专利名称：Saposin C－DOPS:一种抗癌新药的制作方法
技术领域：
本发明研究调节扩散性癌的体积大小的合成物及方法，尤其是调节肿瘤和癌的大小。此外，本发明还研究治疗癌症的合成物及方法。
背景技术：
saposins是一族小型热稳定糖蛋白(～80氨基酸)，对于多种溶菌酶在糖基鞘脂分解代谢途径上的体内水解活性而言不可或缺。(参见Grabowski等人所著的(1990)Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.25385-414；Furst等人所著的(1992)Biochim.Biophys.Acta.11261-16；Kishimoto等人所著的(1992)J.Lipid Res.331255-1267)。saposin族的四个成员(A、B、C及D)是从同一个前体蛋白前saposin(prosaposin)经蛋白水解而来(参见Fujibayashi等人所著的(1985)Am.J.Hum.Genet，37741-748；O′Brien等人所著的(1988)Science 2411098-1101；Rorman等人所著的(1989)Genomics 5486-492；Nakano等人所著的(1989)Biochem.(Tokyo)105152-154；(1989)Reiner等人所著的J Mol.Neurosci，1225-233；在此通过引用纳入。saposins A，B，C及D的完整氨基酸序列已见报导，前体蛋白的染色体组结构及cDNA序列也已见报导(参见Fujibayashi等人所著的(1985)Am.J.Hum.Genet，37741-748；O′Brien等人所著的(1988)Science 2411098-1101；Rorman等人所著的(1989)Genomics 5486-492)。
Saposin定义为鞘脂催化蛋白或辅酶。从结构上看，saposins A，B，C及D四者具有大约50-60％的相似性，包括六种严格保存的半胱氨酸残留物(参见Furst等人所著的(1992)Biochim.Biophys.Acta11261-16)，这些残留物形成三个放置位置完全相同的域内二硫化物桥(参见Vaccaro等人所著的(1995)J.Biol.Chem.2709953-9960)。所有saposin均含有一个糖基部位，其保存位置在N-终端序列的一半之处，但是糖基对于saposin的活性并非必不可少(参见Qi等人所著的(1998)Biochemistry 3711544-11554以及Vaccaro等人所著的(1995)J.Biol.Chem.27030576-30580，在此通过引用将其作为整体纳入)。
所有saposin和类saposin蛋白及域在溶解状态下均含有一个“saposin褶”。此褶为多-螺旋束形状，具有三个保存的二硫化物结构和好几个两亲性多肽。尽管saposin和类saposin蛋白在溶解状态下都具有saposin褶，但是二者在增强溶菌酶鞘脂(SL)和糖基鞘脂(GSL)被特定的水解酶降解上，具有不同的体内生物功能。saposin的这些作用使之在控制溶菌酶鞘脂和糖基鞘脂代谢上占有中心地位(参见Kishimoto等人所著的(1992)J.Lipid Res.331255-1267；Fujibayashi等人所著的(1985)Am.J.Hum.Genet，37741-748；O′Brien等人所著的(1988)Science 2411098-1101，在此通过引用将它们纳入)。此外，saposin C还参与酸性磷脂囊的聚变和扰动(参见Vaccaro等人所著的(1994)FEBS Letters 349181-186，在此通过引用纳入[在此通过引用将其作为整体纳入])。
酸β-葡萄糖苷酶(Gcase，EC 3.1.2.45)要在体内和体外对葡糖苷脂酰鞘氨醇进行最佳的水解需要使用saposin C。此外，saposin C还使裂变诱向含有囊(在电子显微镜下可见)的磷脂酰丝氨酸(参见Vaccaro等人所著的(1994)FEBS Letters 349181-186，在此通过引用纳入)。而且，saposin C具有脂膜结合活性或质膜亲和力的一般属性。saposin C通过埋入外小叶与脂膜联合。H-1和H-5螺旋是这一过程的不可或缺的一部分，表明saposin C与脂膜的适当相互作用可影响其特性和活性。此外，saposin C还诱发脂膜发生结构性变化。Saposin C与平面磷脂双层体之间相互作用的动态过程曾通过原子力显微镜得到实时的显现(参见Qi等人所著的(2001)J.Biol.Chem.27627010-27017以及You等人所著的(2001)FEBS Lett.50397-102，在此通过引用纳入)。
磷脂不对称是哺乳动物质膜的一个众所周知的特征。脂双层体的外小叶含有丰富的磷脂酰胆碱，而氨基磷脂则优先选择内小叶(参见Bevers等人所著的(1998)Lupus Suppl.2S126-S131)。磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰乙醇胺(PE)几乎无一例外地驻留于内小叶，而卵磷脂(PC)和鞘磷脂则在外小叶中很丰富。磷脂不对称可能是所有细胞的一般属性(参见Woon等人所著的(1999)Cell Calcium25(4)313-320)。质膜磷脂不对称通过各种机制得到保持，这些机制包括氨基磷脂改位和磷脂乱位(参见美国专利申请号20020081698)。
一般而言，肿瘤或癌细胞与通常细胞相比，生长速度快得多。这些不正常的细胞主要通过在糖酵解期间产生乳酸或通过呼吸(因为代谢速度快)产生二氧化碳而生产大量的质子。因此，这些细胞和组织周围部位的酸性通常比正常生长速度的细胞周围部位的酸性高。
皮肤扁平细胞癌(SCC)是具有很高细胞转移风险的最常见皮肤癌之一。(参见Alam等人所著的(2001)N.Engl.J.Med.344975-983，在此通过引用纳入)。皮肤癌分为两类黑素瘤和非黑素瘤(NMSC)。据美国癌症协会估计，美国每年的NMSC病例数在一百万以上。SCC大约占所有皮肤瘤的20％，美国每年大约有200,000个新SSC病例。SCC是最常见的从皮肤转移到黏膜的恶性肿瘤，SCC也可直接发生于黏膜之上(参见Boni等人所著的(2002)Neuroendocrinology Letters23S248-51)。当前对SCC患者的治疗包括电干燥法、刮除法、切除法、冷冻疗法、手术切除或Mohs手术。电干燥法、刮除法、手术切除或冷冻疗法如果使用得当，可以消除小的(直径＜1厘米)、轮廓清楚的肿瘤，肿瘤转移发生率较低。手术切除和Mohs手术对具有高风险原发性或再发性SSC患者的治愈率最高。然而，这些治疗方法费用高昂，且可能发生血肿、血清肿、感染和伤口开裂。
因此，人们希望开发出有效而低成本且具有更好外观效果的SCC治疗方法。此外，开发治疗其它类型的癌症(例如乳癌、前列腺癌和淋巴癌)的有效而低成本的治疗方法也很重要。
发明摘要本发明提供调节质膜的内外小叶成分分布的合成物和方法。本发明药物包含内小叶成分和前saposin相关的多肽。“内小叶成分”是指任何自然存在于细胞质膜的内小叶中的分子或其结构类似物，这里所说的细胞尤指动物细胞，更尤指哺乳动物细胞。内小叶成分的一个具体物质是磷脂酰丝氨酸或其结构类似物，例如二油基磷脂酰丝氨酸(dioleoylphosphatidylserine)(DOPS)。前saposin的氨基酸序列在序列列表的SEQ ID NO1中有详细说明。前saposin相关多肽与SEQID NO1中所示的氨基酸序列或其片段之间至少具有80％的相同性并保持质膜亲和力。前saposin相关多肽的一个具体物质是saposin C(序列列表中的SEQ ID NO2)或仿saposin C多肽。saposin C相关多肽与SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列之间至少具有80％的相同性并保持质膜亲和力。本发明药物的多肽与内小叶成分的摩尔比率范围在大约1∶1至大约1∶50之间，但更理想的比率范围在大约1∶1至大约1∶25之间，更进一步理想的比率范围在大约1∶1至大约1∶10之间，而最理想的比率为大约1∶7或1∶3。本项发明的一个具体药物进一步包含一种制药学上可接受的载体。本发明药物可促进细胞死亡，例如细胞凋亡。本项发明的一个具体药物优先诱发超扩散性细胞的凋亡，例如(但不限于)肿瘤和癌细胞。因此，本项发明的一个具体药物是抗癌药物。在本发明的一个方面，发明药物优先诱发癌细胞的的凋亡，例如(但不限于)肉瘤细胞、成神经细胞瘤细胞和鳞片癌细胞。
本发明提供调节一个实验对象的细胞质膜中的内小叶成分分布的方法。这些方法包括给一个实验对象服用一种包含内小叶成分和前saposin相关多肽的药物。这些方法可改变服药者的细胞质膜的外小叶中的内小叶成分的分布情况。本发明的一个具体药物可使外小叶中的内小叶成分浓度得到提高。本发明对内小叶成分分布的一个具体药物调节可优先发生在服药者的超扩散性细胞上。优先发生部位是肿瘤细胞或癌细胞这些超扩散性细胞。在本项发明的一个方面，调节质膜的外小叶的内小叶成分的浓度可诱发凋亡。
提供调节一个实验对象的肿瘤大小的方法。这些方法包括给一个实验对象服用一种包含内小叶成分和前saposin相关多肽的药物。该药物可进一步包含一种制药学上可接受的载体。适合的实验对象包括患有肿瘤的哺乳动物，尤其是人类。本发明的一个具体药物可促进超扩散性细胞的死亡。细胞死亡可以通过凋亡而发生。任何肿瘤均为本发明的潜在目标。目标肿瘤包含超扩散性细胞，例如肿瘤细胞和癌细胞。这些目标肿瘤包括，但不限于，肉瘤、成神经细胞瘤以及鳞片癌细胞。本发明的一个具体药物可调节肿瘤大小，导致肿瘤减小。可以预想，超扩散性细胞未成熟即死亡应导致肿瘤减小。
提供治疗一个实验对象的癌症的方法。这些方法包括给一个实验对象服用一种包含内小叶成分和前saposin相关多肽的药物。该药物可进一步包含一种制药学上可接受的载体。适合的实验对象包括患有癌症的哺乳动物，尤其是人类。本发明的一个具体药物可促进超扩散性细胞的死亡。细胞死亡通过一个过程而发生，该过程可以是(但不限于)凋亡。任何癌症均为本发明的潜在目标。目标癌症包含超扩散性细胞，例如肿瘤和癌细胞。这些目标癌细胞包括，但不限于，生于肉瘤、成神经细胞瘤、乳癌以及鳞片癌上的细胞。在本发明的一个方面，给药方法有经肠胃、不经肠胃、经皮下、经静脉、经腹膜或局部给药。为治疗癌症，可以给一个实验对象单剂量或多剂量的药物。
附图简要说明
图1显示正常永生化角质形成细胞(NIK)(A和B片区)和鳞片癌细胞(SCC)(C和D片区)。A和C片区内的细胞接受安慰剂治疗。B和D片区的细胞接受包含8μM saposin C和26μM DOPS的本发明药物的治疗。本实验的详细细节在本申请的其它地方进行说明。
图2显示取自L5178Y-R细胞系的鼠淋巴瘤细胞。A片区内的细胞接受安慰剂治疗。B片区内的细胞接受60μM DOPS的治疗。C片区内的细胞接受20μM saposin C药物治疗。D片区内的细胞接受包含10μM saposin C和30μM DOPS的本发明药物的治疗。
图3显示评估携带人类鳞片癌细胞异种移植物的裸鼠在接受安慰剂(磷酸缓冲生理盐水，以实心三角形和虚线表示)或本发明药物(saposin C/DOPS，前者剂量为每公斤体重10mg，后者剂量为每公斤体重2mg)皮下注射之前和之后的平均肿瘤大小而得到的结果。误差条表示标准误差。肿瘤大小以mm3计，时间以肿瘤成长天数计算。A片区代表鼠接受两次治疗的结果。第一次和第二次注射的日期以箭头表示。B片区显示鼠接受一次治疗的结果。注射日期以箭头表示。本实验的详细细节在本申请的其它地方进行介绍。
图4显示取自异种移植物的人类鳞片癌细胞肿瘤组织的荧光显微照片。A片区内的细胞接受有荧光标志的磷脂酰丝氨酸和DOPS(NBD-DOSP/DOPS)的混合物的治疗。B片区内的细胞接受有荧光标志的磷脂酰丝氨酸、DOPS和saposin C的混合物的治疗。本实验的详细细节在本申请的其它地方进行介绍。
图5显示取自异种移植物的人类鳞片癌细胞肿瘤组织的显微照片。组织取自接受DOPS(每公斤体重剂量2mg，A和C片区)或saposin C(每公斤体重剂量10mg)与DOPS(每公斤体重剂量2mg，B和D片区)治疗的肿瘤。该组织以TUNEL着色法进行着色或着苏木精和曙红(C和D片区)。B片区内的箭头表示凋亡细胞。D片区内的暗着色表示坏死的区域。
发明的详细说明本发明与调节质膜中内小叶成分分布的合成物和方法有关。本发明还与调节超扩散性细胞，尤其是与牵涉到超扩散性细胞的紊乱有关，更尤其是与肿瘤和癌有关，例如鳞片癌细胞和淋巴瘤。合成物是一种包含含有前saposin相关多肽和内小叶成分的药物，多肽确切地说是saposin C，内小叶成分确切地说是磷脂酰丝氨酸或其结构类似物，或更确切地说是二油基磷脂酰丝氨酸(dioleoylphosphatidylserine)(DOPS)。这两个化合物的组合表现出抗癌活性，因此被称为抗癌药物。“抗癌活性”是指减少细胞扩散速度，从而降低已存在肿瘤和在治疗期间出现的肿瘤的生长速度，和/或破坏已存在瘤性(肿瘤)细胞或新形成瘤性细胞，从而在治疗期间减小肿瘤的总体大小。接受saposin C(或前saposin相关多肽)和DOPS(或内小叶成分)二者的组合治疗，可引起生理反应，进而调节质膜中的内小叶成分的分布情况。
本发明药物的抗癌活性并不限于特定的作用模式，而可以通过各种作用模式发挥作用，其中包括凋亡。环境因素有助于本发明药物优先作用在肿瘤细胞上。这些环境因素包括，但不限于，肿瘤细胞周围的低酸水平、进一步缺氧条件以及肿瘤细胞的外膜上已改变的脂质表现。缺氧是后生因素，可刺激肿瘤细胞的血管内皮成长因素(VEGF)的表达和释放。VEGF是已知的血管渗透性因素，在与正常脉管系统相对的肿瘤组织的紊乱和泄漏脉管系统中发挥作用。本发明的一个具体药物saposinC-DOPS在静脉注射后，优先穿透肿瘤组织，而非健康组织。
本发明包括孤立的或实质上净化的蛋白质或多肽合成物。“孤立的”或“净化的”多肽或其生物活性部分实质上或本质上不受那些通常与自然存在环境中的蛋白质伴行或相互作用的成分的束缚。因此，一种孤立或净化的蛋白质在按基因重组法生产时，实质上不受其它细胞物质或培养介质的束缚，或者在其被化合时，实质上不受化学前体或其它化学物质的束缚。一种实质上不受细胞物质束缚的蛋白质包括杂质蛋白质含量(按干重计)低于大约30％、20％、10％、5％或1％的蛋白质制剂。当本发明蛋白质或其生物活性部分按基因重组法被生产时，理想的培养介质中化学前体和杂质蛋白质化学物的含量(按干重计)低于大约30％、20％、10％、5％或1％。
在此，“前saposin相关多肽”是指具有SEQ ID NO1中所列的前saposin氨基酸序列的任何多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO1中所列的氨基酸序列或其蛋白水解过程的一个片段至少有80％是相同的，其中的多肽保留质膜亲和力。前saposin多肽(SEQ ID NO1)的片段和变异也包括在本发明的范围之内。前saposin经蛋白水解处理后成为四种saposin，即saposin A、B、C及D。在此，“saposin C相关多肽”是指具有SEQ ID NO2中所列的saposin C氨基酸序列或与SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列至少有80％相同性的氨基酸序列的任何多肽，其中的多肽保留质膜亲和力。saposin C相关多肽(SEQ IDNO2)的片段和变异也包括在本发明的范围之内。上述“片段”是指氨基酸序列从而也是蛋白质的一部分。前saposin蛋白质片段保留前saposin的生物活性，因而拥有质膜亲和力。saposin C蛋白质片段保留saposin C的生物活性，因而拥有质膜亲和力。在此，“质膜亲和力”是指通过静电或疏水作用而与磷脂表面相互作用的能力。
本发明前saposin多肽的生物活性的一个片段将编码至少15、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510和520个相邻氨基酸或编码本发明前saposin多肽中的最多524个氨基酸。本发明的saposin C多肽的生物活性部分的一个片段将编码存在于本发明的saposin C中的至少15、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80个相邻氨基酸。
在此，“变异”是指实质上相似的序列。对于核苷酸序列，保守的变异包括那些由于遗传密码的简并性而对本发明的一种前saposin多肽的氨基酸序列进行编码的序列。像这些自然发生的等位基因变异可以视同为使用众所周知的分子生物技术，例如使用酸聚合酶链反应(PCR)和杂交技术。变异核苷酸序列还包括通过合成而得的核苷酸序列，例如那些通过使用部位导向的诱变法而生成的序列，但诱变法仍然编码一个前saposin。
在此，“变异的”蛋白质是指通过在原蛋白质的N端和/或C端删除(所谓的截切)或增加一个或多个氨基酸而获得的蛋白质；或通过在原蛋白质的一个或多个部分删除或增加一个或多个氨基酸而获得的蛋白质；或通过取代原蛋白质的一个或多个部位上的一个或多个氨基酸而获得的蛋白质或通过合成而产生具有上述的一个氨基酸序列的多肽。本发明所包含的变异蛋白质具有生物活性，即它们继续拥有我们所要的原蛋白质的生物活性，即这里所指的质膜亲和力。上述变异可以由例如遗传性多态现象或人类处理而产生。本发明前saposin天然蛋白质的生物活性变异将有至少大约80％、85％，但更理想的是有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％及更多，而最理想的是有至少大约98％、99％或更多的序列与天然蛋白质的氨基酸序列相同，天然蛋白质的氨基酸序列根据序列对齐程序并使用默认参数来确定，对齐程序在本申请的其它地方进行介绍。本发明蛋白质的生物活性变异可与该蛋白质有少至1-15个氨基酸残留物的差异，甚至只有少至1-10，例如6-10，少至5个，少至4、3、2甚至1个氨基酸残留物的差异。
本发明蛋白质通过各种方式发生改变，包括氨基酸取代、删除、截切和插入。这种处理方法在本技术领域已为人普遍知晓。例如前saposin蛋白质的氨基酸序列变异可以通过DNA突变而制得。突变和核苷酸序列改变的方法是众所周知的技术。可参见Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-492；Kunkel等人(1987)Methods inEnzymol.154367-382；美国专利号4,873,192；Walker and Gaastra，eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan PublishingCompany，New York)以及其中引用的文献。有关不影响所得蛋白质的生物活性的适当的氨基酸取代的指导，可参见由Dayhoff等人在(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)中建立的模型以及Qi等人所著的(2001)J.Biol.Chem.27627010-27017，在此通过引用纳入)。可优先使用保守的取代，例如使用一种具有类似属性的氨基酸替换另一种氨基酸。
因此，本发明的多肽和氨基酸序列包括自然存在的序列以及突变形态、变异及其修改形态。此种变异将继续拥有我们需要的质膜亲和力活性。很显然，在编码变异的去氧核糖核酸(DNA)中发生的突变不得将序列置于读取框之外，并且较理想的情况是不创建可产生二次信使核糖核酸(mRNA)结构的互补区域。参见EP专利申请出版物编号75,444。
对本发明所包含的蛋白质序列的删除、插入和取代预计不会使该蛋白质的特性发生根本性变化。然而，当事先预测取代、删除或插入的准确结果有困难时，对本技术有经验的人将希望通过常规筛选试验对结果进行评估。也就是说，可以使用本技术领域已知的方法评估质膜亲和力，这些方法包括，但不限于，荧光分光光度法、荧光共振能量转移或圆形二色测量法。例如，可参见Qi等人所著的(2001)J.Biol.Chem.27627010-27017，在此通过引用纳入}。
变异蛋白质还包括通过突变和重组程序，例如DNA搅乱法，而获得的蛋白质。使用这一程序，可以处理一个或多个不同的saposin C序列，以创建一个拥有所要属性的新的saposin C。这样，可从一组具有相关序列、包含具有实质序列相同性的序列区域并可在体内或体外进行同源重组的多核苷酸生成重组多核苷酸库。例如，使用这一方法，编码一个所要域的序列基元可以在本发明前saposin基因与其它已知基因之间互换，以获得具有所需改良属性(例如改变质膜亲和力)的蛋白质新基因编码。这种DNA搅乱策略已为本技术领域所知。例如，参见Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad Sci.USA9110747-10751；Stemmer(1994)Nature 370389-391；Crameri等人所著的(1997)Nature Biotech.15436-438；Moore等人所著的(1997)J.Mol.Biol.272336-347；Zhang等人所著的(1997)Proc.Natl.Acad Sci.USA 944504-4509；Crameri等人所著的(1998)Nature391288-291；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。
使用下列术语描述两个或更多个氨基酸序列或多肽之间的序列关系(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列相同性”、(d)“序列相同性百分比”以及(e)“实质相同”。
(a)在此，“参考序列”被定义为作为序列比较依据的序列。参考序列可以是某指定序列的子集或整体；例如全长度多肽或氨基酸序列或完整多肽序列的一个片段。
(b)在此，“比较窗口”参考一个氨基酸序列的相邻和指定的片段，其中在比较窗口中的氨基酸序列与参考序列(不包含增加或删除)相比，可以包含增加或删除(即空白)，使两个序列实现最佳的对齐。一般而言，比较窗口的长度至少为20个相邻氨基酸的长度，且可选长度为30、40、50、100个相邻氨基酸的长度或更长。本技术领域有经验者了解到，为避免由于在氨基酸序列中包含空白而与参考序列有高度的相似性，通常会引进一个空白损失并在匹配数量中减去这个空白损失。
对齐序列进行比较的方法在本技术领域已为人熟知。因此，可以使用数学算法来确定两个序列之间的序列相同性百分比。这种数学算法的非限制性例子优先是Myers和Miller在(1988)CABIOS 411-17中提出的算法；Smith等人在(1981)Adv.Appl.Math.2482中提出的局部同源算法；Needleman和Wunsch在(1970)J.Mol.Biol.48443-453中提出的同源对齐算法；Pearson和Lipman在(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.852444-2448中提出的搜索相似性方法；Karlin和Altschul在(1990)Proc.Natl.Acad Sci.USA 872264中提出，并在(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877中修正的算法。
这些数学算法的计算机实施版本可以用来进行序列比较，以便确定序列相同性。就本发明而言，应优先使用GCG程序GAP(10.00版或更新版)及其默认参数或任何等效程序进行核苷酸或蛋白质序列比较，以确定其与本申请公开的序列相比的序列相同性百分比。在此，“等效程序”是指任何序列比较程序，其对于任意两个待比较的序列，可以生成一个对齐，该对齐与优先程序生成的对应对齐相比，具有相同的核苷酸或氨基酸残留物匹配和相同的序列相同性百分比。
序列比较程序包括，但不限于包含在PC/Gene程序(美国加州Mountain View的Intelligenetics公司有售)中的CLUSTAL；包含在V8版Wisconsin Genetics Software Package中的ALIGN程序(V2.0版)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA以及TFASTA(美国的Genetics Computer Group(GCG)公司有售，地址575 Science Drive，Madison，Wis.，USA)。使用这些程序进行的对齐可以使用默认参数。CLUSTAL程序的详细说明可参见Higgins等人所著的(1988)Gene73237-244(1988)；Higgins等人所著的(1989)CABIOS 5151-153；Corpet等人所著的(1988)Nucleic Acids Res.1610881-90；Huang等人所著的(1992)CABIOS 8155-65；以及Pearson等人所著的(1994)Meth.Mol.Biol.24307-331。ALIGN程序依据的是前述Myers和Miller(1988)算法。在比较氨基酸序列时，可以使用PAM 120重量残留表、12空白长度损失和4空白损失与ALIGN程序配合。Altschul等人在(1990)J.Mol.Biol.215403中发表的BLAST程序所依据的是前述Karlin和Altschul(1990)算法。BLAST核苷酸搜索可以使用BLASTN程序，采用score＝100、wordlength＝12来完成，可以获得与编码本发明蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以使用BLASTX程序，采用score＝50、wordlength＝3来完成，可以获得与本发明蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为了获得序列比较所需的空白的对齐，可以使用Gapped BLAST(包含在BLAST 2.0中)，该程序的详细说明可参见Altschul等人所著的(1997)Nucleic AcidsRes.253389。此外，还可以使用PSI-BLAST(包含在BLAST 2.0中)来执行重复搜索，检测分子之间的疏远关系。参见Altschul等人于1997年发表的上述文章。当使用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，可以使用相应程序(例如核苷酸序列BLASTN程序、蛋白质BLASTX程序)的默认参数。参见http//www.ncbi.nlm，nih.gov网站。对齐还可以通过目测的方法手工完成。
(c)在此，两个核酸或多肽序列的“序列相同性”或“相同性”参考该两个序列中的残留物，这些残留物在指定比较窗口长度上被对齐并达到最高对应性时，是相同的。当序列相同性百分比与蛋白质相关地使用时，我们认识到，不相同的残留物位置通常因保守氨基酸取代而发生差异，其中，氨基酸残留物被其它具有相似化学属性(例如电荷或疏水性)的氨基酸残留物所取代，因此不改变分子的功能属性。当序列因保守取代而发生差异时，可以向上调整序列相同性百分比，以修正取代的保守性。序列因这种保守取代而发生差异时，我们说它具有“序列相似性”或“相似性”。这种调整方法已为本技术领域的有经验者所熟知。通常，这种方法包括在给保守取代评分时，将其定为部分而非完全匹配，从而提高序列相同性百分比。因此，例如当一个相同的氨基酸得到的分数是1分，一个非保守取代得到的分数是0分时，一个保守取代得到的分数将在0分和1分之间。保守取代的分数经计算而得，例如执行PC/GENE程序(美国加州Mountain View的Intelligenetics公司出品)中的计算。
(d)在此，“序列相同性百分比”是指在比较窗口中比较两个最佳对齐的序列而测得的值，其中，为了达到两个序列的最佳对齐，比较窗口中的多核苷酸序列部分与参考序列(不包含增加或删除)相比，可以包含增加或删除(即空白)。这一百分比通过以下方法计算而得测定两个序列出现相同核酸基或氨基酸残留物的位置数，从而获得匹配位置数，用匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，相除得到的商乘以100即得序列相同性百分比。
(e)(i)多核苷酸序列的“实质相同”这一术语是指多核苷酸包含一个序列，该序列通过使用上述对齐程序之一和标准参数与参考序列相比，二者的序列相同性百分比至少应为70％，更理想为至少80％，进一步理想为至少90％，而最理想为至少95％。本技术领域的有经验者将认识到，可以对这些数值进行适当的调整，把密码子简并性、氨基酸相似性读取框定位等考虑在内，以确定由两个核苷酸序列编码的两个蛋白质的相应相同性。就这些用途而言，氨基酸序列的实质相同性通常是指序列相同性至少为60％，更理想为至少70％、80％、90％，而最理想为至少95％。
表明核苷酸序列实质相同的另一个指标是，如果两个分子在严格条件下彼此杂交。一般来说，所选的严格条件是温度比具有确定离子强度和pH值的特定序列的热熔点(Tm)低5℃。然而，根据所需的严格程度，严格条件包括的温度范围可以在比Tm低大约1℃至20℃之间，限定条件在本文的其它地方进行论述。在严格条件下彼此之间没有杂交的核酸，如果它们所编码的多肽是实质相同的，那么它们仍然是实质相同的。这在使用基因编码所允许的最大密码子简并性复制核酸时可能发生。表明两个核酸序列实质相同的一个指标是，由第一个核酸编码的多肽与由第二个核酸编码的多肽之间具有免疫杂交反应性。
(e)(ii)对于一种肽而言，“实质相同”这一术语表示一种肽包含一个序列，该序列在指定比较窗口中与参考序列相比，二者的序列相同性至少为70％，更理想应为80％，进一步理想应为85％，而最理想应为至少90％或95％。应优先使用Needleman和Wunsch在(1970)J.Mol.Biol.48443-453中提出的同源对齐算法进行最佳的对齐。表明两个肽序列实质相同的一个指标是，一个肽与抗第二个肽的抗体之间具有免疫反应性。这样，第一个肽与第二个肽实质上是相同的，例如两个肽之间的差异仅仅是一个保守取代而已。“实质相似的”肽共同具有上述序列，但不相同的残留物位置可能因保守氨基酸变化而发生差异。
本发明药物包含类前saposin肽和内小叶成分。“内小叶成分”是指任何分子或其结构类似物，这些分子或其结构类似物自然存在于细胞质膜的内小叶中，这里所说的细胞尤指动物细胞，更尤指哺乳动物细胞。一般来说，内小叶中的内小叶成分的浓度将比外小叶中的内小叶成分的浓度高。人们已认识到，在某些细胞扰动过程中，例如凋亡、坏死以及超繁殖性生长，内外小叶的正常成分发生改变。有代表性的内小叶成分包括，但不限于，磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺及其结构类似物。在此，磷脂酰丝氨酸的“结构类似物”是指任何阴离子磷脂或含有带负电荷的头基的酸性脂类，包括，但不限于，磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、棕榈油酰磷脂酰丝氨酸、棕榈反油酸磷脂酰丝氨酸、肉豆蔻油酸磷脂酰丝氨酸、二亚油基磷脂酰丝氨酸、棕榈亚油酰磷脂酰丝氨酸、脱脂酸磷脂酰丝氨酸以及二油基磷脂酰丝氨酸。
在一个具体应用中，本发明合成物和方法专注于调节质膜中的内小叶成分的分布。在另一个具体应用中，本发明合成物和方法专注于调节和治疗与超扩散性细胞(例如肿瘤和癌症)有关的紊乱。在此，“调节”是指改变、更改、变更、修改或序列改变至少0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。调节质膜中的内小叶成分的分布是改变质膜中内小叶成分的数量、改变内小叶成分在内小叶中的相对位置或改变内小叶成分在质膜的内小叶和外小叶中所占的百分比。这种调节可导致质膜内小叶中的内小叶成分浓度的提高。调节肿瘤大小是改变肿瘤大小、改变至少一个肿瘤细胞或许多肿瘤细胞的大小。
测定质膜中的成分分布的方法在本技术领域已为人所知，其包括，但不限于，共焦显微镜技术、原子力显微镜技术、FRET、荧光淬熄、电子显微镜技术、圆形二色性法、NMR MALDI-TOF、发射光谱分析、光散射技术、电喷雾质谱技术。参见Chang等人所著的(1978)Anal.Biochem.911331；Kishimoto等人所著的(1992)J.LipidResearch 331255-1267；Vaccaro等人所著的(1995)J.Biol.Chem.2709953-9960；以及Fu等人所著的(1994)J Mol.Neurosci.559-67，在此通过引用将它们作为整体纳入。
测定肿瘤大小的方法在本技术领域已为人所知，其包括，但不限于，游标卡尺测量、体积测量法、超声波、磁共振成象、酶联免疫吸附测定、身体检查、X光、正电子放射X光断层摄影术、骨扫描、共振拉曼光谱技术、触觉成像、计算机X光断层摄影术和CAT扫描。
在此，“癌症”、“超扩散性”、“肿瘤”和“瘤性”这几个术语是指能够自主生长(即以快速扩散性细胞生长为特征的异常状态或状况)的细胞。超扩散性和瘤性疾病状态可分为病理性，即表征或构成一种疾病状态，和非病理性，即从常态衍生而来但与疾病状态无关。这一术语包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转变细胞、组织或器官，而不管组织病理学类型或侵入阶段。“超扩散性”这一术语进一步包括产生快速扩散性细胞生长(例如见于某些原发性心肌症)的平滑肌肉细胞。“病理性超扩散性”细胞发生于以恶性肿瘤生长为特征的疾病状态。非病理性超扩散性细胞的例子包括与伤口修复有关的细胞繁殖。
细胞繁殖和/或差异性紊乱的例子包括癌症，例如肿瘤、肉瘤、转移性紊乱，或者造血瘤性紊乱，例如白血病。转移性肿瘤可以产生于许多种原发肿瘤，包括，但不限于，那些产生于前列腺、结肠、肺、乳房和肝脏上的原发肿瘤。
“癌症”或“肿瘤”这两个术语包括各种器官的恶性，例如那些影响肺、乳房、甲状腺、淋巴、胃肠或生殖尿道的恶性，以及腺癌，包括恶性，例如大多数的结肠癌、肾脏细胞癌、前列腺癌和/或睾丸瘤、肺的非小型细胞癌、小肠癌和食道癌。
“扩散性恶性肿瘤”是一个技术术语，系指上皮或内分泌组织的恶性，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳癌、前列腺癌、内分泌系统癌以及黑素瘤。典型的扩散性恶性肿瘤包括那些在子宫颈、肺部、前列腺、乳房、头颈部、结肠和卵巢的组织上形成的肿瘤。这一术语也包括癌肉瘤，例如包括由癌瘤性和肉瘤样组织组成的恶性肿瘤。
“腺癌”是指发生于腺组织或者其中肿瘤细胞构成可识别的腺结构的扩散性恶性肿瘤。
“肉瘤”是一个技术术语，系指间充质衍生物的恶性肿瘤。
皮肤肿瘤和癌包括，但不限于，恶性黑素瘤、良性上皮肿瘤，包括但不限于，脂溢性角化病、棘皮症黑化、上皮纤维息肉、上皮囊肿、角化棘皮瘤、附件(附器)肿瘤；癌变前和恶性表皮肿瘤包括，但不限于，光化角化症、鳞片细胞癌、基细胞癌和梅克尔细胞癌；真皮肿瘤包括，但不限于，良性皮肤纤维瘤、隆突皮肤纤维肉瘤、黄色瘤以及皮肤脉管瘤；细胞迁移至皮肤的肿瘤包括，但不限于，组织细胞增生症X、蕈样肉芽肿(皮肤T细胞淋巴瘤)和肥大细胞增生病。
骨髓细胞肿瘤和癌包括，但不限于，由这些细胞引起的紊乱。这些紊乱包括，但不限于下列疾病与造血干细胞有关的疾病；定型淋巴祖细胞；淋巴细胞包括B和T细胞；定型骨髓祖细胞，包括单核细胞、粒细胞和巨核细胞；以及定型祖红细胞。这包括，但不限于，白血病包括B淋巴白血病、T淋巴白血病、未分化白血病；红白血病、成巨核细胞白血病、单核细胞；[有分化和未分化的白血病均包括在内]；慢性和急性成淋巴细胞白血病、慢性和急性淋巴球白血病、慢性和急性粒细胞白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、慢性和急性骨髓白血病、单核细胞白血病；慢性和急性成髓细胞白血病、慢性和急性骨髓细胞性白血病、慢性和急性早幼粒细胞白血病、慢性和急性粒细胞白血病、单核细胞-巨噬细胞系的血液恶性、例如青少年慢性骨髓性白血病；继发性急性粒细胞白血病、先质血液紊乱；反应性皮肤血管内皮瘤病；与枝状细胞内改变的表达有关的纤维性紊乱、紊乱包括系统硬化、E-M综合征、流行性毒油性综合征、嗜伊红细胞性筋膜炎局限性硬皮病型、瘢痕瘤以及纤维性结肠病；血管瘤样肿块恶性纤维组织细胞瘤；癌，包括原发性头颈鳞片细胞癌；肉瘤，包括卡波西肉瘤；纤维性瘤和叶状肿瘤，包括乳腺纤维性瘤；基质瘤；叶状肿瘤，包括组织细胞瘤；T细胞淋巴瘤；以及B细胞淋巴瘤。
心脏肿瘤和癌包括，但不限于，原发性心脏肿瘤，例如黏液瘤、脂肪瘤、乳头纤维弹性组织瘤、横纹肌瘤、肉瘤以及非心脏肿瘤的心脏效应。
血管肿瘤和癌包括，但不限于，血管瘤、淋巴管瘤、血管球瘤、脉管扩张、杆菌性血管瘤及中级(临界性低级恶性)肿瘤，例如卡波西肉瘤和血管内皮瘤，以及恶性肿瘤，例如血管肉瘤和血管外皮细胞瘤。
B细胞肿瘤和癌包括，但不限于，前体B细胞瘤，例如成淋巴细胞白血病/淋巴瘤。外周B细胞瘤包括，但不限于，慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、浆细胞瘤、多骨髓瘤以及相关实体、淋巴质浆细胞淋巴瘤(瓦尔登斯特伦[Waldenstrom]巨球蛋白血症)、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤(MALToma)以及多毛细胞白血病。
肝肿瘤和癌包括，但不限于，结节性增生、腺瘤以及恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肿瘤。
脑肿瘤和癌包括，但不限于，神经胶质瘤包括星形细胞瘤，包括纤维性(弥漫性)星形细胞瘤和多形性成胶质细胞瘤、纤维性星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤及脑干神经胶质瘤、少突胶质细胞瘤以及室管膜瘤和相关室旁肿块损伤、神经性肿瘤、低分化肿瘤，包括成神经管细胞瘤以及其它脑实质肿瘤，包括原发性脑淋巴瘤、生殖细胞肿瘤及松果体脑实质肿瘤、脑膜瘤、转移性肿瘤、副肿瘤综合征、周围神经鞘肿瘤，包括神经鞘瘤、纤维神经瘤、恶性周围神经鞘瘤(恶性神经鞘瘤)及神经皮肤综合征(斑痣性错构瘤病)，包括神经纤维瘤，包括I型神经纤维瘤(NF1)和II型神经纤维瘤(NF2)、结节性脑硬化以及VonHippel-Lindau病。
卵巢肿瘤和癌包括，但不限于，卵巢瘤，例如体腔上皮瘤、浆液瘤、粘液性肿瘤、子宫内膜样肿瘤、透明细胞腺癌、囊腺纤维瘤、卵巢良性纤维上皮瘤、表面上皮瘤；生殖细胞瘤，例如成熟(良性)畸胎瘤、单层细胞畸胎瘤、未成熟恶性畸胎瘤、恶性胚胎瘤、内胚窦瘤、绒毛膜癌；性索基质瘤，例如粒层细胞-泡膜细胞瘤、泡膜细胞瘤-纤维瘤以及成雄细胞瘤、山细胞瘤及性腺母细胞瘤；以及转移性肿瘤，例如克鲁根堡氏瘤。
肾脏肿瘤和癌包括，但不限于良性肿瘤，例如肾乳头腺瘤、肾纤维瘤或错构瘤(肾髓质间质细胞瘤)、肾血管平滑肌脂肪瘤及瘤细胞瘤，以及恶性肿瘤，包括肾细胞癌(肾上腺样瘤、肾腺癌)，包括肾盂尿路上皮癌。
骨骼肌瘤和癌包括，但不限于，横纹肌肉瘤。
成骨细胞瘤和癌包括，但不限于，骨瘤、骨样骨瘤、成骨细胞瘤、骨肉瘤、骨软骨瘤、软骨瘤、成软骨细胞瘤、软骨粘液纤维瘤、软骨肉瘤、纤维性皮质缺损、纤维性发育不良、纤维肉瘤、恶性纤维性组织细胞瘤、内皮性别性骨髓瘤、原始神经外胚层肿瘤、巨细胞瘤以及转移性肿瘤。
胰腺瘤和癌包括，但不限于，囊性肿瘤和胰腺癌；腺岛细胞瘤包括，但不限于，胰岛瘤、促胃液素瘤以及其它罕见的腺岛细胞瘤。
乳房肿瘤和癌包括，但不限于，基质瘤，例如纤维性瘤、叶状瘤及肉瘤，以及上皮肿瘤，例如大腺管乳头状瘤；乳癌包括原位(非扩散性)肿瘤，包括原位(非扩散性)腺管内肿瘤(包括Paget病)和小叶原位癌以及扩散性(浸润)癌包括，但不限于，非特别类型扩散性腺管内肿瘤、扩散性小叶癌、髓质瘤、胶样(粘液)癌、管状癌及扩散性乳头状癌，以及其它恶性肿瘤。
男性胸部肿瘤和癌包括，但不限于，扩散性恶性肿瘤。
前列腺肿瘤和癌包括，但不限于，扩散性恶性肿瘤。
结肠肿瘤和癌包括，但不限于，非瘤性息肉、腺瘤、家族综合征、直肠癌变、直肠癌以及类癌肿瘤。
肺部肿瘤和癌包括，但不限于，支气管癌，包括副肿瘤综合征、细支气管肺泡癌、神经内分泌肿瘤，例如支气管类癌、其它肿瘤和转移性肿瘤；胸膜瘤，包括孤立性纤维瘤(胸膜纤维瘤)和恶性间皮瘤。
胸腺肿瘤和癌包括，但不限于，胸腺瘤，包括生殖细胞瘤、淋巴瘤、霍奇金氏(Hodgkin)病和类癌。胸腺瘤可包括良性或包裹性胸腺瘤和恶性胸腺瘤I型(扩散性胸腺瘤)或II型、指定性胸腺癌。
扁桃体肿瘤和癌包括，但不限于，非霍奇金氏淋巴瘤B细胞淋巴瘤。
包含前saposin相关多肽和内小叶成分(也称“活性药剂”)的一种本发明药剂可以合成为适合给某一实验对象使用的药物。这些药物一般包含一种前saposin多肽、一种内小叶成分和一种制药学上可接受的载体。在一个具体药物中，前saposin相关多肽与内小叶成分构成一种纳泡。纳泡的直径范围在0.01至10微米之间，较理想应在0.1至1微米之间，进一步理想应在0.1至0.5微米之间，更进一步理想应在0.2至0.4微米之间，而再进一步理想则应在0.2至0.3微米之间。典型的纳泡直径包括，但不限于10纳米、100纳米、150纳米、160纳米、170纳米、180纳米、190纳米、200纳米、210纳米、220纳米、230纳米、240纳米、250纳米、260纳米、270纳米、280纳米、290纳米、300纳米、350纳米、400纳米、450纳米、500纳米、550纳米、600纳米、650纳米、700纳米、750纳米、800纳米、850纳米、900纳米、950纳米以及1000纳米。
在此，“用药”一词具有其最广泛的含义，包括将本发明药物引进某一实验对象的任何方法。“实验对象”是指哺乳动物，例如人类，或者实验或动物或疾病模型。实验对象也可以是非人类动物，例如，但不限于，非人类灵长目动物、马、母牛、山羊、猪、兔、鼠、豚鼠、狗或其它家畜。此外，本发明药物可以用于治疗此处所述的紊乱。因此，凡治疗与超扩散性细胞(例如肿瘤或癌)有关的紊乱均包括在内。在此，“治疗”一词被定义为在某一患者上应用或使用本发明药剂，或者将本发明药剂应用于或投药于某一名具有疾病或疾病症状的患者的某一单独组织或细胞系上，目的是治疗、治愈、缓解、减轻、改变、纠正、改善、改进或影响疾病或疾病的症状。
在此，“制药学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、糖衣、抗菌和抗真菌药剂、等渗或延迟吸收药剂等等与药物用药相容的药剂。在活性药物上使用这种介质和药剂在本技术领域已为人熟知。除非任何传统介质或药剂与活性药物不相容，否则在药物中使用这种介质和药剂乃预料之中。补充性活性药剂也可以合成到药物中。
本发明的一种抗肿瘤药剂或药物经配制后，可以与其预定用药途径相容。用药途径的例子包括不经肠，例如静脉注射、皮内注射、皮下注射、口服(例如吸入)、经皮(外用)、经黏膜、腹腔和直肠直接给药。不经肠、皮内或皮下注射给药的溶液或悬浮液可包括下列成分无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸酯；抗氧化剂例如抗坏血酸维生素C或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲剂例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及肌肉弹性调节剂，例如氯化钠或葡萄糖。酸碱度可以根据酸或碱进行调节，例如盐酸或氢化钠。经肠制剂可以装入安瓿、一次性注射器或者多剂量瓶中，这些容器可以是玻璃或塑料材质。
适合注射的药物包括无菌水溶液(若可溶于水)或分散液和可临时配制成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉注射给药，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL.TM.(BASF；Parsippany，N.J.)或者磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，药物都必须是无菌的并且应当具有容易注射的流动性。药物在制造和存储条件下必须稳定并且必须具有防止受到微生物例如细菌和真菌污染的保护措施。载体可以是溶剂或分散介质，其可以包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等等)以及这些物质的适当混合物。可以通过使用糖衣(例如卵磷脂)、通过维持所需的粒度(对于分散液而言)以及使用表面活性剂的方式，维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过使用各种抗菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸维生素C、乙基汞硫代水杨酸钠等等)来实现。在许多情况下，药物中最好也包括等渗剂，例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨糖醇和氯化钠。可以在药物中包括一种延缓吸收的药剂(例如一硬脂酸铝和凝胶)来延长吸收。
可以将溶于适当溶剂中的所需数量的活性药剂(例如前saposin相关多肽和内小叶成分)与必要的上述一种成分或者多种成分的组合合成，然后过滤杀菌，配制成无菌可注射溶液。一般来说，分散剂的配制方法是将活性药剂融合到无菌介质中，无菌介质包含基本分散介质和必要的上述其它成分。对于用来配制无菌可注射溶液的无菌粉末，配制粉末的较佳方法是真空干燥法和冷冻干燥法，这些方法可以从先前经杀菌过滤的溶液中制造出活性成分粉末以及任何其它想要得到的成分。
口服药物一般包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可以封装在凝胶胶囊中或者压缩成药片。对于口服疗法用药，活性药剂可以与赋形剂融合，并以药片、片剂或胶囊的形式使用。口服药物还可以使用液体载体配制成漱口液，液体载体中的药剂经口给药并冲漱口部，然后吐出或咽下。制药学相容粘合剂和/或辅助材料可以作为药物的一部分。药片、药丸、胶囊、片剂等可以包含以下任何成分或类似性质的药剂粘合剂例如微晶纤维素、黄蓍胶或者凝胶；赋形剂例如淀粉或乳糖、分解剂例如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或Sterotes；助滑剂例如二氧化硅胶体；甜味剂例如蔗糖或糖精；或者调味剂例如薄荷、水杨酸甲酯或者橙味剂。对于吸入给药，药剂以装在压缩容器或配给器中的气雾喷剂的形式给药，该容器包含一种适当的推进物，例如二氧化碳气体或雾化器。
在一个具体药物中，活性药剂与可以防止药剂被身体快速排出的载体一起配制而成，例如控制释放配方，包括植入和微胶囊封装给药机制。可以使用可生物降解、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原磷酯以及聚乳酸。这种配方的配制方法对于本技术领域的有经验者而言是显而易见的。可用材料也可向AlzaCorporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.公司购买。脂质体悬浮液(包括以具有抗病毒抗原的单克隆抗体的感染细胞为目标的脂质体)也可以用作制药学上可接受的载体。这些物质可以根据本技术领域已知的方法进行配制，例如使用美国专利No.4,522,811所描述的方法。
将口服或不经肠的药物配制成剂量单位形态尤其有利，因为可以方便用药并保证剂量的一致性。在此，“剂量单位形态”是指物理上离散的单位，适合治疗实验对象的单位剂量，每单位包含预定数量的活性药剂，预定数量是根据活性药剂与所需的制药学载体联合可产生所要的疗效计算而得。根据疾病的类型和严重程度，给病人选用的本发明药剂的初始剂量大约在1微克/公斤至大约15毫克/公斤(例如0.1至20毫克/公斤)之间，不管是采用一次或多次单独给药或者连续输注的方法。典型的每日剂量可以在大约1微克/公斤至100毫克/公斤之间或者更高剂量，具体剂量要根据上述因素而定。对于多日或更长时间内重复给药，根据具体情况，治疗可继续，直到疾病症状得到适当的抑制为止。然而，其它剂量体系也可能有效。这种疗法的进展情况可以通过传统的技术和化验得到监控。一个典型的剂量体系已在WO 94/04188中公开。本发明的剂量单位形态取决于并直接依赖于活性药剂的独特性质和所要取得的特定疗效以及复合该活性药剂用以治疗个体患者的技术所固有的局限性。
系统用药还可以采用经黏膜或经皮的方法。对于经黏膜或经皮给药，应在配方中使用适合所要渗透的屏障的渗透剂。这种渗透剂在本技术领域已为人所普遍知晓，例如用于经黏膜给药的渗透剂有清洁剂、胆汁盐以及梭链孢酸衍生物。经黏膜给药可以使用鼻用喷剂或栓剂的方法。对于经皮给药，活性药剂被配制成油膏、软膏、胶体或霜剂，这些在本技术领域已众所周知。药剂还可以配制成栓剂(例如传统栓剂可可油及其它甘油酯)形式或者保留灌肠剂实现直肠送药。
本文所述的抗肿瘤或抗癌药剂可以经皮给药。经皮给药一般包括使药剂通过经皮通道进入实验对象或患者的系统循环。皮肤部位包括经皮给药的解剖学区域，包括前臂、腹部、胸部、背部、屁股、乳头部等等。
经皮送药通过使患者的皮肤长时间暴露于药剂或药物源达到送药目的。经皮药贴还具有有控制地向身体提供药剂的优点(参见Hadgraftand Guy(eds)所著的Transdermal Drug DeliveryDevelopmentalissues and Research InitiativesMarcel Dekker，Inc.；Robinson &Lee(eds)所著的(1987)Controlled Drug DeliveryFundamentalsand Applications，Marcel Dekker，Inc；以及Kydonieas & Bemer(eds)所著的(1987)Transderrnal Delivery of Drugsvols 1-3，CRC Press，在此通过引用纳入)。这种剂量形态可以通过溶解、分散或者其它方式将saposin C相关多肽和二油基磷脂酰丝氨酸(dioleoylphosphatidylserine，简称DOPS)的结合物融合到适当的介质(例如弹性体骨架材料)中制作而成。吸收增强剂还可以用来提高药剂通过皮肤的流量。此流量的速度可以通过提供速度控制膜或者将药剂分散在聚合物骨架或凝胶中而得到控制。
许多类型的经皮药贴在此处所述的方法中得到应用。例如，简单胶布药贴可以使用背衬材料和丙烯酸盐胶布制作而成。药剂和任何增强剂可以配制成胶性浇铸溶液并可充分混合。该溶液可以直接浇铸在背衬材料上，而浇铸溶剂则在炉中蒸发掉，留下胶膜。附上释放内衬，即成完整的药贴。
也可以使用聚氨酯骨架药贴进行送药。此药贴的各层包括背衬层、聚氨酯药/增强剂骨架层、膜层、胶粘层以及释放内衬层。聚氨酯骨架使用室温固化聚氨酯预聚物配制而成。在该预聚物中加入水、酒精和药剂配制成坚实的粘性弹性体后，可以直接浇铸在背衬材料上。
本发明的一个更进一步的具体药物可以使用水凝胶骨架药贴。水凝胶骨架一般包括酒精、水、药和几种亲水聚合物。该水凝胶骨架可以夹在背衬和胶粘层之间，融合到经皮药贴上。
对于被动送药系统，释放速度一般通过夹在储药器和皮肤之间的膜、通过从单片装置中进行扩散或者通过将皮肤本身作为送药系统中的速度控制屏障得到控制。(参见美国专利，专利号4,816,258；4,927,408；4,904,475；4,588,580；4,788,062，在此通过引用纳入)。送药速度将部分取决于膜的性质。例如药物在体内穿过膜的速度一般比穿过皮肤屏障的速度高。药剂从装置送往膜的速度的最便利控制方法是在储药器和皮肤之间放置一个速度限制膜。当皮肤对于药物具有充分的渗透性(即通过皮肤的吸收高过通过膜的速度)时，膜将具有控制患者接受剂量速度的功效。
具有适当渗透性的膜材料可以根据所需的渗透性、药剂的性质以及与构建装置有关的机械因素来选择。典型的渗透性膜材料包括广泛的自然和合成聚合物，例如聚二甲基硅氧烷(硅树脂橡胶)、乙烯乙酸乙烯酯共聚物(EVA)、聚氨酯、聚氨酯-聚醚共聚物、聚乙烯、聚酰胺、聚氯乙烯(PVC)、聚丙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯(PTFE)、纤维素材料，例如三乙酸纤维素和硝酸纤维素/醋酸纤维素和水凝胶，例如2-羟乙酯甲基丙烯酸(HEMA)。
装置可以含有其它东西，例如其它制药学上可接受载体，具体要看所要的装置特性而定。例如，根据本发明的配制药物还可以包括一种或多种防腐剂或细菌抑制剂，例如羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、氯化甲酚、杀藻胺等等。这些药物还可以包含其它活性成分，例如抗微生物剂，尤其是抗生素、麻醉剂和止痒剂。
本发明的另一方面还对本发明药剂的外用送药进行了规定。本治疗体系适合抗肿瘤药剂的系统用药，也适合局部疗法，即直接送至病理性或有病的组织。
一般来说，外用药物配方包括将药剂直接送至感染部位、包含药物的制剂，药物的浓度范围一般在大约0.001％至10％之间；较理想的范围为大约0.01至大约10％之间；进一步理想的范围在大约0.1至大约5％之间；而最理想的范围为大约1至大约5％之间，这一浓度包括非毒性、制药学上可接受的外用载体(Barry(eds).Dermatological FormulationsPercutaneous Absorption(1983)Marcel Dekker，Inc；有关传统药剂的标准剂量，可参见例如，Physicians Desk Reference(1992版)；以及美国医学协会的(1992)Drug Evaluations Subscriptions)。
外用制剂可以通过将药剂与传统药物稀释剂和外用干质、液体、霜质和浮质配方中常用的载体相结合配制而成。膏剂和霜剂可以(例如)使用水基或者油基加上适当的浓化剂和/或胶凝物质配制而成。这些基可以包括水和/或油，例如液体石蜡，或植物油，例如花生油或蓖麻油。根据基的性质而进行使用的浓化剂可以包括软石蜡、硬脂酸铝、十六十八混合醇、丙二醇、聚乙二醇、羊毛脂、氢化羊毛脂、蜂蜡等等。洗剂可以使用水基或油基配制而成，并且一般还包括下列之一种或多种稳定化剂、乳化剂、分散剂、悬浮剂、浓化剂、着色剂、香精等等。粉末可以使用任何适宜的基(例如滑石、乳糖、淀粉等等)制作而成。滴剂可以使用水基或非水基配制而成，这些基还可以包括一种或多种分散剂、悬浮剂、增溶剂等等。
本发明药剂的外用剂量形态包括粉末、喷剂、油膏、软膏、霜剂、洗剂、胶体、溶液、药贴和吸入剂。活性药剂可以在无菌条件与制药学上可接受载体、任何防腐剂、缓冲剂或必要的推进物混合。
油膏、软膏、霜剂和胶体还可包含赋性剂，例如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅树脂、膨润土、滑石以及氧化锌或者以上物质的混合物。粉末和喷剂还可包含赋性剂，例如乳糖、滑石、氢氧化铝、硅酸钙以及聚酰胺粉末或者以上物质的混合物。喷剂还可包含惯用的推进物，例如含氯氟羟和挥发性未取代碳氢化合物，例如丁烷和丙烷。
本发明的方法还适用于通过粘膜送药，例如胃肠、舌下、口腔、鼻、肺、阴道、角膜、眼膜(参见Mackay等人所著的(1991)Adv.Drug Del.Rev.7313-338)。
对于经口腔或舌下膜送药，可以使用典型的口服配方例如口含片、药片或胶囊。制造这些配方的方法已为本技术领域所知，包括，但不限于，在预制药片中加入药剂；冷压缩惰性填料、粘合剂和胶囊封装。
另外一种口服配方可以与粘合剂(例如纤维素衍生物、羟丙纤维素)一起敷在口腔黏膜上，如美国专利No.4,940,587所描述，在此通过引用纳入。当敷在口腔黏膜上时，这种口腔粘合配方可以控制药剂释放到口中并穿过口腔黏膜。
对于送药到鼻和/或肺膜，可以采用典型的气雾剂配方。“气雾剂”这一术语包括本发明药剂的任何气载悬浮相，能够被吸入到细支气管或鼻道中。具体而言，气雾剂包括当前发明药剂微滴的气导悬浮液，例如装在计量剂量吸入器或喷雾器中。气雾剂还可以包括悬浮在空气或其它载体气中的药剂干粉药物，可以通过从吸入器装置中吸入的方法送药。
本发明药物具有治疗此处所述的紊乱的功效。药物按疗效数量提供。这里的“疗效数量”是指足以调节所要达到的反应的数量。根据这一定义，药剂中的蛋白质或多肽的疗效数量(即有效剂量)的范围在大约0.001至30毫克/公斤体重之间，较理想的范围在大约0.01至25毫克/公斤体重之间，进一步理想的范围在大约0.1至20毫克/公斤体重之间，而更进一步理想的范围在大约1至15毫克/公斤体重之间。本发明药剂的内小叶成分疗效数量(即有效剂量)的范围在大约0.001至30毫克/公斤体重之间，较理想的范围在大约0.01至大约30毫克/公斤体重之间，进一步理想的范围在大约0.01至大约20毫克/公斤体重之间，更进一步理想的范围在0.01至10毫克/公斤体重之间，再进一步理想的范围在大约0.1至9毫克/公斤、0.1至8毫克/公斤、0.1至7毫克/公斤、0.1至6毫克/公斤、0.1至5毫克/公斤、0.1至4毫克/公斤或者0.1至3毫克/公斤体重之间。
本发明药剂中多肽与内小叶成分的摩尔比率范围在大约1∶1至大约1∶50之间，较理想的范围在大约1∶1至大约1∶25之间，进一步理想的范围在大约1∶1至1∶10之间，而再进一步理想的比率是大约1∶7或大约1∶3。适宜的比率宝库，但不限于，1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12、1∶13、1∶14、1∶15、1∶16、1∶17、1∶18、1∶19、1∶20、1∶21、1∶22、1∶23、1∶24、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45以及1∶50。本发明药剂中的多肽与内小叶成分的质量比率范围在大约15∶1至3∶10之间，较理想的范围在大约15∶1至大约3∶5之间，进一步理想的范围在大约15∶2至大约3∶0之间，而最理想的比率是大约15∶7或者大约5∶1。看得出本发明药剂中的多肽与内小叶成分之间的优先比率可能受到某些因素的影响，例如，但不限于，目标细胞类型。有经验的技术人员看得出某些因素可能影响有效治疗某一实验对象所需的剂量，包括，但不限于，疾病或紊乱的严重程度、先前的治疗、实验对象的总体健康状况和/或年龄以及是否存在其它疾病。而且，使用疗效数量的蛋白质、多肽或者抗体治疗某一实验对象可包括单一治疗或者更可取地包括一系列治疗。在一个首选例子中，每周使用疗效数量的药剂治疗某一实验对象，用药时间在大约一周至十周之间，较理想为二周至八周之间，进一步理想为大约三周至七周，更进一步理想为大约四周、五周或六周。另外也看得出治疗所用的抗体、蛋白质或者多肽的有效剂量可能在具体治疗过程中或增或减。剂量更改可能是因为并可能显然是因为于此处所述的诊断检定结果所致。当治疗中的某一实验对象有部分反应表现或者在症状长期消退之后复发时，可以使用本发明药剂作为后续治疗。因此，在第一个治疗周期(可能包括单剂量体系或多剂量体系)之后间隔了一段时间之后，某一实验对象可以接受一个或多个额外治疗周期，额外治疗周期可包括单剂量体系或多剂量体系。在此，两个治疗周期之间的间隔时间是指停药时间。看得出，停药时间长度取决于任何先前使用本发明抗肿瘤药剂的治疗周期中达到的肿瘤反应程度。药物可以使用容器、装包或分配器包装，并随附用药说明。一种癌症的治疗结果可以采用本技术领域已知的任何方法进行检定，包括，但不限于，体检、实验、原子和X光照相术(即计算机X光体层照相术和/或磁共振成像技术)、超声波以及其它方法。在此，“细胞死亡”是指通过任何机制包括凋亡、坏死和溶解等使细胞失去生命。在此，“凋亡”或者“计划内细胞死亡”是指需要垂死细胞的调制代谢活动的正常生理过程，其通常特征是细胞收缩、染色质浓缩和/或核子分裂、膜的缺失、DNA分裂和/或质膜损害或起泡。以下例子仅为说明用途，并非对本发明进行限制。
实验例一重组saposinC的提纯采用异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷诱导pET系统时，重组saposin C在E.coli细胞中被过度表达(参见Qi等人所著的(1994)J.Biol Chem.26916746-16753，在此通过引用将它们作为整体纳入)。被表达的多肽与His-tag一起从镍柱上洗提。透析之后，多肽通过以下HPLC高效液相色谱法得到进一步提纯。一个C4反相柱与0.1％三氟乙酸(TFA)保持平衡达10分钟。蛋白质在乙腈中按0.1％TFA的线性(0-100％)梯度洗提60分钟以上。主要的蛋白质峰均被收集并冻干。蛋白质浓度按上述方法测定(参见Qi等人所著的(1994)J.Biol.Chem.26916746-16753)。
例二saposin C和二油基磷脂酰丝氨酸的声波降解浴二油基磷脂酰丝氨酸(DOPS)可向Avanti Polar Lipids(Alabaster AL)公司购买。氯仿中有二十至三十微摩尔的DOPS在N2下被干燥并抽真空成脂膜。五至十微摩尔saposin C多肽被添加到干燥膜上并加到50微升Mcllvanine缓冲剂(pH4.7)中制成悬浮液。然后加入细胞培养介质或磷酸盐缓冲盐水(PBS)使悬浮液容积达到1毫升(参见Ausubel等人所著的(2002)Current Protocols inMolecular Biology.John Wiley & Sons，New York，New York，在此通过引用纳入)。以上混合物在浴法声波降解器中经声波降解大约20分钟。如需要，加入适量的冰，防止样品过热。
例三组织培养条件鳞片细胞癌(SCC)细胞和L5178Y细胞在加有10％FBA的DEME介质(Gibco)中培养。正常永生化角质形成细胞(NIK)在50％Cascade介质154(Cascade Biologics)和50％角质形成细胞-SFM介质(Gibco)中生长。
例四体外分析saposin C-DOPS抑制SCC细胞的效果鳞片细胞癌(SCC)细胞和对照细胞(NIK细胞)均在介质中生长，该介质在本文别处进行介绍。把NIK作为对照细胞，是因为已表明SCC在人类皮肤角质形成细胞中是通过一个多步过程而发育的(参见Kubo等人所著的(2002)J.Med.Invest.49111-117)。从已建立的NIK和SCC细胞平皿中除去培养介质。培养介质不做任何处理，向已建立的NIK和SCC细胞平皿中加入saposin C、DOPS或者8μM saposin C+26μM DOPS。这些细胞在治疗之后48-72小时进行检查。图1显示一个上述实验的结果。鳞片细胞癌(SCC)细胞所生长的介质在本文他处进行介绍。培养介质从已建立的SCC细胞平皿中除去。培养介质不做任何处理或者向已建立的SCC细胞平皿中加入含有10μM saposin C+30μM DOPS的药剂。让细胞孵化24小时后，通过TUNEL着色、染色体组DNA的胶体电泳或者使用抗凝结剂蛋白即膜联蛋白V进行杂交测定，分析这些细胞，分析数据未显示。
例五体外分析saposin C-DOPS对鼠淋巴瘤细胞的疗效组织培养平皿种有鼠L5178Y-R淋巴瘤细胞。培养物建立之后，除去培养介质并清洗细胞。这些细胞上覆盖DEME+10％FBA之外，或者无附加药物或者附加60μM DOPS、20μM saposin C或者10μMsaposin C和30μM DOPS。培养物孵化24-48小时。孵化期之后检查培养物。图2显示一个上述实验的结果。
例六体内分析saposin C-DOPS对肿瘤大小的影响裸鼠按(美国)辛辛那提儿童研究基金会(CincinnatiChildren′s Research Foundation)有关实验鼠照料的规定进行喂养。分别对两组各五只裸鼠进行2×106SCC上背部皮下注射，使之发生肿瘤生长。每只鼠分别长出两个肿瘤。让肿瘤生长21天。在第21天，这些动物的肿瘤部位接受纯PBS稀释剂或者包含saposin C(10毫克/公斤体重)和DOPS(2毫克/公斤体重)的药剂皮下注射。在第27天，这些动物的肿瘤部位接受第二次纯PBS稀释剂或者包含saposinC(10毫克/公斤体重)和DOPS(2毫克/公斤体重)的药剂皮下注射。每隔一天用卡尺测量肿瘤大小，肿瘤体积按公式V＝(π/4)LW2进行估算。图3的A片区显示一个上述实验的结果。在单独的一组实验中，裸鼠按(美国)辛辛那提儿童研究基金会(Cincinnati Children′s Research Foundation)有关实验鼠照料的规定进行喂养。分别对两组各五只裸鼠进行2×106SCC上背部皮下注射，使之发生肿瘤生长。每只鼠分别长出两个肿瘤。让肿瘤生长6天。在第6天，这些动物的肿瘤部位接受纯PBS稀释剂或者包含saposin C(10毫克/公斤体重)和DOPS(2毫克/公斤体重)的药剂皮下注射。
每隔一天用卡尺测量肿瘤大小，肿瘤体积按公式V＝(π/4)LW2进行估算。图3的B片区显示一个上述实验的结果。
例七saposin C-DOPS对人类鳞片细胞癌肿瘤组织的疗效使用SCC肿瘤按本技术领域已知的方法制备鼠异种移植物。将荧光标志硝基苯并二唑(NBD)与磷脂酰丝氨酸相连结并制备NBD-PS与DOPS的混合物。使用NBD-DOPS制备荧光标志NBD-PS/DOPS/saposin C药剂。在肿瘤部位按0.1毫克NBD-PS/公斤体重和2毫克DOPS/公斤体重的剂量注射NBD-PS/DOPS。在肿瘤部位按0.1毫克NBD-PS/公斤体重、2毫克DOPS/公斤体重和10毫克saposin C/公斤体重的剂量注射NBD-PS/DOPS/saposin C。肿瘤于用药后24小时被杀死。检查肿瘤的显微切片是否有荧光。图4显示一个上述实验的结果。
例八体外分析saposin C-DOPS对人类细胞的疗效取自人类癌组织和健康组织的细胞均在适合该细胞系的介质中生长。对取自以下癌组织和健康组织细胞系的细胞进行分析乳癌MCF-7、转染显性负caspase 9的MCF-7、转染病媒控制的MCF-7、BT-549；头和颈SCC-25、FaDu；黑素瘤MeWo、Sk-Mel-28；白血病K-562、HL60；子宫颈癌Hela；卵巢癌PA1、转染显性负caspase 9的PA1、PA1-E6；SK-OV3；前列腺癌DU145、PC3；成神经细胞瘤SK-N-SH、SK-SY-5Y、CHLA-79；Ewing肉瘤5838；T细胞淋巴瘤；RoduT；GCT；肺癌A549、H441；肝癌HepG2；健康乳房MCF-10A；以及健康角质形成细胞NIK。96井平底组织培养皿(Falcon，Becton-Dickson Labware，Franklin Lakes NJ)按每井10000个细胞的密度进行种植。细胞皿分别放入含有或不含有本发明药剂的完全培养基中。使用3-(4，5-二甲基噻唑-2-y1)-2，5-二苯四唑溴化物(可向Sigma购买)转甲产品(18992)来评价可存活细胞密度。细胞培养之后72小时，向每个井中添加3-(4，5-二甲基噻唑-2-y1)-2，5-二苯四唑溴化物(MTT)，达到最终浓度为0.25毫克/毫升为止。细胞皿在黑暗中于37℃温度下孵化3个小时。所起的反应通过加入含有0.04N HCI的异丙醇予以终止。将细胞皿彻底混合，并在微ELISA平皿读取器(由SpectraMax Plus，Molecular Devices，Sunnyvale CA制造)上做570纳米分析。使用PharmTools Pro计算机软件(The McCaryGroup，Elkins Park，PA产品)进行生长曲线和回归分析。
例九评估saposin C/DOPS IC50制备saposin C和DOPS摩尔比率分别为1∶7、1∶3和1∶10的混合物。按上述方法制备由多段saposin C蛋白质组成的多肽(参见Wang等人所著的(2003)Arch.Biochem.&Biophys.41545-53，在此通过引用将它们作为整体纳入)。突变saposinC多肽如下所示HNSC由氨基酸残留物1-40组成；H1由残留物4-20组成；H-2则由氨基酸残留物24-40组成。人类SK-Mel-28黑素瘤细胞在96井平底组织培养皿中培养。细胞上覆盖介质，该介质含有各种浓度的saposin C、DOPS、HNSC∶DOPS(1∶3)、H-1∶DOPS 1∶3；H-2∶DOPS 1∶3；或者全长saposin C与DOPS按1∶7、1∶3或1∶10比例混合的混合物。分别对四个SK-Mel-28细胞皿使用每一种治疗。使用MTT转换测定法(在本文他处进行介绍)分析对细胞的抑制效果。使用PharmTools Pro计算机软件(The McCary Group，Elkins Park，PA公司产品)对数据进行基本线性回归分析。分析结果显示在表2中。
例十体内分析saposin C-DOPS对肿瘤细胞的疗效裸鼠按(美国)辛辛那提儿童研究基金会(CincinnatiChildren′s Research Foundation)有关实验鼠照料的规定进行喂养。分别对实验鼠进行2×106SCC上背部皮下注射，使之发生肿瘤生长。让肿瘤生长。这些动物分别使用DOPS(2毫克/体重)或含有saposinC(10毫克/公斤)和DOPS(2毫克/公斤体重)的药剂进行治疗。治疗之后四十八小时，肿瘤被杀死。制备肿瘤组织切片并使用各种方法进行检查。使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸盐缺口端标志(TUNEL)对组织切片检查，评估凋亡情况。(一个上述实验的结果在图5的A和B片区显示。)组织切片使用苏木精和曙红进行着色。(一个上述实验的结果在图5的C和D片区显示。)说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请表明那些对本发明领域有经验者的水平。所有出版物、专利和专利申请在此通过引用纳入，如同具体地引用每个出版物或专利申请，将它们分别纳入一般。尽管为理解清楚起见，通过图解和举例的方法对前述发明作了一定程度的具体说明，但是很显然，在随附的申请专利范围内可作某些变化和修改。
序列表<110>Children′s Hospital Medical Center<120>Saposin C-DOPS一种抗癌新药<130>CHM08/GN003<150>60/466,166<151>2003-04-28<160>2<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>524<212>PRT<213>人<400>1Met Tyr Ala Leu Phe Leu Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Ala Leu Ala1 5 10 15Gly Pro Val Leu Gly Leu Lys Glu Cys Thr Arg Gly Ser Ala Val Trp20 25 30Cys Gln Asn Val Lys Thr Ala Ser Asp Cys Gly Ala Val Lys His Cys35 40 45Leu Gln Thr Val Trp Asn Lys Pro Thr Val Lys Ser Leu Pro Cys Asp50 55 60Ile Cys Lys Asp Val Val Thr Ala Ala Gly Asp Met Leu Lys Asp Asn65 70 75 80Ala Thr Glu Glu Glu Ile Leu Val Tyr Leu Glu Lys Thr Cys Asp Trp85 90 95Leu Pro Lys Pro Asn Met Ser Ala Ser Cys Lys Glu Ile Val Asp Ser100 105 110Tyr Leu Pro Val Ile Leu Asp Ile Ile Lys Gly Glu Met Ser Arg Pro115 120 125Gly Glu Val Cys Ser Ala Leu Asn Leu Cys Glu Ser Leu Gln Lys His130 135 140Leu Ala Glu Leu Asn His Gln Lys Gln Leu Glu Ser Asn Lys Ile Pro145 150 155 160Glu Leu Asp Met Thr Glu Val Val Ala Pro Phe Met Ala Asn Ile Pro165 170 175Leu Leu Leu Tyr Pro Gln Asp Gly Pro Arg Ser Lys Pro Gln Pro Lys180 185 190Asp Asn Gly Asp Val Cys Gln Asp Cys Ile Gln Met Val Thr Asp Ile195 200 205Gln Thr Ala Val Arg Thr Asn Ser Thr Phe Val Gln Ala Leu Val Glu210 215 20His Val Lys Glu Glu Cys Asp Arg Leu Gly Pro Gly Met Ala Asp Ile225 230 235 240Cys Lys Asn Tyr Ile Ser Gln Tyr Ser Glu Ile Ala Ile Gln Met Met245 250 255Met His Met Gln Pro Lys Glu Ile Cys Ala Leu Val Gly Phe Cys Asp260 265 270Glu Val Lys Glu Met Pro Met Gln Thr Leu Val Pro Ala Lys Val Ala275 280 285Ser Lys Asn Val Ile Pro Ala Leu Glu Leu Val Glu Pro Ile Lys Lys290 295 300
His Glu Val Pro Ala Lys Ser Asp Val Tyr Cys Glu Val Cys Glu Phe305 310 315 320Leu Val Lys Glu Val Thr Lys Leu Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys325 330 335Glu Ile Leu Asp Ala Phe Asp Lys Met Cys Ser Lys Leu Pro Lys Ser340 345 350Leu Ser Glu Glu Cys Gln Glu Val Val Asp Thr Tyr Gly Ser Ser Ile355 360 365Leu Ser Ile Leu Leu Glu Glu Val Ser Pro Glu Leu Val Cys Ser Met370 375 380Leu His Leu Cys Ser Gly Thr Arg Leu Pro Ala Leu Thr Val His Val385 390 395 400Thr Gln Pro Lys Asp Gly Gly Phe Cys Glu Val Cys Lys Lys Leu Val405 410 415Gly Tyr Leu Asp Arg Asn Leu Glu Lys Asn Ser Thr Lys Gln Glu Ile420 425 430Leu Ala Ala Leu Glu Lys Gly Cys Ser Phe Leu Pro Asp Pro Tyr Gln435 440 445Lys Gln Cys Asp Gln Phe Val Ala Glu Tyr Glu Pro Val Leu Ile Glu450 455 460Ile Leu Val Glu Val Met Asp Pro Ser Phe Val Cys Leu Lys Ile Gly465 470 475 480Ala Cys Pro Ser Ala His Lys Pro Leu Leu Gly Thr Glu Lys Cys Ile485 490 495Trp Gly Pro Ser Tyr Trp Cys Gln Asn Thr Glu Thr Ala Ala Gln Cys500 505 510Asn Ala Val Glu His Cys Lys Arg His Val Trp Asn515 520<210>2<211>80<212>PRT<213>人<400>2Ser Asp Val Tyr Cys Glu Val Cys Glu Phe Leu Val Lys Glu Val Thr1 5 10 15Lys Leu Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Glu Ile Leu Asp Ala Phe20 25 30Asp Lys Met Cys Ser Lys Leu Pro Lys Ser Leu Ser Glu Glu Cys Gln35 40 45Glu Val Val Asp Thr Tyr Gly Ser Ser Ile Leu Ser Ile Leu Leu Glu50 55 60Glu Val Ser Pro Glu Leu Val Cys Ser Met Leu His Leu Cys Ser Gly65 70 75 80
权利要求
1.包含内小叶成分和前saposin相关多肽的药剂，其中的多肽具有一个氨基酸序列，系选自由下列氨基酸序列组成的群组(a)SEQ ID NO1中所列的氨基酸序列；(b)有80％与SEQ ID NO1中所列的氨基酸序列相同的氨基酸序列，其中的多肽保留质膜亲和力；(c)SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列；以及(d)有80％与SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列相同的氨基酸序列，其中的多肽保留质膜亲和力。
2.在本发明药剂的权利要求1中，内小叶成分是指磷脂酰丝氨酸或其结构类似物。
3.在本专利药剂的权利要求2中，磷脂酰丝氨酸或其结构类似物是指二油基磷脂酰丝氨酸。
4.在本发明药剂的权利要求1中，多肽与内小叶成分的摩尔比率的范围在大约1∶1至大约1∶50之间。
5.在本发明药剂的权利要求5中，多肽与内小叶成分的摩尔比率的范围在大约1∶1至大约1∶10之间。
6.本发明药剂的权利要求1可进一步包含一种制药学上可接受的载体。
7.在本发明药剂的权利要求1中，该药剂可促进超扩散性细胞的死亡。
8.在本发明药剂的权利要求7中，该超扩散性细胞选自由肿瘤细胞和癌细胞组成的群组。
9.调节某一实验对象的细胞质膜中的内小叶成分分布的方法包括给该实验对象用药，所用的药剂包括内小叶成分和前saposin相关多肽，其中的多肽具有一个氨基酸序列，系选自由以下氨基酸序列组成的群组(a)SEQ ID NO1中所列的氨基酸序列；(b)有80％与sEQ ID NO1中所列的氨基酸序列相同的氨基酸序列，其中的多肽保留质膜亲和力；(c)SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列；以及(d)有80％与SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列相同的氨基酸序列，其中的多肽保留质膜亲和力。
10.在本发明方法的权利要求9中，内小叶成分是指磷脂酰丝氨酸或其结构类似物。
11.在本发明方法的权利要求10中，磷脂酰丝氨酸或其结构类似物是指二油基磷脂酰丝氨酸。
12.在本发明方法的权利要求9中，质膜的外小叶中的内小叶成分的分布情况发生了改变。
13.在本发明方法的权利要求12中，外小叶中的内小叶成分浓度得到了提高。
14.在本发明方法的权利要求9中，对内小叶成分分布情况的调节系发生于超扩散性细胞上。
15.在本发明方法的权利要求14中，超扩散性细胞选自由肿瘤细胞和癌细胞组成的群组。
16.在本发明方法的权利要求9中，该方法可促进细胞死亡。
17.一种调节某一实验对象的肿瘤大小的方法，该方法包括使用一种包含内小叶成分和前saposin相关多肽的药剂，其中的多肽具有一个氨基酸序列，系选自由下列氨基酸序列组成的群组(a)SEQ ID NO1中所列的氨基酸序列；(b)有80％与SEQ ID NO1中所列的氨基酸序列相同的氨基酸序列，其中的多肽保留质膜亲和力；(c)SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列；以及(d)有80％与SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列相同的氨基酸序列，其中的多肽保留质膜亲和力。
18.在本发明方法的权利要求17中，该药剂可促进超扩散性细胞的死亡。
19.在本发明方法的权利要求18中，超扩散性细胞选自由肿瘤细胞和癌细胞组成的群组。
20.在本发明方法的权利要求19中，该癌细胞选自由肉瘤、成神经细胞瘤、乳癌和鳞片细胞癌细胞组成的群组。
21.在本发明方法的权利要求17中，内小叶成分是指磷脂酰丝氨酸或其结构类似物。
22.在本发明方法的权利要求21中，磷脂酰丝氨酸或其结构类似物是指二油基磷脂酰丝氨酸。
23.在本发明方法的权利要求17中，该实验对象是哺乳动物。
24.在本发明方法的权利要求23中，该哺乳动物是人类。
25.在本发明方法的权利要求17中，该肿瘤体积减小。
26.在本发明方法的权利要求17中，多肽与内小叶成分的摩尔比率的范围在大约1∶1至大约1∶50之间。
27.在本发明方法的权利要求26中，多肽与内小叶成分的摩尔比率的范围在大约1∶1至大约1∶10之间。
28.在本发明方法的权利要求17中，该药剂可进一步包含一种制药学上可接受的载体。
29.一种治疗某一实验对象的癌症的方法，该方法包括使用一种包含内小叶成分和前saposin相关多肽的药剂，其中的多肽具有一个氨基酸序列，系选自由下列氨基酸序列组成的组(a)SEQ ID NO1中所列的氨基酸序列1；(b)有80％与SEQ ID NO1中所列的氨基酸序列相同的氨基酸序列，其中的多肽保留质膜亲和力；(c)SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列；以及(d)有80％与SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列相同的氨基酸序列，其中的多肽保留质膜亲和力。
30.在本发明方法的权利要求29中，内小叶成分是指磷脂酰丝氨酸或其结构类似物。
31.在本发明方法的权利要求30中，磷脂酰丝氨酸或其结构类似物是指二油基磷脂酰丝氨酸。
32.在本发明方法的权利要求29中，多肽与内小叶成分的摩尔比率的范围在大约1∶1至大约1∶50之间。
33.在本发明药剂的权利要求32中，多肽与内小叶成分的摩尔比率的范围在大约1∶1至大约1∶10之间。
34.在本发明方法的权利要求29中，该药剂可进一步包含一种制药学上可接受的载体。
35.在本发明方法的权利要求29中，该药剂可促进超扩散性细胞的死亡。
36.在本发明方法的权利要求35中，细胞死亡通过凋亡而发生。
37.在本发明方法的权利要求35中，超扩散性细胞选自由几种癌细胞组成的群组。
38.在本发明方法的权利要求37中，该癌细胞选自由肉瘤、成神经细胞瘤、乳癌和鳞片细胞癌细胞组成的群组。
39.在本发明方法的权利要求29中，该实验对象是哺乳动物。
40.在本发明方法的权利要求39中，该哺乳动物是人类。
41.在本发明方法的权利要求29中，药剂的用药方法有经肠道、非肠道、经皮下、经静脉、经腹膜或外用。
42.在本发明方法的权利要求29中，给该实验对象使用多剂量的该药剂。
43.在本发明方法的权利要求29中，给该实验对象使用单剂量的该药剂。
44.抗肿瘤药剂包含具有SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列的多肽以及二油基磷脂酰丝氨酸。
45.在权利要求44中所述的抗肿瘤药剂中，多肽与二油基磷脂酰丝氨酸的质量比率大约为5∶1。
46.在权利要求44中所述的抗肿瘤药剂中，多肽与二油基磷脂酰丝氨酸的质量比率大约为15∶7。
47.在权利要求44中所述的抗肿瘤药剂中，多肽与二油基磷脂酰丝氨酸的质量比率范围在大约15∶1至大约3∶10之间。
48.权利要求44中所述的抗肿瘤药剂包含大约10μM的多肽和大约30μM的二油基磷脂酰丝氨酸。
49.权利要求44中所述的抗肿瘤药剂包含大约10μM的多肽和大约70μM的二油基磷脂酰丝氨酸。
全文摘要
提供治疗患有以超扩散性细胞如肿瘤和癌为特征的紊乱的患者的药物和方法。药物包含的药剂为saposin C (即前saposin相关多肽)与二油基磷脂酰丝氨酸的结合物(即内小叶成分)。这种抗肿瘤药剂按本发明方法并根据一种剂量体系进行用药。使用本发明药剂将在肿瘤患者体内发生积极的治疗反应。
文档编号A61K38/00GK1735424SQ200480001127
公开日2006年2月15日 申请日期2004年3月17日 优先权日2003年4月28日
发明者X·齐 申请人:儿童医院医疗中心