提，并用氯仿洗涤水层后，用60％异丙醇沉淀，离心、干燥后备用。
用4μl双蒸水溶解上述质粒片段，并与连接所得的Exendin4类似物基因片段2μl混合，加1×10连接酶缓冲液1μl、ATP 1μl、及T4连接酶2μl，于16℃连接过夜。
如图3所示，将获得的质粒经限制内切酶BamH I/Sal I双酶切后，再与经Bg III/Sal I双酶切的上述基因片断连接，就可以得到含双基因片断的质粒。反复进行该步骤可以得到含有8个串联拷贝的质粒。
转化取一个大肠杆菌JM103的单菌落，置LB培养液中过夜，从中取500μl接种于100mlLB培养液中，于37℃振荡培养，当菌体浓度达A600nm＝0.6(0.D.)时停止。于6000rpm离心，收集菌体，菌体悬浮于2ml0.1mol/LMgCl2溶液中，于冰浴中维持20分钟。再于6000rpm离心，收集菌体，重新悬浮于2ml 0.1mol/LCaCl2溶液中，置冰浴中保存备用；或加15％甘油，于-84℃冷冻备用。
取以上感受态细胞100μl，加入含Exendin4类似物基因的Lac启动子质粒，于冰浴中维持30分钟，然后转移至42℃维持2分钟，冷却，涂板(1％琼脂粉，含50μg/ml氨苄青霉素(AP))，37℃培养过夜；挑取菌落，分别转移至含50μg/ml AP的LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜，以备抽提质粒鉴定用。与此同时，将所提取的每个单菌落都划线于LB-琼脂平板上，经37℃培养过夜，得到工程菌PE8/JM103(含8个拷贝)，作留种用(备用种)。
发酵发酵使用LB培养液，含蛋白胨10g，酵母粉5g及NaCl 10g/L。
接种PE8/JM103工程菌于10升发酵液中进行发酵，条件为搅拌速度500rpm，通气量为每分钟一个罐体积，37℃，pH7～8，溶氧30～50％。发酵20小时后6000rpm离心收集菌体，菌体悬浮于20mmol/L磷酸缓冲液中(含NaCl 1mol/L)。按1000∶1加溶菌酶，30℃保温1小时，进行破壁，破壁后离心(10,000rpm)收集沉淀。沉淀悬浮于4倍体积的6M的盐酸胍中，搅拌抽提过夜，20,000rpm离心，将上清夜对水透析，10,000离心收集沉淀，得包涵体。将包涵体湿重100g悬浮于1000ml水中，搅拌条件下滴加10ml 2-甲基琥珀酸酐，过程中不断添加少量Na2CO3粉剂，维持溶液PH8-9，反应2小时，使之完全，然后对水透析去盐。在PH7.0，20mmole/L磷酸缓冲液中加胰蛋白酶(1∶1000w/w)37℃保温2小时裂解，用4mole/L盐酸调节PH2-3，搅拌维持4小时除去保护基，经HPLC纯化，梯度是A相含0.5％的甲酸水溶液；B相含乙腈80％(v/v)及甲酸0.5％的溶液。A相，B相溶液以线形梯度洗脱，20ml/分钟流速280nm，220mM紫外波长检测，得纯品GLP-1类似物。整个工艺流程见图2。
本发明的X3为Arg的其它化合物皆用如实施例1所述相同的方法制备。
实施例2、用固相合成法合成Em32化学结构
固相树脂的选择当多肽C-末端为羧基时选择常规的王树脂(Wang Resin，购于上海吉尔生化公司)进行固相合成。在合成结束后，将得到的带侧链保护基的多肽树脂进行裂解(即脱保护基和切断树脂一步完成)，而多肽的C-末端就从王树脂上断裂下来形成羧基。
当多肽C-末端为酰胺时选择常规的氨基树脂(Fmoc-PAL-PEG-PS Resin，购于PE AppliedBiosystem公司)进行固相合成。在合成结束后，将得到的带侧链保护基的多肽树脂进行裂解(即脱保护基和切断树脂一步完成)，而多肽的C-末端就从氨基树脂上断裂下来形成酰胺。
制备步骤17种带侧链保护基的Fmoc-氨基酸原料→固相合成→脱侧链保护基→HPLC纯化→冷冻干燥→Em321.氨基酸单体
2.固相合成的过程如图4所示，固相合成系将Em32的C-末端精氨酸先连接在氨基树脂(Fmoc-PAL-PEG-PS树脂)上，然后一个一个氨基酸从C-端向N-端延伸，共进行33步。
(1)仪器设备Applied Biosystem多肽合成仪，433A型(2)试剂
其中DMF＝N，N-二甲基甲酰胺，DIEA＝N，N-二异丙基乙胺，NMP＝N-甲基吡咯烷酮，DMAP＝二甲氨基吡啶，HOBT＝1-羟基苯并三唑，HBTU＝2-(1H-苯并三唑-基-1，1，3，3-四甲基-Uroniumhedrofluorophosphate。
(3)操作；
以0.25mmole规模为例，称取树脂约0.5g，置入多肽合成仪上的反应器中，将各种带保护基氨基酸称取1mmole装瓶，按Em32s的氨基酸序列从C-端向N-端排列在合成仪中，于25℃室温条件下，由电脑程序(SynthAssiat)控制自动进行脱Fmoc保护、活化、连结，按图所示再进行下一轮循环，如此进行33步完成合成。
氨基酸缩合过程中，需要将羧基活化，一般有HBTU-Fast moc法，
HOBt/DCC法，通用的DCC，酸酐法等方法。我们采用HBTU-Fast moc法进行羧基活化，如下图。
当合成结束后，将得到的带侧链保护基的多肽树脂在多肽合成仪上吹干后称重，接着脱保护基和切断树脂一步完成。
3.脱保护基及切断树脂(1)仪器设备磁力搅拌仪(2)试剂
将带保护基的Em32s多肽树脂置于具塞三角烧瓶，加入裂解试剂如下表
然后在恒温30℃条件下，电磁搅拌反应6小时；过滤、收集滤液，树脂用少量三氟乙酸洗涤；合并收集液与洗涤液，加入乙醚(约200-250mL)产生沉淀，过滤，沉淀用少量乙醚洗涤后立即放入干燥器中。
4.HPLC分离纯化仪器设备
试剂
通过两步HPLC反相层析来制备得到纯度为95％以上的产品。
(1).第一步粗分a).色谱柱采用C18介质的反相层析柱。
b).流动相A相含0.5％(v/v)乙酸的水溶液；B相含乙睛80％(v/v)和0.5％(v/v)乙酸的水溶液；c).上样溶液将多肽-树脂经裂解去除树脂及侧链保护基的多肽粗品(纯度约30-50％)用0.5％乙酸溶液配成浓度为5.0mg/ml的溶液。
d).冼脱条件采用线性梯度冼脱，操作流速为20ml/min，紫外检测波长为280nm，柱温为室温，洗脱梯度为
e).样品收集收集20-60％B的冼脱主峰，产品纯度约75-85％。
(2).第二步精制a).色谱柱采用C18介质的反相层析柱。
b).流动相与第一步粗分相同。
c).上样溶液将第一步粗分得到的收集液(纯度约75-85％)加同体积的双蒸水稀释。
d).冼脱条件采用分段逐次冼脱，操作流速为20ml/min，紫外检测波长为280nm，柱温为室温，冼脱程序为30％B2个柱体积 35％B2个柱体积 50％B6个柱体积；e).样品收集收集50％B的冼脱液，产品的纯度＞95％。结果如图5所示。
5.冷冻干燥(1)仪器设备
(2)操作先将Em32溶液放入低温冰箱中冷冻2小时，然后将其放进冷冻干燥设备中进行冻干得到所需化合物。
本发明的X3为OH或NH2的其它化合物皆用如实施例2所述相同的方法制备。
实施例3Exendin4类似物的降低血糖作用取C57小鼠(中国科学院上海动物中心)，8周龄(体重20g)，9只，分为3组。只给饮水，禁食过夜。
对照组0时，眼窦取血30μl，置于0.3ml 0.9％NaCl溶液中，然后腹腔注射20％葡萄糖溶液200μl，分别于60，120，150，180分钟同样采血，其中于120分钟时第二次腹腔注射20％葡萄糖200μl。血样经3000rpm离心5分钟后，使血球沉淀，取全部离心上清液，以国家卫生部，上海生物制品研究所出品的血糖测定试剂盒进行血糖测定。
Ex4组，按照对照组同样方法，0时取血后腹腔注射20％葡萄糖溶液200μl，皮下注射Exendin4类似物2μg，血糖测定按对照组同样方法进行。
Em32-38组，按Ex4组同样方法进行。
三组降血糖测定结果如图6A和B所示。
实施例4Exendin4类似物的促胰岛素分泌作用C57小鼠(体重20g)禁食过夜，腹腔注射40％葡萄糖100μl，第一组仅给葡萄糖，皮下注射生理盐水100μl，第二组给糖后皮下注射Exendin4类似物溶液100μl(2μg含药量)，于0，2，5，10，20，30，60，90，120min取血20μl，吹入离心管中(预加20μl EDTA 1％)，离心取血清用胰岛素试剂盒(Crystal Chem Inc)测胰岛素。结果见图7。
权利要求
1.Exendin 4类似物，其具有如下结构式HGEGTFTSDLSKQX1EEEAVX2LFIEWLKN28PPSX3Em32HGEGTFTSDLSKQX1EEEAVX2LFIEWLKNG29PPSX3Em33HGEGTFTSDLSKQX1EEEAVX2LFIEWLKNGG30PPSX3Em34HGEGTFTSDLSKQX1EEEAVX2LFIEWLKNGGP31PPSX3Em35其中X1＝Met、Leu或Ile；X2＝Lys；X3＝Arg、OH或NH2。
2.如权利要求1所述的Exendin 4类似物，其中所述的X1是Met。
3.如权利要求1所述的Exendin 4类似物，其中所述的X1是Leu。
4.如权利要求1所述的Exendin 4类似物，其中所述的X1是Ile。
5.如权利要求1-4任一项所述的Exendin 4类似物，其中所述的X3是R。
6.如权利要求1-4任一项所述的Exendin 4类似物，其中所述的X3是OH。
7.如权利要求1-4任一项所述的Exendin 4类似物，其中所述的X3是NH2。
8.一种药物组合物，其含有如权利要求1-7任一项所述的Exendin 4类似物。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其还含有药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。
10.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述的载体选自如乙醇、甘油、水。
11.如权利要求1-7任一项所述的Exendin 4类似物在制备治疗糖尿病药物中的用途。
12.如权利要求11所述的用途，其中的糖尿病是II型糖尿病。
13.如权利要求8-10任一项所述的药物组合在制备治疗糖尿病药物中的用途。
14.如权利要求13所述的用途，其中的糖尿病是II型糖尿病。
全文摘要
本发明提供了Exendin 4类似物多肽，该多肽具有降低血糖作用，可用于治疗II型糖尿病。本发明还提供了含有该多肽的药物组合物和通过化学合成和重组DNA生产工艺生产这些多肽的方法。
文档编号A61P3/00GK1746185SQ200410054300
公开日2006年3月15日 申请日期2004年9月6日 优先权日2004年9月6日
发明者孙玉琨, 张培璋, 周波 申请人:上海华谊生物技术有限公司