专利名称：一种中药组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药组合物，特别涉及用于抑制流感病毒、上呼吸道感染病毒、SARS病毒和细菌的中药组合物。
背景技术：
流行性感冒又称流感，是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，流感发病不受季节限制，一年四季均可发生，但以秋冬季节发病率最高，由于流感病毒存在于病人的鼻涕、口涎、痰液等分泌物中，极易传染而引起流行。根据世界卫生组织的统计，每年世界有6亿至12亿人感染流感，死亡25万至50万人，流感的发病率为15.6％。迄今尚无针对病毒的理想西药。流感在中医属于瘟病的范畴，中医药防治流感有一定的优势，但也没有作用明确的中成药。
上呼吸道感染由细菌和病毒所致，特别是病毒性上呼吸道感染，是人类最常见的疾病之一，其症状可轻可重，目前医学界尚无特效药，治疗上仅以支持对症治疗为主。上呼吸道感染在中医属于外感病范畴，其症可见于瘟病中的“风温”、“春温”、“暑温”等及伤寒中“太阳病”、“少阳病”、“阳明病”各型中。中医药在防治本疾病较西医有一定的优势。虽然目前国内已经存在一定的治疗本疾病的中成药，但也存在病机无统一认识，特别是针对病毒的，具有杀灭和抑制病毒作用的新药极度缺乏。
传染性非典型肺炎(Infectious Atypical Pneumonia，IAP)WHO又称为严重急性呼吸道综合症(Severe Acute Respiratory Syndroma，SARS)，是一种传染性极强的呼吸系统疾病，属于中医的“温病学”范畴。本病始发冬春季节，其特点是发病急剧，传变迅速，病情险恶，传染性极强，人群普遍易感而引起流行。已经在我国及世界30多个国家流行，2003年SARS流行期间，全世界共发生病例8422例，死亡916例，其中中国大陆5327例，死亡349例，严重危害人民的生命健康，并对社会安定和经济建设带来了负面影响。
针对SARS中医的病机转归，实施辨证施治，SARS早期为疫毒侵肺，湿遏热阻，宜清热解毒，化湿透邪；中期肺部实邪充滞，热毒、瘀毒、湿毒壅遏肺络，气机闭塞，因实致虚，宜益气化瘀，利湿解毒；后期肺脾气虚，心血耗损，重在健脾和胃，脾升胃降，中气得复，心血自生。处方多为汤剂，推荐用中成药为清开灵注射液，灯盏细辛注射液，藿香正气液，黄连素，双黄连口服液等。中成药中目前没有针对SARS病毒的防治专用药，且没有针对SARS病毒防治的使用、携带便利的剂型。
针对SARS的西医治疗，在早期针对发热的治疗，主要是解热镇痛药，如阿司匹林，布洛芬，双氯芬酸，吲哚美辛等，但多有不同程度的胃肠反应，或有过敏反应，一般用药3天，体温不降不宜继续使用，长期使用还会抑制骨髓造血功能。导致白细胞和血小板的减少。对于SARS高热及呼吸窘迫综合症的治疗，西医一般使用物理降温，抗生素和激素治疗，特别是激素的使用，虽然能暂时稳定病情，但也可能掩盖一些症状，停药后，体温可迅速回升，同时由于抗感染不足，引起感染病灶的迅速扩散。
鉴于上述危害人类生命健康疾病防治的困难，本研究在于研发出具有抑制流感病毒、上呼吸道感染病毒、SARS病毒和细菌的中药复方制剂。
发明内容
本发明的一个目的在于公开一种新的用于抑制流感病毒、上呼吸道感染病毒、SARS病毒和细菌的中药组合物；本发明的另一个目的在于公开一种新的用于抑制流感病毒、上呼吸道感染病毒、SARS病毒和细菌的中药组合物喷雾剂；本发明的另一个目的在于公开制备一种新的用于抑制流感病毒、上呼吸道感染病毒、SARS病毒和细菌的中药组合物方法；本发明的另一个目的在于公开一种新的用于制备抑制流感病毒、上呼吸道感染病毒、SARS病毒和细菌的中药喷雾剂质量控制方法。
本发明药物组合物的原料药组成及配比如下(按重量份)地龙100-500重量份 黄芩苷1-10重量份 甘草100-500重量份。
本发明药物组合物的原料药组成及配比优选如下(按重量份)地龙200-400重量份 黄芩苷3-8重量份 甘草200-400重量份。
本发明药物组合物的原料药组成及配比优选如下(按重量份)地龙300重量份 黄芩苷6.5重量份 甘草300重量份。
本发明中药组合物的制备方法为取预处理后地龙，加0.1mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，室温下混匀放置15-25小时后，15-25℃400-600rpm匀浆10-20分钟，8000-12000rpm离心，取上清液置50-65℃中放置，8000-12000rpm离心，取上清液进行超滤透析，浓缩液冷藏备用；甘草加水煎煮1-3次，每次1-3小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.10，加入乙醇使含醇量达60-70％，静置10-14小时，滤过，回收乙醇，加入地龙提取液，搅匀，用氨水调pH值适宜，加入黄芩苷，加水适量，搅匀，冷藏，过夜，滤过，经过常规工序直接或间接加入药学上可接受的赋型剂制成临床可接受的剂型，如片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸、口服液、喷雾剂。
本发明中药组合物喷雾剂的制备方法为地龙100-500重量份 黄芩苷1-10重量份 甘草100-500重量份。
取预处理后地龙，加0.1mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，室温下混匀放置15-25小时后，15-25℃400-600rpm匀浆10-20分钟，8000-12000rpm离心，取上清液置50-65℃中放置，8000-12000rpm离心，取上清液进行超滤透析，浓缩液冷藏备用；甘草加水煎煮1-3次，每次1-3小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.10，加入乙醇使含醇量达60-70％，静置10-14小时，滤过，回收乙醇，加入地龙提取液，搅匀，用氨水调pH值适宜，加入黄芩苷，加水适量，搅匀，冷藏，过夜，滤过，加0.2％苯甲酸钠和0.6％苹果香精，搅匀，滤过，加水制成1000体积份，灌装，即得。本发明说明书中所述的重量份/体积份与克/毫升相对应。
本发明中药组合物喷雾剂的质量控制方法包括以下鉴别和/或含量测定鉴别方法包括以下方法中的一种和/或几种1.黄芩取本品液体10ml，水浴蒸干，残渣加甲醇5ml热溶，浓缩至1ml，作为供试品溶液；另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板上，以4-6∶1-4∶1-2∶1-2醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水展开剂，预平衡25-35分钟，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液；供试品色谱中在与黄芩苷对照品色谱相应位置上显一相同的暗绿色斑点；2.甘草取本品液体10ml，加甲醇50ml回流提取1小时，回收甲醇至干，加入30ml水使溶解，用正丁醇提取2-4次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材0.5g，同供试品方法操作得溶液0.5ml，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一用1％NaOH溶液喷雾的预制硅胶G薄层板上，以13-17∶1-2∶1-2∶1-3醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，置紫外光灯下检视；供试品色谱中在与对照药材色谱相应位置上显一相同颜色的荧光斑点；3.地龙取本品10ml，加氯仿20ml，密塞，超声处理15-25分钟，滤过，滤液浓缩至约1ml，作为供试品溶液。另取地龙药材3g，同法制成药材溶液；照薄层色谱法(附录VIB)试验，吸取上述两钟溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以7-11∶1-2苯一醋酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
含量测定黄芩苷照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；45-50∶50-55∶0.1-0.4甲醇-水-磷酸为流动相；检测波长为280nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2500；对照品溶液的制备精密称取在60℃减压干燥4小时的黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含64.40μg的溶液；供试品溶液的制备精密量取本品溶液1ml置100ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，置水浴中微热，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，外标法计算，即得；本品每25ml液体含黄芩苷(C21H18O11)不得少于67.5mg。
本发明组合物制剂主要用于流感、上呼吸道感染和SARS的防治，具有很好的清热解毒、活血化瘀、祛痰止咳之功效，通过抗菌、抗病毒、抗炎、抗过敏、免疫调节及解热等作用以改善呼吸道及肺功能达到防治流感、上呼吸道感染和SARS目的。
本发明组合物所制成液体喷雾剂型具有起效迅速，毒副作用小，储运、携带、使用方便特点。药物成品为药物有效成分的水溶性制剂，在满足药效学对制剂要求的同时，具有制备方便，成本低廉等产业化优势。
本发明组合物喷雾剂的质量控制方法使喷雾剂质量稳定，易于控制。以下实验例进一步说明本发明。
实验例1本发明组合物成份筛选实验160只雄性小鼠体重均衡后，随机组，按正交设计表L16(215)内涵，适应本研究的五因素两水平观察要求，五种影响因素为A地龙、B黄芩苷甙、C甘草酸、D纳洛酮、E栀子甙和三七总甙。各因素均有两种状态为不用药(用1表示)和用药(用2表示)。具体设计统计学表格所示，项目栏的15列代表5种因素或其两两交互作用，其中第01、02、04、08、15列分别代表A、B、C、D、E等5因素影响效果，其余各列反映各部位间的两两交互作用；实验动物的16行代表16组动物；Ri表示观察指标的结果，1水平、2水平各指标数值之间进行t检验，分析两水平的差异，以P＜0.25为有效趋势的有统计学意义1.单一因素对肺水肿程度的影响①地龙80只未用地龙小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别为0.1048±0.037286、0.022613±0.008968、0.082188±0.032733、0.774642±0.088514，80只使用地龙小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别增加为0.116613±0.03751、0.024288±0.008728、0.092325±0.031154、0.78954±0.05269，肺湿重、水重、水百分比增加有显著性意义(P＜0.05)，而肺干重降低无显著性意义(P＞0.05)。说明地龙可能对小鼠急性呼吸窘迫综合征肺水肿具有负性作用。
②黄芩苷80只未用黄芩苷小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别为0.103638±0.036055、0.022263±0.009157、0.081375±0.030975、0.77920±0.088845，80只使用黄芩苷小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别降低为0.117775±0.038297、0.024638±0.008445、0.093138±0.032627、0.784974±0.053037，肺湿重、肺干重、水重增加有显著性意义(P＜0.05)，而水百分比降低无显著性意义(P＞0.05)。说明黄芩苷可能对小鼠急性呼吸窘迫综合征肺水肿具有负性作用。
③甘草80只未用甘草酸小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别为0.10865±0.038944、0.021925±0.008406、0.086725±0.032603、0.795901±0.053888，80只使用甘草酸小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别降低为0.112763±0.036642、0.024975±0.009092、0.087788±0.032102、0.768281±0.086216，肺干重、水百分比降低有显著性意义(P＜0.05)，而肺湿重、水重降低无显著性意义(P＞0.05)。说明甘草酸对小鼠急性呼吸窘迫综合征肺水肿具有防治作用。
④纳洛酮80只未用纳洛酮小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别为0.108275±0.039162、0.023088±0.009192、0.085188±0.033605、0.778869±0.082838，80只使用纳洛酮小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别降低为0.113138±0.036362、0.023813±0.00856、0.089325±0.03092、0.785313±0.061969，肺湿重、肺干重、水重、水百分比变化均无显著性意义(P＞0.05)。说明纳洛酮对小鼠急性呼吸窘迫综合征肺水肿无防治作用。
⑤三七栀子(通络救脑注射液)80只未用三七栀子小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别为0.114975±0.04063、0.023563±0.009487、0.091413±0.034418、0.791414±0.061221，80只使用三七栀子小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别降低为0.106438±0.034354、0.023338±0.008246、0.0831±0.029572、0.772768±0.082458，肺湿重、肺干重、水重、水百分比变化均无显著性意义(P＞0.05)。说明三七栀子对小鼠急性呼吸窘迫综合征肺水肿无防治作用。
2.减轻肺水肿程度的双因素交互作用①地龙与甘草的交互作用80只地龙与甘草酸无交互作用小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别为0.111463±0.038428、0.022813±0.009455、0.08865±0.03106、0.796114±0.058715，80只地龙与甘草酸有交互作用小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别降低为0.10995±0.037283、0.024088±0.008234、0.085863±0.033547、0.768068±0.082931，水百分比降低有显著性意义(P＜0.01)，而肺湿重、肺干重、水重降低无显著性意义(P＞0.05)。说明地龙与甘草酸交互作用对小鼠急性呼吸窘迫综合征肺水肿具有防治作用。
②黄芩苷与甘草的交互作用80只黄芩苷与甘草无交互作用小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别为0.112625±0.037405、0.022838±0.009678、0.089788±0.030921、0.796264±0.062072，80只黄芩苷与甘草交互作用小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别降低为0.108788±0.038226、0.024063±0.007975、0.084725±0.033541、0.767918±0.080396，水百分比降低有显著性意义(P＜0.01)，而肺湿重、肺干重、水重降低无显著性意义(P＞0.05)。说明黄芩苷与甘草交互作用对小鼠急性呼吸窘迫综合征肺水肿具有防治作用。
③纳洛酮与三七栀子的交互作用80只纳洛酮与三七栀子无交互作用小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别为0.107288±0.041068、0.02165±0.00948、0.085638±0.034237、0.795372±0.062714，80只纳洛酮与三七栀子交互作用小鼠的肺湿重、干重、水重、水百分比的平均数值分别降低为0.114125±0.034024、0.02525±0.007847、0.088875±0.030275、0.76881±0.080206，肺干重、水百分比降低有显著性意义(P＜0.01)，而肺湿重、水重降低无显著性意义(P＞0.05)。说明纳洛酮与三七栀子交互作用对小鼠急性呼吸窘迫综合征肺水肿具有防治作用。
④甘草与纳洛酮的交互作用
80只甘草与纳洛酮无交互作用小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别为0.1088±0.0371、0.0225±0.0096、0.0863±0.0303、0.7929±0.0639，80只甘草与纳洛酮交互作用小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别降低为0.1126±0.0385、0.0244±0.0080、0.0882±0.0342、0.7713±0.0800，、水百分比降低有显著性意义(P＜0.05)，而肺湿重、肺干重、水重降低无显著性意义(P＞0.05)。说明甘草与纳洛酮交互作用对小鼠急性呼吸窘迫综合征肺水肿具有防治作用。
3.不影响肺水肿程度的双因素交互作用①地龙与黄芩苷的交互作用80只地龙与黄芩苷无交互作用小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别为0.104075±0.039398、0.023300±0.009979、0.080775±0.032726、0.770971±0.087163，80只使用地龙小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别增加为0.117338±0.035023、0.0236±0.007642、0.093738±0.030627、0.793211±0.053624，肺湿重、水重、水百分比增加有显著性意义(P＜0.05)，而肺干重增加无显著性意义(P＞0.05)。说明地龙与黄芩苷交互作用对小鼠急性呼吸窘迫综合征肺水肿具有负性作用。
②地龙与纳洛酮的交互作用80只地龙与纳洛酮无交互作用小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别为0.106438±0.037715、0.02245±0.00911、0.083988±0.032451、0.781732±0.084837，80只地龙与纳洛酮交互作用小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别增加为0.114975±0.03753、0.02445±0.008545、0.090525±0.031927、0.78245±0.059378，肺湿重、肺干重、水重、水百分比变化均无显著性意义(P＞0.05)。说明地龙与纳洛酮交互作用对小鼠急性呼吸窘迫综合征肺水肿无防治作用③黄芩苷甙与纳洛酮的交互作用80只黄芩苷甙与纳洛酮的交互作用小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别为0.106625±0.037923、0.02315±0.008828、0.083475±0.032396、0.775055±0.081643，80只黄芩苷甙与纳洛酮的交互作用小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别增加为0.114788±0.037363、0.02375±0.008939、0.091038±0.031869、0.789127±0.062908，肺湿重、水重增加有显著性意义(P＜0.05)，而肺干重、水百分比增加无显著性意义(P＞0.05)。说明黄芩苷甙与纳洛酮交互作用对小鼠急性呼吸窘迫综合征肺水肿起负性作用。
④甘草与三七栀子的交互作用80只甘草与三七栀子无交互作用小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别为0.1068±0.0393、0.0226±0.0089、0.0842±0.0339、0.7802±0.0845，80只甘草与三七栀子交互作用小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别增加为0.1146±0.0359、0.0243±0.0088、0.0904±0.0305、0.7840±0.0598，肺湿重、肺干重、水重、水百分比增加均无显著性意义(P＞0.05)。说明甘草与三七栀子交互作用对小鼠急性呼吸窘迫综合征肺水肿无影响。
⑤黄芩苷与三七栀子的交互作用80只黄芩苷与三七栀子无交互作用小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别为0.111275±0.036446、0.023625±0.008638、0.08765±0.03059、0.784136±0.058003，80只黄芩苷与三七栀子交互作用小鼠的肺湿重、干重、水重、水百分比的平均数值分别降低为0.110138±0.039229、0.023275±0.009129、0.086863±0.034029、0.780046±0.085735，肺干重、肺湿重、水重、水百分比降低均无显著性意义(P＞0.05)。说明黄芩苷与三七栀子交互作用对小鼠急性呼吸窘迫综合征肺水肿具无影响。
⑥地龙与三七栀子的交互作用80只地龙与三七栀子无交互作用小鼠的肺湿重、肺干重、水重、水百分比的平均数值分别为0.107488±0.034436、0.0223±0.008912、0.085188±0.029367、0.789401±0.066445，80只地龙与三七栀子交互作用小鼠的肺湿重、干重、水重、水百分比的平均数值分别降低为0.113925±0.040756、0.024600±0.008713、0.089325±0.034971、0.774781±0.078741，肺干重、肺湿重、水重、水百分比降低均无显著性意义(P＞0.05)。说明地龙与三七栀子交互作用对小鼠急性呼吸窘迫综合征肺水肿具无影响。
4.实验结论①单一因素降低肺水肿的程度地龙、黄芩苷可能有负性作用，甘草具有防治作用，纳洛酮、三七栀子无防治作用。
②因素交互减轻肺水肿的程度地龙与甘草、黄芩苷与甘草、纳洛酮与三七栀子、甘草与纳洛酮等4种两因素交互作用具有防治效应。
综上所述，地龙、黄芩苷与甘草组方治疗SARS为最佳筛选配伍。
实验例2提取工艺研究实验一、甘草提取工艺研究参考《中国药典》2000版一部甘草浸膏制备方法，甘草提取以水为溶剂，以水煎煮次数、加水倍数及时间为因素A，水煎液浓缩相对密度为因素B，乙醇沉淀浓度为因素C，采用四因素三水平表安排实验；检测指标为甘草酸含量；检测方法采用HPLC方法。
甘草含量测定方法参照药典(中国药典2000年版一部66页)甘草项下含量测定方法)仪器Waters2695高效液相色谱仪，Waters2996紫外检测器色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.2mol/L醋酸铵溶液-冰醋酸(67∶33∶1)为流动相；检测波长为250nm。理论板数按甘草酸单铵盐峰计算应不低于2000。
对照品溶液的制备由于没有买到中国药品生物制品鉴定所的标准甘草酸单铵盐对照品，只能用现有甘草酸单铵盐(标记含量98％)作对照，以确定工艺。因此，所测得结果偏低，而不影响试验趋势。
供试品溶液的制备 精密吸取表2中各提取条件下所得样品，水浴蒸干，用流动相定溶，在线性范围内进样，计算，即得。
因素水平表及实验结果如下表1 甘草提取工艺正交实验因素水平表
表2 甘草提取工艺正交实验结果
表3 黄芩提取工艺方差分析表
F0.05(2，2)＝19F0.01(2，2)＝99如上图方差分析结果所示，因素A影响呈显著性差异，且A2＞A3＞A1故选择水平A2；在因素B中B3＞B1＞B2，故选择B3；而在因素C中C3＞C2＞C1，但是C3与C2差别不大，根据实验结果与文献我们选择C2。因此根据实验结果应选择A2B3C2为最佳工艺条件。但从级差值和方差分析来看，B因素即浓缩密度对于结果影响不显著，因此，从小试结果来看，我们选择密度1.1较为适宜，即水煎煮三次，加水量分别为10、8、8倍，时间分别为2、1、1小时；水煎液合并后浓缩至相对密度1.1，并且醇沉浓度为65％。
二、地龙提取工艺研究我们采用新的提取工艺，提取鲜地龙含有的抗病毒治疗和预防上呼吸道感染有效成分，在处方筛选中我们发现这些成分是一类以DNA酶为主的物质，因此我们采用了生化方法进行蛋白酶混合成分的提取。
A.地龙制备工艺研究预处理鲜地龙用自来水漂洗体表的污垢，置18-22℃的蒸馏水中浸泡8小时，每2小时漂洗并换水，使地龙吐净胃肠道中的泥土。然后加0.i％NaCl，混匀，刺激其分泌大量黄色分泌物，重复三次，每次20分钟，间隔期间用10倍体积蒸馏水漂洗2次。然后置于直径为0.5mm的尼龙网中，用强力吸水纤维吸去多余液体，-20℃冷冻保存。
粗蛋白液制备取处理过的地龙，加5倍体积0.1mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，室温下混匀放置20小时，发泡，用工业匀浆机500rpm匀浆15分钟，每3分钟间歇1分钟，匀浆温度为20℃。10000rpm离心20分钟，取上清备用。
精滤液制备取上清液置55℃中36小时，10000rpm离心20分钟，取上清进行超滤透析，外水透析液是样品的50倍体积，超滤后样品被浓缩15-18倍，呈澄明无色或微褐色液体，冷冻备用。
B.工艺筛选蛋白的分离提纯关键是对原料的处理，因此我们对工艺中处理后的地龙溶解剂激溶法与直接匀浆后柱层析法进行了对照研究。具体方法如下激溶法将预处理后地龙加溶解剂5倍体积0.1mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液发泡使地龙蛋白自溶，然后进行匀浆，高速离心后上清液即为粗蛋白溶液。将粗蛋白溶液按前述方法制备精滤液后，冷冻干燥，以冻干粉与原料地龙的比率计算产率。
柱层析法将预处理后干地龙直接匀浆，然后将离心后上清液过柱，蛋白洗脱液即为粗蛋白溶液。将粗蛋白溶液按前述方法制备精滤液后，冷冻干燥，以冻干粉与原料地龙的比率计算产率。
两种工艺的实验结果如下表4不同工艺的终产品产率、活性比较
从以上结果分析，激溶法提取地龙活性成分可使产品得率和总活性均有大幅度的提高。而且采用激溶法不仅可最大限度的提取原料中的活性成分，而且减少离心后的杂质清理及环境污染问题，而柱层析法中直接匀浆不能使蛋白质全部溶解，有效成分损失较多，而且离心后产生大量废弃物，带来了很多工业污物的处理问题。
激溶法省略了柱层析过程，不仅节省了大量的生产成本，而且去除了生产环节的限速步骤，简化了超滤等后续工作，大大提高生产效率，同时终产物活性明显提高，是一种经济实用高效的生产工艺。
实验例3本发明组合物药理学实验研究实验中所用龙芩草喷雾剂为本发明组合物喷雾制剂(制剂详见实施例)。
1.龙芩草喷雾剂解热试验的药效学研究实验采用大肠杆菌内毒素致日本大耳白家兔发热模型，静脉注射内毒素后家兔体温开始上升，至第1-2小时达到第一个高峰，此后体温稳定于此或略有升降，到第4小时左右体温第二次升高并且超过第一个体温高峰，此后逐渐下降，持续8小时以上，模型组家兔体温曲线呈内毒素发热之典型双峰热型。与模型组比较，龙芩草喷雾剂有非常显著的解热作用(P＜0.01)，且呈明显量效关系，其解热作用优于双黄连口服液。
2.龙芩草喷雾剂化痰试验的药效学研究实验中使小鼠雾化吸入酚红生理盐水，通过检测小鼠气管洗液中的酚红吸光度来反映其气管粘膜的分泌能力。结果显示龙芩草喷雾剂5.91g/kg组小鼠酚红排泌量明显增加，与空白组相比较有极显著差异(p＜0.01)，其他各组无明显改变(P＞0.05)。
3.龙芩草喷雾剂镇咳试验的药效学研究实验采用小鼠氨水引咳模型，观察龙芩草喷雾剂对此模型的小鼠咳嗽潜伏期及咳嗽次数的影响。结果显示，龙芩草喷雾剂剂对氨水所致小鼠咳嗽的咳嗽潜伏期影响不大，各组与空白组相比较无统计学意义(P＞0.05)；而龙芩草喷雾剂1.48g/kg组小鼠的咳嗽次数明显减少，并与空白组相比较，具有极显著差异(p＜0.01)，其他各组无明显改变(P＞0.05)。
4.龙芩草喷雾剂对油酸所致大鼠急性肺损伤模型肺组织TNF、IL-6、IL-2等炎性因子的表达的作用的影响正常对照大鼠肺组织内TNF、IL-6、IL-2的表达较低，油酸所致急性肺损伤模型大鼠肺组织内TNF、IL-6、IL-2的表达明显增高，阳性药组、龙芩喷雾剂2.85g/kg组、0.71g/kg组能明显降低油酸所致急性肺损伤模型大鼠肺组织内TNF、IL-6、IL-2的表达，与模型组比较具有统计学意义(p＜0.05，p＜0.01)，小剂量组降低不明显。
5.龙芩草喷雾剂最小杀菌浓度测定采用液体稀释法测定龙芩草喷雾剂最小杀菌浓度。龙芩草喷雾剂对金黄色葡萄球菌的最小杀菌稀释度是1∶4，对乙型溶血性链球菌的最小杀菌稀释度是1∶16，对肺炎克雷伯氏杆菌的最小杀菌稀释度是1∶2；而对大肠杆菌和绿脓杆菌没有杀菌作用。
6.龙芩草喷化剂对油酸所致大鼠急性肺损伤模型的影响采用油酸所致大鼠急性肺损伤模型。龙芩草喷雾剂能有效促进油酸所导致急性肺损伤大鼠的肺功能，动脉血压和心率，动脉血气，肺表面张力系数，肺组织表面活性物质含量，肺系数和含水百分比，肺组织病变性质及其形态计量等指标均明显好转，达到甚至超过纳络酮治疗作用。结果证明龙芩草喷雾剂对油酸引起的急性肺损伤具有显著的防治作用。
7.龙芩草喷化剂对野百合碱所致肺损伤慢性大鼠模型的影响采用野百合碱所致大鼠慢性肺损伤模型，龙芩草喷雾剂能显著促进野百合碱所导致慢性肺损伤大鼠的肺功能，肺动脉血压，动脉血气，肺表面张力系数，肺组织表面活性物质含量，肺组织羟脯氨酸含量，血清透明质酸含量，肺、心脏、肝脏的脏器系数，肺组织病变和胶原纤维沉积及其形态计量等指标均好转，部分疗效优于硝苯地平。龙芩草喷雾剂对野百合碱引起的慢性肺损伤具有显著的防治作用。
8.龙芩草喷雾剂体外抗流感病毒的药效学研究试验采用给药后观察小鼠肺部病变率、死亡保护率和延长生命率来检测龙芩草喷雾剂体内对流感病毒的抑制作用，结果显示龙芩草喷雾剂能显著降低小鼠发病率、减轻肺部病变率和延长生命率，经统计学处理差异具有显著性(p＜0.01)，结果表明龙芩草喷雾剂具有显著抑制流感病毒的作用。
9.龙芩草喷雾剂体外抗甲3型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒3型、鼻病毒的药效学研究采用病毒(CPE)法，在狗肾传代细胞(MDCK)、咽癌上皮细胞(Hep-2)、人胚肾传代细胞(293)和宫颈癌传代细胞(HeLa)内，检测龙芩草喷雾剂体外抗甲3型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒3型、鼻病毒14型的抑制作用，结果显示龙芩草喷雾剂对甲3型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒3型有一定的抑制作用，但对鼻病毒14型作用不明显。
下述实施例均能实现上述实验例的效果。
实施例1龙芩草喷雾剂地龙300g黄芩苷6.5g甘草300g以上三味，取预处理后地龙300g，加5倍体积0.1mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，室温下混匀放置20小时后，20℃500rpm匀浆15分钟，10000rpm离心20分钟，取上清液置55℃中36小时，10000rpm离心20分钟，取上清进行超滤透析，浓缩液冷藏备用；甘草300g加水煎煮，第一次10倍量水2小时，第二、三次各8倍量水1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.10(60℃测)，加入乙醇使含醇量达65％，静置12小时，滤过，回收乙醇至无醇味，加入地龙提取液，搅匀，用氨水调pH值5.5-6.5，加入黄芩苷6.5g，加水适量，搅匀，冷藏(4-8℃)，过夜，滤过，加0.2％苯甲酸钠和0.6％苹果香精，搅匀，滤过，加水制成1000ml，灌装，即得。
鼻腔、口腔喷雾，每次3-5揿，每日6-12次或遵遗嘱。
25ml/瓶实施例2口服液地龙400g黄芩苷8.5g甘草400g以上三味，取预处理后地龙400g，加6倍体积0.1mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，室温下混匀放置24小时后，24℃500rpm匀浆15分钟，10000rpm离心20分钟，取上清液置55℃中36小时，10000rpm离心20分钟，取上清进行超滤透析，浓缩液冷藏备用；甘草400g加水煎煮，第一次12倍量水2小时，第二、三次各8倍量水1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.10(60℃测)，加入乙醇使含醇量达65％，静置12小时，滤过，回收乙醇至无醇味，加入地龙提取液，搅匀，用氨水调pH值5.5--6.5，加入黄芩苷8.5g，加水适量，搅匀，冷藏(4-8℃)，过夜，滤过，经常规工艺制成口服液1000ml.
实施例3片剂地龙250g黄芩苷4.5g甘草300g以上三味，取预处理后地龙250g，加4倍体积0.1mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，室温下混匀放置20小时后，20℃500rpm匀浆15分钟，10000rpm离心20分钟，取上清液置55℃中36小时，10000rpm离心20分钟，取上清进行超滤透析，浓缩液冷藏备用；甘草300g加水煎煮，第一次9倍量水1.5小时，第二、三次各9倍量水1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.10(60℃测)，加入乙醇使含醇量达65％，静置12小时，滤过，回收乙醇至无醇味，加入地龙提取液，搅匀，用氨水调pH值5.5--6.5，加入黄芩苷4.5g，加水适量，搅匀，冷藏(4-8℃)，过夜，干燥，经常规工艺制成片剂。
实施例4胶囊地龙350g黄芩苷6.5g甘草250g以上三味，取预处理后地龙350g，加9倍体积0.1mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，室温下混匀放置20小时后，20℃500rpm匀浆15分钟，10000rpm离心20分钟，取上清液置55℃中36小时，10000rpm离心20分钟，取上清进行超滤透析，浓缩液冷藏备用；甘草250g加水煎煮，第一次10倍量水2小时，第二、三次各8倍量水1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.10(60℃测)，加入乙醇使含醇量达65％，静置12小时，滤过，回收乙醇至无醇味，加入地龙提取液，搅匀，用氨水调pH值5.5-6.5，加入黄芩苷6.5g，加水适量，搅匀，冷藏(4-8℃)，过夜，干燥，经常规工艺制成胶囊。
实施例5龙芩草喷雾剂质量控制方法鉴别1.黄芩取本品液体10ml，水浴蒸干，残渣加甲醇5ml热溶，浓缩至1ml，作为供试品溶液。另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板上，以5∶3∶1∶1醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水展开剂，预平衡30分钟，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液；供试品色谱中在与黄芩苷对照品色谱相应位置上显一相同的暗绿色斑点；2.甘草取本品液体10ml，加甲醇50ml回流提取1小时，回收甲醇至干，加入30ml水使溶解，用正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材0.5g，同供试品方法操作得溶液0.5ml，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一用1％NaOH溶液喷雾的预制硅胶G薄层板上，以15∶1∶1∶2醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中在与对照药材色谱相应位置上显一相同颜色的荧光斑点；3.地龙取本品10ml，加氯仿20ml，密塞，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至约1ml，作为供试品溶液。另取地龙药材3g，同法制成药材溶液；照薄层色谱法(附录VIB)试验，吸取上述两钟溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以9∶1苯一醋酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
含量测定黄芩苷照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；47∶53∶0.2甲醇-水-磷酸为流动相；检测波长为280nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2500；对照品溶液的制备精密称取在60℃减压干燥4小时的黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含64.40μg的溶液。供试品溶液的制备精密量取本品溶液1ml置100ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，置水浴中微热，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，外标法计算，即得；本品每25ml液体含黄芩苷(C21H18O11)不得少于67.5mg。
权利要求
1.一种中药组合物，其特征在于该组合物是由下列原料药制成的地龙100-500重量份黄芩苷1-10重量份甘草100-500重量份。
2.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于该组合物是由下列原料药制成的地龙200-400重量份黄芩苷3-8重量份甘草200-400重量份。
3.如权利要求2所述的中药组合物，其特征在于该组合物是由下列原料药制成的地龙300重量份黄芩苷6.5重量份甘草300重量份。
4.如权利要求2所述的中药组合物，其特征在于该组合物是由下列原料药制成的地龙400重量份黄芩苷8.5重量份甘草400重量份。
5.一种中药喷雾制剂，其特征在于该喷雾剂是主要由下列原料药制成的地龙100-500重量份黄芩苷1-10重量份甘草100-500重量份。
6.如权利要求5所述的喷雾制剂，其特征在于该喷雾剂是主要由下列原料药制成的地龙200-400重量份黄芩苷3-8重量份甘草200-400重量份。
7.如权利要求6所述的喷雾制剂，其特征在于该喷雾剂是主要由下列原料药制成的地龙300重量份黄芩苷6.5重量份甘草300重量份。
8.如权利要求1-4所述的中药组合物，其特征在于该组合物经过常规工序直接或间接加入药学上可接受的赋型剂制成临床片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸、口服液。
9.如权利要求1-4所述的中药组合物，特征在于该组合物在制备用于抑制流感病毒、上呼吸道感染病毒或SARS病毒和细菌药物中的应用。
10.如权利要求5-7所述的喷雾剂，特征在于该组合物在制备用于抑制流感病毒、上呼吸道感染病毒或SARS病毒和细菌药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种中药组合物，特别涉及用于抑制流感病毒、上呼吸道感染病毒、SARS病毒和细菌的中药组合物。该组合物由地龙、黄芩苷、甘草组成。该中药组合物制备中，对不同原料药分别采用不同提取方法，使得有效成份的充分溶出，最后并经过科学的工序直接或间接加入药学上可接受的赋型剂制成临床可接受的剂型，包括如片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸等、口服液、喷雾剂；本发明组合物具有很好的清热解毒、活血化瘀、祛痰止咳功效，且无毒副作用。
文档编号A61K35/56GK1754554SQ200410080210
公开日2006年4月5日 申请日期2004年9月28日 优先权日2004年9月28日
发明者牛欣, 司银楚, 徐元景, 李海燕, 牛勃, 陆汉文, 顾立刚, 王玥琦, 蔡大勇, 王宏涛, 席时芳, 贾旭, 周莉, 杜红, 叶明磊, 赵红, 黄兵, 文仁都 申请人:北京中医药大学