专利名称：用于治疗对皮质激素类－和/或钙调磷酸酶抑制剂有耐受性的包含皮质激素类和免疫抑 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物组合、如药学活性化合物的组合的新用途。
已经在治疗学上将抑制T-细胞增殖、即T淋巴细胞增殖的物质用作免疫抑制剂和/或免疫调节剂，所述的物质例如包括皮质激素类如糖皮质激素及其衍生物。但是，已知对该类药物存在或可能产生耐受性，例如皮质激素类耐受性，这意味着该类药物对成功治疗多种疾病而言没有活性或活性不足。
我们现在已经令人吃惊地发现如果使用组合治疗的话，可克服对该类物质的耐受性。
本发明一方面提供了皮质激素类与式I化合物的组合在制备用于治疗对皮质激素类有耐受性的疾病和/或对钙调磷酸酶抑制剂有耐受性的疾病、例如用于治疗其中单独使用式I化合物或单独使用皮质激素类无效或效力不足的疾病的药物中的用途， 其中R1是式(a)基团
其中，R5是氯、溴、碘或叠氮基，R6是羟基或甲氧基，且R4是羟基且10，11位是单键；或者R4不存在且10，11位是双键；或者R1是式(b)或(c)基团 和 其中，R6如上定义，和R4是羟基且10，11位是单键，R2是氧代且23，24位是单键；是羟基且23，24位是单或双键；或者R2不存在且23，24位是双键；R3是甲基、乙基、丙基或烯丙基。
治疗无效或效力不足指本发明组合的化合物在单独使用时在临床环境中不表现出效力或者表现出效力不足。我们已经建立了一种体外系统，例如如本文所述的系统，其中，在某些情况下仅使用皮质激素类或者仅使用钙调磷酸酶抑制剂不能使T-细胞增殖的抑制达到治疗性处理所必需的程度。因此，这些系统可作为对皮质激素类和/或钙调磷酸酶抑制剂有耐受性的体内实验模型。
我们已经确定单独使用抑制作用小于35％、例如小于25％、例如小于20％的本发明组合的化合物对治疗性处理而言是不足够的。另一方面，我们已经确定如果达到至少60％或更高、如80％、90％至实际达100％的抑制作用，则单独使用本发明组合的化合物足以进行治疗性处理。
式I化合物在例如EP-B-0427680中有公开，其中指明了式I化合物优选的取代基，其优选的取代基同样是本申请中优选的取代基；例如在式I化合物中各单独定义的取代基可例如与所定义的取代基彼此独立地是优选的取代基；例如包括式Ip化合物，如在EP-B-0427680的实施例66a中作为“33-表位-33-氯-FR 520”的化合物，也称为“ASM981”。
本发明另一方面提供了本发明的皮质激素类与式I化合物的组合的用途，其中式I化合物是式Ip化合物 本发明组合中的皮质激素类包括药学活性的皮质激素类及其衍生物，例如包括皮质类固醇，如糖皮质激素类(即具有糖皮质激素样活性)，例如表现出药学活性的那些，以及糖皮质激素受体的非类固醇配体，例如包括游离形式和下述形式的皮质激素类-酯类，例如包括单-和二-酯，例如盐形式，例如钠盐，-缩醛和缩酮，如丙酮化合物，例如是盐和溶剂化物形式(在可应用的情形下)。
实例包括阿氯米松(如-二丙酸酯)、amicinonide、倍氯米松(例如-二丙酸酯)、倍他米松(例如-醋酸酯、-苯甲酸酯、-二丙酸酯、磷酸钠、-戊酸酯)、布地奈德、甘珀酸(例如钠盐)、环索奈德、氯倍他索(例如-丙酸酯)、氯倍他松(例如-丁酸酯)、氯可托龙(例如-醋酸酯、-新戊酸酯)、氯泼尼醇、皮质酮、促皮质素(例如-氢氧化锌)、皮质醇、可的松(例如-醋酸酯)、可的伐唑、地夫可特、地西龙(例如-丙酮化合物)、地奈德、地塞米松(例如磷酸钠、-醋酸酯、-异烟酸酯(isomicotinate))、去氧米松、二氟拉松(例如-二醋酸酯)、二氟可龙(例如-新戊酸酯、戊酸酯)、二氟泼尼酯、氟氯龙、氟氢可的松、氟氢缩松、氟米松(例如-新戊酸酯)、氟尼缩松、氟可丁(丁基)、醋酸氟轻松、氟轻松(例如-丙酮化合物)、氟可龙(例如-己酸酯)、氟米龙、氟培龙(例如-醋酸酯)、氟泼尼定(例如-21-缩醛、-醋酸酯)、氟泼尼龙(例如-戊酸酯)、氟氢可舒松、氟替卡松(例如-丙酸酯、戊酸酯)、福莫可他、哈西奈德、卤倍他索(例如-丙酸酯)、卤米松(例如一水合物)、氢化可的松(例如-醋酸酯、-丁丙酸酯、-丁酸酯、环戊丙酸酯、-磷酸钠、-琥珀酸钠、-半琥珀酸酯、-戊酸酯)、甲羟松、甲泼尼龙(例如-醋酸酯、-磷酸钠、-琥珀酸钠、-醋丙酯)、莫米松(例如糠酸酯(fuorate))、尼伐可醇、帕拉米松(例如-醋酸酯)、泼尼卡酯、泼尼松龙(例如包括-醋酸酯、-半琥珀酸酯、-磷酸钠、-琥珀酸钠、-叔丁乙酯)、泼尼松、泼尼松龙、强的松龙戊酸酯、泼尼立定、罗氟奈德(例如棕榈酸酯)、替卡贝松(例如-丙酸酯)、替泼尼旦、曲洛奈德、曲安西龙(例如-丙酮化合物、-丙酮化合物磷酸钠、-二醋酸酯)，例如，及其药效学等同物，优选氢化可的松、倍他米松如倍他米松17-戊酸酯，或地塞米松。
药效学等同物意欲包括具有与本文所列的具体皮质激素类相似的药学活性的皮质激素类。
药用赋形剂包括例如适宜的载体和/或稀释剂，例如包括填充剂、粘合剂、崩解剂、流动调节剂、润滑剂、糖和甜味剂、香料、防腐剂、稳定剂、润湿剂和/或乳化剂、增溶剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂。
本发明另一方面提供了本发明的皮质激素类与式I化合物的组合的用途，其中所述的皮质激素类选自氢化可的松、倍他米松如倍他米松17-戊酸酯，和地塞米松。
本发明组合的化合物可以是游离形式、盐形式、溶剂化物形式或者其中存在盐和/或溶剂化物的盐与溶剂化物形式。
本发明另一方面提供了-本发明的皮质激素类与式I化合物的组合的用途，其中式I化合物为盐形式；-本发明的皮质激素类与式I化合物的组合的用途，其中皮质激素类为盐形式；-本发明的皮质激素类与式I化合物的组合的用途，其中式I化合物和皮质激素类均为盐形式。
对皮质激素类有耐受性的疾病是已知的，包括例如-脱发，例如全部脱发或全身脱毛，-变态反应，例如接触性变态反应，-淀粉样变性，例如全身性淀粉样变性，-动脉炎，例如高安动脉炎，-关节炎，例如(幼年型)类风湿性关节炎、青少年型寡关节炎(oligoarthritis)、结节病关节炎，-关节病，例如脊椎关节病，-哮喘，例如支气管哮喘、慢性哮喘，-结肠炎，-结膜炎，例如角膜结膜炎，-节段性回肠炎，包括与节段性回肠炎有关的对皮质类固醇有耐受性的坏疽性脓皮病、难以治疗的节段性回肠炎，-囊性纤维化，-皮炎(＝皮肤病)，如接触性皮炎、特应性皮炎、过敏性接触性皮炎和日光性皮炎、苔癣样皮炎、溃疡性皮炎，-多发性硬化症，例如脑多发性硬化症，-湿疹，-格雷夫斯病，例如格雷夫斯眼病，-移植物抗宿主病(GVHD)，-血管瘤，-肝炎，-炎性肠病(IBD)，
-胰岛素依赖型糖尿病，-眼内炎性疾病，-角膜炎，-巨噬细胞活化综合征，-肌无力，例如重症肌无力，-脊髓炎，例如脑脊髓炎，-肌炎，例如(幼年型)皮肌炎(DM)、多肌炎(PM)和包函体肌炎(IBM)，-肾炎，例如肾小球性肾炎、肾炎综合征，-眼炎，例如交感性眼炎，-肺炎，-多关节炎，例如慢性多关节炎如斯蒂尔病，-银屑病，-肺部疾病或肺病，例如慢性阻塞性肺疾病(COPD)，-视网膜脱离-结节病或神经结节病，-巩膜炎，-硬化症，例如肾小球硬化症，-败血症性休克，-舍格伦综合征，-全身性红斑狼疮，-移植排斥，例如(肾或肾脏)同种异体移植物排斥，-血小板减少性紫癜，例如免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、(慢性)特发性血小板减少性紫癜，-溃疡性结肠炎，-荨麻疹，例如(慢性)特发性荨麻疹、荨麻疹性血管炎，-眼色素层眼，如前眼色素层眼、慢性眼色素层眼、周边眼色素层眼、难治的眼色素层眼、贝赫切特眼色素层眼、肉芽肿性眼色素层眼如伏格特-小柳-原田疾病。
本发明另一方面提供了本发明的皮质激素类与式I化合物如式Ip化合物的组合的用途，其中所述的疾病是其中在该疾病的病理生理学中涉及T细胞(即T淋巴细胞)的疾病，例如T-细胞介导的急性或慢性炎性疾病或紊乱或自身免疫性疾病，例如选自下述的那些-移植物抗宿主病(GVHD)，-自身免疫性疾病和炎性病症，特别是具有包括自身免疫性组分在内的病原学的炎性病症，例如血液学紊乱，包括例如溶血性贫血、再生障碍性贫血、单纯红细胞性贫血和自发性血小板减少症、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、多软骨炎、硬皮病、韦格纳肉芽肿病、慢性活动性肝炎、桥本甲状腺炎、斯-约综合征、特发性口炎性腹泻、自身免疫性炎性肠病、格雷夫斯病、结节病、多发性硬化症、肺间质纤维化、重症肌无力、肾小球性肾炎(具有和不具有肾炎综合征)、青少年型皮肌炎、青少年型糖尿病(I型糖尿病)、免疫介导的眼病症，例如眼色素层眼(前眼色素层眼和后眼色素层眼)、角膜成形术、慢性角膜炎、干性角膜结膜炎、春季角膜结膜炎；-免疫介导疾病的皮肤表现；-炎性和过度增殖性皮肤疾病，如银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎和湿疹性皮炎、脂溢性皮炎、扁平苔癣、天疱疮、大疱性类天疱疮、大疱性表皮松懈、荨麻疹、血管性水肿、血管炎、红斑、皮肤嗜曙红细胞增多、红斑狼疮和痤疮；-过敏性病症，例如春季结膜炎、眼变态反应；-炎性神经损伤，例如脑炎症；-脑缺氧、低氧或缺血；-哮喘，-慢性阻塞性肺疾病(COPD)，-炎性肠病(IBD)，包括溃疡性结肠炎和节段性回肠炎；-多药耐药性(MDR)，和-局限性脱发，其中仅使用式I化合物如式Ip化合物或仅使用皮质激素类是无效的或者效力不足。
本发明另一方面提供了本发明的皮质激素类与式I化合物的组合的用途，其中疾病选自特应性皮炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、溃疡性结肠炎和节段性回肠炎。
治疗包括治疗和预防。
对于该类治疗而言，适宜的剂量当然取决于例如所用的本发明化合物的化学性质和药动学数据、宿主个体、给药方式以及所治疗病症的性质和严重程度。然而通常，为了在较大的哺乳动物如人中获得令人满意的结果，钙调磷酸酶抑制剂如吡美莫司当局部施用时以约0.1％至5％w/v或w/w的溶液或乳剂形式提供，其中所述的剂量取决于所治疗疾病的种类以及给药部位，或者当全身给药、如口服给药时以每名患者10mg至120mg、例如0.1mg/kg至2mg/kg钙调磷酸酶抑制剂如吡美莫司的剂量提供，并且，皮质激素类以标准疗法中已知的剂量给予，例如，当局部应用时以0.5至5％剂量给予，当全身给药如口服给药时以0.25至2500mg、优选1至500mg、例如1至50mg的剂量给予。
本发明另一方面提供了皮质激素类和钙调磷酸酶抑制剂的组合在制备用于治疗对皮质激素类有耐受性的疾病和/或对钙调磷酸酶抑制剂有耐受性的疾病的药物、如药物组合物中的用途，其中在所述疾病的病理生理学中涉及T细胞，前提是排除在其病理生理学中涉及T细胞的局灶性节段性肾小球硬化症，例如用于治疗其中对单独使用钙调磷酸酶抑制剂或单独使用皮质激素类无效或效力不足的疾病。
本发明另一方面提供了本发明的钙调磷酸酶抑制剂与皮质激素类的组合的用途，其中所述疾病选自-移植物抗宿主病(GVHD)，-自身免疫性疾病和炎性病症，特别是具有包括自身免疫性组分在内的病原学的炎性病症，例如血液学紊乱，包括例如溶血性贫血、再生障碍性贫血、单纯红细胞性贫血和自发性血小板减少症、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、多软骨炎、硬皮病、韦格纳肉芽肿病、慢性活动性肝炎、桥本甲状腺炎、斯-约综合征、特发性口炎性腹泻、自身免疫性炎性肠病、格雷夫斯病、结节病、多发性硬化症、肺间质纤维化、重症肌无力、肾小球性肾炎(具有和不具有肾炎综合征)、青少年型皮肌炎、青少年型糖尿病(I型糖尿病)、免疫介导的眼病症，例如眼色素层眼(前眼色素层眼和后眼色素层眼)、角膜成形术、慢性角膜炎、干性角膜结膜炎、春季角膜结膜炎；-免疫介导疾病的皮肤表现；-炎性和过度增殖性皮肤疾病，如银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎和湿疹性皮炎、脂溢性皮炎、扁平苔癣、天疱疮、大疱性类天疱疮、大疱性表皮松懈、荨麻疹、血管性水肿、血管炎、红斑、皮肤嗜曙红细胞增多、红斑狼疮和痤疮；-过敏性病症，例如春季结膜炎、眼变态反应；-炎性神经损伤，例如脑炎症；-脑缺氧、低氧或缺血；-哮喘，-慢性阻塞性肺疾病(COPD)，-炎性肠病(IBD)，包括溃疡性结肠炎和节段性回肠炎；-多药耐药性(MDR)，-溃疡，如胃溃疡，-由缺血性疾病和血栓形成引起的血管损伤，-与热灼伤有关的引起坏死的损伤，和-局限性脱发，其中仅使用钙调磷酸酶抑制剂或仅使用皮质激素类是无效的或者效力不足。
“对皮质激素类有耐受性的疾病”和/或“对钙调磷酸酶抑制剂有耐受性的疾病”如上定义。
钙调磷酸酶是在细胞内发信号中所涉及的钙/钙调蛋白-调节的蛋白磷酸酶。关于钙调磷酸酶的综述，参见例如Rusnak和Mertz，Physiol.Rev.80，1483-1521(2000)和Feske等人，Biochem.Biophys.Commun.311，1117-1132(2003)。钙调磷酸酶抑制剂是阻断适宜底物的钙调磷酸酶脱磷酸作用的物质。
本发明的钙调磷酸酶抑制剂优选是具有钙调磷酸酶抑制活性的亲免素结合化合物。
亲免素结合钙调磷酸酶抑制剂是与亲免素类如环亲素和巨菲蛋白(macrophilin)形成钙调磷酸酶抑制复合物的化合物。环亲素结合钙调磷酸酶抑制剂的实例有环孢素类或环孢素衍生物(下文称为环孢素类)，巨菲蛋白结合钙调磷酸酶抑制剂的实例有子囊霉素和子囊霉素衍生物(下文称为子囊霉素类)，参见例如Liu等人，Cell 66，807-815(1991)和Dumont等人，J.Exp.Med.，176，751-780(1992)，以及他克莫司(FK506)。
环孢素类及其制备例如在US4117118有公开，其中指明了式I化合物优选的取代基，其优选的取代基同样是本申请优选的取代基；例如在式I化合物中各单独定义的取代基可例如与所定义的取代基彼此独立地是优选的取代基。环孢素最初由土壤真菌Potypaciadium infilatum中提取，具有环状11-氨基酸结构，包括例如环孢素A至I，如环孢素A、B、C、D和G，优选环孢素A。
子囊霉素类及其制备是已知的。子囊霉素(FR520)是在例如US3,244,592和EP349061中公开的大环内酯抗生素，其中指明了式I化合物优选的取代基，其优选的取代基同样是本申请优选的取代基；例如在式I化合物中各单独定义的取代基可例如与所定义的取代基彼此独立地是优选的取代基。多种子囊霉素衍生物是已知的，其天然存在于真菌种类中，或者通过控制发酵操作或通过化学衍生化来获得。
子囊霉素类包括例如如上所述的式I化合物，优选吡美莫司。
本发明另一方面提供了本发明的皮质激素类和钙调磷酸酶抑制剂的组合的用途，其中钙调磷酸酶抑制剂是其中取代基如上所述的式I化合物，优选是式Ip化合物。
本发明另一方面提供了本发明的钙调磷酸酶抑制剂与皮质激素类的组合的用途，其中钙调磷酸酶抑制剂是式II化合物
其中，R1是羟基或被保护的羟基，R2是氢、羟基或被保护的羟基，R3是甲基、乙基、丙基或烯丙基，n是整数1或2，和符号直线和虚线表示单键。
式II化合物在例如EP-B-0184162中有公开，其中指明了式I化合物优选的取代基，其优选的取代基同样是本申请优选的取代基；例如在EP-B-0184162的式I化合物中各单独定义的取代基可例如与所定义的取代基彼此独立地是优选的取代基。优选的化合物是式IIFK化合物FK 506(他克莫司)。
本发明另一方面提供了本发明的钙调磷酸酶抑制剂与皮质激素类的组合的用途，其中钙调磷酸酶抑制剂是式IIFK化合物
本发明另一方面提供了本发明的钙调磷酸酶抑制剂与皮质激素类的组合的用途，其中钙调磷酸酶抑制剂是式III化合物 其中R是甲基、乙基、丙基、异丙基或-CH(OH)CH3，优选R是乙基(环孢素A)。
本发明另一方面提供了本发明的皮质激素类与钙调磷酸酶抑制剂的组合的用途，其中皮质激素类选自如上所述的皮质激素类，优选皮质激素类选自氢化可的松、倍他米松如倍他米松17-戊酸酯，和地塞米松。
钙调磷酸酶抑制剂与皮质激素类的组合的化合物可以是游离形式、盐形式、溶剂化物形式或者其中存在盐和/或溶剂化物的盐与溶剂化物形式。
本发明另一方面提供了-本发明的皮质激素类和钙调磷酸酶抑制剂的组合的用途，其中钙调磷酸酶抑制剂是盐形式；-本发明的皮质激素类和钙调磷酸酶抑制剂的组合的用途，其中皮质激素类是盐形式；-本发明的皮质激素类和钙调磷酸酶抑制剂的组合的用途，其中钙调磷酸酶抑制剂和皮质激素类均为盐形式。
本发明的组合可以包含一种或多种钙调磷酸酶抑制剂和一种或多种皮质激素类，并且优选包含一种钙调磷酸酶抑制剂和一种皮质激素类。
本发明的组合的化合物可以以游离形式或可药用盐的形式使用，例如施用，所述的可药用盐例如是酸加成盐或金属盐；任选是溶剂化物的形式。皮质激素类还可以是例如酯或丙酮化合物的形式，并且还可以是盐的形式。盐/酯/丙酮化合物/溶剂化物形式的本发明组合的化合物表现出与本发明所用的游离形式的化合物相同数量级的活性；任选是溶剂化物的形式。
治疗和剂量如上述式I化合物与皮质激素类的组合中所述。
钙调磷酸酶抑制剂(例如包括式I、II或III化合物)与皮质激素类的比例取决于多种因素，例如各化合物的效力。
本发明另一方面提供了一种除可药用赋形剂外还包含式Ip化合物与氢化可的松的组合的药物组合物。
本发明另一方面提供了一种除可药用赋形剂外还包含式Ip化合物与倍他米松如倍他米松17-戊酸酯的组合的药物组合物。
本发明另一方面提供了一种除可药用赋形剂外还包含式Ip化合物与地塞米松的组合的药物组合物。
在本发明的组合中，可药用赋形剂如适宜的载体和/或稀释剂例如包括填充剂、粘合剂、崩解剂、流动调节剂、润滑剂、糖和甜味剂、香料、防腐剂、稳定剂、润湿剂和/或乳化剂、增溶剂、调节渗透压的盐和缓冲剂。
本发明的组合包括
-固定组合，其中两种药学活性药物在同一制剂中；-药盒，其中两种药学活性药物在分开的制剂中，在同一包装、例如带有共同给药说明的包装中出售；以及-独立的组合，其中药学活性物质被独立包装，但是给出了同时或依次给药的说明。
本发明的药物组合物可以根据例如与常规方法相似的方法来制备，例如通过混合、制粒、包衣、溶解或冷冻干燥法来制备。单位剂型可包含例如约0.5mg至约1000mg、如1mg至约500mg的药学活性化合物。本发明的以及用于本发明的药物组合物可以通过任何常规途径来给药，例如经肠内(例如包括经鼻、口腔、直肠、口服)、胃肠道外(例如包括静脉内、肌内、皮下)或局部(例如包括表皮、鼻内、气管内)给药；其例如是包衣或未包衣的片剂、胶囊、注射溶液或混悬液(例如安瓿或小瓶形式)、乳剂、凝胶、糊剂、吸入粉末、泡沫、酊剂、唇膏、滴剂、喷雾剂或栓剂的形式。
包括例如式I、II和III化合物在内的钙调磷酸酶抑制剂和皮质激素类是已知的或者可以根据例如与常规方法相似的方法来获得。
本发明的组合除包含钙调磷酸酶抑制剂和皮质激素类作为活性成分外还可包含另外的药学活性化合物。所述另外的药学活性化合物包括其它抗炎剂、免疫调节剂和抗增殖剂。
本发明另一方面提供了还包含另外的药学活性药物的本发明的药物组合物。
我们已经用人外周血单核细胞(PBMC)建立了体外系统，用其作为对皮质激素类和/或钙调磷酸酶抑制剂有耐受性的体外实验模型，其中单独使用皮质激素类或单独使用钙调磷酸酶抑制剂(包括例如环孢素A和式I、II或III化合物)对T-细胞增殖根本没有作用或者仅有部分抑制作用。这些系统在本文被描述为对皮质激素类有耐受性和/或对钙调磷酸酶抑制剂有耐受性，例如对式I化合物有耐受性，它们使用高细胞密度(如在96孔板中为50,000-200,000个细胞/孔)和T-细胞增殖的强效刺激物，即超抗原葡萄球菌肠毒素B(SEB)和/或抗-CD3加上抗-CD28单克隆抗体的组合。它们与使用低细胞密度和/或较弱刺激物如仅抗-CD3抗体的系统形成对比，其中皮质激素类和钙调磷酸酶抑制剂在纳摩尔至低于纳摩尔的浓度下完全或几乎完全抑制T-细胞增殖。
令人吃惊地是，在本文所述的耐受性系统中，我们已经发现钙调磷酸酶抑制剂与皮质激素类的组合可强烈地抑制T-细胞增殖(例如60％抑制至高达完全抑制)，而该组合的单一组分根本不产生抑制或抑制作用不高于35％。测定和测量如实施例的“方法”中所述。
如实施例中所示，我们已经发现在我们的体外系统中，仅式I、II或III化合物如IP、IIFK或环孢素A，或者仅氢化可的松，或者仅倍他米松17-戊酸酯，或者仅地塞米松可能基本没有抑制作用或者仅部分(如小于T-细胞增殖35％)的抑制作用；而在同一测定中，氢化可的松与式Ip化合物的组合，或倍他米松17-戊酸酯与式Ip化合物的组合，或地塞米松与式Ip化合物的组合，或氢化可的松与式IIFK化合物的组合，或地塞米松与式IIFK化合物的组合，或氢化可的松与环孢素A的组合，或倍他米松17-戊酸酯与环孢素A的组合，或地塞米松与环孢素A的组合表现出至少60％至高达完全抑制的抑制作用。因此，我们发现本发明的化合物的组合在单一组分不表现出抑制作用或表现出小于35％、如小于25％、如小于20％的抑制的情形下可表现出活性。
在下述实施例中，温度以摄氏度(℃)给出且未校正。
采用下述缩写ASM 式Ip化合物(ASM981，吡美莫司)BETA 倍他米松17-戊酸酯BrdU 5-溴-2-脱氧-尿苷CsA 环孢素ADEX 地塞米松DMSO 二甲基亚砜FCS 胎牛血清FK式IIFK化合物(FK506，他克莫司)
HC 氢化可的松MAb 单克隆抗体μg 微克μM 微摩尔nM 纳摩尔OD 光密度PBMC 外周血单核细胞rpm 转数/每分钟RPMI 在Roswell Park Memorial Institute形成的介质RT 室温SD 标准差SEB 葡萄球菌肠毒素B(超抗原)STIM-C 经刺激对照UNSTIM-C 未经刺激对照实施例A材料刺激人T-细胞受体的鼠抗-CD3单克隆抗体(克隆SPV-T3/1，同种型IgG2a)是已知的(Spits H.，Keizer G.，Borst J.等人，(1983)Characterizationof monoclonal antibodies against cell surface molecules associated withcytotoxic activity of natural and activated killer cells and cloned CTL lines，Hybridoma 2423-437)并且可以酌情制备。鼠抗-CD28单克隆抗体(克隆CD28.2，同位型IgG1，κ)得自BD Biosciences(目录号555725)。SEB得自Toxin Technology Inc.(萨拉索塔，佛罗里达，USA；目录号TX-BT202)。以测量DNA合成期间掺入的BrdU为基础的细胞增殖ELISA试剂盒(比色法)得自Roche Molecular Biochemicals(曼海姆，德国)。根据制造商的说明使用这些试剂盒。
细胞培养在无菌条件下通过Ficoll/Hypaque离心法将PBMC从人血沉棕黄层中分离出来，将其冷冻在90％FCS+10％DMSO中并将其储存在液氮中。在各实验中，将冷冻的PBMC解冻，然后洗涤并将其重新混悬于由RPMI1640(Gibco-BRL，Paisley，UK)组成的培养介质中，该培养介质补充有10％热灭活FCS(Gibco)、2mM谷氨酰胺、0.1mg/ml链霉素和100单位/ml青霉素(Gibco)。将0.1ml所得细胞混悬液加入96孔平底细胞培养板(Nunc，Roskilde，丹麦)第2-11列的各孔中，而第12列仅包含介质并将其作为介质空白。仅内部的孔接受细胞并将其用于该实验中(即排除第1列以及A和H行；仅接受介质)。首先将溶剂对照和试验化合物(加入量为0.05ml/孔)和细胞一起在37℃/5％CO2下温育2小时。然后，向所有孔加入刺激物(0.05ml/孔)至所示的终浓度，未进行刺激的对照(其接受培养介质(0.05ml/孔))除外，将该板在37℃/5％CO2下再温育68小时，然后加入BrdU(0.02ml/孔BrdU标记溶液[＝10μM在细胞培养介质中的BrdU]，得自ELISA试剂盒)。在37℃/5％CO2下另外温育4小时后，将板与RT在1200rpm(300×g)下离心10分钟。除去上清液后，将板于60℃温育1小时以干燥细胞。一式三份(即每个浓度3个孔)对溶剂对照和各化合物或化合物组合(以所示终浓度)进行试验。将试验化合物(即本发明的化合物-组合和该组合的各化合物)溶解于DMSO中，随后在细胞培养介质中稀释至细胞板中的DMSO终浓度不超过0.2％(v/v)。
T-细胞增殖试验对这些板进行处理，以按照制造商的说明采用ELISA试剂盒(RocheMolecular Bioehemieals)根据DNA合成期间掺入的BrdU来测定细胞增殖。光密度用微量滴定板读数器于450nm进行测量，参考波长为690nm。用软件程序ExcelTM对吸光度数据进行分析。不含细胞的孔的均值用作空白并从其它值中减去该值。计算各化合物和化合物组合的吸光度均值和标准偏差，然后将其标准化为包含刺激物的溶剂对照(即经刺激对照，其被定义为100％)。同样计算各化合物和化合物组合的抑制％。
在下述实施例1至27中，类似于本文所述进行T-细胞增殖试验。
在第0天，将细胞接种到96-孔细胞培养板中并在加入刺激物前将其用化合物预温育2小时。在第3天(即68小时后)，加入BrdU并温育4小时，之后进行处理以通过BrdU ELISA测定掺入的BrdU。
在随后的表中，定义下列术语-“未经刺激对照”未经刺激的对照(即细胞减去刺激物和化合物)所测量的OD均值，同时给出所计算的SD值。
-“经刺激对照”经刺激的对照(即细胞加刺激物并减去化合物)所测量的OD均值，同时给出所计算的SD值。
-“化合物”在刺激物和化合物存在下所测量的OD均值，同时给出所计算的SD值。
-“标准化OD[或SD](经刺激对照％)”OD和SD值相对于经刺激对照标准化，其中经刺激对照被设定为100。
-“％抑制”被定义为100％-[(样品OD-未经刺激对照OD)/(经刺激对照OD-未经刺激对照OD)]×100％。负值表明相对于经刺激对照而言对增殖的刺激作用(定义为0％抑制)。高于100的值表明抑制低于未经刺激对照的水平(定义为100％抑制)。
实施例1细胞/孔200000化合物HC(10μM)，ASM(30nM)，BETA(300nM)，HC(10μM)+ASM(30nM)的组合，以及BETA(300nM)+ASM(30nM)的组合刺激物抗-CD3单克隆抗体(0.1μg/ml)+抗-CD28单克隆抗体(1μg/ml)结果得到如下述表1所述的结果。
表1
从表1可以清楚地看出，单独使用ASM、单独使用HC和单独使用BETA在该系统中基本不能抑制T-细胞增殖，而ASM+HC和ASM+BETA的组合表现出高于65％的抑制作用。
实施例2细胞/孔100000化合物HC(10μM)，ASM(30nM)，BETA(300nM)，HC(10μM)+ASM(30nM)的组合，以及BETA(300nM)+ASM(30nM)的组合刺激物抗-CD3单克隆抗体(0.1μg/ml)+抗-CD28单克隆抗体(1μ/ml)结果得到如下述表2所述的结果。
表2
从表2可以清楚地看出，单独使用ASM、单独使用HC和单独使用BETA在该系统中对T-细胞增殖的抑制低于17％，而ASM+HC和ASM+BETA的组合表现出高于73％的抑制。
实施例3细胞/孔50000化合物HC(10μM)，ASM(30nM)，BETA(300nM)，HC(10μM)+ASM(30nM)的组合，以及BETA(300nM)+ASM(30nM)的组合刺激物抗-CD3单克隆抗体(0.1μg/ml)+抗-CD28单克隆抗体(1μg/ml)结果得到如下述表3所述的结果。
表3
从表3可以清楚地看出，单独使用ASM、单独使用HC和单独使用BETA在该系统中基本不能抑T-细胞增殖，而ASM+HC和ASM+BETA的组合表现出高于93％的抑制。
实施例4细胞/孔200000化合物HC(10μM)，ASM(30nM)，BETA(300nM)，HC(10μM)+ASM(30nM)的组合，以及BETA(300nM)+ASM(30nM)的组合刺激物SEB(0.1μg/ml)结果得到如下述表4所述的结果。
表4
从表4可以清楚地看出，单独使用ASM、单独使用HC和单独使用BETA在该系统中对T-细胞增殖的抑制低于17％，而ASM+HC和ASM+BETA的组合表现出高于99％的抑制(即基本完全抑制)。
实施例5细胞/孔100000化合物HC(10μM)，ASM(30nM)，BETA(300nM)，HC(10μM)+ASM(30nM)的组合，以及BETA(300nM)+ASM(30nM)的组合刺激物SEB(0.1μg/ml)结果得到下述表5所述的结果。
表5
从表5可以清楚地看出，单独使用ASM、单独使用HC和单独使用BETA在该系统中对T-细胞增殖的抑制低于24％，而ASM+HC和ASM+BETA的组合表现出高于99％的抑制(即基本完全抑制)。
实施例6细胞/孔200000化合物DEX(300nM)，ASM(30nM)，BETA(300nM)，DEX(300nM)+ASM(30nM)的组合，以及BETA(300nM)+ASM(30nM)的组合刺激物抗-CD3单克隆抗体(0.1μg/ml)+抗-CD28单克隆抗体(1μg/ml)结果得到如下述表6所述的结果。
表6
从表6可以清楚地看出，单独使用ASM、单独使用DEX和单独使用BETA在该系统中对T-细胞增殖的抑制低于14％，而ASM+DEX和ASM+BETA的组合表现出高于79％的抑制。
实施例7细胞/孔100000化合物DEX(300nM)，ASM(30nM)，BETA(300nM)，DEX(300nM)+ASM(30nM)的组合，以及BETA(300nM)+ASM(30nM)的组合刺激物抗-CD3单克隆抗体(0.1μg/ml)+抗-CD28单克隆抗体(1μg/ml)结果得到如下述表7所述的结果。
表7
从表7可以清楚地看出，单独使用ASM、单独使用DEX和单独使用BETA在该系统中对T-细胞增殖的抑制低于25％，而ASM+DEX和ASM+BETA的组合表现出高于86％的抑制。
实施例8细胞/孔50000化合物DEX(300nM)，ASM(30nM)，BETA(300nM)，DEX(300nM)+ASM(30nM)的组合，以及BETA(300nM)+ASM(30nM)的组合刺激物抗-CD3单克隆抗体(0.1μg/ml)+抗-CD28单克隆抗体(1μg/ml)结果得到如下述表8所述的结果。
表8
从表8可以清楚地看出，单独使用ASM、单独使用DEX和单独使用BETA在该系统中对T-细胞增殖的抑制低于26％，而ASM+DEX和ASM+BETA的组合表现出高于96％的抑制。
实施例9细胞/孔200000化合物DEX(300nM)，ASM(30nM)，BETA(300nM)，DEX(300nM)+ASM(30nM)的组合，以及BETA(300nM)+ASM(30nM)的组合刺激物SEB(0.1μg/ml)结果得到如下述表9所述的结果。
表9
从表9可以清楚地看出，单独使用ASM、单独使用DEX和单独使用BETA在该系统中对T-细胞增殖的抑制低于19％，而ASM+DEX和ASM+BETA的组合表现出高于100％的抑制(即基本完全抑制)。
实施例10细胞/孔100000化合物DEX(300nM)，ASM(30nM)，BETA(300nM)，DEX(300nM)+ASM(30nM)的组合，以及BETA(300nM)+ASM(30nM)的组合刺激物SEB(0.1μg/ml)结果得到如下述表10所述的结果。
表10
从表10可以清楚地看出，单独使用ASM、单独使用DEX和单独使用BETA在该系统中对T-细胞增殖的抑制低于34％，而ASM+DEX和ASM+BETA的组合表现出高于99％的抑制(即基本完全抑制)。
实施例11细胞/孔100000化合物DEX(300nM)，ASM(30nM)，以及DEX(300nM)+ASM(30nM)的组合刺激物抗-CD3单克隆抗体(0.1μg/ml)+抗-CD28单克隆抗体(1μg/ml)结果得到如下述表11所述的结果。
表11
从表11可以清楚地看出，单独使用ASM和单独使用DEX在该系统中对T-细胞增殖的抑制低于25％，而ASM+DEX的组合表现出高于96％的抑制。
实施例12细胞/孔100000化合物DEX(300nM)，ASM(30nM)，以及DEX(300nM)+ASM(30nM)的组合刺激物SEB(0.1μg/ml)
结果得到如下述表12所述的结果。
表12
从表12可以清楚地看出，单独使用ASM和单独使用DEX在该系统中对T-细胞增殖的抑制低于24％，而ASM+DEX的组合表现出高于101％的抑制(即基本完全抑制)。
实施例13细胞/孔200000化合物HC(10μM)，FK(30nM)，BETA(300nM)，HC(10μM)+FK(30nM)的组合，以及BETA(300nM)+FK(30nM)的组合刺激物抗-CD3单克隆抗体(0.1μg/ml)+抗-CD28单克隆抗体(1μg/ml)结果得到如下述表13所述的结果。
表13
从表13可以清楚地看出，单独使用FK、单独使用HC和单独使用BETA在该系统中基本不能抑T-细胞增殖，而FK+HC和FK+BETA的组合表现出高于60％的抑制。
实施例14细胞/孔100000化合物HC(10μM)，FK(30nM)，BETA(300nM)，HC(10μM)+FK(30nM)的组合，以及BETA(300nM)+FK(30nM)的组合刺激物抗-CD3单克隆抗体(0.1μg/ml)+抗-CD28单克隆抗体(1μg/ml)结果得到如下述表14所述的结果。
表14
从表14可以清楚地看出，单独使用FK、单独使用HC和单独使用BETA在该系统中对T-细胞增殖的抑制低于31％，而FK+HC和FK+BETA的组合表现出高于80％的抑制。
实施例15细胞/孔200000化合物DEX(300nM)，FK(30nM)，BETA(300nM)，DEX(300nM)+FK(30nM)的组合，以及BETA(300nM)+FK(30nM)的组合刺激物抗-CD3单克隆抗体(0.1μg/ml)+抗-CD28单克隆抗体(1μg/ml)结果得到如下述表15所述的结果。
表15
从表15可以清楚地看出，单独使用FK、单独使用DEX和单独使用BETA在该系统中对T-细胞增殖的抑制低于14％，而FK+DEX和FK+BETA的组合表现出高于88％的抑制。
实施例16细胞/孔100000化合物DEX(300nM)，FK(30nM)，BETA(300nM)，DEX(300nM)+FK(30nM)的组合，以及BETA(300nM)+FK(30nM)的组合刺激物抗-CD3单克隆抗体(0.1μg/ml)+抗-CD28单克隆抗体(1μg/ml)结果得到如下述表16所述的结果。
表16
从表16可以清楚地看出，单独使用FK、单独使用DEX和单独使用BETA在该系统中对T-细胞增殖的抑制低于25％，而FK+DEX和FK+BETA的组合表现出高于92％的抑制。
实施例17细胞/孔50000化合物DEX(300nM)，FK(30nM)，BETA(300nM)，DEX(300nM)+FK(30nM)的组合，以及BETA(300nM)+FK(30nM)的组合刺激物抗-CD3单克隆抗体(0.1μg/ml)+抗-CD28单克隆抗体(1μg/ml)结果得到如下述表17所述的结果。
表17
从表17可以清楚地看出，单独使用FK、单独使用DEX和单独使用BETA在该系统中对T-细胞增殖的抑制低于26％，而FK+DEX和FK+BETA的组合表现出高于99％的抑制(即基本完全抑制)。
实施例18细胞/孔100000化合物DEX(300nM)，FK(30nM)，和DEX(300nM)+FK(30nM)的组合刺激物抗-CD3单克隆抗体(0.1μg/ml)+抗-CD28单克隆抗体(1μg/ml)结果得到如下述表18所述的结果。
表18
从表18可以清楚地看出，单独使用FK和单独使用DEX在该系统中对T-细胞增殖的抑制低于25％，而FK+DEX的组合表现出高于98％的抑制(即基本完全抑制)。
实施例19细胞/孔200000化合物HC(10μM)，CsA(300nM)，BETA(300nM)，HC(10μM)+CsA(30nM)的组合，以及BETA(300nM)+CsA(300nM)的组合刺激物抗-CD3单克隆抗体(0.1μg/ml)+抗-CD28单克隆抗体(1μg/ml)结果得到如下述表19所述的结果。
表19
从表19可以清楚地看出，单独使用CsA、单独使用HC和单独使用BETA在该系统中基本不能抑T-细胞增殖，而CsA+HC和CsA+BETA的组合表现出高于75％的抑制。
实施例20细胞/孔100000化合物HC(10μM)，CsA(300nM)，BETA(300nM)，HC(10μM)+CsA(30nM)的组合，以及BETA(300nM)+CsA(300nM)的组合刺激物抗-CD3单克隆抗体(0.1μg/ml)+抗-CD28单克隆抗体(1μg/ml)结果得到如下述表20所述的结果。
表20
从表20可以清楚地看出，单独使用CsA、单独使用HC和单独使用BETA在该系统中对T-细胞增殖的抑制低于16％，而CsA+HC和CsA+BETA的组合表现出高于89％的抑制。
实施例21细胞/孔50000化合物HC(10μM)，CsA(300nM)，BETA(300nM)，HC(10μM)+CsA(30nM)的组合，以及BETA(300nM)+CsA(300nM)的组合刺激物抗-CD3单克隆抗体(0.1μg/ml)+抗-CD28单克隆抗体(1μg/ml)结果得到如下述表21所述的结果。
表21
从表21可以清楚地看出，单独使用CsA、单独使用HC和单独使用BETA在该系统中基本不能抑T-细胞增殖，而CsA+HC和CsA+BETA的组合表现出高于97％的抑制(即基本完全抑制)。
实施例22细胞/孔200000化合物HC(10μM)，CsA(300nM)，BETA(300nM)，HC(10μM)+CsA(30nM)的组合，以及BETA(300nM)+CsA(300nM)的组合刺激物SEB(0.1μg/ml)结果得到如下述表22所述的结果。
表22
从表22可以清楚地看出，单独使用CsA、单独使用HC和单独使用BETA在该系统中对T-细胞增殖的抑制低于17％，而CsA+HC和CsA+BETA的组合表现出高于99％的抑制(即基本完全抑制)。
实施例23细胞/孔200000化合物DEX(300nM)，CsA(300nM)，BETA(300nM)，DEX(300nM)+CsA(30nM)的组合，以及BETA(300nM)+CsA(300nM)的组合刺激物抗-CD3单克隆抗体(0.1μg/ml)+抗-CD28单克隆抗体(1μg/ml)结果得到如下述表23所述的结果。
表23
从表23可以清楚地看出，单独使用CsA、单独使用DEX和单独使用BETA在该系统中对T-细胞增殖的抑制低于14％，而CsA+DEX和CsA+BETA的组合表现出高于88％的抑制。
实施例24细胞/孔100000化合物DEX(300nM)，CsA(300nM)，BETA(300nM)，DEX(300nM)+CsA(30nM)的组合，以及BETA(300nM)+CsA(300nM)的组合刺激物抗-CD3单克隆抗体(0.1μg/ml)+抗-CD28单克隆抗体(1μg/ml)结果得到如下述表24所述的结果。
表24
从表24可以清楚地看出，单独使用CsA、单独使用DEX和单独使用BETA在该系统中对T-细胞增殖的抑制低于25％，而CsA+DEX和CsA+BETA的组合表现出高于94％的抑制。
实施例25细胞/孔50000化合物DEX(300nM)，CsA(300nM)，BETA(300nM)，DEX(300nM)+CsA(30nM)的组合，以及BETA(300nM)+CsA(300nM)的组合刺激物抗-CD3单克隆抗体(0.1μg/ml)+抗-CD28单克隆抗体(1μg/ml)结果得到如下述表25所述的结果。
表25
从表25可以清楚地看出，单独使用CsA、单独使用DEX和单独使用BETA在该系统中对T-细胞增殖的抑制低于26％，而CsA+DEX和CsA+BETA的组合表现出高于98％的抑制(即基本完全抑制)。
实施例26细胞/孔200000化合物DEX(300nM)，CsA(300nM)，BETA(300nM)，DEX(300nM)+CsA(30nM)的组合，以及BETA(300nM)+CsA(300nM)的组合刺激物SEB(0.1μg/ml)结果得到如下述表26所述的结果。
表26
从表26可以清楚地看出，单独使用CsA、单独使用DEX和单独使用BETA在该系统中对T-细胞增殖的抑制低于16％，而CsA+DEX和CsA+BETA的组合表现出高于100％的抑制(即基本完全抑制)。
实施例27细胞/孔100000化合物DEX(300nM)，CsA(300nM)，和DEX(300nM)+CsA(300nM)的组合刺激物抗-CD3单克隆抗体(0.1μg/ml)+抗-CD28单克隆抗体(1μg/ml)结果得到如下述表27所述的结果。
表27
从表27可以清楚地看出，单独使用CsA和单独使用DEX在该系统中对T-细胞增殖的抑制低于29％，而CsA+DEX的组合表现出高于98％的抑制(即基本完全抑制)。
权利要求
1.皮质激素类与式I化合物的组合在制备用于治疗对皮质激素类有耐受性的疾病和/或对钙调磷酸酶抑制剂有耐受性的疾病的药物中的用途， 其中R1是式(a)基团 其中，R5是氯、溴、碘或叠氮基，R6是羟基或甲氧基，且R4是羟基且10，11位是单键；或者R4不存在且10，11位是双键；或者R1是式(b)或(c)基团 和 其中，R6如上定义，和R4是羟基且10，11位是单键，R2是氧代且23，24位是单键；是羟基且23，24位是单或双键；或者R2不存在且23，24位是双键；R3是甲基、乙基、丙基或烯丙基。
2.权利要求1所述的用途，其中所述的式I化合物是式Ip化合物
3.权利要求1或2中任意一项所述的用途，其中所述的皮质激素类选自氢化可的松、倍他米松和地塞米松。
4.权利要求1至3中任意一项所述的用途，其中在所述疾病的病理生理学中涉及T细胞。
5.权利要求1至4中任意一项所述的用途，其中所述的疾病选自特应性皮炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、溃疡性结肠炎和节段性回肠炎。
6.皮质激素类和钙调磷酸酶抑制剂的组合在制备用于治疗对皮质激素类有耐受性的疾病和/或对钙调磷酸酶抑制剂有耐受性的疾病的药物中的用途，其中在所述疾病的病理生理学中涉及T细胞，前提是排除在其病理生理学中涉及T细胞的局灶性节段性肾小球硬化症。
7.权利要求6所述的用途，其中所述的钙调磷酸酶抑制剂是式I化合物 其中取代基的定义如权利要求1所述。
8.权利要求6所述的用途，其中所述的钙调磷酸酶抑制剂是式II化合物， 其中R1是羟基或被保护的羟基，R2是氢、羟基或被保护的羟基，R3是甲基、乙基、丙基或烯丙基，n是整数1或2，和符号直线和虚线表示单键。
9.权利要求6所述的用途，其中所述的钙调磷酸酶抑制剂是式III化合物 其中R是甲基、乙基、丙基、异丙基或-CH(OH)CH3。
10.权利要求6或7中任意一项所述的用途，其中所述的钙调磷酸酶抑制剂是权利要求2的式Ip化合物。
11.权利要求6或8中任意一项所述的用途，其中所述的钙调磷酸酶抑制剂是式IIFK化合物
12.权利要求6或9中任意一项所述的用途，其中所述的钙调磷酸酶抑制剂是其中R为乙基的式III化合物。
13.权利要求6至12中任意一项所述的用途，其中所述的皮质激素类选自氢化可的松、倍他米松和地塞米松。
14.权利要求6至13中任意一项所述的用途，其中所述的钙调磷酸酶抑制剂或皮质激素类为盐形式或者两者均为盐形式。
15.药物组合物，该组合物除可药用赋形剂外还包含式Ip化合物与氢化可的松的组合。
16.药物组合物，该组合物除可药用赋形剂外还包含式Ip化合物与倍他米松的组合。
17.药物组合物，该组合物除可药用赋形剂外还包含式Ip化合物与地塞米松的组合。
全文摘要
皮质激素类与式I化合物的组合在制备用于治疗对皮质激素类有耐受性的疾病和/或对钙调磷酸酶抑制剂有耐受性的疾病的药物中的用途，所述的疾病例如是在其病理生理学中涉及T细胞的疾病。
文档编号A61K31/57GK1747743SQ200480003706
公开日2006年3月15日 申请日期2004年2月9日 优先权日2003年2月10日
发明者A·温尼斯基 申请人:诺瓦提斯公司