专利名称：一种复合辅酶药的制备方法及其复合辅酶药和临床的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，特别涉一种新的复合辅酶药的制备方法及一种新型复合辅酶药和临床的新用途。
背景技术：
70年代研制出一种注射用复合辅酶冻干粉针剂，它是一种从酵母菌(啤酒酵母、食用酵母和白地霉)中提取，含有辅酶A(CoA)、辅酶I(NAD)，ATP和谷胱甘肽的天然辅酶复合制剂。长期以来用于治疗急慢性肝炎、原发性血小板减少性紫癜、血小板减少症，对冠状动脉硬化、慢性动脉炎、心肌梗塞、肾功能衰弱引起的少尿、尿毒症等可作为辅助治疗药。
酵母是单细胞真核生物，其细胞中含有糖、脂肪、蛋白质、核酸等生物物质代谢(合成和分解)必须的各种辅酶。但由于原生产工艺使用了加热破壁，真空减压浓缩，透析等老生产工艺，导致多种辅酶失活及降解破坏，从而影响了其辅酶种和临床应用的范围。
发明内容
本发明的目的是为克服已有技术的不足之处，提出一种新的复合辅酶药的制备方法及其复合辅酶药和临床的用途，通过改变已有的复合辅酶的生产工艺，使得原复合辅酶药物产品中的辅酶物质从原有的四种增加到九种；该复合辅酶能保护多种细胞免受缺氧损伤，维持或恢复其正常代谢，使它能用于心脏、肝脏手术，肝损伤恢复，射线或化疗引起的细胞损伤恢复等临床治疗。
本发明提出的一种复合辅酶药制备方法，包括以下步骤1)将新鲜酵母加5-8倍PH值为PH3.0～5.0、0.01M～0.03M醋酸缓冲溶液制成酵母细胞悬液；2)用高压均质机在70～150Mpa压力破碎酵母细胞的细胞壁，破碎时温度维持在0℃～20℃；3)将破碎后的酵母细胞悬液冷冻离心，冷冻离心条件为0℃～5℃，速度为20000～35000CPM，时间30～60分钟，得到清液；4)用活性炭吸附滤出液，浓缩用含2.0～3.5％氨的40％乙醇溶液洗脱；5)采用离子交换层析将解析液调PH7.5-9.0，上阴离子交换柱，用PH8.0～9.0，0.01～0.03M磷酸缓冲液溶液洗脱；6)洗脱液经截流分子量为5000-10000超滤；
7)超滤液经纳滤或反渗透去H2O，浓缩至原体积1/5-1/10，调PH2.5～3.5，加5～10倍体积，-10℃～-20℃冷丙酮，收集沉淀；9)沉淀溶于水后除菌灌封、冻干。
采用上述制备方法的复合辅酶药，其辅酶成分含有辅酶A(CoA)、辅酶I(NAD)、谷胱苷肽(GSH)，腺三磷(ATP)其特征在于，还含有黄素单核苷酸(FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、腺二磷(ADP)、腺一磷(AMP)、腺苷蛋氨酸(SAM)。
上述的复合辅酶不但用于急慢性肝炎、原发性血小板减少性紫癜、血小板减少症，作为冠状动脉硬化、慢性动脉炎、心肌梗塞、肾功能衰弱引起的少尿、尿毒症的辅助治疗药，还用于心脏手术、心肌缺氧、脑缺氧、农药中毒、放射线病的治疗药物及各种组织细胞的缺氧损伤、物理和化学损伤的保护药物。
本发明的特点及效果本发明的制备方法使用了高压均质机破碎细胞代替原来的加热破壁；使用超滤技术代替原来的透析法；使用反透析和纳滤代替原来的真空减压浓缩；使得原复合辅酶药物产品中的辅酶物质从原有的四种增加到九种，并经动物实验表明新复合辅酶能保护多种细胞免受缺氧、自由基损伤，维持或恢复其正常代谢，使它能用于心脏、肝脏手术，肝损伤恢复，射线、化疗和手术引起的细胞损伤恢复等临床治疗。
具体实施例方式
实施例1新鲜面包酵母加5倍PH4.0 0.01M醋酸缓冲溶液制成酵母细胞悬液；用高压均质机在100Mpa压力破碎酵母细胞，维持细胞悬液20℃以下；5℃条件下将破碎后的酵母细胞悬液冷冻离心，速度为20000CPM离心60分钟得清液；活性炭吸附，用含2％氨的40％氨乙醇溶液解吸，解吸液调PH8.0，上Ambrite IRC50离子交换柱，用PH8.5，0.02M磷酸液冲液洗脱；洗脱液用截流分子量8000的超滤器超滤，滤出液经纳滤浓缩去H2O，浓缩至原体积1/10，调PH3.5，加5倍体积，-10℃冷丙酮沉淀，收集沉淀，溶于无热原水中，除菌灌封、冻干。
测定各有机成分的浓度，除菌封冻干。
产品分析结果
实施例2新鲜啤酒酵母加6倍PH3.0、0.03M醋酸缓冲液，用高压均质机在70Mpa压力下破碎细胞，维持细胞破碎液10℃以下，3℃条件下30000 CPM离心45分钟，得清液；用截流分子量为8000的超滤膜超滤；活性炭吸附，用含3.0％氨的40％氨乙醇解析；解析液调PH至7.5上Ambrite IRC 50离子交换柱，用PH9.0，0.01M磷酸缓冲液洗脱；洗脱液经截流分子量为5000的超滤膜超滤；超滤液用反渗透去H2O浓缩至原体积1/5，调PH2.5，加10倍体积-15℃的冷丙酮，0℃过夜，次日收集沉淀。将沉淀溶于无热原水，测定各成分的浓度，除菌灌封、冻干。
产品分析结果
实施例3将新鲜食用酵母，加8倍PH4.5，0.01M醋酸缓冲溶液；用高压均质机，在150Mpa压力下，破碎酵母细胞，维持破碎液在5℃以下；0℃条件下离心35000cpm，30分钟得到清液；收集滤出液；活性炭吸附滤出液，用含3.5％氨的40％乙醇解析；解析液调PH至9.0，上Ambrite IRC 50离子交换柱，用PH8.0、0.03M磷酸缓冲液洗脱，洗脱液经截流分子量为9000的超滤膜超滤，超滤液经反渗透浓缩至原体积1/8，调PH3.0，加8倍体积-20℃的冷丙酮，次日收集沉淀。将沉淀溶于无热原水，测定各成分的浓度，除菌灌封、冻干。
产品分析结果
实施例4将新鲜白地霉加5倍PH3.0，0.01M醋酸缓冲液；用高压均质机150Mpa压力下，破碎细胞，破碎液维持15℃以下；4℃30000cpm离心35分钟，得清液；活性炭吸附，用含2.0％氨的40％乙醇解吸，解吸液调PH8.5，上Ambrite IRC 50离子交换柱，用PH8.5，0.02M磷酸缓冲液洗脱，洗脱液经截流分子量为5000的超滤膜超滤，滤液经纳滤浓缩成原体积的1/8，调PH3.5，加10倍-15℃冷丙酮，置0℃过夜，收集沉淀。溶于一定量的无热原水，测定各成分并经除菌灌封、冻干。
产品分析结果
用本发明的复合辅酶，对心脏复苏(CPR)后大鼠甲状腺的保护作用，说明如下使用窒息(琥珀酰胆碱)合并0.5M冰氯化钾停跳液致大鼠心跳骤停，5分钟后开始心肺复苏。实验分三组①对照组为假手术组(不经窒息、心跳骤停和心肺复苏过程之大鼠)；②常规复苏组为心肺复苏后24小时组；③复合辅酶实验组。常规药物复苏同时给予复合辅酶(按一支/10Kg)生理盐水稀释后腹腔注入，复苏后12小时再给同等剂量。每组8只大鼠。
(1)试验大鼠血清甲状腺素T3、T4促甲状腺激素的变化如表I所示表1血清T3、T4、TSH变化(X±S)
与对照组比与对照组比*P＜0.05，与常规复苏组比#P＜0.05。
结果表明CPR会造成血清T3、T4、TSH浓度明显下降，但常规复苏组明显低于复合辅酶组，两组T3、T4的差别有显著性。
(2)甲状腺组织中MDA(丙二醛)合量，超氧化物歧化酶(SOD)活力和Na+-K+-ATPase活力的变化如表2所示表2各组组织中MDA含量、SOD活力、Na+-K+-ATPase活力(X±S)
与对照组比与对照组比*P＜0.05，与常规复苏组比#P＜0.05。
结果表明常规复苏组甲状腺组织MDA含量明显高于对照组，且明显高于复合辅酶组，而SOD和Na+-K+-Atpase活力低于对照组，并显著低于复合辅酶组。
(3)实验鼠原位末端转移酶标记(Tunel标记)变化如表3所示表3各组TUNEL.阳性细胞数平均灰度值(X±S)
与对照比*P＜0.05，与常规复苏组比#P＜0.05。
结果表明常规复苏组Tunel阳性细胞较明显高于对照组，并显著高于复合辅酶组，其平均灰度值明显低于对照组并低于复合辅酶组，常规组与复合辅酶组间的差异有统计学意义。
(4)试验大鼠Fas表达差异的研究如表4所示
与对照比*P＜0.05，与常规复苏组比#P＜0.05。
结果显示复合辅酶组Fas基因表达阳性细胞数和平均灰度与常规复苏组比较有显著性差异。
以上四组试验表明1.复合辅酶提高了CPR大鼠SOD、Na+-K+-ATPase活力，改善组织细胞能量代谢对抗氧自由基的损伤，并表现为组织中脂质过氧化降解产物MDA的合量低于常规复苏组。
2.复合辅酶下调了调亡相关基因Fas的表达，而且表现为调亡细胞(Tunel阳性细胞)的明显减少，从而减轻了缺氧、灌注引发的组织细胞损伤，对CPR后大鼠具有保护作用。
3.复合辅酶减轻了复苏后大鼠血清甲状腺激素改变的程度，有益于改善心跳暂停和CPR的预后。
权利要求
1.一种复合辅酶药制备方法，包括以下步骤1)将新鲜酵母加5-8倍PH值为PH3.0～5.0、0.01M～0.03M醋酸缓冲溶液制成酵母细胞悬液；2)用高压均质机在70～150Mpa压力破碎酵母细胞的细胞壁，破碎时温度维持在0℃～20℃；3)将破碎后的酵母细胞悬液冷冻离心，冷冻离心条件为0℃～5℃，速度为20000～35000CPM，时间30～60分钟，得到清液；4)用活性炭吸附滤出液，用含2.0～3.5％氨的40％乙醇溶液洗脱；5)采用离子交换层析将解析液调PH7.5-9.0，上阴离子交换柱，用PH8.0～9.0，0.01～0.03M磷酸缓冲液溶液洗脱；6)洗脱液经截流分子量为5000-10000超滤；7)超滤液经纳滤或反渗透去H2O，浓缩至原体积1/5-1/10，调PH2.5～3.5，加5～10倍体积，-10℃～-20℃冷丙酮，收集沉淀；9)沉淀溶于水后除菌灌封、冻干。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述新鲜酵母菌为新鲜的啤酒酵母、面包酵母、食用酵母或白地霉之一种。
3.采用如要求1所述制备方法的复合辅酶药，其辅酶成分含有辅酶A、辅酶I、谷胱苷肽、腺三磷，其特征在于，还含有黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、腺二磷、腺一磷、腺苷蛋氨酸。
4.如权利要求3所述的复合辅酶，其特征在于，所述辅酶成分的浓度如下FAD 2～20ug/mlFMN 2～20ug/mlADP 0.1～0.5mg/mlAMP 0.1～0.5mg/mlSAM 1～20ug/mlCoA 100～300U/ml、NAD 0.1～0.5mg/ml、ATP 0.1～2.5mg/mlGSH 1～5mg/ml
5.如权利要求3所述的的复合辅酶，其特征在于所述辅酶中ATP、ADP、AMP的比例是EE=ATP+1/2ADPATP+ADP+AMP=0.30~0.95]]>之间
6.一种如权利要求3所述的复合辅酶不但用于急慢性肝炎、原发性血小板减少性紫癜、血小板减少症，作为冠状动脉硬化、慢性动脉炎、心肌梗塞、肾功能衰弱引起的少尿、尿毒症的辅助治疗药，还用于心脏手术、心肌缺氧、脑缺氧、农药中毒、放射线病的治疗药物，及心肌细胞、肝脏细胞和神经细胞的缺氧损伤、物理和化疗损伤的保护药物。
全文摘要
本发明涉及一种复合辅酶药的制备方法及其复合辅酶药和临床的用途，属于医药技术领域，本发明的复合辅酶药，其辅酶成分含有辅酶A(CoA)、辅酶I(NAD)、谷胱苷肽(GSH)，腺三磷(ATP)其特征在于，还含有黄素单核苷酸(FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、腺二磷(ADP)、腺一磷(AMP)、腺苷蛋氨酸(SAM)。本发明通过改变已有的复合辅酶的生产工艺，使得原复合辅酶药物产品中的辅酶物质从原有的四种增加到九种；该复合辅酶能保护肝细胞、心肌细胞等多种细胞，维持或恢复其正常代谢，使它能用于心脏、肝脏手术，肝损伤恢复，射线或化疗引起的细胞损伤恢复等临床治疗。
文档编号A61P39/00GK1586502SQ20041005808
公开日2005年3月2日 申请日期2004年8月13日 优先权日2004年8月13日
发明者郑昌学 申请人:北京奥路特生物医药研发有限公司, 海南康永药品有限公司, 北京苏里曼医药科技有限公司