专利名称：奶制品中褪黑素的提纯方法和检测方法
技术领域：
本发明涉及奶制品中褪黑素的提纯方法和检测方法。
背景技术：
褪黑素学名为N-乙酰基-5-甲氧基色胺，是脊椎动物脑中松果腺体合成和分泌的一种吲哚类激素。其纯品为淡黄色叶片状结晶，分子式为C13H16N2O2，相对分子质量232.27，熔点116-118℃。国内外对褪黑素的昼夜节律及其催眠的药理作用均有综合报道，结果表明褪黑素与睡眠及睡眠失调密切相关。不同动物、不同剂量、不同指标的实验都表明，褪黑素与睡眠和睡眠失调密切相关，具有明显的改善睡眠的效果。外源补充褪黑素，能改善睡眠和重建睡眠节律。褪黑素作为一种新型的催眠药物或食品，有其独特的特点1)小剂量就有较为理想的改善睡眠效果。2)褪黑素作为一种内源性物质，通过对内分泌系统的调节而起作用，对机体来说并非异物。褪黑素在体内有自身的代谢途径，不会造成母药及其代谢产物在体内的蓄积。3)褪黑素生物半衰期短，在口服几小时后即降至正常人的生理水平，不会因蓄积残留而影响次日的精力。4)毒性极小。动物实验测不出其半数致死量，即使大剂量(800mg/kg)时也不引起大鼠死亡。但连续服用300mg/日褪黑素4个月后，会有抑制排卵的副作用。因此褪黑素的催眠作用具有内源性、小剂量、高效、低毒的特点。卫生部已批准褪黑素为改善睡眠保健食品的功能因子(Ernest Hartmann M.D.et al.，Sleep Induced by L-Tryptophan.TheJournal of Nervous and Mental Disease，167497-499；Lois A.Steinberg et al.，Tryptophan Intake Influences Infants Sleep Latency.J nutr 1221781-1791；金宗濂，保健食品的功能评价与开发，中国轻工业出版社，2001)。但目前褪黑素产品多为片剂或胶囊，故目前褪黑素的检测都是针对其粉末或胶囊样品。随着褪黑素日渐被引入牛奶等奶制品中后，在检测时，发现很难将其从奶制品中分离提纯，导致常规的检测结果偏低、不准确；从食品的有关规定来说，不能准确测定奶制品中的褪黑素含量，从某种程度上制约了褪黑素在奶(乳)制品中的应用。
发明内容
本发明人为解决上述问题，经过了诸多的试验，目的之一即为提供一种奶制品中褪黑素的提纯方法。
上述的目的是通过下列技术方案来实现的一种奶制品中褪黑素的提纯方法，其包括下列步骤1)将奶制品进行脱脂，过滤后得到脱脂奶；2)将该脱脂奶按常规调整pH为4.4～4.8；3)将步骤2)得到的产物进行离心后取乳清；4)将该乳清用不少于该奶制品3倍体积的乙酸乙酯分三次萃取；5)萃取液去除乙酸乙酯后即得到褪黑素。
其中，步骤1)中所述的脱脂为离心脱脂。
该步骤2)中调整的pH最好为4.6。
所述的离心条件最后为8000rpm，20分钟。
而所述的去除乙酸乙酯最好是经过真空蒸发来实现。
上述的乙酸乙酯最好选用分析纯。
本发明的目的之二则是提供一种利用上述提纯方法，而对奶制品中褪黑素的进行检测的方法。
上述目的是通过下列技术方案来实现一种奶制品中褪黑素的检测方法，其包括根据上述的提纯方法分别分离提纯需检测的样品奶及作为标准的标准奶中的褪黑素，用甲醇溶解，经高效液相色谱分离，用外标法定量，根据峰面积计算出样品奶中的褪黑素含量。
其中，所述的高效液相色谱分离的条件为色谱柱为Nova-Pak C18柱3.9mm×150mm；流动相为体积比为1∶1的甲醇和水；紫外线波长为260nm；流速为1.0mL/min；进样量为10ul。
该标准奶是指由褪黑素标准品溶于未含褪黑素的样品奶中所制得。
而所制得的标准奶中的褪黑素浓度最好分别为1.6、1.2、0.8、0.4mg/kg。
本发明中的奶制品是指普通牛奶或用奶粉、乳清粉、稀奶油或其他牛奶组分配制成的还原奶或含乳饮料。
本发明的方法不仅解决了奶制品中褪黑素的分离提纯问题，且可以准确定量，有利于褪黑素在奶(乳)制品中的应用。
图1为样品奶中褪黑素检测的HPLC曲线图。
具体实施例方式
为更好地说明、理解本发明方法的操作步骤及效果，下面用实施例来具体说明之。
实施例1 样品奶中褪黑素的提纯取50ml含褪黑素的舒睡奶(市售，光明乳业股份有限公司生产)，经离心机8000rpm/20min离心脱脂，玻璃丝过滤后将脱脂奶调至pH4.6，8000rpm/20min离心后取乳清，用150ml乙酸乙酯分三次萃取，用旋转蒸发仪在40℃真空蒸发乙酸乙酯，得到少量产物。
实施例2 褪黑素标准奶的制备准确称取褪黑素标准品(纯度99.9％以上，Sigma公司产品)制成0.04mg/ml水溶液，移取上述溶液2ml、1.5ml、1.0ml、0.5ml于50ml未含褪黑素、但其余成份与样品奶一致的舒睡奶(市售，光明乳业股份有限公司生产)中，配置成褪黑素浓度分别为1.6、1.2、0.8、0.4mg/kg的标准奶。
实施例3 标准奶中褪黑素的提纯取实施例2中褪黑素浓度为1.6mg/kg的标准奶50ml，经离心机8000rpm/20min离心脱脂，玻璃丝过滤后将脱脂奶调至pH4.4，8000rpm/20min离心后取乳清，用300ml乙酸乙酯分三次萃取，用旋转蒸发仪在40℃真空蒸发乙酸乙酯，得到少量产物。
实施例4 标准奶中褪黑素的提纯取实施例2中褪黑素浓度为1.2mg/kg的标准奶50ml，经离心机8000rpm/20min离心脱脂，玻璃丝过滤后将脱脂奶调至pH4.8，8000rpm/20min离心后取乳清，用200ml乙酸乙酯分三次萃取，在40℃真空蒸发乙酸乙酯，得到少量产物。
实施例5 标准奶中褪黑素的提纯取实施例2中褪黑素浓度为0.8mg/kg的标准奶50ml，经离心机8000rpm/20min离心脱脂，玻璃丝过滤后将脱脂奶调至pH4.6，8000rpm/20min离心后取乳清，用150ml乙酸乙酯分三次萃取，在40℃真空蒸发乙酸乙酯，得到少量产物。
用同样方法对褪黑素浓度为0.4mg/kg的标准奶中的褪黑素进行提纯。
实施例6 提纯的褪黑素再处理将实施例1、3、4、5中得到的少量产物分别再用甲醇溶解定容到10ml，用微孔过滤器(Sartorius Minisart TM，0.45um孔径)0.45um微滤膜加压过滤，各滤液待上机测定。
实施例7 高效液相色谱分离(HPLC)及外标法测定利用高效液相色谱仪(Waters2690型)带996型紫外检测器进行高效液相色谱分离，色谱分离条件为色谱柱为Nova-Pak C18柱3.9mm×150mm；柱温40℃；流动相为体积比为1∶1的甲醇(色谱纯，含量＞99.9％)和水(超纯水)；紫外线波长为260nm；流速为1.0mL/min；进样量为10ul。接下来按照常规外标法来进行测定，包括标准曲线绘制将上述实施例6中的标准奶的各滤液依次进样10ul，用HPLC测定各浓度相应的峰面积值，绘制标准曲线；样品测定取实施例6中样品奶滤液10ul注入高效液相色谱仪分离测定，其曲线如图1所示，以标准品峰的保留时间定性，并根据样品组分的峰面积在标准曲线上查出相应组分的含量；结果计算根据标准曲线计算。
上述实施例中的离心机为Beckman Coulter公司的Avanti TM J-301型，旋转蒸发仪为Heidolph公司Laborota 4000型，各试剂均为市售，未特殊说明的甲醇与乙酸乙酯均为分析纯。
权利要求
1.一种奶制品中褪黑素的提纯方法，其包括下列步骤1)将奶制品进行脱脂，过滤后得到脱脂奶；2)将该脱脂奶按常规调整pH为4.4～4.8；3)将步骤2)得到的产物进行离心后取乳清；4)将该乳清用不少于该奶制品3倍体积的乙酸乙酯分三次萃取；5)萃取液去除乙酸乙酯后即得到褪黑素。
2.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于步骤1)中所述的脱脂为离心脱脂。
3.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于步骤2)中调整pH为4.6。
4.根据权利要求1或2所述的提纯方法，其特征在于所述的离心条件为8000rpm，20分钟。
5.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于步骤5)中所述的去除乙酸乙酯是经过真空蒸发实现的。
6.根据权利要求1或5所述的提纯方法，其特征在于该乙酸乙酯为分析纯。
7.一种奶制品中褪黑素的检测方法，其包括根据权利要求1所述的提纯方法分别分离提纯需检测的样品奶及作为标准的标准奶中的褪黑素，用甲醇溶解，经高效液相色谱分离，用外标法定量，根据峰面积计算出样品奶中的褪黑素含量。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于所述的高效液相色谱分离的条件为色谱柱为Nova-Pak C18柱3.9mm×150mm；流动相为体积比为1∶1的甲醇和水；紫外线波长为260nm；流速为1.0mL/min；进样量为10ul。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于该标准奶是指由褪黑素标准品溶于未含褪黑素的样品奶中所制得。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于所制得的标准奶中的褪黑素浓度分别为1.6、1.2、0.8、0.4mg/kg。
全文摘要
一种奶制品中褪黑素的提纯方法，其包括下列步骤1)将奶制品进行脱脂，过滤后得到脱脂奶；2)将该脱脂奶调整pH为4.4～4.8；3)将步骤2)得到的产物进行离心后取乳清；4)将该乳清用不少于该奶制品3倍体积的乙酸乙酯分三次萃取；5)萃取液去除乙酸乙酯后即得到褪黑素。一种奶制品中褪黑素的检测方法，其包括根据上述的提纯方法分别分离提纯需检测的样品奶及作为标准的标准奶中的褪黑素，用甲醇溶解，经高效液相色谱分离，用外标法定量，根据峰面积计算出样品奶中的褪黑素含量。上述两种方法不仅解决了奶制品中褪黑素的分离提纯问题，且可以准确定量。
文档编号A61K31/4045GK1742588SQ200410054289
公开日2006年3月8日 申请日期2004年9月3日 优先权日2004年9月3日
发明者巫庆华, 郑小平, 吴正钧, 孙立国, 苏米亚, 龚广予, 李存瑞, 王荫榆, 郭本恒 申请人:光明乳业股份有限公司