专利名称：Glp－1类似物的制作方法
技术领域：
本发明涉及GLP-1类似物，具体地本发明涉及GLP-1改构多肽，该多肽具有降低血糖作用，性质比母体GLP-1高效、稳定，可用于治疗II型糖尿病。本发明还提供了通过化学合成和重组DNA生产工艺生产这些多肽的方法。
背景技术：
世界各国糖尿病患者人数逐年增多，现在中国有4000万，印度6000万，美国1800万，日本600万，糖尿病患者分为两种，一是胰岛素依赖型糖尿病(I型糖尿病)和非胰岛素依赖型糖尿病(II糖尿病)。其中，II型糖尿病占糖尿病患者的90％以上。
II型糖尿病患者表现了许多特征，如餐后胰岛素分泌量不足，胰岛素分泌时间滞后，高血糖等。肥胖II型糖尿病患者周边细胞胰岛素受体敏感性降低，因而产生血糖高，血液中胰岛素水平也高的情况，糖化血红蛋白，HbAlc在8％以上(正常为4～6％)。接着就会产生糖尿病并发症，如心脏病及肾功能衰竭等。
如今，控制糖尿病的有6类药物●促胰岛素分泌类磺酰脲类，melitioneds类●非胰岛素促分泌药物胰岛素，α-葡萄糖苷酶抑制剂，双胍类及Thioagolinediones。
根据英国UKPDS对数千名II型糖尿病患者的6年跟踪研究报告指出上述6类药物对II型糖尿病患者皆无能为力，不能遏制胰脏β-细胞的不断进行性的恶化，不能降低HbAlc水平，也不能阻止糖尿病的并发症如心脏病、肾衰竭。因此需要研究新的II型糖尿病治疗药物。
1985年发现了一种肠激素GLP-1(7-36)-NH2，其是小肠L-细胞分泌的一种多肽，能促进胰岛素分泌，降低血糖。外源给予GLP-1能使II型糖尿病患者的血糖水平正常化(Diabetes Care(1992)15，270-276；Lancet(2002)359，824-830；Endoer.Rev(1996)16，390-410；Diabetologia(1985)28，565-573)。
GLP-1具有下列功能●能促进胰岛素原的合成，促胰岛素分泌，降低血糖●改善β-细胞功能，增加β-细胞量●增加周边细胞胰岛素受体的敏感性●降低HbAlc(Diabetes(2002)51，1443-1452；Diabetologia(2002)45，1263-73；Diabetes 525-529(2001)；Diabetes(2001)50，725；Diabetes(2003)52，365-371；Recent Prog.Hormne Res.(2001)56，377-399；Disbetologia(1996)39，1546-1553；Am.J.Physicl Endocrinol.Metab.(2001)281，E242-247；J.Clin.Endocrinology and Metabolism(2003)88，3082-3089；Diabetes(2002)Diabetes Care(2002)22403-408(United KingdomProspective Diabetes Study)(UKPDS Reports 57)；N.Engl.J.Med，UKPDS Reports；Diabetes Care(2000)2364-69；Lancet(2002)152072-2077；Diabetes S12796-2803；U.S.patent 477967，478017，478425；Diabetes Care(1999)22403-408；J.Clin.Endocrinology andMetabolism(2003)883082-3089；Diabetes(1995)44，1295；RestoregenReport July 5，2001)。
另外，GLP-1在脑神经细胞中也存在受体，GLP-1通过脑屏障进入脑中与受体结合GLP-1，对老年痴呆症(Alzheimer’s disease)有疗效，使促糊精状β-多肽(Amyloid-β-peptide)含量降低，并能修饰其前体-糊精蛋白前体(Amyloid Protein Precursor，APP)，特别是GLP-1，Exendin4能保护神经原细胞不被氧化剂或谷氨酸作用而凋亡(J.Pharmaceology & Experimental Therapeutics(2002)302881-888；J.Nearosa Res.(2003)72603-612；J.Biol.Chem.(2003)278471-478；J.Alzheimer’s Disease(2002)487-496)。GLP-1对减肥也起重要作用(J.Nutr.(2003)1332326-2330；Inter.J.Obesity(2001)25781-792；J.Chin.Invest.(1998)101515-520；Eur.J.Pharmacology(2002)440269-279)。
在血液中，GLP-1受二肽酶(DPPIV)的作用切除N-端二肽而迅速分解，因此很多人都研究能抵抗二肽酶降解的其改变结构(美国专利No.5118,666；PCT/US 87101005；WO 87/06941；WO 90/11296；PCT/US 89101121)。
1、修饰GLP-1(7-36)的C-端和分子中的氨基酸残基GLP-1(7-36)是由人的小肠L-细胞分泌的多肽，其结构为H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg。
由于GLP-1在血液中受二肽酶(DPPIV)作用迅速降解为GLP-1(9-36)，失去降糖作用，因此为了延长GLP-1的半衰期(t1/2)，世界上很多实验室开展多方面的研究，一种是研究DPPIV的抑制剂如NN2211，有的置换GLP-1分子中的氨基酸残基，如Gly8-GLP-1(7-36)，可以抵抗DDPPIV的降解，但Gly8-GLP-1(7-36)的促胰岛素分泌和降血糖作用比母体GLP-1大为降低，有的将GLP-1(7-37)的AA8置换成D-型氨基酸，如，Ala8-GLP-1，或AA9-GLP-1，结果促胰岛素分泌作用都远远低于母体GLP-1(7-36)。另外，还有将GLP-1的C-端加上6个Lys残基，即GLP-1(7-36)-(Lys)6。还有的将Gly8-GLP-1(7-36)的C-端加上Exendin4的C-端的Ex4(31-33)，Ex4(31-36)和Ex4(31-39)，其中，GLP-1端加Ex4C的9个氨基酸残基的，Gly8-GLP-1(7-36)Ex4-(31-39)恢复到母体GLP-1活性水平能抵抗DPPIV的降解作用。这样GLP-1(7-36)由30个氨基酸残基变成39个与Exendin4肽链长度相同(J.Chin.Endocrinol.Melab.(1995)80952-957；Trend in Pharmacilogical Sci.(2003)24377-383；RegulatoryPeptides(2003)114153-158；WO 03/011892 A2，(2003)；WO01/04156(2001))。
修饰GLP-1侧链基因延长其半衰期t1/2也获得成功(J.Bilh.Chem.27221201-21206(97)；Inter.J.Peptide Protein Res.(1992)40333-343；Endocrinology(1989)1253109-3114；Regulatory Peptides(1999)7993-102，(2003)14151-158；Bilchemistry(2001)402860-2869；US Patent(1992)5118666；WO 03/011892，(PCT/US02/24141)；Trend in PharmacologicalSci.24(2003)378-383；J.Med.Chem.(2000)431664-1669；Diabetologia(1998)41271-278)。
2、修饰GLP-1(7-36)的N-端GLP-1(7-37)，GLP-1(7-36)的N-末端的His之外加1个或几个氨基酸残基或除去两个氨基酸残基，则无促胰岛素分泌作用，如GLP-1(1-37)，GLP-1(6-37)，GLP-1(8-37)都没有促胰岛素分泌作用(Endocribology(1989)1283109-3114；Regulatory Peptide(1999)7993-102；Biochemistry(2001)402860-69)。
迄今为止，对GLP-1(7-36)的分子修饰结果，综合列于表中N-端修饰7 36GLP-1(7-36) HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFLAWLVKGRPhe7-GLP-1(7-36)FAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFLAWLVKGRTyr7-GLP-1(7-36)YAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFLAWLVKGRAc7-GLP-1(7-36)AcHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFLAWLVKGRGLP-1(8-37) _AEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFLAWLVKGRGGLP-1(1-37)XXXXXXHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFLAWLVKGRGAA8-GLP-1(7-37)HXEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFLAWLVKGRGX＝Ser，Thr，Gly，Aib，d-Ala，LeuC-端修饰7 36GLP-1(7-35) HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFLAWLVKG_
GLP-1(7-36)Ex-4(31-39)HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFLAWLVKGRPSSGAPPPSG8-GLP-1(7-36) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFLAWLVKGRG8-GLP-1(7-36)Ex-4(31-33)HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFLAWLVKGRPSSG8-GLP-1(7-36)Ex-4(31-36)HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFLAWLVKGRPSSGAPG8-GLP-1(7-36)Ex-4(31-39)HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFLAWLVKGRPSSGAPPPS然而，上述GLP-1的分子结构改变都没有获得显著提高的GLP-1降糖作用。本发明通过对GLP-1改构研究获得GLP-1类似物，这些类似物表现出比母体大为提高的降血糖作用和稳定性，适于治疗II型糖尿病。另外，本发明不采用体外(in vitro)的GLP-1受体结合能力，cAMP的形成能力和促胰岛瘤细胞分泌胰岛素的方法，而直接利用体内(in vivo)降血糖效果来评价GLP-1的结构与活性的关系，这种直接测定降血糖作用对II型糖尿病的临床应用有直接指导意义。
发明概述本发明提供了GLP-1类似物，该GLP-1类似物具有式I的通式1 1020 30HX1FGTFTSDVSSYLEGQAAKEFLAWLVKGPPSX2(式I)X1＝Ala或Gly，X2＝Arg-OH、OH或NH2另外本发明还提供了制备上述GLP-1类似物的方法，使向广大的II型糖尿病患者大量提供GLP-1治疗药物成为可能。
附图的简要说明
图1是合成的GLP-1类似物基因片断序列图；图2是基因工程法生产GLP-1类似物的流程图；图3是含多拷贝GLP-1基因的质粒的构建示意图；图4是用固相合成法合成GLP-1(7-35)-PPSR和G8-GLP-1(7-35)-PPSR的示意5A-C是本发明GLP-1类似物的降血糖效果图；图6是本发明GLP-1类似物的促胰岛素分泌效果图。
发明详述本发明的一个方面提供了结构发生改变，而降糖活性更高更稳定的式(I)的GLP-1类似物。优选地，X1为Ala或Gly，X2为Arg-OH。此时，GLP-1类似物的结构式为His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Leu-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Pro-Pro-Ser-Arg-OH或His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Leu-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Pro-Pro-Ser-Arg-OH分别简称为GLP-1(7-35)-PPSR和Gly8-GLP-1(7-35)-PPSR。
同理，当X1为Ala，X2为OH或NH2时分别简称为GLP-1(7-35)-PPS-OH和GLP-1(7-35)-PPS-NH2；当X1为Gly，X2为OH或NH2时分别简称为Gly8-GLP-1(7-35)-PPS-OH和Gly8-GLP-1(7-35)-PPS-NH2。
本发明的另一方面提供了含有上述GLP-1类似物的组合物，该组合物含有一种或多种式I的化合物和一种药学上可接受的稀释剂或赋形剂，优选地该组合物为单位剂量形式，如片剂、丸剂、胶囊(包括持续释放或延迟释放形式)、粉剂、颗粒、酏剂、酊剂、糖浆和乳液，消毒的注射用溶液或悬液，气雾剂或液体喷剂，滴剂、针剂、自动注射装置或栓剂。例如，以片剂或胶囊地形式口服给药，上述活性药物组分可以与一种口服的无毒的药学可接受的惰性载体，如乙醇、甘油、水及其类似物结合。另外，本发明还提供了上述化合物及药物组合物的在制备治疗疾病中的用途，优选地该疾病是糖尿病。
本发明的又一个方面提供了制备上述GLP-1类似物的方法，包括化学合成方法和基因工程方法。对于X2＝NH2的类似物，可以使用化学方法来合成。对于X2＝Arg-OH或OH的类似物可以既可以用化学合成法生产，也可以用基因工程方法生产，优选使用基因工程方法。其中的化学方法优选是固相合成法。当然还可以采用本领域公知的其它常规方法来合成。
多肽的基因工程生产方法与蛋白相比有一定难度，在应用基因工程技术制备象GLP-1这样的分子量较小的中等长度的多肽时，为避免细胞将表达出来的较小分子量的多肽消化掉，通常的方法是将它的基因与另一分子量较大的载体蛋白(carrier protein)的基因联接在一起，再以融合蛋白的形式表达出来。另外，融合蛋白要经过适当的方法进行裂解、分离等才能得到目的多肽，受到许多技术方面的限制。一般的基因工程方法得到的融合蛋白中GLP-1含量较少，裂解后在复杂蛋白混合物中，进一步分离纯化GLP-1难度很大，无生产使用价值。
通过分析研究，本发明将n个(n＝2～32)表达GLP-1类似物的基因串联起来进行质粒构造(图3)。应用这种独特的思路构建的基因工程菌，其表达的融合蛋白是由n个GLP-1类似物组成，再经过用适当的方法裂解，就可产生n个GLP-1类似物。这样不仅提高了GLP-1类似物的表达量，也大大减少了下游加工的步骤，从而为大批量低成本生产GLP-1类似物奠定了很好的技术基础。根据GLP-1类似物的氨基酸序列，选择大肠杆菌使用频率最多的密码子合成四个相应的DNA片段。
实施例1用基因工程方法生产GLP-1(7-35)-PPSR材料克隆载体含lac启动子质粒；宿主菌JM103Promega公司；T4多核苷酸激酶试剂盒Promega公司；T4连接酶试剂盒Promega公司；限制性内切酶EcoR I、Sal I、Bgl II、BamH I试剂盒Promega公司；分子量标准λDNA、φ×174DNAPromega公司；低分子量标准蛋白质上海思吉生物制品有限公司；ATP(Adenosine-5’-triphosphate，腺苷-5’-三磷酸)Boehringer Mannheim公司；丙烯酸胺E.Merck；甲叉双丙烯酰胺Fluka；溴乙锭(Ethidum bromid)Serva；TrisA.R上海思吉生物制品有限公司(进口分装)；SDSA.R上海思吉生物制品有限公司(进口分装)。
LB培养液胰胨(Tryptone)Oxoid，酵母浸出粉Oxoid，氯化钠(A.R)中国医药集团上海化学试剂站。
其他化学试剂均为AR级，中国医药集团上海化学试剂站提供。
基因片段的连接1)5’-AAT TCC AGA TCT ATG CGT CAC GCG GAA GGT ACC TTCACC AGC GAT GTG GTG AGC AGC TAT CTG-3’2)5’-GAA GGT CAG GCG GCG AAA GAA TTT ATC GCG TGG CTGGTG AAA GGT CCG CCG AGC CGT TCC TAG G-3’3)5’-TGGAC CTA GGA TCC ACG GCT CGG CGG ACC TTT CACCAG CCA CGC GAT AAA TTC TTT CGC CGC CTG-3’4)5’-ACC TTC CAG ATA GCT GCT CAC ATC GCT GGT GAA GGTACC TTC CGC GTG ACG CAT AGA TCT GG-3’将以上四个基因片段(含量均为A260nm＝3(0.D.))各加双蒸水30μl。取正负链DNA片段各2μl分别混合于两个塑料管中(即(1)+(3)和(2)+(4))，并加入下列试剂进行5’端磷酸化反应
混合后于37℃保温30分钟，然后于水浴中加热至95℃，维持3分钟后徐徐退火，自然冷却至室温。再将退火后的二个双股DNA片段混合(即(1+3)+(2+4))，并加入下列试剂
混匀后，于16℃维持过夜使之连接。然后经过12％PAGE或1％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，以λDNA/EcoR I，Sal I双酶切DNA片段或φ×174DNA/SalI酶切片段为分子量标准参照物，分取连接的基因片段经过抽提、回收、干燥，溶解备用。
如图1所示，将获得的基因片断用EcoR I/Sal I双酶切，从而获得粘性末端。
GLP-1基因的克隆取含有Lac启动子的质粒1μg(1μg/ml)，加1×10中盐缓冲液1μl，新制备的双蒸水6μl，然后加入限制性内切酶EcoRI、SalI各1μl，于37℃保温30分钟，经氯仿-酚试剂抽提，并用氯仿洗涤水层后，用60％异丙醇沉淀，离心、干燥后备用。
用4μl双蒸水溶解上述质粒片段，并与连接所得的GLP-1类似物基因片段2μl混合，加1×10连接酶缓冲液1μl、ATP 1μl、及T4连接酶2μl，于16℃连接过夜。
如图3所示，可以将获得的质粒经限制内切酶BamH I/Sal I双酶切后，再与经Bg III/Sal I双酶切的上述基因片断连接，就可以得到含双基因片断的质粒。反复进行该步骤可以得到含有2-32个拷贝的质粒。
转化取一个大肠杆菌JM103的单菌落，置LB培养液中过夜，从中取500μl接种于100mlLB培养液中，于37℃振荡培养，当菌体浓度达A600nm＝0.6(0.D.)时停止。于6000rpm离心，收集菌体，菌体悬浮于2ml0.1mol/LMgCl2溶液中，于冰浴中维持20分钟。再于6000rpm离心，收集菌体，重新悬浮于2ml 0.1mol/LCaCl2溶液中，置冰浴中保存备用；或加15％甘油，于-84℃冷冻备用。
取以上感受态细胞100μl，加入含GLP-1类似物基因的Lac启动子质粒，于冰浴中维持30分钟，然后转移至42℃维持2分钟，冷却，涂板(1％琼脂粉，含50μg/ml氨苄青霉素(AP))，37℃培养过夜；挑取菌落，分别转移至含50μg/ml AP的LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜，以备抽提质粒鉴定用。与此同时，将所提取的每个单菌落都划线于LB-琼脂平板上，经37℃培养过夜，得到工程菌P lac/E8，作留种用(备用种)。
发酵发酵使用LB培养液，含蛋白胨10g，酵母粉5g及NaCl 10g/L。
接种P lac/E8工程菌于10升发酵液中进行发酵，条件为搅拌速度500rpm，通气量为每分钟一个罐体积，37℃，pH7～8，溶氧30～50％。发酵20小时后6000rpm离心收集菌体，菌体悬浮于20mmol/L磷酸缓冲液中(含NaCl 1mol/L)。按1000∶1加溶菌酶，30℃保温1小时，进行破壁，破壁后离心(10,000rpm)收集沉淀。沉淀悬浮于4倍体积的6M的盐酸胍中，搅拌抽提过夜，20,000rpm离心，将上清夜对水透析，10,000离心收集沉淀，得包涵体。将包涵体湿重100g悬浮于1000ml水中，搅拌条件下滴加10ml 2-甲基琥珀酸酐，过程中不断添加少量Na2CO3粉剂，维持溶液PH8-9，反应2小时，使之完全，然后对水透析去盐。在PH7.0，20mmole/L磷酸缓冲液中加胰蛋白酶(1∶1000w/w)37℃保温2小时裂解，用4mole/L盐酸调节PH2-3，搅拌维持4小时除去保护基，经HPLC纯化，梯度是A相含0.5％的甲酸水溶液；B相含乙腈80％(v/v)及甲酸0.5％的溶液。A相，B相溶液以线形梯度洗脱，20ml/分钟流速280nm，220mM紫外波长检测，得纯品GLP-1类似物。整个工艺流程见图2。
实施例2用基因工程方法生产G8-GLP-1(7-35)-PPSR1)5’-AAT TCC AGA TCT ATG CGT CAC GGT GAA GGT ACC TTCACC AGC GAT GTG AGC AGC TAT CTG-3’2)5’-GAA GGT CAG GCG GCG AAA GAA TTT ATC GCG TGG CTGGTG AAA GGT CCG CCG AGC CGT GGA TCC TAG G-3’3)5’-TGGAC CTA GGA TCC ACG GCT CGG CGG ACC TTT CACCAG CCA CGC GAT AAA TTC TTT ACC CGC CTG-3’4)5’-ACC TTC CAG ATA GCT GCT CAC ATC GCT GGT GAA GGTACC TTC CCA GTG ACG CAT AGA TCT GG-3’用上述4个基因片断代替实施例1中的4个基因片断，克隆方法、融合蛋白的分离、纯化、裂解均与实施例1相同。
实施例3、用固相合成法合成GLP-1(7-35)-PPSR和G8-GLP-1(7-35)-PPSR化学结构(1)GLP-1(7-35)-PPSRH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Pro-Pro-Ser-Arg-NH2(2)G8-GLP-1(7-35)-PPSRH-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Pro-Pro-Ser-Arg-NH2固相树脂的选择当多肽C-末端为羧基时选择常规的王树脂(Wang Resin，购于上海吉尔生化公司)进行固相合成。在合成结束后，将得到的带侧链保护基的多肽树脂进行裂解(即脱保护基和切断树脂一步完成)，而多肽的C-末端就从王树脂上断裂下来形成羧基。
当多肽C-末端为酰胺时选择常规的氨基树脂(Fmoc-PAL-PEG-PS Resin，购于PE AppliedBiosystem公司)进行固相合成。在合成结束后，将得到的带侧链保护基的多肽树脂进行裂解(即脱保护基和切断树脂一步完成)，而多肽的C-末端就从氨基树脂上断裂下来形成酰胺。
合成步骤17种带侧链保护基的Fmoc-氨基酸原料→固相合成→脱侧链保护基→HPLC纯化→冷冻干燥→GLP-1(7-35)-PPSR/G8-GLP-1(7-35)-PPSR1.氨基酸单体氨基酸名称 来源Fmoc-L-Ala-OH Peptide Institute.Inc.
Fmoc-L-Arg(Pmc)-OH Peptide Institute，Inc.
Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH Peptide Institute，Inc.
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH Peptide Institute，Inc.
Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH PE Applied BiosystemFmoc-L-Gly-OH Peptide Institute，Inc.
Fmoc-L-His(Trt)-OHPeptide Institute，Inc.
Fmoc-L-Ile-OH Peptide Institute，Inc.
Fmoc-L-Leu-OH Peptide Institute，Inc.
Fmoc-L-Lys(Trt)-OHPeptide Institute，Inc.
Fmoc-L-Phe-OH Peptide Institute，Jnc.
Fmoc-L-Pro-OH Peptide Institute，IncFmoc-L-Ser(tBu)-OHPeptide Institute，Inc.
Fmoc-L-Thr(tBu)-OHPeptide Institute，Inc.
Fmoc-L-Trp-OH Peptide Institute，Inc.
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OHPeptide Institute，Inc.
Fmoc-L-Val-OH Pentide Institute，Inc.
2.固相合成的过程如图4所示，固相合成系将GLP-1(7-35)-PPSR的C-末端精氨酸先连接在氨基树脂上，然后一个一个氨基酸从C-端向N-端延伸，共进行33步。
(1)仪器设备Applied Biosystem多肽合成仪，433A型(2)试剂
其中DMF＝N，N-二甲基甲酰胺，DIEA＝N，N-二异丙基乙胺，NMP＝N-甲基吡咯烷酮，DMAP＝二甲氨基吡啶，HOBT＝1-羟基苯并三唑，HBTU＝2-(1H-苯并三唑-基-1，1，3，3-四甲基-Uroniumhedrofluorophosphate。
(3)操作以0.25mmole规模为例，称取树脂约0.5g，置入多肽合成仪上的反应器中，将各种带保护基氨基酸称取1mmole装瓶，按GLP-1(7-35)-PPSR/G8-GLP-1(7-35)-PPSR的氨基酸序列从C-端向N-端排列在合成仪中，于25℃室温条件下，由电脑程序(SynthAssiat)控制自动进行脱Fmoc保护、活化、连结，按图所示再进行下一轮循环，如此进行33步完成合成。
氨基酸缩合过程中，需要将羧基活化，一般有HBTU-Fast moc法，HOBt/DCC法，通用的DCC，酸酐法等方法。我们采用HBTU-Fast moc法进行羧基活化，如下图。
当合成结束后，将得到的带侧链保护基的多肽树脂在多肽合成仪上吹干后称重，接着脱保护基和切断树脂一步完成。
3.脱保护基及切断树脂(1)仪器设备磁力搅拌仪(2)试剂
将带保护基的GLP-1(7-35)-PPSR/G8-GLP-1(7-35)-PPSR多肽树脂置于具塞三角烧瓶，加入裂解试剂如下表
然后在恒温30℃条件下，电磁搅拌反应6小时；过滤、收集滤液，树脂用少量三氟乙酸洗涤；合并收集液与洗涤液，加入乙醚(约200～250mL)产生沉淀，过滤，沉淀用少量乙醚洗涤后立即放入干燥器中。
4.HPLC分离纯化仪器设备
试剂
通过两步HPLC反相层析来制备得到纯度为95％以上的产品。
(1)第一步粗分a).色谱柱采用C18介质的反相层析柱。
b).流动相A相含0.5％(v/v)乙酸的水溶液；B相含乙睛80％(v/v)和0.5％(v/v)乙酸的水溶液；c).上样溶液将多肽-树脂经裂解去除树脂及侧链保护基的多肽粗品(纯度约30～50％)用0.5％乙酸溶液配成浓度为5.0mg/ml的溶液。
d).冼脱条件采用线性梯度冼脱，操作流速为20ml/min，紫外检测波长为280nm，柱温为室温，洗脱梯度为
e).样品收集收集20～60％B的冼脱主峰，产品纯度约75～85％。
(2)第二步精制a).色谱柱采用C18介质的反相层析柱。
b).流动相与第一步粗分相同。
c).上样溶液将第一步粗分得到的收集液(纯度约75～85％)加同体积的双蒸水稀释。
d).洗脱条件采用分段逐次冼脱，操作流速为20ml/min，紫外检测波长为280nm，柱温为室温，冼脱程序为30％B2个柱体积→35％B2个柱体积→50％B6个柱体积；e).样品收集收集50％B的冼脱液，产品的纯度＞95％。
5.冷冻干燥(1)仪器设备
(2)操作先将GLP-1(7-35)-PPSR或G8-GLP-1(7-35)-PPSR溶液放入低温冰箱中冷冻2小时，然后将其放进冷冻干燥设备中进行冻干得到所需化合物。
实施例4、GLP-1(7-35)-PPS-NH2的合成利用多肽合成仪(Applied Biosystem)按实施例3所述固相合成方法进行。
实施例5、G8-GLP-1(7-35)-PPSOH的合成如实施例4所述方法进行。
实施例6、G8-GLP-1(7-35)-PPS-NH2的合成如实施例4所述方法进行。
实施例7、G8-GLP-1(7-35)-PPSR的降血糖作用取C57小鼠(中国科学院上海动物中心)，8周龄(体重20g)，9只，分为3组。只给饮水，禁食过夜。
对照组0时，眼窦取血30μl，置于0.3ml 0.90％NaCl溶液中，然后腹腔注射20％葡萄糖溶液200μl，分别于60，120，150，180分钟同样采血，其中于120分钟时第二次腹腔注射20％葡萄糖200μl。血样经3000rpm离心5分钟后，使血球沉淀，取全部离心上清液，以国家卫生部，上海生物制品研究所出品的血糖测定试剂盒进行血糖测定。
GLP-1(7-36)组，按照对照组同样方法，0时取血后腹腔注射20％葡萄糖溶液200μl，皮下注射GLP-1(7-36)2μg，血糖测定按对照组同样方法进行。
G8-GLP-1(7-35)-PPSR组，按GLP-1(7-36)组同样方法进行。
三组降血糖测定结果如图5A所示，说明G8-GLP-1(7-35)-PPSR比GLP-1(7-36)更具长效性。
实施例8、GLP-1(7-35)-PPSR及其它化合物的降血糖作用按实施例7同样方法测定GLP-1(7-35)-PPSR和本发明的其它化合物的降血糖作用，结果见图5B和5C。
实施例9、G8-GLP-1(7-35)-PPSR的促胰岛素分泌作用C57小鼠(体重20g)禁食过夜，腹腔注射40％葡萄糖100μl，第一组仅给葡萄糖，皮下注射生理盐水100μl，第二组给糖后皮下注射GLP-1类似物溶液100μl(2μg含药量)，于0，2，5，10，20，30，60，90，120min取血20μl，吹入离心管中(预加20μl EDTA 1％)，离心取血清用胰岛素试剂盒(Crystal Chem Inc)测胰岛素(图6)。
权利要求
1.GLP-1类似物，其具有如下结构式HX1FGTFTSDVSSYLEGQAAKEFLAWLVKGPPSX2X1＝Ala或Gly，X2＝Arg-OH，OH或NH2。
2.如权利要求1所述的GLP-1类似物，其中所述的X1是Gly。
3.如权利要求1所述的GLP-1类似物，其中所述的X1是Ala。
4.如权利要求1-3任一项所述的GLP-1类似物，其中所述的X2是Arg-OH。
5.如权利要求1-3任一项所述的GLP-1类似物，其中所述的X2是OH。
6.如权利要求1-3任一项所述的GLP-1类似物，其中所述的X2是NH2。
7.一种药物组合物，其含有如权利要求1-6任一项所述的GLP-1类似物。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其还含有药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述的载体选自如乙醇、甘油、水。
10.如权利要求1-6任一项所述的GLP-1类似物在制备治疗糖尿病的药物中的用途。
11.如权利要求10所述的用途，其中所述的糖尿病是II型糖尿病。
12.如权利要求7-9任一项所述的药物组合在制备治疗糖尿病药物中的用途。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述的糖尿病是II型糖尿病。
全文摘要
本发明提供了GLP－1类似物，该类似物是GLP－1的改构多肽，该多肽具有降低血糖作用，性质比母体GLP－1高效、稳定，可用于治疗II型糖尿病。另外，本发明还提供了制备上述多肽的方法。
文档编号A61K38/22GK1746188SQ200410054299
公开日2006年3月15日 申请日期2004年9月6日 优先权日2004年9月6日
发明者孙玉琨, 张培璋, 周波 申请人:上海华谊生物技术有限公司